高抗氧化活性、低毒副作用的有机硒黄酮类化合物的制备及应用

本发明涉及功能食品，具体涉及高抗氧化活性、低毒副作用的有机硒黄酮类化合物的制备及应用，特别是将所述有机硒黄酮类化合物作为抗氧化活性成分在功能食品因子中的应用。

背景技术：

1、活性氧(reactive oxygen species,ros)参与调节生物体的各种生理功能方面发挥着重要作用。当机体受到外界环境的有害刺激时，机体内各种蛋白酶的分泌失控，导致生物系统中活性氧(ros)与抗氧化防御系统失衡，进而诱发细胞和组织水平的病理改变。动脉粥样硬化、神经退行性疾病、老年性病变、癌变发生等均与ros积累和氧化应激密切相关。

2、因此，为了预防和治疗这类疾病，减少体内过多的自由基，抗氧化剂可以起到非常有效的作用。市面上有很多合成抗氧化药物，但都有一定的副作用，不利于长期使用。天然抗氧化剂比化学合成的抗氧化剂安全得多，而且它们的某些抗氧化效率也可能高于合成药物。食品资源和药食同源植物如藤茶、葛根等来源的天然黄酮具有多样性和生物活性的药效团，具有特定的空间和电子特性，它们可以防止脂质过氧化，维持体内自由基的平衡，从而提高机体抵抗氧化应激引起的一系列疾病的能力。

3、藤茶来源的黄酮报道如下：cn202310937129.4的专利申请，仅涉及一种藤茶茎或叶总黄酮分离方法及乳膏的制备及应用；cn202210725262.9的专利申请，仅涉及一种藤茶黄酮提取物及其在制备复配藤茶黄酮口服液中的应用；cn201811211063.6的专利申请，仅涉及一种藤茶黄酮组合物醇质体及其制备方法和应用；cn201210039472.9的专利申请，也仅涉及一种藤茶面膜胶囊及其制备方法。可以看出，目前关于从新食品资源藤茶和多种药食同源植物葛根、天麻、皱皮木瓜组合提取硒黄酮，并用于制备高抗氧化活性、低毒副作用的功能食品因子在食品领域的应用未见报道。故行业内需要一种高抗氧化活性、低毒副作用的功能食品因子，防止脂质过氧化，维持体内自由基的平衡，从而提高机体抵抗氧化应激引起的一系列疾病的能力。

4、藤茶系葡萄科蛇葡萄属，植物名为显齿蛇葡萄[ampelopsis grossedentata(hand-mazz)w.t.wang]，是藤本植物，是2013年批准的新食品原料，属于新食品资源。藤茶是西南地区重要的特色经济作物，黄酮含量高达30％，素有“黄酮之王”的美称，仅恩施地区人工种植面积近10万余亩，年产值突破了20亿元。藤茶具有丰富的黄酮、硒多糖含量，现代药理学研究证明其黄酮成分具有清热解毒，利咽消肿、平肝降压的功效，已被民间广泛应用于降血脂、降血压、抗发炎感染等预防和治疗。但是目前关于对新食品资源藤茶来源的硒黄酮抗氧化活性研究、从藤茶中制备硒黄酮的工艺技术未见报道。现有技术中也没有关于藤茶来源的高抗氧化活性、低毒副作用的硒黄酮成分在用于制备体外抗氧化活性的功能食品因子中的应用。

5、基于上述理由，提出本技术。

技术实现思路

1、基于上述理由，针对现有技术中存在的问题或缺陷，本发明的目的在于提供一种高抗氧化活性、低毒副作用的有机硒黄酮类化合物的制备及其在功能食品因子中的应用，解决或至少部分解决现有技术中存在的上述技术缺陷。

2、为了实现本发明的上述第一个目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种高抗氧化活性、低毒副作用的有机硒黄酮类化合物的制备方法，包括将富硒藤茶、富硒葛根、富硒天麻、富硒木瓜粉碎，然后按配比混合、低温回流提取、中空纤维超滤膜除杂、活性炭除色素、反相硅胶除脂和多糖、凝胶色谱除杂、冷冻或喷雾干燥的步骤。

4、进一步地，上述技术方案，所述有机硒黄酮类化合物包含二氢杨梅素、杨梅素、葛根素、大豆苷、天麻素、对羟基苯甲醇、齐墩果酸、熊果酸、有机硒等活性成分。

5、进一步地，上述技术方案，所述获得的有机硒黄酮类化合物得率≥10％。所述有机硒黄酮类化合物中总黄酮含量≥85％；二氢杨梅素含量为60～70％，杨梅素含量为0.5～1.0％、葛根素含量为0.5～0.9％、大豆苷含量为0.3～0.6％、天麻素含量为1～1.5％、对羟基苯甲醇含量为0.1～0.3％、齐墩果酸含量为0.2～0.8％、熊果酸含量为0.2～0.8％。

6、进一步地，上述技术方案，所述获得的有机硒黄酮类化合物中有机硒含量≥0.15mg/kg，明确了有机硒黄酮类化合物中所含se元素通过se-o-c和se-s-c的方式结合到黄酮单体分子上。现有很多技术的硒黄酮不能明确硒元素的存在形式(仅描述为有机硒或无机硒的存在形式)，而无机硒的形式存在对人体有毒副作用。

7、进一步地，上述技术方案，上述所述富硒藤茶、富硒葛根、富硒天麻、富硒木瓜这些原料中有机硒的含量均≥1.2mg/kg。在本发明的优选实施例中，本发明选择恩施富硒土壤生长的富硒藤茶、富硒葛根、富硒天麻、富硒木瓜，通过自身吸收se元素并代谢转化为有机se元素结合到自身的黄酮、多糖、蛋白等大分子物质上，提高了se元素的生物转化效率，以上述富硒原料获得的有机硒黄酮类化合物具有安全无毒的特征。

8、进一步地，上述技术方案，选择富硒藤茶、富硒葛根、富硒天麻、富硒木瓜(特别是富硒皱皮木瓜)原料干重配料比例为：4.5～5.0：1.0～1.5：1.0～1.5：1.0～1.5。所选原料中，藤茶的黄酮含量达20％(w/w)以上，而且各种原料黄酮含量、黄酮种类及抗氧化效果也不一样。随意改变原料的比例会影响最后硒黄酮的得率的得率、黄酮状态性质及抗氧化活性，也会导致对正常细胞的毒性。

9、进一步地，上述技术方案，在本发明的优选实施例中，所述低温回流提取具体是选择65wt％～70wt％的乙醇溶液作为提取溶剂，采用的提取温度≤65℃，例如可以是55～65℃。采用的回流提取时间为1.0～1.5h，料液比为1/50～2.5/50g/ml。

10、具体地，上述技术方案，采用低温回流提取，能直接运用于大规模生产实践，低温可极大限度保护黄酮生物活性成分，具有操作简单、利于工业化生产的优势。本发明选择65wt％～70wt％乙醇溶液作为提取溶剂，因为原料中的活性成分极性范围与其相似，选择其作为提取溶剂具有最佳的溶解度和提取效率。提取料液比为1/50～2.5/50g/ml，过高的料液比会导致原料中活性成分的黄酮成分溶解不充分，浪费原材料；过低的比例又会导致从乙醇溶液中富集回收黄酮活性成分较为困难，增加生产成本。

11、进一步地，上述技术方案，因为各植物原料的组织碎片、细胞碎片等杂质大多大于0.45μm。本发明所述中空纤维超滤膜除杂具体是将低温回流提取所得提取液直接经0.22～0.45μm中空纤维超滤膜除杂，有效去除固体杂质颗粒、变性不溶解的生物大分子dna、蛋白质等杂质。

12、进一步地，上述技术方案，所述活性炭除色素，本发明选择1/100～2/100g/ml的料液比颗粒状活性炭吸附除色素。本发明精确地控制富集颗粒状活性炭的料液比，过高比例加入颗粒状活性炭会导致有机硒黄酮类化合物也被吸附到活性炭的表面，有机硒黄酮类化合物回收不充分，导致原料的浪费和最后总黄酮的得率不高；而过低的比例加入颗粒状活性炭会导致色素等杂质吸附不充分，最后的有机硒黄酮类化合物中杂质含量太高，也会加大生产成本。

13、进一步地，上述技术方案，所述反相硅胶除脂和多糖的步骤，具体是将活性炭除色素后所得滤液，进一步通过反相硅胶柱除脂和多糖等杂质，除杂过程包括依次进行的料液比1/500～5/500g/ml的超纯水洗脱除多糖、料液比1/500～2/500g/ml的70wt％～80wt％乙醇溶液洗脱过程。

14、更进一步地，上述技术方案，在本发明的优选实施例中，选择c18反相硅胶(孔径100a，粒径40～60μm)纯化除多糖、脂类。反相硅胶表面键合c18碳链对弱极性的脂类物质有较强的吸附力，对多糖、酚类等强极性化合物有较弱的吸附力，呈现非常好的分离效果，达到快速有效除杂的效果。

15、具体地，上述技术方案，在本发明的优选实施例中，料液比1/500～5/500g/ml的超纯水洗脱除多糖、料液比1/500～2/500g/ml的70～80wt％乙醇溶液洗脱c18反相硅胶，收集乙醇洗脱液为目标洗脱液。其中：料液比1/500～5/500g/ml的超纯水能有效除去强极性活性成分的多糖、有机酸、多酚；料液比1/500～2/500g/ml的70～80wt％乙醇溶液能高效地将硒黄酮目标物质洗脱下来，使弱极性的脂类等杂质保留在硅胶上面，有效除去了脂类和多糖类等强极性和弱极性化合物。便于后期通过凝胶色谱除去大分子、小分子杂质。

16、进一步地，上述技术方案，所述凝胶色谱除杂步骤，在本发明的优选实施例中，采用凝胶(sephadex g-25)色谱柱层析除杂，选择70～80wt％的乙醇溶液洗脱过凝胶色谱柱纯化，按总洗脱体积1/3收集为一组分，收集到第二个组分即为目标洗脱液，浓缩，并冷冻或喷雾干燥，为精制的高抗氧化活性、低毒副作用的有机硒黄酮类化合物。本发明利用极性和分子量两个指标对目标硒黄酮进行了有效的除杂质处理，使得到的有机硒黄酮类化合物的纯化总黄酮含量≥85％以上，这是现有技术办法没有达到的纯度。

17、进一步地，上述技术方案，所述冷冻干燥的温度为-20～-25℃，时间为6～8h。

18、本发明的第二个目的在于提供采用上述所述方法制备得到的高抗氧化活性、低毒副作用的有机硒黄酮类化合物。

19、本发明的第三个目的在于提供采用上述所述方法制备得到的高抗氧化活性、低毒副作用的有机硒黄酮类化合物作为抗氧化活性成分在功能食品因子中的应用。

20、本发明提供了一种具有抗氧化活性的功能食品因子，包括上述所述方法制备得到的高抗氧化活性、低毒副作用的有机硒黄酮类化合物。

21、本发明提供了一种具有抗氧化活性的功能食品，包括上述所述具有抗氧化活性的功能食品因子和食品药学上可接受的任意剂型的辅料。

22、进一步地，上述技术方案，所述功能食品包括固体饮料、速溶茶、罐装液体饮料、冲剂等。

23、本发明依据中药配伍原则即“四气五味”，根据七情配伍、君臣佐使的原则，整合既是食品又是药品的葛根、天麻、木瓜和新食品资源藤茶及其对应的药性数据组合成强抗氧化的方剂。现代药理学研究发现：葛根富含异黄酮抗氧化活性成分，具有升阳透疹，生津止渴，解肌退热的作用；天麻富含黄酮、多酚、多糖等抗氧化活性成分，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络、健脑保护神经等功效；木瓜(特别是皱皮木瓜)富含如多酚、有机酸、黄酮类多种天然抗氧化活性成分，具有活筋活络、胃化湿、抗炎镇痛等功效。因此，以葛根、天麻、木瓜配伍藤茶，能获得更具抗氧化功效的抗氧化活性成分。硒元素作为人体必需的微量元素之一，具有降血糖、抗衰老、提高人体免疫力等预防保健作用，享有“生命的火种”、“长寿元素”等美誉。因此，从食品资源植物来源的富硒黄酮具有独特的优势。但现有行业内还没有从新食品资源藤茶及配伍葛根、天麻、木瓜组合中提取有机硒黄酮类化合物以及在抗氧化方面的作用。

24、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

25、(1)本发明研究发现，以新食品资源藤茶组合葛根、天麻、木瓜等药食同源中药材为原料，提取了较高得率的有机硒黄酮类化合物，而且提取的硒黄酮具有极强的dpph自由基清除活性，且还同时对正常人肾小管上皮细胞(hkc)没有毒副作用。

26、(2)现有技术未对提取的硒黄酮的硒存在形式、黄酮成分做研究。本发明研究发现，我们明确了制备的有机硒黄酮类化合物的黄酮纯度、黄酮单体组成、相对含量等结构特征。

27、(3)中药材中众多的活性成分含有不饱和键，正是这些不饱和化学键使其具有抗氧化功效。但是这也使得活性物质本身变得极为不稳定，在高温下容易与氧气发生反应导致物质失去活性。因此，本发明采用的低温回流提取不同于现有技术中其他方法在于能极大程度保护活性成分不被破坏。其次，本发明具有操作简单、利于工业化生产的优势，直接运用于大规模生产实践。

28、(4)本发明采用中空纤维超滤膜除杂工艺，与现有技术相比，减少了提取液中的固体杂质颗粒对后续活性炭、反相硅胶填料的污染，提高了活性炭对色素分子的提取效率，提高了活性炭的使用寿命，有效降低生产成本。

29、(5)本发明研究发现，本发明制备得到的有机硒黄酮类化合物具有极强的dpph自由基清除活性，同时对正常人肾小管上皮细胞(hkc)、正常肺上皮细胞系beas-2b均没有毒副作用和损伤。而现有技术中很多的合成抗氧化药物都有一定的副作用，不利于长期使用。本发明提供的有机硒黄酮类化合物已经证明对正常细胞活性没有影响，具有来源安全的特点，很好的解决了现有抗氧化剂的毒副作用问题，因此本
技术实现要素：
对抗氧化功能食品领域的发展具有重要意义。

30、(6)本发明所述的有机硒黄酮类化合物在功能食品因子中的浓度为0.4mg/ml时，对dpph自由基清除率为95～100％；浓度为0.1mg/ml时，对dpph自由基清除率为20～25％。

31、并且，本发明所述的有机硒黄酮类化合物浓度为0～400ug/ml时，对正常人肾小管上皮细胞(hkc)抑制率均为0％。

32、本发明所述的有机硒黄酮类化合物浓度为0～400ug/ml时，对正常肺上皮细胞系beas-2b抑制率也均为0％。