一种多频超声联合硫辛酸杀菌的方法

1.本发明公开了一种多频超声联合硫辛酸杀菌的方法，属于食品杀菌技术领域。
技术背景
2.超声波是超过人类听觉阈值的振动频率》20khz的声波。当在介质中传播时，超声的机械能部分转化为热量，部分转化产生压力、冲击波、剪切力等。近年来，超声在食品领域的应用越来越广泛。其中，超声具有的杀菌能力也在被不断重视。与传统热杀菌技术相比，超声具有杀菌速度快、操作简单、对人体无伤害且不影响食品品质等优点。超声杀菌的机理在于其产生的空化效应。但是，超声波单独杀菌存在杀菌不彻底的问题，因此常和温度、其他物理方式、以及抑菌物质等进行联合来增强杀菌效果。超声波和热结合，可以提高杨梅汁中枯草芽孢杆菌的杀菌效果，缩短杀菌时间并降低杀菌温度(li j,cheng h,liu d,et al.inactivation of bacillus subtilis and quality assurance in chinese bayberry(myrica rubra)juice with ultrasound and mild heat.lwt-food science and technology,2019,108:113-119.)。超声和紫外线结合后不仅可以完全灭活芒果汁中的致病菌，还可以保持和提高芒果汁的营养价值(wang j,liu q,xie b,et al.effect of ultrasound combined with ultraviolet treatment on microbial inactivation and quality properties of mango juice.ultrasonics sonochemistry,2020,64:105000.)。超声与次氯酸钠的联合处理在控制大肠杆菌方面显示出协同增效作用，可以减少消毒剂次氯酸钠的使用量(guo l,sun y,zhu y,et al.the antibacterial mechanism of ultrasound in combination with sodium hypochlorite in the control of escherichia coli.food research international,2019,129:108887.)
3.由于化学类抑菌剂在生产和环境中存在的问题日益增多，植物源活性物质抑菌剂的开发成为研究的热点。植物类抑菌剂具有对环境友好，残留低、毒性低等特点。硫辛酸是一类天然的类维生素化合物，广泛分布于如菠菜、西红柿等的蔬菜中。硫辛酸除具有抗氧化性外，还具有极高的保健功能和医用价值。但是硫辛酸是否具有光谱的抗菌性以及抗菌能力是否能达到食品应用的要求等还未有报道。采用多频超声联合硫辛酸进行杀菌处理同样也鲜有报道；本发明可以扩大硫辛酸的应用范围，也可以为超声的联合杀菌提供新的思路。超声联合硫辛酸进行杀菌，确定超声的条件和硫辛酸的浓度是其需要解决的一个重要问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有超声联合杀菌存在的缺陷，如超声和热、超声和其它物理加工方法联合存在能耗高、超声和化学抑菌剂联合存在对环境不友好等缺陷，提供一种超声联合植物源抗菌剂杀菌的方法，即多频超声联合硫辛酸杀菌的方法，重在寻找合适的超声条件和硫辛酸浓度来达到杀灭膜醭毕赤酵母的目的，该方法设备简单、操作简便，能耗低、对环境友好，对人体安全，杀菌效果好，具有巨大的工业化应用潜力。
5.为了实现以上目的，本发明采用的步骤如下：
6.首先取膜醭毕赤酵母接种于ypd液体培养基中进行活化培养，培养后的菌液划线于ypd固体培养基，经固体培养基培养后取单菌落接种到ypd液体培养基中，继续在液体培养基中培养，培养后得到种子培养液；
7.取种子培养液接种到ypd液体培养基中，培养一段时间后，得到培养液，进行多频超声联合硫辛酸的杀菌处理；其中多频超声联合硫辛酸的杀菌处理的操作为：在培养液中加入硫辛酸，硫辛酸在溶液中的终浓度为0.3～2.5mg/ml，然后设定超声参数对混合溶液进行超声处理，处理后即实现多频超声联合硫辛酸杀菌的目的；
8.其中超声参数为：频率20、28、40khz的任意一种或多种组合，功率150～300w，间歇比5/3、5/5、10/3、10/5、15/3或15/5s，时间5～20min。
9.进一步的，所述活化培养的条件为：温度28℃，时间20～22h，转速150～180r/min；所述固体培养基培养的温度为28℃，时间为48h；所述液体培养基中培养的条件为：温度28℃，时间48h，转速150～180r/min。
10.进一步的，所述种子培养液接种到ypd液体培养基中，接种量为1～2％(v/v)，培养时间为12h，培养温度为28℃。
11.进一步的，ypd液体培养基的组成为：(以1l用量计)酵母提取物5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，蒸馏水定容至1l。
12.进一步的，ypd固体培养基的组成为：(以1l用量计)酵母提取物5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水定容至1l。
13.进一步的，所述培养液中活菌数量达到107～108cfu/ml。
14.进一步的，所述硫辛酸在溶液中的浓度为2.5mg/ml。
15.进一步的，所述超声频率为20、28、40khz的任意一种或多种组合，功率为150～300w，间歇比为5/3、5/5、10/3、10/5、15/3或15/5s，时间为20min。
16.进一步的，超声频率为20和40khz的组合使用，功率为300w，间歇比为15/3s，时间为20min。
17.本发明的有益效果是：
18.本发明采用的超声频率为20、28、40khz的任意一种或多种组合，功率为150～300w，间歇比为5/3、5/5、10/3、10/5、15/3或15/5s，时间为5～20min；硫辛酸浓度为0.3～2.5mg/ml，能够实现显著的杀菌效果。要达到最优的杀菌效果需要超声条件和硫辛酸的浓度控制在合适的范围内，单独硫辛酸处理的log(n/n0)为-0.768，单独超声处理的log(n/n0)为-0.823；而结合处理的log(n/n0)为-5.012，发明人在长期的研究过程中，创造性的发现采用多频超声联合硫辛酸处理，获得了意想不到的显著技术效果。
19.本发明采用超声联合植物源抑菌剂的方式进行杀菌，可以在达到好的杀菌效果的同时避免环境问题，而且此方法操作简单、高效、能耗低、成本低廉，具备良好的应用前景。
具体实施方式
20.下面结合实施例对本发明进行详细描述，但本发明不局限于这些实施例。
21.各实施例中采用的膜醭毕赤酵母cicc33151购自中国工业微生物菌种保藏中心。各实施例以膜醭毕赤酵母cicc33151在处理前后的杀菌残留率对数值为指标来评价超声联
合硫辛酸对膜醭毕赤酵母的杀菌效果。
22.实施例1：
23.将膜醭毕赤酵母cicc33151接种到ypd液体培养基中，在28℃、150r/min培养活化，将活化后的菌液于ypd固体平板培养基中划线，培养48h，取单菌落接种到50ml ypd液体培养基中，继续在28℃、150r/min摇床振荡条件下培养48h得到种子培养液；
24.将1ml种子培养液转接到50ml ypd培养基中，培养的条件为：温度28℃，时间48h，转速150r/min；培养至对数生长期，得到培养液；使培养液中的活菌数量达到107cfu/ml；取10ml培养液装入无菌的聚乙烯小袋中，接入硫辛酸，使其终浓度为0.3mg/ml，将聚乙烯小袋用夹子固定悬挂在铁架台，放至多频超声反应器超声槽中心并没过水面进行超声处理，超声频率20khz，功率150w，间歇比5/3s、超声时间5min，并使用蠕动泵控制超声槽中的水温保持室温。
25.对处理前后膜醭毕赤酵母进行菌落总数的测定。
26.菌落总数的检测根据gb 4789.2-2010《食品微生物学检验菌落总数测定》，采用ypd固体平板，28℃下培养48h，计数。重复三次，取平均值。杀菌效果采用残存率的对数值log(n/n0)表示，其中，n为杀菌后菌落数，n0为杀菌前菌落数，结果见表1。
27.实施例2：
28.操作步骤同实施例1，与实施例1不同的步骤是：硫辛酸终浓度为1.25mg/ml，超声频率40khz，功率200w，间歇比10/5s、超声时间10min；结果见表1。
29.实施例3：
30.操作步骤同实施例1，与实施例1不同的步骤是：硫辛酸终浓度为2.5mg/ml，超声频率20+40khz，功率300w，间歇比为15/3s、超声时间20min，结果见表1。
31.对比例1：
32.操作步骤同实施例1，与实施例1不同的步骤是：硫辛酸终浓度为2.5mg/ml，不采用超声处理。
33.对比例2：
34.操作步骤同实施例1，与实施例1不同的步骤是：超声频率20+40khz，功率300w，间歇比15/3s、超声时间20min，不加入硫辛酸进行处理。
35.表1超声联合硫辛酸对膜醭毕赤酵母杀菌效果影响
[0036][0037]
通过实验结果可知，虽然硫辛酸能产生一定的杀菌效果，但单独使用时杀菌效果不佳，单独采用多频超声也有一定的杀菌效果，但效果也不理想，两者均无法实现良好的杀菌效果；正常情况下使用2种效果不佳的方式结合仍然实现不了良好的技术效果，所以硫辛
酸结合超声也并非本领域的常规操作；发明人在长期的研究过程中，创造性的发现采用多频超声联合硫辛酸处理，可以显著提高杀菌效果，而且在一定的超声条件和一定浓度范围的硫辛酸的联合处理下，取得了意想不到的技术效果，单独硫辛酸处理的log(n/n0)为-0.768，单独超声处理的log(n/n0)为-0.823；而结合处理的log(n/n0)为-5.012，杀菌效果可以达到商业无菌要求，这为多频超声联合硫辛酸处理在食品加工领域的应用提供了广阔的前景，此项技术不仅取得了很好的杀菌效果，而且能耗低，对环境友好，具有工业化应用潜力。
[0038]
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。