一种分段式糖基化反应降低牡蛎致敏性的方法

1.本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种分段式糖基化反应降低牡蛎致敏性的方法。


背景技术：

2.近年来，随着牡蛎在世界范围内销售量越来越高，其作为原料或者原辅料被添加于食品中也逐渐增多，由牡蛎带来的食品安全问题也日益严重，其中食物过敏作为食品安全问题的一个部分，越来越引起人们的重视。食物过敏主要由食物中特定的组分引起的由免疫球蛋白e介导的i型超敏反应，其症状主要表现为水肿、荨麻疹、腹泻、过敏性哮喘等，严重的食物过敏会导致休克甚至死亡。据调查显示全世界范围内约2％～4％的成年人和6％～8％的儿童对特定食品产生过敏反应，其中90％以上的食物过敏是由八大类食品引起。目前，牡蛎已被报道的主要致敏原有：鱼类小清蛋白、贝类原肌球蛋白(tropomyosin,tm)、精氨酸激酶(arginine kinase,ak)、肌浆钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium binding protein,scp)等。其中小清蛋白的研究已经相对成熟，食品加工技术中高温高压处理、辐照处理、酶法交联、糖基化反应均可以降低小清蛋白的致敏性。而贝类中的主要致敏原tm具有耐热耐消化等特性，普通的加工处理不仅无法降低tm的致敏性，有时甚至会增强。近年来，寻找合适的加工方法降低贝类牡蛎中的主要致敏原的致敏性已经成为防治食物过敏的一个至关重要的问题。


技术实现要素：

3.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
4.为此，根据本发明的实施例，本发明提出了一种分段式糖基化反应降低牡蛎致敏性的方法，其包括以下步骤：
5.浸渍：将牡蛎清洗后放入盐糖水中浸渍；
6.预煮：将糖水煮沸，将浸渍后的牡蛎放入糖水中预煮；
7.二次浸渍：将预煮后的牡蛎捞出沥干，于盐糖水中浸渍；
8.煮制：将糖水煮沸，再将二次浸渍后的牡蛎放入糖水中煮制，包装灭菌。
9.根据本发明实施例的一种分段式糖基化反应降低牡蛎致敏性的方法，该方法利用浸泡去除牡蛎水溶性致敏原，分段式糖基化反应消除牡蛎不耐热致敏原、削减牡蛎耐热致敏原，以解决传统牡蛎加工过程中难以降低牡蛎致敏原致敏性的难题，同时也能保证牡蛎原有的风味及品质。该方法操作简便、成本低、易实现规模化生产。
10.另外，根据本发明上述实施例提出的一种分段式糖基化反应降低牡蛎致敏性的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
11.可选地，浸渍时，按质量百分比计，盐糖水包括：1％～2％食盐、1％～10％木糖；浸渍时间为15分钟～45分钟。
12.可选地，预煮时，按质量百分比计，糖水包括1％～10％木糖；预煮时间为1分钟～
1.5分钟。
13.可选地，二次浸渍时，按质量百分比计，盐糖水包括：1％～2％食盐、1％～4％木糖；浸渍时间为30分钟～120分钟。
14.可选地，二次浸渍时，牡蛎与盐糖水的质量比为1:3～1:5。
15.可选地，煮制时，按质量百分比计，糖水包括1％～5％木糖；煮制时间为5分钟～15分钟。
16.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
17.图1为根据本发明实施例1的福建牡蛎的加工流程和新鲜福建牡蛎按照流程被加工成产品的状态；
18.图2为根据本发明实施例2的褶牡蛎的加工流程和新鲜褶牡蛎按照流程被加工成产品的状态；
19.图3为根据本发明实施例的加工前后牡蛎的主要致敏原igg结合活性的变化；
20.图4为根据本发明实施例的加工前后牡蛎的致敏原ige结合活性的变化；
21.图5为根据本发明实施例的加工前后牡蛎的硬度、弹性、咀嚼度变化。
具体实施方式
22.以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
23.为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
24.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
25.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
26.实施例1
27.浸渍：新鲜福建牡蛎(图1b)清洗后，于盐糖水(2％食盐、2％木糖、96％水)浸渍，浸渍时间为45分钟(图1c)。
28.预煮：将糖水煮沸，将浸渍后的福建牡蛎放入糖水(2％木糖、98％水)中预煮1分钟(图1d)。
29.二次浸渍：将预煮后的福建牡蛎捞出，沥干，按w(牡蛎):w(盐糖水)＝1:5，浸于盐糖水(2％食盐、4％木糖、94％水)中120分钟(图1e)。
30.煮制：糖水(2％木糖、98％水)煮沸，将二次浸渍后的福建牡蛎用糖水煮制10分钟(图1f)，包装灭菌(图1g)。
31.具体实施流程如图1a，将新鲜牡蛎经过处理之后包装成成品，牡蛎状态如图1bcdefg所示。
32.实施例2
33.浸渍：新鲜褶牡蛎(图2b)清洗后，于盐糖水(2％食盐、2％木糖、96％水)浸渍，浸渍时间为45分钟(图2c)。
34.预煮：将糖水煮沸，将浸渍后的褶牡蛎放入糖水(2％木糖、98％水)中预煮1分钟(图2d)。
35.二次浸渍：将预煮后的福建牡蛎捞出，沥干，按w(牡蛎):w(盐糖水)＝1:5，浸于盐糖水(2％食盐、4％木糖、94％水)中120分钟(图2e)。
36.煮制：糖水(2％木糖、98％水)煮沸，将二次浸渍后的福建牡蛎用糖水煮制10分钟(图2f)，包装灭菌(图2g)。
37.具体实施流程如图2a，将新鲜牡蛎经过处理之后包装成成品，牡蛎状态如图2bcdefg所示。
38.试验例
39.将实施例1和实施例2的牡蛎进行测试：
40.1、牡蛎主要致敏原igg结合活性的变化：
41.加工前后牡蛎全蛋白制备：取加工前后的牡蛎置于5倍体积(v/v)，4℃，含0.5mol/l nacl的pbs缓冲液(0.2mol/l nah2po4·
2h2o、0.2mol/l na2hpo4·
12h2o)，进行组织捣碎，离心(12000g，4℃，25分钟)，取上清，即为加工前后牡蛎全蛋白。
42.加工前后牡蛎全蛋白sds-page分析：配制15％的聚丙烯酰胺凝胶将sds化的加工前后牡蛎全蛋白取70μg上样进行电泳(电流10ma，电泳时间1.5小时)。凝胶用考马斯亮蓝r-250进行染色，染至深蓝色，后换用适量脱色液，脱色至显示出清晰的蓝色蛋白条带，最后用凝胶成像仪拍照保存。结果如图3a所示，加工后，福建牡蛎及褶牡蛎的蛋白条带的强度有所降低。图中m：标准蛋白；1：褶牡蛎未经处理的全蛋白；2：褶牡蛎经过加工后的全蛋白；3：福建牡蛎未经过处理的全蛋白；4：福建牡蛎经加工处理的全蛋白。
43.加工前后牡蛎全蛋白western blot分析：在sds-page电泳后，将凝胶上所有可转移的条带通过转膜仪转移至硝酸纤维素膜上。使用5％(w/v)脱脂奶封闭1.5小时，将封闭后的硝酸纤维素膜置于tbs-t(1mol/l tris-hcl(ph 8.0、0.3mol/l nacl、0.5ml/l tween 20)中洗涤3次，每次5分钟。并在室温下用兔抗福建牡蛎tm多克隆抗体为一抗(稀释比例为1:50万)；兔抗福建牡蛎ak多克隆抗体(稀释比例为1:50万)；兔抗福建牡蛎scp多克隆抗体(稀释比例为1:5000)孵育50分钟，用tbs-t洗5次后，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg抗体为二抗(稀释比例为1:2万)孵育50分钟，用tbs-t洗7次后用ecl底物发光显色液显色。经过western blot分析发现，无论是福建牡蛎还是褶牡蛎，其致敏原tm和ak的igg结合活性均有显著性降低(图3b、3c)，scp的igg结合活性有所降低，但变化不显著(图3d)。通过image j分析，将福建牡蛎、褶牡蛎中致敏原tm、ak、scp的igg结合活性数值化(图3e)。可以发现，褶牡蛎中的致敏原强度相较于福建牡蛎强，很可能是因为大多数致敏原都存在于贝柱中，而贝柱在褶牡蛎中的占比相较于福建牡蛎的占比大，从而导致其igg结合能力更强一些。
44.2、牡蛎致敏原ige结合活性的变化：
45.加工前后牡蛎全蛋白制备：取加工前后的牡蛎置于5倍体积(v/v)，4℃，含0.5mol/l nacl的pbs缓冲液(0.2mol/l nah2po4·
2h2o、0.2mol/l na2hpo4·
12h2o)，进行组织捣碎，离心(12000g，4℃，25分钟)，取上清，即为加工前后牡蛎全蛋白。
46.加工前后牡蛎全蛋白sds-page分析：配制15％的聚丙烯酰胺凝胶将sds化的加工前后牡蛎全蛋白取70μg上样进行电泳(电流10ma，电泳时间1.5小时)。凝胶用考马斯亮蓝r-250进行染色，染至深蓝色，后换用适量脱色液，脱色至显示出清晰的蓝色蛋白条带，最后用凝胶成像仪拍照保存。结果如图4a所示，经过加工后，福建牡蛎、褶牡蛎的蛋白条带的强度有所降低。图中m：标准蛋白；1：褶牡蛎未经处理的全蛋白；2：褶牡蛎经过加工后的全蛋白；3：福建牡蛎未经过处理的全蛋白；4：福建牡蛎经加工处理的全蛋白。
47.加工前后牡蛎全蛋白western blot分析：在sds-page电泳后，将凝胶上所有可转移的条带通过转膜仪转移至硝酸纤维素膜上。使用5％(w/v)脱脂奶封闭1.5小时，将封闭后的硝酸纤维素膜置于tbs-t(1mol/l tris-hcl(ph 8.0、0.3mol/l nacl、0.5ml/l tween 20)中洗涤3次，每次5分钟。并在室温下用褶牡蛎过敏患者血清为一抗(稀释比例为1:50万)孵育过夜；兔抗福建牡蛎ak多克隆抗体(稀释比例为1:50万)；兔抗福建牡蛎scp多克隆抗体(稀释比例为1:5000)孵育50分钟，用tbs-t洗5次后，用辣根过氧化物酶标记的羊抗人ige抗体为二抗(稀释比例为1:2万)孵育50分钟，用tbs-t洗7次后用ecl底物发光显色液显色。经过western blot分析后发现，无论是福建牡蛎还是褶牡蛎，其致敏原和血清结合的能力均显著性降低(图4b)。图4c的image j分析可以清晰明了的对比出福建牡蛎、褶牡蛎加工前后其ige结合活性的变化。可以发现，褶牡蛎和血清结合的能力相较于福建牡蛎与血清的结合能力强，因为大多数致敏原都存在于贝柱中，而贝柱在褶牡蛎中的占比相较于福建牡蛎的占比大，从而导致其与血清的结合能力更强一些。
48.3、牡蛎硬度、弹性、咀嚼度变化：
49.方法参照欧韦(欧韦,杨汝晴,张凌晶,孙乐常,翁凌,刘光明,曹敏杰.太平洋牡蛎冷藏过程中闭壳肌品质的变化[j].食品科学,2022,1-11)。
[0050]
结果如图5所示，在图5a和图5b中，福建牡蛎和褶牡蛎在生产工艺流程过程中硬度呈逐步上升趋势，均在预煮1分钟达到峰值，随后逐渐下降。在图5c和图5d中，经过加工后，福建牡蛎和褶牡蛎的弹性呈上升趋势。在图5e和图5f中，福建牡蛎和褶牡蛎在经过加工后其咀嚼度有所提高。生产工艺结束后的牡蛎其硬度和咀嚼度都有所提升，弹性起伏变化相对较小，并且发现褶牡蛎的硬度、弹性和咀嚼度都较福建牡蛎高，说明经过加工后褶牡蛎的口感相对更好。
[0051]
综上，根据本发明的实施例，利用浸泡去除牡蛎水溶性致敏原，分段式糖基化反应消除牡蛎不耐热致敏原、削减牡蛎耐热致敏原，解决了传统牡蛎加工过程中难以降低牡蛎致敏原致敏性的难题，同时也能保证牡蛎原有的风味及品质，该方法操作简便、成本低、易实现规模化生产。
[0052]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点
可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
[0053]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。