一种枯草芽孢杆菌发酵银杏叶渣制备富硒饲料添加剂的方法及应用

1.本发明属于微生物技术及动物饲料添加剂技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌发酵银杏叶渣制备富硒饲料添加剂的方法。


背景技术：

2.纳米硒是纳米级的单质硒，具有较高的生物安全性、抗氧化活性和抑菌性能。利用微生物合成的纳米硒，具有绿色安全、环保无污染、产量高、成本低、低毒性等多种优势。
3.益生菌是活性微生物，是畜禽肠道内极为重要的优势菌。益生菌可以改善畜禽肠道微生物系统菌群，维持畜禽机体的健康，在发挥益生功能的同时产生活性物质和抑菌物质。《饲料添加剂品种目录(2008)》中规定的饲用益生菌添加剂菌种，共16种；植物乳杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、干酪乳杆菌、沼泽红假单胞菌、乳酸肠球菌、保加利亚乳杆菌、产朊假丝酵母、两歧双歧杆菌、乳酸乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、嗜酸乳杆菌。益生菌具有抑制肠道中有害病原菌的增长、促进肠道中有益菌的繁殖、增强宿主免疫力和改善宿主肠道内的菌群结构等重要生理功效，最重要的是，益生菌能够调节宿主肠道微生物系统菌群的生态平衡。因此，益生菌对于畜禽的生长、免疫和肠道微生物菌群结构具有重要的意义，被视为抗生素的有力替代品之一。
4.微生物发酵饲料原料种类非常多，除了一些较常规的粮食饲料原料外，其他非粮饲料原料也可应用在微生物发酵饲料的生产中。目前，微生物发酵饲料原料主要分为植物类、废渣类、混合原料、餐余类等。银杏叶富含200多种活性物质，包括黄酮类、生物碱、内酯类、有机酸类、多糖类和儿茶素类等，其中黄酮类和内酯类具有较强的生理活性，对机体的新陈代谢有良好的改善作用，能有效调节动物机体免疫机能，进而提高动物的免疫能力和生长性能。因此，银杏叶经加工处理，具有替代抗生素的潜力。但是目前，绝大多数银杏叶可以直接加工得到高附加值的银杏叶提取物，2012-2017年，银杏叶提取物行业产量持续增长，年均复合增长率达到29.1％；2017年，银杏叶提取物行业产量为558.4吨，相应的银杏叶渣产量已经突破3万吨。因此，有效利用银杏叶提取物加工过程中的副产物银杏叶渣，经产硒益生菌发酵，制备富硒且具有抑菌活性的发酵饲料，既可以满足新时代无抗养殖的健康发展需要，还可以变废为宝，实现银杏叶废弃物的资源化再利用，减少环境污染，具有良好的经济效益和社会效益。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌发酵银杏叶渣制备富硒饲料添加剂的方法。
6.本发明的另一目的是提供所述枯草芽孢杆菌发酵银杏叶渣制备富硒饲料添加剂的用途。
7.技术方案：本发明所述枯草芽孢杆菌发酵银杏叶渣制备富硒饲料添加剂的方法，
将银杏叶渣65-75份与苜蓿5-15份、米糠5-15份混合，经干燥、粉碎，混匀后加入总重量3％-7％的枯草芽孢杆菌lp-1和1-10mmol/l的亚硒酸钠，拌匀、发酵，发酵结束后，干燥，即可制得添加剂产品。
8.进一步地，在30-45℃条件下好氧发酵24-72小时。发酵得到的纳米硒的尺寸在20-200nm之间。干燥后的发酵饲料添加剂含水量≤30％(重量)。枯草芽孢杆菌lp-1基因组扩增采用的引物为：
9.正向引物为：5
’‑
agagtttgatcatggctcag-3’(27f)；
10.反向引物为：3
’‑
cgcttaccttgttacgactt-5’(1492r)。
11.枯草芽孢杆菌lp-1菌株的16s rdna片段共有1511nt碱基对组成，其序列如seq id no.1所示。
12.得到的富硒饲料添加剂在动物饲养中的应用。
13.所述富硒枯草芽孢杆菌lp-1可在24h内将2mmol/l的亚硒酸钠充分合成单质纳米硒。
14.所述发酵饲料添加剂富含纳米硒，该纳米硒的尺寸在20-200nm之间，其在发酵饲料添加剂的浓度在安全范围内。
15.一种枯草芽孢杆菌发酵银杏叶渣制备富硒饲料添加剂的方法，所述发酵饲料添加剂含水量≤30％(重量)。
16.有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
17.1、该枯草芽孢杆菌lp-1由本实验室自主筛选、鉴定，可在24h内将2mmol/l 的亚硒酸钠充分合成单质纳米硒。
18.2、该富硒饲料添加剂能够调解肠道微生物生态平衡，增强动物免疫能力，提高动物的生长性能、成活率和相对生长率，同时降低发病率。
19.3、本发明为银杏叶加工利用提供了一种新工艺，也为饲料添加剂市场提供了一种新的营养性饲料添加剂，具有极其广阔的应用前景和工业价值。
附图说明
20.图1是枯草芽孢杆菌lp-1与其他细菌构建的进化树示意图；
21.图2是枯草芽孢杆菌lp-1合成纳米硒电镜图；
22.图3是枯草芽孢杆菌lp-1合成纳米硒edx元素分析图；
23.图4是枯草芽孢杆菌lp-1发酵银杏叶条件优化图(时间)；
24.图5是枯草芽孢杆菌lp-1发酵银杏叶条件优化图(温度)；
25.图6是枯草芽孢杆菌lp-1发酵银杏叶条件优化图(接种量)。
具体实施方式
26.实施例1：枯草芽孢杆菌lp-1的筛选
27.从淮安市洪泽湖养殖塘采集肥沃的底泥备用。称取1g底泥加入50ml无菌水的三角瓶中，混匀，依次梯度稀释10-1-10-6
底泥悬浊液，用无菌微量移液器分别吸取不同稀释倍数的土壤悬浊液200μl于lb固体培养皿中，涂布均匀，将平板封并倒置于37℃恒温培养箱中培养1-7d。将分离到的微生物多次平板划线进行纯化，挑出单菌落用lb斜面培养基保存与4℃
冰箱中。将上述筛选出的菌株分别接种于含有5mmol/l亚硒酸钠的lb培养基平板及培养液中，37℃培养 2d。找出最先高效合成纳米硒的菌株后(溶液颜色变红明显)，观察该菌耐受性实验，分别取10-100mmol/l，每隔10mmol/l一个梯度，测量其最优菌株耐受性情况，分别接种到含有相应浓度亚硒酸钠的lb培养液中，37℃震荡培养，实时观察生长情况，每个梯度设置三个平行实验。
28.实施例2：枯草芽孢杆菌lp-1的16s rrna分子学鉴定
29.枯草芽孢杆菌lp-1的基因组采用“ezup柱式基因组dna抽提试剂盒”(南京诺唯赞生物科技有限公司)进行提取。
30.pcr与序列测定：提取的基因组dna参照takara公司的16s rdnabacterial identification pcr kit试剂盒说明书进行pcr扩增，其中正向引物为： 5
’‑
agagtttgatcatggctcag-3’(27f)，反向引物为： 3
’‑
cgcttaccttgttacgactt-5’(1492r)。pcr扩增条件设置为：94℃变性 1min；55℃退火30s；72℃延伸1min；30个循环。采用1％琼脂糖凝胶电泳检测发现，lp-1菌株16s rdna片段大小约为1450bp，如图1所示。将目的片段在紫外灯下切割下来，用回收试剂盒silica bead dna gelextraction kit进行dna 的回收。16s rdna序列测定由上海生工有限公司测序进行序列测定。测定序列结果表明lp-1菌株的16s rdna片段共有1511nt碱基对组成，其序列如seq idno.1所示。将得到的序列通过ncbi的genbank数据库进行blast比对，并构建系统发育树(图1)。菌株lp-1与芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)(accession no：mn795904)单独构成一个分支，进化上的距离最近，反映出它们之间亲缘关系最近，运用danman软件分析得到二者同源性为99％。结合传统的生理生化特性鉴定以及16s rdna序列分析的结果，判定菌株lp-1为枯草芽孢杆菌。
31.实施例3：枯草芽孢杆菌lp-1制备纳米硒及表征
32.将枯草芽孢杆菌lp-1接种于lb液体培养基中，并添加亚硒酸钠使其终浓度为2mmol/l，37℃震荡培养24h。发酵液颜色明显变红后，3500rpm离心15 min，除去菌体沉淀，再经12000rpm高速离心15min，收集红色沉淀，并经无菌生理盐水反复洗涤3次，得纳米硒纯溶液。通过dls粒度分析仪测定纳米硒粒径大小分布，同时采用sem-eds联用对其形貌及元素组成进行分析(图2和图3)。
33.实施例4：枯草芽孢杆菌lp-1发酵银杏叶条件优化
34.采用单因素实验，以发酵后产物中的氨基酸态氮含量为主要考察指标，对接种量(1％、5％、8％、10％)、发酵的温度(23℃、30℃、37℃、44℃)、发酵的时间(12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h)对发酵效果的影响进行研究(图 4、5、6)。
35.实施例5：富硒银杏叶饲料添加剂制备方法
36.将银杏叶渣与苜蓿、米糠按5∶1∶1混合，经干燥、粉碎，混匀后加入总重量5％的枯草芽孢杆菌lp-1和2mmol/l的亚硒酸钠，拌匀，在35-40℃条件下，发酵24-48小时。发酵结束后，置通风干燥处烘至含水量≤30％(重量)，即可制备得到富硒银杏叶渣发酵饲料添加剂产品。
37.实施例6：枯草芽孢杆菌lp-1发酵银杏叶制备富硒饲料添加剂
38.通过单因素优化，得到枯草芽孢杆菌lp-1发酵银杏叶最佳条件为：接种量 8％、发酵温度为37℃，发酵时间为48h。在此优化条件下大量制备枯草芽孢杆菌lp-1发酵银杏叶的
发酵液，后经喷雾干燥制备得到益生菌富硒饲料添加剂。