一种酰胺键水解酶在降解赭曲霉毒素A中的应用的制作方法

本发明属于生物降解，具体涉及一种酰胺键水解酶在降解赭曲霉毒素a中的应用。

背景技术：

1、赭曲霉毒素a(ochratoxin a，ota)是由多种曲霉属和青霉属真菌产生的一种次级代谢产物，会对粮食、蔬果产生污染，常在豆类、咖啡、水果、葡萄酒、坚果和香料中检出。

2、亟需开发高效、可持续的方法以将其从食品和饲料中清除。目前，基于物理、化学和生物的方法和多种降解机制已被探索和应用。例如，物理去除策略包括辐照、光处理、超声处理、热处理、吸附等。化学防治方法包括用二氧化氯、碱、臭氧进行处理等。然而，上述方法在实际应用时仍存在一些缺陷，例如物理处理后毒素降解不完全、使用化学试剂时造成二次污染等。且上述方法普遍存在环境不友好、特异性不强、资源浪费严重、安全风险高等问题，难以满足食品加工和保障粮食安全的实际需求。

3、微生物参与的生物催化具有反应条件温和、环境友好、可持续的优点。然而基于微生物的解毒，存在引入微生物有毒代谢产物、由突变导致的活力下降、在食品和粮食解毒过程中消耗粮食本身营养物质等诸多实际操作中的不可控因素。挖掘特异性酶元件以实现ota生物降解成为一种更为理想的方法。目前已知部分羧基肽酶a、酰胺酶和肽酶可将ota水解为低毒产物。然而此类肽酶对ota降解率较低，通常为30-40％，无法满足实际应用的需求。

4、经典理论认为酶具有严格的底物和反应特异性。然而，近年来研究发现一部分酶能够催化不同于其天然底物的物质发生反应，这种现象即是酶的底物杂泛性的体现。前期研究报道，大肠杆菌中超过30％的酶具有杂泛性，而这些酶催化了大肠杆菌60％以上的内源代谢反应。这种特性也在rueda等建立了protmiscuity数据库上充分反映。protmiscuity中包含了57种酶和其催化的88种原生反应及混杂反应，其中约12％的酶能催化三个及以上的混杂反应。

5、因此，借助毒素降解途径预测和酶元件挖掘方法，开展ota降解酶挖掘，发现新型的能够高效降解ota的酰胺键水解酶，在食品加工和保障粮食安全中具有重要应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种酰胺键水解酶在降解赭曲霉毒素a中的应用。本发明首次发现一种来源于rhodanobacter thiooxydans的酰胺键水解酶具备降解赭曲霉毒素a的功能，所述酰胺键水解酶对赭曲霉毒素a的降解率在99.09％以上，可作为赭曲霉毒素a的解毒剂，在食品加工和保障粮食安全中具有重要应用价值。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种酰胺键水解酶在降解赭曲霉毒素a中的应用，所述酰胺键水解酶具有(i)、(ii)或(iii)所示的氨基酸序列中的任意一个：

4、(i)如seq id no:1所示的氨基酸序列；

5、(ii)与seq id no:1所示的氨基酸序列具有≥90％同源性的氨基酸序列，且与(i)所述序列功能相同或相似的氨基酸序列；

6、(iii)seq id no:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(i)所述序列功能相同或相似的氨基酸序列。

7、seq id no:1：

8、msmprlllvvavsclplaagadaparddagsqrinliecarlldpaagrmlgqttlviedgrikeihpgaidiepyrkaagtlrvvrlpdatcmpglidshthltmqfsrdsysdkfrlnpadhairgtvyakrtllagfttvrnlgdddnasialrnavnaglvpgphifttgkplgttgghadpsngfrwdlqgdpgpkdgiidspaeawkavrqhykdgadlikimpsggvldessssgnpqmtleeieavvaaahdygftvaahahgaeairravlggvdsiehgtfmdapdmklmkehgtwyvptiiagqyvmekakqgwyppqvarkaeevgpvildtagkaykagvkiafgtdagvyphgdnarefvymvqagmpsmfvlqaatthaaellhksdqlgriavgrgadviavpgnpldditvmqhvsfvmkdgvvykqdgkpai。

9、优选地，所述酰胺键水解酶来源于rhodanobacter thiooxydans。

10、优选地，所述酰胺键水解酶催化赭曲霉毒素a中的酰胺键断裂。

11、本发明首次发现一种来源于rhodanobacter thiooxydans的酰胺键水解酶(氨基酸序列如seq id no:1所示)，长度450氨基酸，在实验条件下降解了99.09％的赭曲霉毒素a，展现了良好的降解效率。所述酰胺键水解酶催化赭曲霉毒素a降解为无毒性物质(如图1所示)，赭曲霉毒素a中含有酰胺键，是良好的水解位点，所述酰胺键水解酶水解赭曲霉毒素a的酰胺键生成已被报道毒性显著降低的赭曲霉毒素α和l-苯丙氨酸。

12、可以理解，本技术发现了来源于rhodanobacter thiooxydans的酰胺键水解酶(氨基酸序列如seq id no:1所示)具备降解赭曲霉毒素a的功能，那么rhodanobacterthiooxydans或相近菌株中的序列及功能与seq id no:1所示序列相同或相似的酶均能预期其具备降解赭曲霉毒素a的功能。此外，利用本领域通用技术手段对seq id no:1所示序列进行取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基改造而获得的酶，同时功能与原蛋白相同或相似，亦可预期其具备降解赭曲霉毒素a的功能。

13、优选地，所述酰胺键水解酶包括天然来源的或人工合成的。

14、优选地，所述天然来源的酰胺键水解酶为从rhodanobacter thiooxydans的培养液中分离纯化得到的酰胺键水解酶。

15、优选地，所述人工合成的酰胺键水解酶为通过基因工程表达的酰胺键水解酶。

16、优选地，所述基因工程表达的酰胺键水解酶采用包括如下步骤的方法制备得到：

17、(1)合成编码酰胺键水解酶的核酸，将核酸序列连接到蛋白表达载体质粒，得到反应模版质粒；

18、(2)将所述反应模版质粒加入到无细胞反应体系中，孵育后得到基因工程表达的酰胺键水解酶。

19、优选地，步骤(1)中，所述编码酰胺键水解酶的核酸包括seq id no:2所示的核苷酸序列。

20、seq id no:2：

21、atgtctatgccaagattgttgttggttgttgctgtttcttgtttgccattggctgctggtgctgacgctccagctagagacgacgctggttctcaaagaatcaacttgatcgaatgtgctagattgttggacccagctgctggtagaatgttgggtcaaaccaccttggttatcgaagacggtagaatcaaggaaatccacccaggtgctatcgacatcgaaccatacagaaaggctgctggtaccttgagagttgttagattgccagacgctacctgtatgccaggtttgatcgactctcacacccacttgaccatgcaattctctagagactcttactctgacaagttcagattgaacccagctgaccacgctatcagaggtaccgtttacgctaagagaaccttgttggctggtttcaccaccgttagaaacttgggtgacgacgacaacgcttctatcgctttgagaaacgctgttaacgctggtttggttccaggtccacacatcttcaccaccggtaagccattgggtaccaccggtggtcacgctgacccatctaacggtttcagatgggacttgcaaggtgacccaggtccaaaggacggtatcatcgactctccagctgaagcctggaaggctgttagacaacactacaaggacggtgctgacttgatcaagatcatgccatctggtggtgttttggacgaatcttcttcttctggtaacccacaaatgaccttggaagaaatcgaagctgttgttgctgctgctcacgactacggtttcaccgttgctgctcacgctcacggtgctgaagctatcagaagagctgttttgggtggtgttgactctatcgaacacggtaccttcatggacgctccagacatgaagttgatgaaggaacacggtacctggtacgttccaaccatcatcgctggtcaatacgttatggaaaaggctaagcaaggttggtacccaccacaagttgctagaaaggctgaagaagttggtccagttatcttggacaccgctggtaaggcttacaaggctggtgttaagatcgctttcggtaccgacgctggtgtttacccacacggtgacaacgctagagaattcgtttacatggttcaagctggtatgccatctatgttcgttttgcaagctgctaccacccacgctgctgaattgttgcacaagtctgaccaattgggtagaatcgctgttggtagaggtgctgacgttatcgctgttccaggtaacccattggacgacatcaccgttatgcaacacgtttctttcgttatgaaggacggtgttgtttacaagcaagacggtaagccagctatc。

22、优选地，步骤(1)中，所述蛋白表达载体质粒包括d2p表达质粒。

23、优选地，步骤(2)中，所述孵育的条件为35-37℃(例如可以是35℃、36℃或37℃等)反应2.5-3.5h(例如可以是2.5h、3h或3.5h等)。

24、第二方面，本发明提供一种降解赭曲霉毒素a的方法，所述方法包括：将第一方面所述的酰胺键水解酶与含有赭曲霉毒素a的样品混合，实现降解赭曲霉毒素a。

25、第三方面，本发明提供第一方面所述的酰胺键水解酶在制备降解赭曲霉毒素a的产品中的应用。

26、第四方面，本发明提供一种赭曲霉毒素a生物降解剂，所述生物降解剂含有第一方面所述的酰胺键水解酶。

27、优选地，所述生物降解剂还包括载体、防腐剂或蛋白保护剂中的任意一种或至少两种的组合。

28、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

29、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

30、本发明首次发现一种来源于rhodanobacter thiooxydans的酰胺键水解酶具备降解赭曲霉毒素a的功能，所述酰胺键水解酶对赭曲霉毒素a的降解率在99.09％以上，可作为赭曲霉毒素a的解毒剂，在食品加工和保障粮食安全中具有重要应用价值。