用于哺乳动物的补充动物饲料的制作方法

用于哺乳动物的补充动物饲料
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年2月18日提交的美国专利申请序列号62/977,990的优先权，其内容通过引用以其全文并入本文。


背景技术：

3.在为促进生长而优化的现代条件下饲养的哺乳动物接受含有高比例的蛋白质(通常为大豆或棉籽粕的形式)及高百分比的谷物诸如玉米或米洛(一种类型的高粱)的日粮。饲料添加剂已被用于改良农场动物(包括妊娠或泌乳哺乳动物)的健康和福祉。饲料是维持农场动物和从哺乳动物生产食物的相对昂贵的成本因素(典型地是成本的50％至70％)。因此，对哺乳动物的饲料转化为食品(包括奶)的任何改良，或对哺乳动物的繁殖性能的提高，都可以直接提升食品生产商的盈利能力。
4.添加剂的使用并非没有问题。抗生素在动物饲料中的广泛使用促进了抗生素耐药微生物的发展。由于越来越多的抗生素耐药细菌出现在饲养场，并且抗生素耐药细菌可能导致流行病，政府关于限制动物饲料中抗生素的使用面临的压力越来越大。
5.因此，对改良妊娠或泌乳哺乳动物的健康和福祉的新的、安全的、有效的方法有迫切和日益增加的需求。


技术实现要素：

6.本发明的特征在于用于以下的方法中的补充动物饲料：(i)改善亚临床乳腺炎的一种或多种症状；(ii)减少亚临床乳腺炎进展为完全临床乳腺炎的频率；(iii)减少哺乳动物初乳或奶中的细菌计数；(iv)减少哺乳动物的生理应激；(v)改良哺乳动物的繁殖性能；和/或(vi)改良哺乳动物后代健康。
7.在第一方面，本发明的特征在于一种治疗哺乳动物的亚临床乳腺炎的方法，该方法包括给该哺乳动物喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料。在一些实施例中，该哺乳动物正在泌乳。在另外的实施例中，该哺乳动物正在哺育后代。该哺乳动物可以是牛、马、狗、猫、绵羊、或猪。在一些实施例中，该哺乳动物是牛。在特定实施例中，该哺乳动物是奶牛。奶牛可以是荷斯坦牛(holstein cattle)、娟姗牛(jersey cattle)、瑞士褐牛(brown swiss cattle)、更赛牛(guernsey cattle)、爱尔夏牛(ayrshire cattle)、乳用短角牛、或红白花荷斯坦牛(red and white holstein)。在其他实施例中，该哺乳动物是猪。在一些实施例中，该喂食是在从该哺乳动物收集奶之前的10天至30天(例如，从10天至15天、从10天至20天、从15天至20天、从15天至25天、从20天至25天、从20天至30天、或从25天至30天)。在其他实施例中，该喂食是在从该哺乳动物收集奶之前的30天至50天(例如，从30天至40天、从35天至45天、从40天至50天、从30天至35天、从35天至40天、从40天至45天、或从45天至50天)。在仍其他实施例中，该喂食是在从该哺乳动物收集奶之前的20天至45天(例如，从20天至30天、从25天至35天、从30天至40天、从35天至45天、从21天至42天、从21天至28天、或从28天至42天)。在一些实施例中，该喂食在从该哺乳动物收集奶期间进行。在一
些实施例中，该奶的保质期增加。在一些实施例中，该方法包括改善亚临床乳腺炎的一种或多种症状。在特定实施例中，该方法包括减少(例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或更多)该哺乳动物中亚临床乳腺炎进展为完全临床乳腺炎的频率。
8.在另一个方面，本发明的特征在于一种改良哺乳动物后代健康的方法，该方法包括在该哺乳动物怀孕后给该哺乳动物喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料。该哺乳动物可以是牛、马、狗、猫、绵羊、或猪。在一些实施例中，该哺乳动物是猪。在一些实施例中，该喂食是在从该哺乳动物怀孕之前的10天至30天(例如，从10天至15天、从10天至20天、从15天至20天、从15天至25天、从20天至25天、从20天至30天、或从25天至30天)。在一些实施例中，该喂食在该后代的妊娠期期间进行。在一些实施例中，该方法进一步包括在该哺乳动物哺育该后代期间，继续喂食该哺乳动物。在一些实施例中，从该怀孕哺乳动物向该后代的被动免疫转移增强。在特定实施例中，该哺乳动物在怀孕之前或之后患有亚临床乳腺炎或处于亚临床乳腺炎的风险下。在特定实施例中，改良后代健康包括：(i)减少出生时死胎或木乃伊胎的数量；(ii)增加活后代从出生到断奶的存活率；(iii)增加后代从出生到断奶的体重增加；和/或(iv)减少后代从出生到断奶的感染性疾病(例如，腹泻)的发生率。与对照哺乳动物的后代相比，存活率的平均增加可以大于0.5％，优选大于1％、2％、3％、4％、或5％。与对照哺乳动物的后代相比，后代从出生到断奶的体重增加的平均增加可以大于0.5％，优选大于1％、2％、3％、4％、或5％。与对照哺乳动物的后代相比，后代从出生到断奶的感染性疾病(例如，腹泻)的发生率的平均降低可以大于0.5％，优选大于1％、2％、3％、4％、或5％。
9.在另一个方面，本发明的特征在于一种减少泌乳哺乳动物的生理应激的方法，该方法包括在该哺乳动物泌乳期间给该哺乳动物喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料。在一些实施例中，该哺乳动物正在哺育后代。该哺乳动物可以是牛、马、狗、猫、绵羊、或猪。在一些实施例中，该哺乳动物是牛。在特定实施例中，该哺乳动物是奶牛。奶牛可以是荷斯坦牛、娟姗牛、瑞士褐牛、更赛牛、爱尔夏牛、乳用短角牛、或红白花荷斯坦牛。在其他实施例中，该哺乳动物是猪。在一些实施例中，减少生理应激包括减少该哺乳动物的脂肪损失。在特定实施例中，该哺乳动物在泌乳期间患有亚临床乳腺炎或处于亚临床乳腺炎的风险下。
10.在另一个方面，本发明的特征在于一种在哺乳动物生下后代后改良该哺乳动物的繁殖性能的方法，该方法包括给该哺乳动物喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料。该哺乳动物可以是牛、马、狗、猫、绵羊、或猪。在一些实施例中，该哺乳动物是牛。在特定实施例中，该哺乳动物是奶牛。奶牛可以是荷斯坦牛、娟姗牛、瑞士褐牛、更赛牛、爱尔夏牛、乳用短角牛、或红白花荷斯坦牛。在其他实施例中，该哺乳动物是猪。在一些实施例中，改良繁殖性能减少了该哺乳动物恢复发情所需的天数。在特定实施例中，该哺乳动物在其怀孕之前或之后患有亚临床乳腺炎或处于亚临床乳腺炎的风险下。
11.本发明的特征进一步在于一种减少哺乳动物初乳或奶中的细菌计数的方法，该方法包括给该哺乳动物喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料。在一些实施例中，该哺乳动物正在泌乳。在另外的实施例中，该哺乳动物正在哺育后代。该哺乳动物可以是牛、马、狗、猫、绵羊、或猪。在一些实施例中，该哺乳动物是牛。在特定实施例中，该哺乳动物是奶牛。奶牛可以是荷斯坦牛、娟姗牛、瑞士褐牛、更赛牛、爱尔夏牛、乳用短角牛、或红白
花荷斯坦牛。在其他实施例中，该哺乳动物是猪。
12.在该哺乳动物正在泌乳的上述方法的特定实施例中，该方法可以包括给该哺乳动物喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料，其中该喂食是：(i)在从该哺乳动物收集奶之前的10天至30天(例如，从10天至15天、从10天至20天、从15天至20天、从15天至25天、从20天至25天、从20天至30天、或从25天至30天)；或(ii)在从该哺乳动物收集奶之前的30天至50天(例如，从30天至40天、从35天至45天、从40天至50天、从30天至35天、从35天至40天、从40天至45天、或从45天至50天；或(iii)在从该哺乳动物收集奶之前的20天至45天(例如，从20天至30天、从25天至35天、从30天至40天、从35天至45天、从21天至42天、从21天至28天、或从28天至42天)。在一些实施例中，该喂食在从该哺乳动物收集奶期间进行。在一些实施例中，该奶的保质期增加。
13.在该哺乳动物怀孕的上述方法的特定实施例中，该方法可以包括给该哺乳动物喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料，其中该喂食是：(i)在从该哺乳动物怀孕之前的10天至30天(例如，从10天至15天、从10天至20天、从15天至20天、从15天至25天、从20天至25天、从20天至30天、或从25天至30天)；或(ii)在从该哺乳动物怀孕之前的30天至50天(例如，从30天至40天、从35天至45天、从40天至50天、从30天至35天、从35天至40天、从40天至45天、或从45天至50天)；或(iii)在从该哺乳动物怀孕之前的20天至45天(例如，从20天至30天、从25天至35天、从30天至40天、从35天至45天、从21天至42天、从21天至28天、或从28天至42天)。在一些实施例中，该喂食在该哺乳动物的整个妊娠期期间进行(例如，与约115天的妊娠期同时喂食母猪)。在其他实施例中，该喂食至少持续该哺乳动物的妊娠期的前半段。在仍其他实施例中，该喂食至少持续该哺乳动物的妊娠期的后半段。在一些实施例中，所得到的后代健康得到改良。
14.在任何上述方法的特定实施例中，该动物主要(例如，80％或更多)被喂食补充有类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料。采用这种方法，该动物饲料可以包含0.0001％至0.005％(w/w)(例如，0.0001％至0.003％(w/w)、0.0001％至0.001％(w/w)、0.0005％至0.003％(w/w)、0.0005％至0.001％(w/w)、0.001％至0.003％(w/w)、0.001％至0.005％(w/w)、或0.003％至0.005％(w/w))类胡萝卜素-氧共聚物。该动物饲料可以包含0.0002％至0.001％(w/w)类胡萝卜素-氧共聚物。在特定实施例中，该动物饲料包含0.0004％至0.001％(w/w)类胡萝卜素-氧共聚物。
15.在任何上述方法的其他实施例中，该动物主要(例如，80％或更多)被喂食未补充类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料，但每天至少接受补充有类胡萝卜素-氧共聚物的单独每日喂食。采用这种方法，该每日喂食可以包含含有0.01％至0.5％(w/w)(例如，0.01％至0.1％(w/w)、0.05％至0.2％(w/w)、0.075％至0.4％(w/w)、0.15％至0.4％(w/w)、或0.2％至0.5％(w/w))类胡萝卜素-氧共聚物的高度补充动物饲料。该动物饲料可以包含0.02％至0.1％(w/w)类胡萝卜素-氧共聚物。在特定实施例中，该动物饲料包含0.05％至0.1％(w/w)类胡萝卜素-氧共聚物。例如，当这些哺乳动物是通过牧场放牧喂食的牛时，本发明的方法包括每天用该高度补充动物饲料喂食。
16.在另一个方面，本发明的特征在于一种生产巴氏杀菌奶的方法，该方法包括：(i)提供从哺乳动物获得的奶，其中在从该哺乳动物收集奶之前的至少10天开始至30天(例如，从10天至15天、从10天至20天、从15天至20天、从15天至25天、从20天至25天、从20天至30
天、或从25天至30天)的期间，哺乳动物被喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料；以及(ii)使用低温巴氏杀菌工艺加工该奶以生产该巴氏杀菌奶。在其他实施例中，在从该哺乳动物收集奶之前的至少30天开始至50天(例如，从30天至40天、从35天至45天、从40天至50天、从30天至35天、从35天至40天、从40天至45天、或从45天至50天)的期间，该哺乳动物被喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料。在仍其他实施例中，在从该哺乳动物收集奶之前的至少20天开始至45天(例如，从20天至30天、从25天至35天、从30天至40天、从35天至45天、从21天至42天、从21天至28天、或从28天至42天)的期间，该哺乳动物被喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料。在一些实施例中，该奶的保质期增加。在其他实施例中，该奶中的细菌计数减少。该哺乳动物可以是牛、马、狗、猫、绵羊、或猪。在一些实施例中，该哺乳动物是牛。在特定实施例中，该哺乳动物是奶牛。奶牛可以是荷斯坦牛、娟姗牛、瑞士褐牛、更赛牛、爱尔夏牛、乳用短角牛、或红白花荷斯坦牛。
17.定义
[0018]“动物”是指任何动物，包括但不限于绵羊、猪、牛、和鸟类。“哺乳动物”是指具有泌乳能力的动物，包括但不限于绵羊、猪、和牛。
[0019]
如本文使用的，“类胡萝卜素”是指可以在植物、藻类、细菌和某些动物(诸如鸟类和贝类)中发现的具有萜类基团的天然存在的色素。类胡萝卜素包括作为碳氢化合物(即不含氧)的胡萝卜素及其含氧衍生物(即叶黄素)。类胡萝卜素的实例包括番茄红素；β-胡萝卜素；玉米黄质；海胆酮；异玉米黄质；虾青素；角黄素；叶黄素；柠檬黄素；β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯；羟基类胡萝卜素，诸如别黄嘌呤、阿扑胡萝卜醇、虾红素、虾青素、辣椒红素、辣椒玉红素、胡萝卜素二醇、胡萝卜素三醇、胡萝卜醇、隐黄质、癸异戊二烯黄素、表叶黄素、岩藻黄质、羟基胡萝卜素酮、羟基海胆酮、羟基番茄红素、叶黄素、番茄黄质、神经松质、八氢番茄红素、植物氟烯、紫菌红素乙、球形烯、环烯、紫黄质、和玉米黄质；和羧基类胡萝卜素，诸如阿朴胡萝卜素酸、13-阿朴-8'-胡萝卜素酸、玄参红酸、红木素、羧基胡萝卜素、藏花酸、二阿朴胡萝卜素酸、链孢霉黄素、降红木素、和番茄红素酸。
[0020]
如本文使用的，“类胡萝卜素-氧共聚物”是指通过与分子氧自发反应以其反应性双键完全氧化的类胡萝卜素，从而导致类胡萝卜素与氧的共聚物作为主要产物。在一些实施例中，类胡萝卜素-氧共聚物是通过使类胡萝卜素与多达6摩尔至8摩尔当量氧或来自另一种氧化剂的当量氧反应而形成。这种反应产生大比例的聚合材料(即分子量大于1,000道尔顿的材料)。聚合物材料被认为是通过可以由多个双键形成的各种氧化片段的许多可能的化学组合形成的。美国专利号5,475,006和u.s.s.n.08/527,039中描述了制备类胡萝卜素-氧共聚物的方法，其中每个通过引用并入本文。
[0021]
如本文使用的，奶的“低温巴氏灭菌”是指一种在55℃至65℃(例如，从55℃至60℃、从58℃至63℃、从60℃至65℃、从60℃至63℃、从61℃至64℃、从62℃至65℃、从62℃至64℃、或从62℃至65℃)的范围内的温度下将奶加热足以把奶的总细菌计数减少50％，优选55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％的时间段(例如，从10分钟至1小时、从20分钟至40分钟、从30分钟至1小时、从30分钟至40分钟、从40分钟至1小时、从1小时至2小时、或从1小时至3小时)的方法。
[0022]
如本文使用的，哺乳动物中“改良后代健康”是指(i)减少出生时死胎或木乃伊胎的数量；(ii)增加活后代从出生到断奶的存活率；(iii)增加后代从出生到断奶的体重增
加；和/或(iv)减少后代从出生到断奶的感染性疾病(例如，腹泻)的发生率。该改良是与除了对照哺乳动物的饲料未补充类胡萝卜素-氧聚合物之外在相同条件下饲养的相同物种、年龄和状况(例如，怀孕前、妊娠或泌乳)的对照哺乳动物相比。与对照哺乳动物的后代相比，存活率的平均增加可以大于0.5％，优选大于1％、2％、3％、4％、或5％。与对照哺乳动物的后代相比，后代从出生到断奶的体重增加的平均增加可以大于0.5％，优选大于1％、2％、3％、4％、或5％。与对照哺乳动物的后代相比，后代从出生到断奶的感染性疾病(例如，腹泻)的发生率的平均降低可以大于0.5％，优选大于1％、2％、3％、4％、或5％。
[0023]
如本文使用的，哺乳动物中“饲料摄入量”是指每只哺乳动物每日消耗的饲料(例如，千克/天)。
[0024]
如本文使用的，哺乳动物中“减少生理应激”是指以下中任一项：(i)减少哺乳动物的脂肪损失；(ii)减少心率；以及(iii)减少血压。该改良是与除了对照哺乳动物的饲料未补充类胡萝卜素-氧共聚物之外在相同条件下饲养的相同物种、年龄和状况(例如，怀孕前、妊娠或泌乳)的对照哺乳动物相比。
[0025]
如本文使用的，与除了对照哺乳动物的饲料未补充类胡萝卜素-氧共聚物之外在相同条件下饲养的相同物种、年龄和状况的对照哺乳动物相比，哺乳动物“改良繁殖性能”是指(i)哺乳动物在较短时间内恢复发情；(ii)减少出生时小于正常的后代数量；和/或(iii)增加每窝后代数量。
[0026]
如本文使用的，“oxbc”是主要含有类胡萝卜素-氧共聚物(例如，β-胡萝卜素-氧共聚物)以及少量的许多小分子氧化分解产物的化合物，由多达6摩尔至8摩尔当量氧与β-胡萝卜素反应形成。在一些实例中，oxbc作为商业产品oxc-β
tm
牲畜10％预混物施用。
[0027]
如本文使用的，术语“亚临床乳腺炎”是指由不会在奶或乳房中产生可见变化的亚临床乳房内感染导致的哺乳动物乳腺炎症。尽管奶看起来正常，但在亚临床感染的母牛通常会产生较少的奶，并且奶的质量将降低。
[0028]
如本文使用的，术语“治疗亚临床乳腺炎”是指(i)改善亚临床乳腺炎的一种或多种症状，或(ii)减少亚临床乳腺炎进展为完全临床乳腺炎的频率。使用本发明的方法治疗患有亚临床乳腺炎的哺乳动物，可以增加哺乳动物奶产生，改良哺乳动物奶质量，并且可以降低(例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多)亚临床乳房炎进展为完全临床乳房病的风险。(i)改善亚临床乳腺炎的一种或多种症状或(ii)减少亚临床乳腺炎进展为完全临床乳腺炎的频率的效果是与除了对照哺乳动物的饲料未补充类胡萝卜素-氧共聚物之外在相同条件下饲养的相同物种、年龄和状况(例如，亚临床乳腺炎的相同严重程度和状态，例如，怀孕前、妊娠和/或泌乳)的对照哺乳动物相比。
[0029]
从以下详细说明以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将会是显而易见的。
附图说明
[0030]
图1证明了实例2中oxbc对以下三个实验组的泌乳奶牛的干物质摄入量(dmi)的影响：ctr2、t1、和t2。
[0031]
图2证明了实例2中oxbc对以下三个实验组的泌乳奶牛的奶产生的影响：ctr2、t1、和t2。
[0032]
图3证明了研究期的天气数据。t
max
＝24小时内的最高温度；t
min
＝24小时内的最低
温度；和precip＝24小时内的总沉淀。
[0033]
图4是在开始喂食之前(d 0)以及21天和42天之后喂食oxbc或对照的母牛的四分体(quarter)的四分体水平scc的自然对数的小提琴图。在小提琴图中，开放圆代表中值，实心条代表四分位距，须代表该四分位距延伸1.5倍，并且阴影代表数据的核密度图。
[0034]
图5显示了在开始喂食之前(d 0)以及21天和42天之后喂食oxbc(
·
)或对照(
△
)的母牛的四分体的四分体水平scc的自然对数的估计边际平均值。
[0035]
图6显示了在用oxbc(
·
)或对照(
△
)饮食开始喂食后，在第21和第42天的scc《200,000个/ml的四分体的估计平均比例。
[0036]
图7是开始喂食oxbc或对照饮食前后ln母牛水平(畜群测试)scc的小提琴图。
[0037]
图8显示了开始喂食oxbc(
·
)或对照(
△
)饮食前后ln母牛水平(畜群测试)scc的估计边际平均值。
[0038]
图9显示了喂食补充oxbc(实心橙色条)或喂食对照饮食(交叉阴影蓝色条)的母牛在开始喂食前和开始喂食后进行的畜群测试的估计边际平均值(95％置信区间)每日奶产量(千克/母牛/天)。
[0039]
图10是开始喂食oxbc或对照饮食前后母牛水平(畜群测试)乳脂百分比的小提琴图。
[0040]
图11显示了开始喂食oxbc(
·
)或对照(
△
)饮食前后母牛水平(畜群测试)乳脂百分比的估计边际平均值。
[0041]
图12是开始喂食oxbc或对照饮食前后母牛水平(畜群测试)乳蛋白百分比的小提琴图。
[0042]
图13显示了开始喂食oxbc(
·
)或对照(
△
)饮食前后母牛水平(畜群测试)乳蛋白百分比的估计边际平均值。
具体实施方式
[0043]
本发明的特征在于通过给哺乳动物喂食包含类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料来治疗哺乳动物(例如，牛、马、狗、猫、绵羊、或猪)的亚临床乳腺炎和减少其初乳或奶中的细菌计数的方法。本发明的特征还在于通过给哺乳动物喂食包含类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料来减少生理应激、改良繁殖性能、和改良后代健康的方法。
[0044]
已经证明，与无治疗相比，抗微生物剂治疗后亚临床乳房内感染(例如，亚临床乳腺炎)的细菌学治愈率提高(例如，亚临床乳腺炎)(参见sol等人,journal of dairy science[乳业科学杂志],80,2803-2808(1997)；oliver等人,journal of dairy science[乳业科学杂志],87,2393-2400(2004)；deluyker等人journal of dairy science[乳业科学杂志],88,604-614(2005)；以及steele和mcdougall,new zealand veterinary journal[新西兰兽医学杂志],62,38-46(2014))。然而，用抗微生物剂治疗亚临床病例与相关奶渣的经济学受到质疑(swinkels等人,new zealand veterinary journal[新西兰兽医学杂志],62,38-46(2005))，并且发展抗微生物剂耐药性的风险增加的可能性表明，常规使用抗微生物剂治疗亚临床感染可能是不合理的(barlow,journal of mammary gland biology and neoplasia[乳腺生物学与肿瘤形成杂志],16,385-407(2009))。因此，替代性的非抗微生物剂方法是优选的。本发明的方法可以提供这种非抗微生物剂方法。
[0045]
类胡萝卜素-氧共聚物的施用
[0046]
使用本发明的方法，将类胡萝卜素-氧共聚物以有效治疗哺乳动物的亚临床乳腺炎和/或减少其初乳或奶中的细菌计数的量喂给哺乳动物。使用本发明的进一步方法，将类胡萝卜素-氧共聚物以有效减少泌乳哺乳动物的生理应激的量喂给泌乳哺乳动物。使用本发明的其他方法，将类胡萝卜素-氧共聚物喂给哺乳动物，以改良哺乳动物繁殖性能并且增加后代健康。
[0047]
对于类胡萝卜素-氧共聚物，典型的剂量范围从每天约5μg/kg至约50mg/kg体重。理想的是，给哺乳动物每天喂食5μg/kg和5mg/kg体重之间或5μg/kg和0.5mg/kg体重之间的剂量。要施用的类胡萝卜素-氧共聚物的确切量可以取决于哺乳动物的物种、饮食和状态(例如，怀孕前、妊娠或泌乳)等变量，以及类胡萝卜素-氧共聚物是否与其他饲料补充剂组合。标准试验(诸如实例中描述的那些)可以用于优化类胡萝卜素-氧共聚物的剂量和剂量频率。
[0048]
动物饲料
[0049]
本发明的动物饲料可以含有有效减少哺乳动物初乳或奶中细菌计数或减少鸟类蛋细菌计数的量的类胡萝卜素-氧共聚物。本发明的动物饲料可以含有有效改良哺乳动物后代健康和/或改良哺乳动物的繁殖性能的量的类胡萝卜素-氧共聚物。本发明的动物饲料可以含有有效减少泌乳哺乳动物的生理应激的量的类胡萝卜素-氧共聚物。
[0050]
通常按照行业标准将动物饲料配制以提供营养。可以由各种不同的饲料成分配制饲料，这些成分是根据市场价格和可用性选择的。因此，饲料的某些组分可能会随着时间而变化。有关动物饲料配方和nrc指南的讨论，请参见church,livestock feeds and feeding[牲畜饲料和喂食],o&b books,inc.,科瓦利斯市,俄勒冈州(1984)和feeds and nutrition digest[饲料和营养文摘],ensminger,oldfield和heineman编辑,ensminger publishing corporation,克洛维斯,加利福尼亚州(1990)，其中每个通过引用并入本文。
[0051]
传统上基于蛋白质和能量需求对猪和其他动物饲料进行平衡，如果需要满足其他需求则进行调整，这些需求将因哺乳动物的不同生长阶段(例如，怀孕前、妊娠或泌乳)和哺乳动物的维持而变化。在某些喂食情况下，必须注意提供适当的氨基酸以及整体蛋白质含量。例如，喂食大量玉米的猪必须在饲料中提供足够的赖氨酸。在大多数哺乳动物饮食中，谷物中的淀粉都满足能量需求。也可以通过向饲料添加脂肪来满足能量需求。含有类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料也可以配制用于牛、马、狗、猫、绵羊、和鸟类等。
[0052]
可以根据需要向动物饲料添加其他成分，以促进哺乳动物健康和生长。成分包括但不限于糖、复合碳水化合物、氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和半胱氨酸等)、维生素(例如，硫胺、核黄素、吡哆醇、烟酸、烟酰胺、肌醇、氯化胆碱、泛酸钙、生物素、叶酸、抗坏血酸和维生素a、b、k、d、e等)、矿物质、蛋白质(例如，肉粉、鱼粉、液体或粉末鸡蛋、鱼可溶性物、乳清蛋白浓缩物)、油(例如，大豆油)、玉米淀粉、钙、无机磷酸盐、硫酸铜、和氯化钠。本领域已知的任何药物成分也可以添加到动物饲料中，包括但不限于抗生素和激素。有关动物饲料的维生素、矿物质和抗生素补充，请参见church,livestock feeds and feeding[牲畜饲料和喂食],o&b books公司,俄勒冈州科瓦利斯市(1984)。
[0053]
根据本发明可以使用本领域已知的任何动物饲料混合物，包括但不限于牧草，诸如果园草、梯牧草、高羊茅、黑麦草、苜蓿、红豆草、三叶草和野豌豆；谷物饲料，诸如玉米、小麦、大麦高粱、小黑麦、黑麦、卡诺拉油菜和大豆、作物残渣、谷物、豆类副产品和其他农业副产品。在要处理或保存所得到的饲料的情况下，在加工或保存之前，可以用类胡萝卜素-氧共聚物处理饲料。理想的是，本发明的动物饲料包括菜籽粕、棉籽粕、大豆粕、或玉米粕。
[0054]
加工可包括干燥、青贮、切碎、颗粒化、切片、打包、轧制、回火、研磨、裂化、爆裂、挤压、微粉化、烘烤、剥落、烹饪、和/或爆破。例如，通过首先混合进料组分，然后利用热和压力通过模具压实和挤出饲料组分，从而产生颗粒化饲料。本发明的动物饲料可以如下所述颗粒化，例如，macbain,pelleting animal feed[动物饲料颗粒化],american feed manufacturers association[美国饲料制造商协会],阿灵顿,弗吉尼亚州(1974)，通过引用并入本文。
[0055]
在怀孕前、妊娠和/或泌乳期期间补充饮食
[0056]
本发明的方法(例如，用包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料喂食哺乳动物)可以用于改良妊娠或泌乳哺乳动物的健康和福祉。补充即将怀孕、正在妊娠和/或泌乳的哺乳动物的饮食的优点包括：(i)改善亚临床乳腺炎的一种或多种症状；(ii)减少亚临床乳腺炎进展为完全临床乳腺炎的频率；(iii)减少该哺乳动物初乳或奶中的细菌计数；(iv)减少该哺乳动物的生理应激；(v)改良该哺乳动物的繁殖性能；和(vi)改良该哺乳动物后代健康。
[0057]
改善亚临床乳腺炎症状
[0058]
本发明的特征在于一种改善泌乳哺乳动物亚临床乳腺炎的一种或多种症状的方法，其中该方法包括任选地在该哺乳动物泌乳期间，给该哺乳动物喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料。例如，本发明的方法可用于治疗患有亚临床乳腺炎的哺乳动物，增加哺乳动物奶产生和/或改良哺乳动物奶产生质量。
[0059]
减少亚临床乳腺炎进展为完全临床乳腺炎
[0060]
本发明的特征在于一种减少泌乳哺乳动物中亚临床乳腺炎进展为完全临床乳腺炎的频率的方法，其中该方法包括任选地在该哺乳动物泌乳期间，给该哺乳动物喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料。例如，本发明的方法可以用于治疗患有亚临床乳腺炎的哺乳动物，将亚临床乳腺炎进展为完全临床乳腺炎的风险降低20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或更多。
[0061]
减少生理应激
[0062]
本发明的特征在于一种减少泌乳哺乳动物的生理应激的方法，其中该方法包括在该哺乳动物泌乳期间给该哺乳动物喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料。泌乳导致哺乳动物的生理应激(例如，体重减轻)。减少泌乳哺乳动物的生理应激增加了哺乳动物的健康和福祉。在一个实例中，通过母猪的背部脂肪厚度(例如，背部脂肪的mm)监测泌乳母猪的生理应激。
[0063]
改良繁殖性能并且改良后代健康
[0064]
本发明的特征在于一种在哺乳动物生下后代后改良该哺乳动物的繁殖性能的方法，其中该方法包括在该哺乳动物泌乳期间给该哺乳动物喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料。通过断奶后哺乳动物恢复发情的速度、出生时小于正常的后代数量、
或每窝后代数量来测量繁殖性能。
[0065]
例如，对于母猪而言，改良繁殖性能是指母猪在断奶后7天(例如，6天、5天、4天、3天、2天、或1天)内恢复发情。还通过出生时弱仔猪数量和每窝仔猪总数来测量繁殖性能。出生时弱仔猪是出生时体重《0.7kg的仔猪。后代的死亡率也表明了繁殖性能。后代可以是活胎或死胎。
[0066]
减少奶中的细菌计数
[0067]
本发明的特征在于一种减少哺乳动物初乳或奶中的细菌计数的方法，其中该方法包括给该哺乳动物喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料。降低奶中的总细菌计数可以增加奶的保质期。
[0068]
巴氏杀菌奶的补充饮食
[0069]
本发明的特征进一步在于一种从哺乳动物生产巴氏杀菌奶的方法，其中给该哺乳动物喂食包含有效量的类胡萝卜素-氧共聚物的动物饲料，并且使用低温巴氏杀菌工艺加工该奶。
[0070]
奶是细菌生长的绝佳媒介。奶的巴氏杀菌典型地包括在高温(例如，70℃至75℃)下加热奶约15秒(例如，约5秒、约10秒、约20秒、约25秒、或约30秒)。低温巴氏杀菌是在低温(例如，55℃至65℃)下加热奶的过程。在低温巴氏杀菌中，将奶加热约20分钟(例如，约10分钟、约15分钟、约25分钟、或约30分钟)。
[0071]
与生奶相比，巴氏杀菌奶增加了奶的安全性并且增加了奶的保质期。
[0072]
实例
[0073]
提出以下实例向本领域普通技术人员提供可以如何使用、制造以及评价本文所述的组合物和方法的描述，并且旨在纯粹是本发明的示例，而非旨在限制本发明人认为的本发明的范围。
[0074]
实例1.经产母猪妊娠和泌乳期间饮食oxbc的影响
[0075]
进行了以下实例，以调查在经产母猪妊娠和泌乳期间饮食oxbc补充对生产力和免疫状态的影响。
[0076]
材料
[0077]
妊娠或泌乳母猪
[0078]
在妊娠第85天，总共150头经产母猪(landrace
×
yorkshire)，范围从第3胎到第8胎，根据胎次、历史繁殖性能和预计分娩日期随机分配到3个饮食治疗，每个治疗50头母猪。对照组(ctr1)的动物接受了基础饮食，没有补充剂；低剂量oxbc组(s1)的动物接受了补充4mg/kg oxbc的基础饮食；以及高剂量oxbc组(s2)的动物接受了补充8mg/kg oxbc的基础饮食。3种实验饮食没有一个补充药物。喂食试验从妊娠第85天到泌乳第21天(断奶)进行。
[0079]
断奶后7天，记录泌乳母猪的体重增加和发情率。在妊娠第85天和第110天以及泌乳第21天，用母猪背部脂肪测量仪(瑞恩(renco)，美国)测量母猪的背部脂肪厚度。还记录了泌乳期间母猪的平均每日饲料摄入量。
[0080]
饮食
[0081]
为满足或超过妊娠和泌乳母猪的nrc(2012)要求而配制的基础商业化玉米-大豆粕饮食(表1)用作治疗组1的基础饮食(对照饮食)。对于治疗组2和3，将oxbc分别以4ppm或8ppm添加到基础饮食中。通过饲料施用的oxbc是商业预混物产品oxc-βtm牲畜10％。将oxbc
以玉米为代价添加到基础饮食中。从妊娠第85天至第112天，母猪都被圈养在妊娠栏(gestation stall)中，并且每天提供3.0kg的饲料。在产前2天，母猪被运送到产仔箱，并且被随意喂食，直到泌乳第21天断奶。
[0082]
表1.基础饮食的组成
[0083][0084]
*
预混物每千克饮食提供以下：va(维生素a)12000iu、vd(维生素d)3000iu、ve(维生素e)90iu、vk(维生素k)4.0mg、vb1(维生素b1)3.0mg、vb2(维生素b2)10mg、vb6(维生素b6)4mg、vb
12
(维生素b
12
)40μg、烟酸40mg、泛酸20mg、叶酸4mg、生物素0.45mg；cu(硫酸铜)125mg、fe(硫酸亚铁)150mg、i(碘酸钙)0.25mg、zn(硫酸锌)100mg、mn(硫酸锰)40mg、se(亚硒酸钠)0.25mg。
[0085]
表2.基础饮食的营养含量
[0086]
营养计算水平de(可消化能)3420kcal/kgcp(粗蛋白)17.9％ca(钙)1.02％总磷0.79％可用的磷0.55％盐(氯化钠)0.41％lys(赖氨酸)0.96％met(蛋氨酸)+cys(半胱氨酸)0.57％thr(苏氨酸)0.66％trp(色氨酸)0.23％
[0087]
方法
[0088]
统计分析
[0089]
对于实验数据，除母猪发情率外，使用spss 21.0(spss公司，芝加哥市，伊利诺伊州，美国)的单向方差分析程序确定治疗之间是否存在显著差异。当发现总体差异时，使用lsd多范围检验来确定平均值之间的差异。使用卡方检验分析母猪发情率。结果表示为平均值和sem，但母猪发情率以百分比表示。
[0090]
概率《0.05被认为是显著的，概率》0.05并且《0.10被认为是治疗之间的趋势。
[0091]
母猪生产力-后代
[0092]
从分娩(出生)到断奶测量并记录后代的以下标准：出生数量(总正常活后代(出生体重大于0.7kg；无出生缺陷)、死胎、木乃伊胎、弱活后代(出生体重小于0.7kg；无出生缺陷)、或活畸形后代(一种或多种出生缺陷)。记录每个单独仔猪的出生体重，并且计算每窝仔猪的平均出生体重。还记录了断奶仔猪数量、断奶前仔猪存活率和仔猪腹泻率。
[0093]
在断奶时(泌乳第21天)，记录断奶仔猪数量、腹泻发生率和每个单独仔猪体重。还测量了每窝仔猪平均体重、仔猪平均每日增重、和仔猪存活率。
[0094]
血液样品
[0095]
从来自每种饮食治疗的10头母猪(n＝10)的子集中收集血液样品。随机选择母猪，在性交后85天，以及产后0天、14天和21天通过耳静脉穿刺收集血液(10ml)。在每个时间段对相同子集母猪进行放血。
[0096]
在所有4个时间点(性交后85天(“妊娠第85天”)和产后0天(“泌乳第0天”)、14天(“泌乳第14天”)和21天(“泌乳第21天”)处理母猪血液获得白细胞吞噬活性。使用流式细胞仪使用吞噬测试试剂盒并且按照以下的程序测定白细胞吞噬活性：leonard等人,effect of maternal fish oil and seaweed extract supplementation on colostrum and milk composition,humoral immune response,and performance of suckled piglets[补充母体鱼油和海藻提取物对初乳和奶成分、体液免疫反应、和哺乳仔猪性能的影响].journal of animal science[动物科学杂志],88,2988-2997(2010)。
[0097]
初乳和奶样品
[0098]
从选择用于血样血液取样收集的相同母猪收集初乳和奶。肌肉内注射20iu催产素后，产后12小时内、泌乳第14天和泌乳第18天，从功能性腺体收集初乳。每次收集大约30ml。评估泌乳第14天的初乳和奶的体细胞计数、营养成分、免疫球蛋白水平、和细胞因子水平。使用流式细胞仪(赛默飞世尔(thermo fisher)，美国)测量初乳和奶中体细胞计数。
[0099]
通过gc-ms测量泌乳第18天奶中oxbc含量。在泌乳第14天，通过elisa测量初乳和奶中的scd14(可溶性cd14)、细胞因子(tnfα、il-8、il-18)、白三烯b4、igm、iga、和igg水平。
[0100]
还测定了初乳和奶的营养成分，包括脂肪、蛋白质和乳糖。
[0101]
结果
[0102]
妊娠或泌乳母猪
[0103]
泌乳期间平均每日饲料摄入量、妊娠第110天和泌乳第21天的背部脂肪厚度、和泌乳期间背部脂肪厚度减少在治疗之间没有统计学显著差异(表3)。然而，adfi和背部脂肪厚度都存在剂量依赖性趋势。在整个喂食期间，在母猪中没有发现食欲不足和临床疾病的迹象。
[0104]
表3.经产母猪的妊娠晚期和泌乳期间饮食oxbc补充对哺乳期间饲料摄入量和母猪背脂肪厚度的影响
[0105][0106][0107]
母猪生产力-后代
[0108]
出生和发情率
[0109]
oxbc治疗不影响每窝出生、活产、死产和木乃伊以及畸形仔猪总数。相比对照组ctr1，有较少的弱仔猪和增加的每窝出生体重的趋势，并且s1和s2组发情率趋势分别高5％和6％。
[0110]
表4.经产母猪的妊娠晚期和泌乳期间饮食oxbc补充对后代的影响
[0111] ctr1s1s2p值母猪总数505050 每窝总出生数11.40
±
0.3711.48
±
0.3111.25
±
0.330.907每窝活产仔数10.60
±
0.3310.55
±
0.2810.58
±
0.330.995每窝弱仔猪**数0.40
±
0.100.35
±
0.080.27
±
0.090.689每窝死胎和木乃伊胎数0.67
±
0.160.77
±
0.170.56
±
0.140.630每窝畸形仔猪数0.12
±
0.050.16
±
0.070.17
±
0.070.852初生窝重，kg16.45
±
0.4617.10
±
0.3516.97
±
0.530.580个体出生体重，kg1.47
±
0.031.51
±
0.031.53
±
0.030.421断奶后7天内母猪发情率(％)85.790.791.70.886
[0112]
**弱仔猪是指出生时《0.70kg的仔猪。
[0113]
断奶
[0114]
表5显示了饮食oxbc补充有助于提高断奶时的窝重和仔猪个体重量，增加断奶前存活率并且降低腹泻率。
[0115]
表5.经产母猪的妊娠晚期和泌乳期间饮食oxbc补充对后代的影响
[0116][0117][0118]
血液样品
[0119]
如表6所述，母猪全血中的中性粒细胞吞噬活性不受饮食oxbc补充的影响。
[0120]
无论饮食治疗如何，中性粒细胞吞噬活性在妊娠第85天最高，在分娩时降至最低，并且在泌乳第14天和泌乳第21天反弹至较高值。
[0121]
表6.经产母猪的妊娠晚期和泌乳期间饮食oxbc补充对母猪全血中性粒细胞吞噬活性的影响
[0122] ctr1s1s2p值母猪总数101010 妊娠第85天91.14
±
1.9690.88
±
2.8690.35
±
1.180.849分娩70.40
±
2.9775.08
±
2.8874.87
±
2.160.404泌乳第14天80.34
±
3.4380.67
±
3.3883.39
±
3.190.477泌乳第21天84.80
±
2.7485.41
±
2.1886.40
±
1.660.879
[0123]
初乳和奶样品
[0124]
体细胞计数(scc)
[0125]
如表7和表8所述，尽管经产母猪的初乳和奶中营养成分和体细胞计数(scc)的差异并没有上升到统计学显著的高度，但仍有增加％脂肪和降低scc的趋势。在泌乳第14天，随着饮食oxbc水平增加，奶中乳糖浓度有增加的趋势(p＝0.071)。
[0126]
表7.经产母猪的妊娠晚期和泌乳期间饮食oxbc补充对母猪初乳营养成分和体细胞计数(scc)的影响
[0127]
[0128][0129]
表8.经产母猪的妊娠晚期和泌乳期间饮食oxbc补充对母猪第14天奶营养成分和体细胞计数(scc)的影响
[0130] ctr1s1s2p值母猪总数101010 脂肪，％4.96
±
0.405.64
±
0.315.30
±
0.160.300固体脂肪，％11.40
±
0.3210.81
±
0.2511.10
±
0.230.195蛋白质，％3.86
±
0.104.02
±
0.114.13
±
0.080.173乳糖，％5.67
±
0.135.93
±
0.126.09
±
0.110.071scc，
×
106/ml4.03
±
0.303.52
±
0.333.34
±
0.320.300
[0131]
免疫球蛋白水平
[0132]
表9和表10显示了妊娠晚期和泌乳期间饮食oxbc补充对经产母猪初乳和奶中免疫球蛋白浓度的影响。在泌乳第14天oxbc补充饮食显著提高了初乳免疫球蛋白水平，包括奶中igm、iga和igg(p《0.05)，以及igm(p《0.05)和igg水平(p＝0.052)。关于剂量反应，s2组在泌乳第14天初乳中的igm、iga和igg水平和泌乳第14天奶中的igg和igm水平高于s1组。
[0133]
表9.经产母猪的妊娠晚期和泌乳期间饮食oxbc补充对母猪泌乳第14天初乳免疫球蛋白水平的影响
[0134] ctr1s1s2p值母猪总数101010 igm，mg/ml2.55
±
0.35b4.38
±
0.52a4.52
±
0.42a0.005iga，mg/ml2.39
±
029b4.34
±
0.40a5.11
±
0.52a0.001igg，mg/ml26.91
±
2.09b28.97
±
1.89
ab
33.22
±
1.62a0.024
[0135]
表10.经产母猪的妊娠晚期和泌乳期间饮食oxbc补充对母猪第14天奶免疫球蛋白水平的影响
[0136] ctr1s1s2p值母猪总数101010 igm，mg/ml0.024
±
0.005b0.051
±
0.010a0.057
±
0.011a0.023iga，mg/ml0.26
±
0.060.34
±
0.070.29
±
0.080.764igg，mg/ml1.26
±
0.121.70
±
0.292.02
±
0.300.052
[0137]
细胞因子水平
[0138]
如表11和表12所示，妊娠晚期和泌乳期间饮食oxbc补充降低了初乳中的tnf-α和il8水平，以及奶中的tnf-α和il18水平(p《0.05)，而在泌乳第14天，其倾向于增加奶中的scd14水平(p＝0.055)。关于剂量反应，与喂食4mg/kg oxbc饲料的母猪相比，喂食8mg/kg的
oxbc饮食的母猪在泌乳第14天的初乳中tnf-α、il8水平在数量上降低，奶中tnf-α水平降低，并且奶中scd14水平增加，但两个oxbc治疗组之间的这些指标没有统计学差异(p》0.05)。
[0139]
表11.经产母猪的妊娠晚期和泌乳期间饮食oxbc补充对母猪初乳细胞因子水平的影响
[0140] ctr1s1s2p值母猪总数101010 tnf-α，ng/ml0.34
±
0.13a0.10
±
0.03b0.08
±
0.02b0.044il8，pg/ml1079.06
±
113.80a982.27
±
68.81
ab
605.46
±
67b0.001il18，pg/ml97.39
±
14.25109.09
±
7.0878.52
±
16.820.338scd14，ng/ml15.36
±
1.3518.90
±
2.6725.43
±
9.350.185ltb4，ng/ml1.40
±
0.360.98
±
0.151.10
±
0.350.498
[0141]
表12.经产母猪的妊娠晚期和泌乳期间饮食oxbc补充对母猪奶细胞因子水平的影响
[0142][0143][0144]
oxbc水平
[0145]
通过测量葛让酸含量测量oxbc含量。在泌乳第18天，收集了10头母猪/治疗的30ml奶/母猪。然而，葛让酸测量的最低奶需求为200ml。因此，混合了来自10头母猪的相同体积(20ml)以获得足够的体积(200ml)进行单个测量。ctr1组、s1组和s2组奶中的葛让酸含量分别为5.99ng/ml、7.69ng/ml、和11.02ng/ml。ctr1、s1和s2组奶中oxbc含量的相应计算水平分别为0.30mg/ml、0.38mg/ml、和0.55mg/ml。
[0146]
结论
[0147]
在整个喂食期间，在母猪没有发现食欲不振和临床疾病的迹象。断奶时的窝重和仔猪个体重量增加，表明妊娠晚期和泌乳期间oxbc补充饮食提高了经产母猪的泌乳性能。改良的机制可以通过改良的免疫球蛋白水平和初乳和奶的促炎因子水平降低来解释。因此，妊娠晚期和泌乳期间的饮食oxbc补充对经产母猪的免疫状态显示出有益的影响，这将支持其哺育后代的健康。
[0148]
实例2.饮食oxbc对泌乳奶牛的乳腺炎治疗的影响
[0149]
进行了以下研究，以调查饮食oxbc补充预防或减少奶牛的乳腺炎的能力。
[0150]
材料
[0151]
选择三十头患有临床乳腺炎的泌乳荷斯坦奶牛(体重：655.3
±
81.9kg)进行试验。在开始试验之前，使母牛适应10天，以便有足够的时间确定基线体细胞计数(scc)。将母牛平等地分到三个饮食治疗组之一(每个治疗组10只动物)：对照、低剂量oxbc、和高剂量oxbc。
[0152]
每个治疗组的基础饮食是全混合日粮(tmr)。对照组(ctr2)的动物接受了基础饮食，没有补充剂或药物；低剂量oxbc组(t1)的动物接受了补充30ppm oxbc的基础饮食；以及高剂量oxbc组(t2)的动物接受了补充60ppm oxbc的基础饮食。研究期持续45天，包括10天的适应期。
[0153]
方法
[0154]
每头母牛都有耳标以识别。所有动物均按照农场的标准操作程序(sop)进行管理，包括疫苗接种、健康干预、饮食配方和饲料来源。
[0155]
评估标准包括以下内容：每天测定各组动物的干物质摄入量(dmi)；每2天记录每只动物产奶的总重量(kg)(奶产量)；以及测量每周从每只动物收集的奶样品的体细胞计数(scc)、细菌总数(tbc)、和蛋白质、脂肪和乳糖含量。
[0156]
对获得的数据进行sas的glm程序(版本9.4；赛仕软件研究所(sas institute)，美国)。duncan显著差异检验程序用于确定平均值之间的差异。在p≤0.05宣称有显著性。
[0157]
结果
[0158]
干物质摄入量(dmi)
[0159]
ctr2组的dmi为18.48千克/天，而t1组和t2组的dmi分别为17.96千克/天和18.07千克/天。
[0160]
奶产生
[0161]
如图2所示，ctr2组和t1组或t2组之间没有观察到显著差异。从第5天至第25天，奶产生略有增加。然而，奶产生从第27天降低。
[0162]
奶中脂肪、蛋白质和乳糖。体细胞计数(scc)。
[0163]
表13示出了oxbc对奶中脂肪、蛋白质和乳糖的量以及体细胞计数(scc)的影响。除第28天和第35天的蛋白质含量(p《0.05)外，三组(ctr2、t1、和t2)之间未观察到显著差异(p》0.05)。t1组的乳蛋白含量高于ctr2组和t2组。尽管各组间无统计学显著差异，但t1组的scc倾向于低于ctr2和t2组。
[0164]
表13.oxbc对奶含量和scc的影响。
[0165]
天含量ctr2t1t2semp值0脂肪，％4.834.965.030.520.960蛋白质，％3.693.523.490.160.620乳糖，％4.514.814.660.130.260scc，
×
1000/ml38404050400911520.997脂肪，％3.843.683.320.440.667蛋白质，％3.813.643.440.140.177乳糖，％4.664.914.940.090.067scc，
×
1000/ml26071659246110220.7514脂肪，％4.424.333.790.390.47
biotechnology[生物技术趋势],27,486-493)。
[0175]
总之，补充30ppm oxbc可显著提高乳蛋白含量，并且导致奶scc降低，而补充60ppm的oxbc对scc无显著影响。此外，补充30ppm和60ppm oxbc均减少了奶的tbc。
[0176]
实例3-饮食oxbc对泌乳奶牛畜群中亚临床乳腺炎的治疗的影响
[0177]
进行了以下研究，以进一步调查饮食oxbc补充对治疗奶牛乳腺炎的能力。
[0178]
阴性对照干预研究
[0179]
该阴性对照干预研究是使用来自位于新西兰北岛的4个商业奶畜群来进行的。
[0180]
根据最近一次畜群(dhia)测试中scc》200,000个细胞/毫升并且在采样前14天内没有使用抗微生物剂或非甾体类抗炎药治疗的记录来选择母牛。检查了母牛的乳头末端，并且从每个单独四分体收集了用于细菌学和scc测定的奶样品。
[0181]
scc》200,000个细胞/毫升并且从中分离出细菌的四分体入组。将母牛按年龄(2岁与》2岁)分段，按畜群测试scc进行排序，然后在连续成对的母牛中随机分配喂食0.5kg颗粒化谷基饲料，该饲料包含或不包含3g oxbc预混物。本研究中使用的oxbc是商业产品oxc-β
tm
牲畜10％。牧主每天评估母牛，对临床乳腺炎症状明显的母牛进行微生物学培养取样，并且按照正常农场方案进行治疗。在治疗开始后21和42天，对入组四分体进行细菌学和scc重新取样。
[0182]
与对照喂食的母牛相比，在母牛饮食中以oxc-β
tm
牲畜10％的形式掺入oxbc 42天增加了细菌治愈率(例如，消退亚临床乳腺炎并且减少临床乳腺病的风险)。这些影响被解释为补充oxbc的母牛的免疫功能改良的结果。通过补充oxbc提供足够水平的免疫支持β-胡萝卜素共聚物有助于免疫系统在oxbc组中以最佳水平发挥作用。再次注意到，oxbc已被证明没有抗微生物活性，因此细菌感染数量的减少并不是由于产品的任何直接抗微生物活性引起的。
[0183]
材料和方法
[0184]
动物阶段的开始
[0185]
动物的选择和取样发生在畜群测试后6天和15天之间。一旦获得微生物学和scc结果，就开始喂食，并且将母牛分配给治疗。
[0186]
动物
[0187]
每头母牛都由一个单独的管理编号(“母牛编号”)进行识别，该编号在每个畜群中都是唯一的。通过塑料耳标进行识别。此外，所有研究动物均具有终身身份和电子识别(eid)标签。不需要适应环境。母牛接受在畜群中实施的正常预防性健康计划。表15显示了研究中母牛的纳入标准。
[0188]
表15.纳入标准
[0189][0190]
畜群
[0191]
畜群基于以下入组：
[0192]
■
存在个体母牛识别系统，并且愿意允许电子访问母牛记录；
[0193]
■
愿意遵循实验方案；
[0194]
■
畜群测试(dhia)数据可用；以及
[0195]
■
愿意记录所有动物健康事件(代谢紊乱、乳腺炎、跛行、胎盘滞留、和子宫感染)以及动物健康治疗的细节。
[0196]
动物环境、喂食和管理
[0197]
这些母牛是在新西兰乳业管理系统上进行管理的，即在牧场上管理，而不是圈养。母牛主要被喂食黑麦草/白三叶草牧场草地。补充喂食是由牧主或管理者酌情决定的，但是两个治疗组中的母牛的管理方式使他们可以平等地获得任何补充饲料(参见表17)。水可以随意使用。
[0198]
图3给出了研究期间ruakura气象站(lat-37.7739，长175.3052)的日最高和最低温度以及24小时降雨量。该数据来自niwa(美国国家水与大气研究所(national instituted of water and atmospheric research))。
[0199]
母牛受到畜群正常的饲养、健康和管理实践的约束，但伴随疗法与上面和下面确定的疗法一致的情况除外。母牛被分组管理，母牛未入组研究。该研究中入组母牛按照研究地点的正常实践挤奶，每天两次。
[0200]
研究结束时，研究中的所有母牛都保留在原始畜群中。
[0201]
程序
[0202]
牧主和工作人员对动物被分配的治疗组是致盲的。技术人员每天到农场进行治疗喂食，治疗饲料用颜色编码，并且没有按治疗类型标记。农场治疗表同样地进行颜色编码。因此，提供饲料的技术人员、牧主或他们的工作人员都不知道治疗分配。
[0203]
样品被分配了一个唯一的标识符，使得实验室工作人员(lic，cognosco)不知道动物的身份或治疗组。
[0204]
临床乳腺炎的诊断由农场主、管理者和/或工作人员负责。由于这些个体是致盲的，临床乳腺炎诊断不应出现偏差。
[0205]
在畜群中，将母牛按年龄(2岁或》2岁)分段，按先前的畜群测试scc进行排序，然后随机分配到2个治疗组。
[0206]
母牛数据通过从电子数据库(mindapro，lic，纽斯泰德，汉密尔顿，新西兰)下载数据并且加载到专用数据库(access，微软，华盛顿州，美国)中来获得。随机化后，创建了起草用于初步取样的母牛清单，并且提供给牧主/管理者。
[0207]
这些母牛被交给经过训练的研究技术人员，并且评估了乳头末端评分(mein等人,evaluation of bovine teat condition in commercial dairy herds:1.non-infectious factors[对商业奶畜群中牛乳头状况的评估：1.非感染性因素].(2001))。在此时间点排除了那些具有严重乳头末端损伤的动物(评分＝“非常粗糙”)。此外，评估了抗微生物剂和nsaid治疗的电子和农场记录，并且排除了前14天治疗的任何母牛。
[0208]
初步取样
[0209]
在无菌乳头末端准备后，从每个四分体的每头选定母牛收集两份奶样品(约5ml和约25ml)。这些样品在4℃下保存，并且在收集后24小时内进行微生物学处理，并且在收集后72小时内提交四分体水平scc测定。
[0210]
确认有一个或多个四分体感染的母牛(即存在公认的细菌乳房内感染且四分体水平scc》200,000个细胞/毫升)被纳入研究中，并且随机分配给上述治疗。
[0211]
治疗
[0212]
分配给oxbc组的母牛每天喂食约0.5kg的含有oxbc的谷物浓缩物颗粒持续42天。对照组每天喂食约0.5kg不含oxbc的谷物浓缩物持续42天。
[0213]
谷物浓缩物颗粒由商业饲料厂(seales winslow，莫林斯维尔，新西兰)配制和混合。该颗粒含有25％小麦、25％玉米、30％棕榈粕、8％布罗尔(broll)、4％干酒糟、8％糖蜜、和0.02％甜味剂(鲁玛甜(rumasweet))。治疗饮食包括0.6％的oxc-β
tm
牲畜10％预混物。因此，给治疗动物每天每头母牛喂食大约3g oxc-β
tm
牲畜10％商品，相当于每头母牛每天0.3g oxbc活性物。
[0214]
通过将适当的饲料类型放入挤奶室中的个体母牛饲料箱中进行喂食。这是由研究技术人员每天访问每个农场时进行的。饲料是用一个接在柱子上的量筒运送的，这样技术人员就可以在挤奶室中站在母牛后面，将饲料运送到母牛前面的饲料槽中。为了便于识别研究动物，用两种不同颜色的“尾漆”标记母牛，这两种颜色对应于饲料类型。在喂食的每一天，分别记录喂食给每只入组动物的饲料运送。此外，还记录了对每只动物是否消耗饲料和未消耗饲料的目视评估。通过在每天喂食之前和之后称量饲料袋，计算每个畜群中每天运送给每组的饲料质量，以反复核对是否运送了适当的饲料质量。表16给出了饲料的每日摄入量的估计平均值(
±
标准差(sd))。
[0215]
表16.以千克/母牛/天提供对照和含有oxbc的乳制品颗粒的每日平均量(喂食时)
[0216][0217]
取样后程序和观察
[0218]
在开始治疗后的第21天和第42天，在针对微生物学和scc进行无菌乳头末端准备后，从每个入组四分体收集四分体水平奶样品。
[0219]
微生物学由莫林斯维尔anexafvc的经过训练的技术人员进行。根据美国国家乳腺炎委员会(national mastitis council,usa)推荐的程序进行微生物学。简而言之，将10μl奶涂在含有0.1％菊粉(fort richard，奥克兰，新西兰)的5％血琼脂板的四分体上，并且在37℃下孵育48小时。
[0220]
基于菌落形态、革兰氏染色和过氧化氢酶反应确定细菌属。用凝结酶试验测试了革兰氏阳性、过氧化氢酶阳性分离株，以将cns与金黄色葡萄球菌(s.aureus)区分开。通过七叶苷反应、camp测试以及在菊粉和sf肉汤中的生长评估革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性。在macconkeys琼脂、三铁糖、柠檬酸盐上对大肠菌群进行传代培养，并进行运动性测试。如果使用常规的生化测试不清楚分离株的身份，则提交分离株进行maldi tof测试。使用从专用数据库中生成的唯一样品标识号来识别样品。
[0221]
在某些情况下，从奶样品中分离出2种不同的细菌物种。这些是单独报告的，并且用于分析新的乳房内感染率。然而，在报告中，当与次要病原体(例如，凝固酶阴性葡萄球菌(staphylococcus)(cns)或棒状杆菌属(corynebacterium)物种)结合分离时，它们被编码为混合主要感染(即，主要病原体(例如，金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、乳房链球菌(streptococcus uberis)、停乳链球菌(streptococcus dysgalactiae))，或在存在2种不同的次要病原体的情况下，被编码为混合次要感染。
[0222]
在lic实验室(riverlea，哈密尔顿)使用荧光光学方法(foss，希勒罗德，丹麦)测定scc。结果被转发给cognosco，作为逗号分隔变量(csv)文件，这些文件已加载到专用数据库中
[0223]
研究期间没有发生不良事件。正如预期的那样，如下所述，在研究过程中对许多动物进行了临床疾病的治疗(例如，乳腺炎和跛行)。在研究过程中，没有动物表现出全身性疾病，因此任何入组动物都没有发生其他兽医访问。
[0224]
研究期间伴随疗法
[0225]
在动物福利被认为有风险的情况下施用含有抗生素或非甾体抗炎药(nsaid)的产品。记录所有治疗的原因和类型。评估每种治疗对研究结果的影响。
[0226]
在研究期间，没有入组动物死亡或安乐死，因此没有进行尸检。
[0227]
从研究中去除母牛的原因
[0228]
开始喂食后第35天，一头母牛在挤奶过程中受伤。由于这种伤害，在研究的第35天
和第42天之间，这头母牛无法被带到挤奶室。因此，这头母牛在这段时间内没有被喂食适当的饲料，在并且在第42天没有取样。无法确定该母牛的四分体的细菌学和scc，并且该母牛被排除在最终分析之外。
[0229]
结果
[0230]
这项研究的实验单元是四分体。
[0231]
基于在先前的畜群测试中scc升高，总共选择了267头母牛进行初步评估和取样。其中，227头进行奶取样。其余的40头没有取样，因为它们已经被剔除、没有出现、在初步评估时被诊断患有临床乳腺炎、或者乳头末端很粗糙。七十一头母牛没有符合四分体水平入组标准的四分体(即，四分体水平scc》200,000个细胞/毫升并且培养时存在细菌)，并且没有入组。因此，156头母牛的一个或多个四分体符合入组标准，并且在年龄分段后被分配给饲料治疗。
[0232]
分别有77头与79头母牛以及135个四分体与129个四分体被分配给对照和治疗喂养组(表17)。最初取样后，但在开始喂食前，三头母牛被诊断患有临床乳腺炎。在开始喂食之前，这些母牛被排除在研究之外。
[0233]
两头母牛在入组后用全身性抗微生物剂治疗跛行(一头在治疗组，一头在对照组，两头都只有一个入组四分体)。入组后，共有5头母牛和7个四分体被诊断患有临床乳腺炎：来自对照组的4头母牛和6个四分体；和来自治疗组的1头母牛和1个四分体。
[0234]
表17.被选择并且入组研究评估的母牛的宿命口服补充oxbc对治疗亚临床乳腺炎的影响
[0235][0236]
结果变量
[0237]
关键结果变量是细菌治愈率。细菌治愈率被定义为在开始治疗前存在的细菌未从d 21或d 42样品中分离出来的情况下发生的。细菌治愈被定义为即使在治疗后取样时识别出不同细菌物种也会发生。在开始喂食42天内被诊断患有临床乳腺炎的入组四分体被定义
为细菌治愈率失败。在四分体的奶样品被定义为受污染(n＝3)时，或者在由于动物未出现而未采集样品(n＝1)时，则无法定义四分体治疗后的状态，并且因此细菌治愈被编码为空。
[0238]
还分析了四分体和母牛水平scc、奶产量、和临床乳腺炎发病率。
[0239]
统计设计和分析
[0240]
采用卡方分析针对分类变量评估分配给两个治疗组的动物的平衡，分类变量包括畜群、年龄组(分类为小母牛(初产)与母牛(经产))、品种(将≥12/16的荷兰牛分类为荷兰牛，否则为杂交牛或娟姗牛)、以及开始喂食时产奶天数(分类为15天-60天、61天-75天、76天-90天、≥91天))；以及开始喂食前的畜群测试中母牛水平scc自然对数的单向方差分析。
[0241]
多变量模型用于评估治疗效应(即，oxbc与无oxbc补充(对照))。建模过程中考虑了潜在的混杂变量，包括年龄(即初产与经产)、品种(荷兰牛与其他)、先前四分体水平scc、四分体位置(即后腺体与前腺体)、开始喂食时产奶天数(dim)以及乳房内感染类型(分类为主要与次要)。使用卡方分析(用于分类变量)或逻辑回归(对于连续变量)，对所测试的细菌治愈率的每个潜在的解释变量进行初步双变量分析。然后将那些相关的变量(p《0.2)用于手动正向逐步建模过程。在最终模型中保留的显著的(即p《0.05)或被去除的变量导致治疗组效应的系数变化超过20％。对于细菌治愈率，最终模型是混合效应二元逻辑回归模型，其中包括母牛作为随机效应。由于相对较少的母牛入组了多个四分体，试图创建3水平模型(即畜群中的母牛中的四分体)导致模型无法收敛。请注意，由于没有初产动物符合一个畜群的入组标准(speldhurst)，因此包括年龄在内的模型也无法收敛。因此，该变量从建模中删除。对于初步逻辑回归模型，使用hosmer lemeshow测试、链路测试以及通过在纳入/排除变量时评估bic的变化来评估模型拟合。数据报告为治疗效应的优势比(or)以及估计边际平均值和95％置信区间。
[0242]
四分体水平scc数据是在多水平重复测量广义线性回归建模之前转换的自然对数(ln)，该模型的腺体嵌套在牛群中嵌套的母牛中。固定效应包括治疗组和相对于喂食开始的天数(即d 0、21、42)。治疗与天数相互作用强制纳入模型。估计边际平均值来自最终模型，并且使用成对比较且使用bonferroni校正对治疗组的边际平均值和天进行配对比较。
[0243]
使用逻辑回归分析了开始喂食后42天内临床乳腺炎诊断的发生率，计算标准误差按畜群聚类。
[0244]
四分体水平scc还被记录为《200,000个细胞/毫升或≥200,000个细胞/毫升，然后使用多水平重复测量逻辑回归模型分析了该分类变量，该模型的腺体嵌套在畜群中嵌套的母牛中。固定效应包括治疗组和相对于喂食开始的天数(即d 21、42)。注：根据设计，研究中仅包括scc》200,000个细胞的四分体，因此根据定义，所有四分体的scc大于第0天。治疗与天数相互作用强制纳入模型。估计边际平均值来自最终模型，并且使用bonferroni校正对治疗组的边际平均值和天进行配对比较。
[0245]
使用多水平重复测量广义线性回归模型分析了来自临治疗开始前以及治疗期间或恰治疗期后下一次畜群测试的母牛复合(畜群测试)scc、奶产量(千克/母牛/天)和奶固体(即，乳脂和乳蛋白千克总和/母牛/天)。对scc进行自然对数转换以进行分析。固定效应包括治疗以及测试是在喂食开始之前还是之后。治疗与时间相互作用强制纳入模型。将其他解释性变量(例如，初产与经产；编码为荷兰牛与其他的品种；畜群测试中的dim)提供给模型，并且包括显著的(p《0.05)和/或导致治疗系数变化》20％的变量。估计边际平均值来
喂食时dim15-60d2024440.81 61-75d181937
ꢀꢀ
76-90262147
ꢀꢀ
91+d121325 [0256]
描述性微生物学
[0257]
在开始喂食前(第0天)和开始喂食后d 21和d 42，次要病原体(即cns和棒状杆菌属物种)是最常见的分离株(表21)。
[0258]
表20显示了按相对于开始喂食的天数计的分配给具有oxbc(对照)或含有添加的oxbc的补充饲料的母牛的四分体的细菌诊断。d 0是开始喂食前的四分体水平样品结果，而d 21和42是开始喂食后收集的样品。
[0259]
表20.细菌诊断
[0260][0261]1混合主要感染是主要病原体(即金黄色葡萄球菌、停乳链球菌或乳房链球菌)和次要病原体(即cns或棒状杆菌属物种)均可从中分离的奶样品
[0262]2混合次要感染是从中分离出两个次要病原体(即cns或棒状杆菌属物种)的奶样品
[0263]
细菌治愈率
[0264]
初步双变量模型发现细菌治愈率与治疗、年龄、dim、前后腺、畜群和四分体水平scc之间存在关联。品种和治疗前细菌学物种与细菌学治愈率在双变量水平上无关。
[0265]
在最终模型中，仅治疗组保留在模型中。与来自喂食对照饲料的母牛的四分体相比，喂食oxbc的母牛中有更多四分体经受细菌感染治愈(来自oxbc喂食与对照喂食的母牛的四分体分别为13.9(95％ ci 4.1-23.7)％和与6.9(95％ ci 4.8-9.1)％；p＝0.02；优势比＝2.18(95％ci 1.14-4.17))。
[0266]
四分体水平scc
[0267]
对于四分体水平ln scc，不存在治疗(p＝0.34)或天数(p＝0.12)的效应，也不存
在治疗与天数相互作用(p＝0.17)(图4和图5)。
[0268]
治疗(p＝0.56)或天(0.64)对scc《200,000个细胞/毫升的四分体比例没有影响。然而，存在治疗与天数相互作用(p＝0.05；图6)。已消退的四分体相对于未消退的四分体更多(9/52(17.3％)与43/463(9.3％))具有scc《200,000个细胞/毫升的趋势(p＝0.07)。
[0269]
临床乳腺炎发病率
[0270]
在开始喂食后42天内，喂食oxbc的母牛中患有临床乳腺炎的四分体与对照喂食的母牛的四分体相比较少，[1/129(0.78(精确二项95％ ci 0.02-4.24)％)]与6/135[4.44(精确二项95％ ci 1.65-9.42)％)]。喂食oxbc的母牛的四分体与喂食对照饮食的母牛的四分体相比的乳腺炎诊断优势比为0.17(95％ ci 0.03-0.82)。治疗组中被诊断患有乳腺炎的一头母牛的四分体是在开始喂食后41天被诊断出。这头母牛长期感染金黄色葡萄球菌。
[0271]
母牛水平奶质量和产量
[0272]
开始喂食后，母牛水平(畜群测试)scc下降(p《0.001)，但不存在治疗效应(p＝0.66)，也不存在治疗与时间相互作用(p＝0.56；图7和图8)。
[0273]
奶产量不受oxbc喂食的影响(oxbc与对照喂食组的母牛分别为22.9(95％ ci 21.0-24.8)与23.1(95％ ci 21.2-25.1)千克/母牛/天；p＝0.71)。奶产量在治疗后产生记录较低(治疗后与治疗前畜群测试分别为21.0(95％ ci 19.0-22.9)与25.0(95％ ci 23.1-27.0)千克/母牛/天；p《0.001)。不存在治疗与时间相互作用(p＝0.84；图6)。与杂交牛或娟姗牛相比，荷兰牛产生更多的奶(荷兰牛与其他品种分别为24.4(95％ ci 22.4-26.4)与22.3(95％ ci 20.3-24.2)千克/母牛/天；p＝0.005)，并且初产动物比经产动物产生较少的奶(初产与经产母牛分别为19.2(95％ ci 16.5-21.8)与23.4(95％ ci 21.6-25.3)千克/母牛/天；p《0.001)。
[0274]
乳脂百分比不受oxbc喂食的影响[oxbc与对照喂食组的母牛分别为4.72(95％ ci 4.49-4.96)％与4.54(95％ ci 4.41-4.89)％；p＝0.41；图7a]。乳脂百分比在治疗后产生记录较低[治疗后与治疗前畜群测试分别为4.60(95％ ci 4.36-4.82)％与4.78(95％ ci 4.54-5.01)％；p＝0.04]。不存在治疗与时间相互作用(p＝0.68；图7b)。与杂交牛或娟姗牛相比，荷兰牛的乳脂百分比较低[荷兰牛与其他品种分别为4.55(95％ ci 4.30-4.80)％与4.76(95％ ci 4.53-5.00)％；p＝0.05]。
[0275]
乳蛋白百分比不受oxbc喂食的影响[oxbc与对照喂食组的母牛分别为3.71(95％ ci 3.64-3.78)％与3.71(95％ ci 3.65-3.78)％；p＝0.92；图8a]。乳蛋白百分比在治疗后产生记录较低[治疗后与治疗前畜群测试分别为3.66(95％ ci 3.59-3.72)％与3.77(95％ ci 3.70-3.83)％]；p＝0.003]。不存在治疗与时间相互作用(p＝0.83；图8b)，并且不存在品种效应(p＝0.80)。
[0276]
讨论
[0277]
这项对照随机干预研究证明，相对于对照喂食的母牛，有亚临床乳房内感染的泌乳奶牛口服补充oxbc导致细菌感染的治愈率提高，并且随后的临床乳腺炎风险减少。oxbc补充对四分体或母牛水平scc或奶产量均无影响。
[0278]
总共分别分配了135个和129个四分体给治疗(oxbc)和对照组。对照组细菌治愈率仅为7％，而治疗组为14％。当前研究中更严格的入组标准可能导致选择更显著的亚临床感
染进行研究，并且可能在对照组中产生了较低的细菌治愈率。
[0279]
细菌感染的消退与较低的四分体水平scc相关。然而，尽管喂食oxbc的母牛的四分体的消退率较高，但饲料治疗组之间的四分体或母牛水平scc没有差异。还值得注意的是，在第42天，不到20％的已消退的四分体的scc《200,000个细胞/毫升，这说明尽管细菌病原体明显清除，但乳腺仍存在长期炎症。
[0280]
结论是，泌乳奶牛口服补充oxbc导致有亚临床乳腺炎的四分体的细菌治愈率和随后的临床乳腺炎发病率高于喂食没有额外oxbc的对照饮食的母牛的四分体。oxbc对奶产量或成分没有影响。
[0281]
其他实施例
[0282]
虽然本发明已结合其特定实施例予以描述，但应理解其能够进行进一步修改，并且希望本技术涵盖通常遵循本发明的原则并且包括与本发明的偏差的本发明的任何变化、用途或改造，这些偏差在本发明所属技术的己知或常规实践范围内，并且可以适用于如上阐明并且在权利要求范围内出现的基本特征。其他实施例在权利要求中。