一种基于芦苇的草鱼免疫性能饲料及其制备方法

1.本发明属于鱼产饲料技术领域，具体涉及一种基于芦苇的草鱼免疫性能饲料及其制备方法。


背景技术：

2.鱼类作为低等脊椎动物，已具备较为完善的获得性免疫反应，可通过非特异性免疫反应和特异性免疫反应来抵抗病原入侵。饲料是鱼类非特异性免疫系统的重要组成部分，主要由肝脏合成，具有溶菌和细胞溶解作用，在早期抗感染过程中发挥着重要作用。il-1是鱼类重要的细胞因子，在调节吞噬细胞活性，诱导炎症反应，抵抗病原入侵中发挥重要作用。溶菌酶(lysozyme)是鱼类体内重要的非特异性免疫因子，在清除、消灭病原微生物中发挥重要作用。ifn系统是目前所知机体防御反应中出现得最早的细胞功能调节系统免疫因子；igm是由b淋巴细胞分化产生参与病原活性抑制和抗原呈递过程调节的特异性免疫因子。
3.但是，现有的鱼饲料通常含有小麦成分，小麦对草鱼肝脏结构和免疫性能的影响，小麦对草鱼的肝脏氨基酸代谢能力效果不理想，从而使草鱼的非特异性免疫反应水平效果不理想，因此我们需要提出一种基于芦苇的草鱼免疫性能饲料及其制备方法来解决上述存在的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种基于芦苇的草鱼免疫性能饲料及其制备方法，通过在饲料中添加芦苇，利用芦苇中的活性成分能一定程度上提高草鱼的非特异性免疫反应水平，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
6.一种基于芦苇的草鱼免疫性能饲料，按质量百分比计，包括如下原料：小麦0％-30％、芦苇0％-30％、豆粕30％、鱼粉3％、菜籽粕26％、磷酸二氢钙2.5％、cmc粘合剂2％、氯化胆碱0.15％、膨润土1.25％、三氧化二钇0.1％、维生素预混物1％、矿物盐预混物1％、豆油3％。
7.优选的，按质量百分比计，包括如下原料：小麦30％、芦苇0％、豆粕30％、鱼粉3％、菜籽粕26％、磷酸二氢钙2.5％、cmc粘合剂2％、氯化胆碱0.15％、膨润土1.25％、三氧化二钇0.1％、维生素预混物1％、矿物盐预混物1％、豆油3％。
8.优选的，按质量百分比计，包括如下原料：小麦15％、芦苇15％、豆粕30％、鱼粉3％、菜籽粕26％、磷酸二氢钙2.5％、cmc粘合剂2％、氯化胆碱0.15％、膨润土1.25％、三氧化二钇0.1％、维生素预混物1％、矿物盐预混物1％、豆油3％。
9.优选的，按质量百分比计，包括如下原料：小麦0％、芦苇30％、豆粕30％、鱼粉3％、菜籽粕26％、磷酸二氢钙2.5％、cmc粘合剂2％、氯化胆碱0.15％、膨润土1.25％、三氧化二钇0.1％、维生素预混物1％、矿物盐预混物1％、豆油3％。
10.优选的，所述芦苇在使用时将芦苇粉碎后56℃干燥后磨成粉，所述芦苇的有效成分包括水分、粗蛋白质、粗灰粉、粗纤维，所述芦苇的总能量在17.73mj/kg。
11.优选的，所述维生素预混物按质量组份计包括如下原料：维生素a1.65份、维生素d0.025份、维生素e50份、维生素k10份、维生素c100份、硫胺素20份、核黄素20份、维生素b620份、维生素b
12
0.02份、叶酸5份、泛酸钙50份、烟酸100份、生物素0.1份、纤维素645.2份。
12.优选的，所述矿物盐预混物按质量组份计包括如下原料：氯化钠500份、七水合硫酸镁8155.6份、二水合磷酸二氢钠12500份、磷酸二氢钾16000份、二水合磷酸氢钙7650.6份、七水合硫酸亚铁2286.2份、五水合乳酸钙1750份、七炎合硫酸锌178份、一水合硫酸锰61.4份、五水合硫酸铜15.5份、七水合硫酸钴0.5份、碘化钾1.5份、玉米淀粉753.7份。
13.基于以上叙述的一种基于芦苇的草鱼免疫性能饲料，本发明还提供了一种基于芦苇的草鱼免疫性能饲料的制备方法，包括如下步骤：
14.s1、准备如下原料：小麦、芦苇、豆粕、鱼粉、菜籽粕、磷酸二氢钙、cmc粘合剂、氯化胆碱、膨润土、三氧化二钇、维生素预混物、矿物盐预混物、豆油；
15.s2、将小麦、芦苇、豆粕和菜籽粕的固体原料分别进行粉碎，将粉碎后的混合物过筛，选出直径小于0.43mm的固体颗粒；
16.s3、将固体颗粒按饲料配比进行混合搅拌，得到饲料混合物；
17.s4、将饲料混合物使用饲料制粒机加工成直径为3mm的饲料颗粒；
18.s5、将饲料颗粒包装后放置在阴凉干燥的环境下保存备用。
19.优选的，步骤s4中所述饲料颗粒的营养成分包括粗蛋白33％-32.61％、粗脂肪4.6％-4.82％、粗纤维4.84％-13.87％和灰分9.95％-12.45％，所述饲料颗粒营养总能在19.84％-19.96％。
20.本发明提出的一种基于芦苇的草鱼免疫性能饲料及其制备方法，与现有技术相比，具有以下优点：
21.本发明的饲料主要包括小麦、芦苇、豆粕、鱼粉、菜籽粕、磷酸二氢钙、cmc粘合剂、氯化胆碱、膨润土、三氧化二钇、维生素预混物、矿物盐预混物、豆油，通过在饲料中添加芦苇，利用芦苇中的活性成分能一定程度上提高草鱼的非特异性免疫反应水平。
附图说明
22.图1为本发明的流程框图；
23.图2为芦苇对草鱼血清和肝脏中免疫因子含量和活性的影响示意图；
24.图3为芦苇对草鱼头肾(a)、肝(b)、脾(c)和肾(d)组织中免疫基因表达水平影响示意图；
25.图4为芦苇对草鱼肝脏组织形态的影响示意图。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发
明保护的范围。
27.实施例1
28.本发明提供了一种基于芦苇的草鱼免疫性能饲料，按质量百分比计，包括如下原料：小麦30％、芦苇0％、豆粕30％、鱼粉3％、菜籽粕26％、磷酸二氢钙2.5％、cmc粘合剂2％、氯化胆碱0.15％、膨润土1.25％、三氧化二钇0.1％、维生素预混物1％、矿物盐预混物1％、豆油3％；
29.芦苇在使用时将芦苇粉碎后56℃干燥后磨成粉，芦苇的有效成分包括水分、粗蛋白质、粗灰粉、粗纤维，芦苇的总能量在17.73mj/kg。
30.维生素预混物按质量组份计包括如下原料：维生素a1.65份、维生素d0.025份、维生素e50份、维生素k10份、维生素c100份、硫胺素20份、核黄素20份、维生素b620份、维生素b
12
0.02份、叶酸5份、泛酸钙50份、烟酸100份、生物素0.1份、纤维素645.2份。
31.矿物盐预混物按质量组份计包括如下原料：氯化钠500份、七水合硫酸镁8155.6份、二水合磷酸二氢钠12500份、磷酸二氢钾16000份、二水合磷酸氢钙7650.6份、七水合硫酸亚铁2286.2份、五水合乳酸钙1750份、七炎合硫酸锌178份、一水合硫酸锰61.4份、五水合硫酸铜15.5份、七水合硫酸钴0.5份、碘化钾1.5份、玉米淀粉753.7份。
32.基于以上叙述的一种基于芦苇的草鱼免疫性能饲料，本发明还提供了一种基于芦苇的草鱼免疫性能饲料的制备方法，包括如下步骤：
33.s1、准备如下原料：小麦、芦苇、豆粕、鱼粉、菜籽粕、磷酸二氢钙、cmc粘合剂、氯化胆碱、膨润土、三氧化二钇、维生素预混物、矿物盐预混物、豆油；
34.s2、将小麦、芦苇、豆粕和菜籽粕的固体原料分别进行粉碎，将粉碎后的混合物过筛，选出直径小于0.43mm的固体颗粒；
35.s3、将固体颗粒按饲料配比进行混合搅拌，得到饲料混合物；
36.s4、将饲料混合物使用饲料制粒机加工成直径为3mm的饲料颗粒；饲料颗粒的营养成分包括粗蛋白33％-32.61％、粗脂肪4.6％-4.82％、粗纤维4.84％-13.87％和灰分9.95％-12.45％，饲料颗粒营养总能在19.84％-19.96％；
37.s5、将饲料颗粒包装后放置在阴凉干燥的环境下保存备用。
38.实施例2
39.相同之处不再重复赘述，与实施例1不同的是，按质量百分比计，包括如下原料：小麦15％、芦苇15％、豆粕30％、鱼粉3％、菜籽粕26％、磷酸二氢钙2.5％、cmc粘合剂2％、氯化胆碱0.15％、膨润土1.25％、三氧化二钇0.1％、维生素预混物1％、矿物盐预混物1％、豆油3％。
40.实施例3
41.相同之处不再重复赘述，与实施例1不同的是，按质量百分比计，包括如下原料：小麦0％、芦苇30％、豆粕30％、鱼粉3％、菜籽粕26％、磷酸二氢钙2.5％、cmc粘合剂2％、氯化胆碱0.15％、膨润土1.25％、三氧化二钇0.1％、维生素预混物1％、矿物盐预混物1％、豆油3％。
42.实施例4
43.根据实施例1、实施例2和实施例3的饲料原料配比，配比数据如下表格：(即跟小麦相比实施例1中芦苇含量为0％，实施例2中芦苇含量为50％，实施例3中芦苇的含量为
100％)
44.类别实施例1实施例2实施例3小麦30％15％0％芦苇0％15％30％豆粕30％30％30％鱼粉3％3％3％菜籽粕26％26％26％磷酸二氢钙2.5％2.5％2.5％cmc粘合剂2％2％2％氯化胆碱0.15％0.15％0.15％膨润土1.25％1.25％1.25％三氧化二钇0.1％0.1％0.1％维生素预混物1％1％1％矿物盐预混物1％1％1％豆油3％3％3％
45.选取66尾健康草鱼，随机分成3组，每组3个重复，分别饲喂实施例1、实施例2和实施例3制备的饲料，饲养41d后，分别检测血清生化指标、肝脏组织结构和免疫相关指标变化，具体检测过程及结果如下：
46.1.2饲养管理
47.养殖试验在室内循环水养殖塑料圆桶(直径1.5m)中进行。试验用草鱼为养殖场养殖的，且属于大规格草鱼，以基础饲料暂养2周后，选取平均体重为(145
±
2)g的66尾健康草鱼，按体质量差异不显著随机分为3组(p》0.05)，每组设3个重复，每个重复7-8尾鱼。养殖试验每天分上午(8～9点)、下午(3～4点)2次投喂，起始日投喂量为鱼体重的3％，养殖周期41d。养殖期间保持微流水，空气压缩机曝气，每天测量水温，观察实验鱼活动情况、健康状态等。
48.1.3样品采集与处理
49.养殖实验结束后，停食24h，每个水槽中随机选取3尾鱼，使用肝素钠抗凝，尾静脉取血，4℃静置1h后，4000r/min离心15min，吸取上层清液，取上层血清用于生化指标和免疫因子含量检测；解剖后，取肝、脾、肾、头肾各约0.2g，液氮速冻后，-80℃冰箱保存，用于免疫基因表达水平检测；取约肝脏1g于2ml离心管中，加1ml灭菌ddh2o，制成肝组织匀浆，稀释10倍，每管150μl分装后，-80℃冰箱中保存，用于检测肝脏中免疫因子含量；取0.5cm
×
0.5cm
×
0.5cm大小的肝脏组织固定于10％甲醛中，用于h&e染色，观察肝脏组织结构。
50.1.4血清生化指标检测
51.血清生化指标检测送常德市力源医学检测中心完成，总蛋白(tp)采用双缩脲法测定，白蛋白(alb)采用bcg法测定，球蛋白(glb)采用计算法测定，血糖(glu)采用已糖激酶法测定，谷草转氨酶(ast)和谷丙转氨酶(alt)活性采用ifcc速率法测定。
52.1.5肝脏组织结构观察
53.肝脏组织在10％甲醛中固定24h后，经30％～100％乙醇梯度脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋，制备4～5um厚度的石蜡组织切片，he常规染色，中性树胶封片后，使用徕卡
(leica)高级显微系统(dm3000)观察肝脏组织的结构特征。
54.1.6免疫因子含量与活性检测
55.血清和肝脏中免疫球蛋白m(igm)、白介素1(il-1)、补体蛋白3(c3)、总补体(ch50)、皮质醇(cortisol)含量检测均采用鱼类相应免疫因子的elisa试剂盒，检测方法参照试剂盒进行。
56.1.7免疫基因表达水平检测分析
57.1.7.1rna提取与cdna第一链合成
58.取-80℃保存的肝、脾、肾和头肾组织，使用trizol试剂(invitrogen，usa)提取总rna，方法参考trizol试剂说明书，提取的rna使用1％的琼脂糖电泳检测rna完整性，完整性好的总rna用于下一步实验。取2μg总rna，使用revertaid
tm
firststrandcdnasynthesis(thermofisher,usa)逆转录试剂盒，利用oligo(dt)18引物合成cdna第一链,用于免疫基因表达水平分析。
59.1.7.2荧光定量pcr分析
60.查阅相关文献，确定本实验检测的免疫基因为热应激蛋白70(hsp70)，溶菌酶，主要组织相容性复合物i(mhc-i)、干扰素(ifn)、c3、igm、il-1。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，引物序列信息见表如下：
[0061][0062]
荧光定量pcr反应体系：2
×
mastermix10μl，10μmol/l引物0.4μl，稀释后的模板9.6μl。反应程序为：95℃预变性3min：95℃5s，60℃10s，72℃15s，共40个循环，溶解曲线65-97℃，每秒升高0.1℃。基因表达水平计算采用2-δδct法，数据处理使用lightcycler480softwarerelease1.5.0和excel软件，以actin基因为参考基因，0％替代组基因表达水平做均一化分析。
[0063]
1.8数据分析
[0064]
采用spss17.0软件进行数据单因素方差分析(one-wayanova)，使用duncan法进行组间显著性分析，显著性水平为p《0.05，检测结果以平均值
±
标准差(mean
±
se)，免疫因子含量与活性、免疫相关基因表达水平检测结果利用graphpadprism6软件进行绘图。
[0065]
2.结果与分析
[0066]
2.1血清生化指标
[0067]
随芦苇替代比例增加草鱼血清tp、alb和glb含量表现出先升高后降低的趋势，但整体而言，3组间tp、alb和glb含量变化不显著(p》0.05)。替代组草鱼血糖浓度均低于对照组，特别是50％替代组显著低于对照组。除100％替代组的ast活性外，替代组草鱼血清中alt和ast活性均有大幅度升高，且显著高于对照组(p《0.05)，如下表格为芦苇对草鱼血清生化指标的影响：
[0068]
项目item0％50％100％总蛋白tp(g/l)32.97
±
3.2936.50
±
1.8734.57
±
0.35白蛋白alb(g/l)15.73
±
1.1117.00
±
1.0415.70
±
0.40球蛋白glb/(g/l)17.23
±
2.1819.50
±
0.9018.87
±
0.64血糖glu(mmol/l)9.85
±
0.81a6.35
±
0.56b7.68
±
1.02ab谷丙转氨酶alt/(u/l)22.35
±
2.05a64.60
±
8.34b98.05
±
1.48c谷草转氨酶ast/(u/l)47.00
±
3.11a84.10
±
17.25b51.45
±
0.92a
[0069]
注：同行数据上标字母不同表示两组间差异显著(p《0.05)，相同表示两组间差异不显著(p》0.05)。
[0070]
2.2肝脏组织结构
[0071]
对照组肝脏细胞界限不清晰，肝细胞空泡化严重，其伴随有少量淋巴细胞浸润(图4中的a,b)。50％和100％替代组草鱼肝脏肝细胞界限较为清晰，细胞核显色清楚，且基本位于中央，细胞排列整齐，大小均一(图4中的c，d，e，f)。
[0072]
2.3免疫因子含量与活性
[0073]
与对照组相比，il-1和c3的含量在100％芦苇替代组草鱼血清中显著升高(p《0.05)，ch50含量在50％和100％芦苇替代组中均显著低于对照组(p《0.05)。il-1和ch50含量在100％芦苇替代组草鱼肝脏中显著高于对照组(p《0.05)，但c3含量显著低于对照组(p《0.05)；il-1、c3、igm和cortisol在50％芦苇替代组草鱼血清和肝脏中含量变化与对照组相比差异均不显著(p》0.05)，如图2所示为芦苇对草鱼血清和肝脏中免疫因子含量和活性的影响，图中免疫因子含量与活性的单位分别为igm(μg/ml)、il-1(pg/ml)、c3(μg/ml)、ch50(u/ml)、cortisol(ng/ml)。
[0074]
2.4免疫基因表达水平
[0075]
与对照组相比，100％芦苇替代组草鱼hsp70、il-1、mhc-i、lysozyme在头肾均显著上调表达(p《0.05)，而c3和ifn均显著下调；50％芦苇替代组草鱼c3、hsp70、lysozyme、mhc-i、ifn等基因在头肾均显著下调表达(p《0.05)(图3-a)；替代组草鱼肝脏中il-1、lysozyme与对照组相比均显著下调表达(p《0.05)，而c3、mhc-i、ifn和igm表达水平差异均不显著(p》0.05)(图3-b)；50％芦苇替代组草鱼脾脏中c3和hsp70的表达水平显著高于对照组，而mhc-i表达水平显著低于对照组(p《0.05)；100％芦苇替代组草鱼脾脏中除ifn，igm基因外，其他检测基因表达水平均显著低于对照组(图3-c)；100％芦苇替代组草鱼肾脏中hsp70、mhc-1、
ifn和igm基因的mrna表达水平均显著高于对照组(p《0.05)，50％芦苇替代组肾脏中除c3外，其他检测基因表达水平差异均不显著(p》0.05)(图3-d)。
[0076]
3.不同替代比例芦苇对草鱼免疫性能的影响
[0077]
替代组草鱼血清中il-1，c3和cortisol，肝脏中il-1和ch50均表现出随芦苇替代比例增加而上升的趋势，其中100％芦苇替代组草鱼非特异性免疫指标变化与对照组相比具有显著差异(p《0.05)，而igm含量无显著差异(p》0.05)。从免疫因子含量变化结果可知，饲料中添加适量芦苇，可增强草鱼的非特异性免疫反应，对特异性免疫反应影响不显著，结果和陈密等[30]研究结果一致，其发现芦苇中的活性成分芦丁可显著提高草鱼非特异性免疫力。同时免疫基因表达水平变化结果显示，饲料中添加100％的芦苇能不同程度的上调hsp70、il-1、lysozyme、mhc-i、ifn和igm在头肾、肾中的表达水平，而50％芦苇替代组草鱼免疫基因表达水平和对照组相比均下调表达。因此，草鱼免疫基因的mrna表达水平变化趋势结果显示，随芦苇添加量的增加，草鱼免疫力水平呈先下降后上升的趋势，具体芦苇影响草鱼免疫力的调节机制需设计更详细实验方法来进行探索。因此，综合免疫因子含量和mrna表达水平变化结果显示，饲料中添加芦苇，能一定程度上提高草鱼的非特异性免疫反应水平，这可能和芦苇所含的活性成分黄酮类物质、芦苇多糖、芦丁等相关。研究表明芦苇中黄酮类活性物质具有显著的抗菌能力和抗氧化性能；嫩芦苇含有丰富的维生素，在机体代谢中起着重要作用，同时可增强獭兔免疫力。
[0078]
综上，结果表明，替代组草鱼血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶与对照组相比具有明显的升高，而总蛋白、白蛋白和球蛋白与对照组相比变化不明显。肝脏组织切片结果显示，与对照组相比，替代组草鱼肝脏细胞界限清晰，组织结构有所改善。免疫因子含量与表达水平检测结果显示，与对照组相比，100％替代组草鱼血清中白介素1(il-1)、补体3(c3)含量显著升高(p《0.05)，肝脏中il-1、总补体(50％haemolyticcomplement,ch50)的含量显著升高(p《0.05)；50％芦苇替代组草鱼血清中il-1、c3和肝脏中il-1、ch50等免疫因子显著含量高于对照组；同时，饲喂不同芦苇替代比例的饲料均能显著影响草鱼头肾、肾、肝脏和脾脏中c3、il-1、主要组织相容性复合物i(mhc-i)和干扰素(ifn)等基因的相对表达水平。因此，使用芦苇替代小麦能改善草鱼肝脏组织结构，提高肝脏氨基酸代谢能力，一定程度上可提高草鱼的非特异性免疫反应水平。
[0079]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。