双酵母制备的酿酒酵母培养物及其应用

本发明涉及发酵工程和动物与营养饲料领域，具体地说，涉及双酵母制备的酿酒酵母培养物及其应用。

背景技术：

1、仔猪断奶特别是早期断奶时由于自身“消化道发育不健全”，加上生长与饲养环境、饲料、管理等因素的改变受到的综合应激，在生产中易出现食欲不佳，易导致肠道粘膜免疫屏障受损，导致在仔猪阶段容易出现各种应激性、营养性、病菌性和病毒性等多种腹泻症状。在限抗、禁抗的国内外养殖环境下，增强仔猪肠道健康，提高免疫调节能力，是降低生猪养殖中仔猪死淘率的关键所在。

2、酿酒酵母培养物是一种在特定工艺条件下由酵母菌在特定的培养基(如玉米、麦麸和燕麦等谷物)上经过充分的厌氧发酵后形成的微生态制品，主要由细胞外代谢产品、经过发酵后变异的培养基和少量的已无活性的酵母细胞所构成，其富含肽类、有机酸、寡糖以及未知生长因子，可达到完全替代仔猪日粮替代抗生素，也有部分抑菌型酿酒酵母培养物技术和产品，以及应用酿酒酵母培养物制备的对抗仔猪腹泻的饲料产品，酿酒酵母培养物的功能已经被广泛认可和开发利用。

3、糖蜜是生产大豆浓缩蛋白的副产物，来源广泛价格低廉，但是大豆糖蜜在畜禽养殖中的直接应用受到富含低聚糖(10-20％)限制，所以，近年来有部分学者和企业，利用大豆糖蜜中棉籽糖和水苏糖等功能性低聚糖，开发功能性饲料产品(伍树松，2021；陈河龙，2021；燕飞，2021)，或利用大豆糖蜜发酵获得功能性酿酒酵母培养物产品(刘明，2018)。但是利用大豆糖蜜中棉籽糖、水苏糖和皂苷等成分，结合其他固态培养基的发酵功能成分，形成专用于仔猪的酿酒酵母培养物产品，尚未发现相关报道。

4、果渣、咖啡渣等食品加工的副产物，富含膳食纤维，多项研究表明可应用于反刍动物养殖(刘树民等，2013；施金杰等，2022)。但是，这些食品加工副产物因皂苷、单宁等影响适口性和消化率的抗营养因子，其高糖、高水分的特性也造成了易酸败变质等问题，无法大量直接使用。

5、这些因素严重限制这类食品加工副产物在动物养殖的使用价值，并造成不同程度的资源浪费和环境污染问题。在现今全球食物资源缩紧的大形势下，实现食品加工副产品的合理开发利用，是有利于我国农业提质增效发展的重要途径之一。

6、针对以上问题，本发明以两株酿酒酵母为菌源，利用大豆糖蜜和咖啡渣等发酵原料，通过发酵工程优化研制出针对仔猪腹泻、胀气的功能性酿酒酵母培养物，对我国饲料工业和畜禽养殖具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供双酵母制备的酿酒酵母培养物及其应用。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种双酵母制备的酿酒酵母培养物，其是以食品加工副产物为培养基，接入保藏编号为cgmcc no.24839的酿酒酵母saccharomyces cerevisiae hkb-145007和保藏编号为cgmcc no.13261的酿酒酵母hkb-36进行发酵，得到双酵母制备的酿酒酵母培养物。

3、所述食品加工副产物包括但不限于大豆糖蜜、果渣、咖啡渣、麸皮、玉米皮。

4、其中，酿酒酵母saccharomyces cerevisiae hkb-145007为抑菌型酵母，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号cgmcc no.24839，保藏日期2022年5月6日。该酿酒酵母菌可对咖啡渣等原料高效发酵，其培养物中富含有机酸、多酚等活性物质，提高酿酒酵母培养物的功能性。

5、酿酒酵母hkb-36可参见cn109401990b。该酿酒酵母菌生长代谢能力旺盛，能通过培养基发酵后产生抑菌物质，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等有害菌有显著抑制作用。

6、第二方面，本发明提供所述酿酒酵母培养物的制备方法，包括以下步骤：

7、(1)种子液的制备；

8、(2)液体有氧发酵；

9、(3)固体厌氧发酵；

10、(4)固体发酵产物经破壁得到酿酒酵母培养物成品。

11、具体地，分别制备酿酒酵母hkb-145007和hkb-36的种子液，将酿酒酵母hkb-145007和hkb-36的种子液按体积比4∶6或5∶5混合，接入液体培养基，经有氧发酵获得双酵母菌液，hkb-145007和hkb-36的酵母菌总含量≥5.5g/l(酵母菌干重)；

12、将双酵母菌液与大豆糖蜜按质量比1∶(0.5-1)混合作为发酵剂；将麸皮2份和玉米皮2份混匀高温灭菌后，混入苹果渣或咖啡渣1份，作为固体发酵原料；将发酵剂与固体发酵原料按质量比1∶(1-1.5)混合后，调控水分含量为55％-60％，进行厌氧发酵；其中，所述份为重量份；

13、步骤(4)包括：厌氧发酵结束后，向固体发酵产物中添加发酵产物质量百分数1％的破壁剂，作用4-6h，发酵产品经粉碎、干燥，制成酿酒酵母培养物成品。

14、进一步地，步骤(2)使用的液体培养基是用水将大豆糖蜜稀释为大豆糖蜜质量的2.5倍，并调节ph值为6.0制备而成。

15、步骤(1)包括：将经过斜面菌种活化的酿酒酵母hkb-145007接种至含有麦芽浸出粉145g/l和氯霉素0.08g/l，ph值为6.0的液体种子培养基中，在28℃恒温摇床培养32h，转速150r/min，得到hkb-145007种子液。

16、将经过斜面菌种活化的酿酒酵母hkb-36接种至含有麦芽浸出粉145g/l和氯霉素0.08g/l，ph值为6.0的液体种子培养基中，在28℃恒温摇床培养32h，转速200r/min，得到hkb-36种子液。

17、步骤(2)进行有氧发酵的条件优选为：种子液的接种量为20％-25％，发酵温度29℃，发酵时间36h，通气量2-4l/min，得到双酵母菌液。

18、步骤(3)进行厌氧发酵的条件优选为：发酵温度30℃，发酵时间32h。

19、第三方面，本发明提供所述酿酒酵母培养物的以下任一应用：

20、1)用于制备抑菌生物制品；

21、2)用作饲料添加剂；

22、3)用于畜禽养殖。

23、所述菌包括但不限于金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、大肠杆菌(escherichia coli)、沙门氏菌(salmonella)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)。

24、第四方面，本发明提供一种饲料，包括如下重量份的各成分：酿酒酵母培养物2-3份、膨化玉米50-60份、去皮豆粕15-25份、膨化大豆10-14份、乳清粉2-4份、麦麸0.5-1.5份、鱼粉2-4份、葡萄糖0.5-1.2份、大豆油1-2份、磷酸氢钙1.5-2.5份、石粉0.5-1.5份、食盐0.2-0.5份、l-赖氨酸0.1-0.4份、dl-蛋氨酸0.05-0.2份、l-苏氨酸0.05-0.1份、l-色氨酸0.05-0.1份、l-缬氨酸0.05-0.1份和维生素矿物质预混料1-1.5份。

25、其中，每公斤维生素矿物质预混料含有：维生素a 12000iu、维生素d3 2500iu、维生素e 30iu、维生素k3 3mg、维生素b1 2mg、维生素b3 40mg、维生素b12 12μg、烟酸40mg、泛酸15mg、叶酸1.2mg、生物素0.2mg、氯化胆碱400mg、铁90mg、铜10mg、锌80mg、锰30mg、碘0.35mg和硒0.3mg。

26、第五方面，本发明提供所述饲料在仔猪养殖中的应用。

27、以双酵母菌得到的酿酒酵母培养物在可显著减少和改善断奶仔猪的营养性腹泻和细菌性腹泻，提高断奶仔猪养殖生产成绩。

28、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

29、(一)本发明的酿酒酵母培养物以来源丰富、价格低廉的大豆糖蜜、麸皮、果渣和咖啡渣等工农业加工副产物为主要发酵原料，实现原料资源化利用，这不仅降低生产成本，而且减少了因废弃造成的资源浪费、环境污染等问题。

30、(二)本发明的酿酒酵母培养物富含蛋白质、甘露聚糖、有机酸和多酚等活性物质，以及少量棉籽糖和苏子糖等功能性低聚糖，是一种具有高营养价值的饲料原料。

31、(三)本发明的酿酒酵母培养物的发酵菌株之一--酿酒酵母菌hkb-145007，其代谢产物对仔猪肠道中的有益杆菌有促进作用，对魏氏梭菌等产气荚膜菌属有抑制效果，可对仔猪胀气有较好缓解作用。

32、(四)本发明提供的酿酒酵母培养物通过添加在断奶仔猪饲料中应用，可降低有机酸、氧化锌等原料使用，尤其配合低蛋白日粮技术，在降低仔猪腹泻同时，提高饲料利用率，保障仔猪生长性能。