专利名称：一种生产具改善了的生物学效应的藻类的方法
技术领域：
本发明涉及生产改善了的生物学效应的藻类的方法。
从远古时期起，人类就将藻类用作养分和食物。远东的人们是消费藻类的主力;但是，近来，发达国家也使用干固形式或片剂的藻类。藻类是具有极高营养价值的载体，因为干固形式的藻类含有高浓度的健康生命所必须的物质，例如，维生素、蛋白质、蛋白微元素的复合物、糖份，多聚不饱和脂肪酸等。
近来，环境污染已成为世界性的问题。今天，有毒重金属(如，铅、汞、镉、铜)及致癌物(如浓缩的多环芳族化合物)对海洋的污染已不容忽视。这些物质积聚在海藻体内是个难题。由海洋获得的或在其它天然条件下繁殖的“完整海藻”，不能用于人或动物的养分，食物、化妆品和药品;只有事先经提纯除去了生物学有害物质之后的“完整海藻”的一些组分才是可用的。这类提纯方法之一，参见CaramesdeGuovea“CosmeticsandToiletries”95，47(1980)。然而，提纯使一部分生物学活性成分被分解，因此，所获的海藻成分的生物学价值显著地降低(ZajicPropertiesandProductsofalgaeEditionPlanum，NewYork，〔1970〕)。
因此，制备没受环境污染的无菌藻类已渐重要。
已知有一些人工培育藻类的方法，例如，于阳光下的盆中，或在保证无菌条件的封闭空间内于天然光照或人工光照或无光照条件下培育藻类。
据日本公开专利第5696690号，藻类的培育使用海藻，无菌海水，人工光照，含各种养分盐的溶液。
据日本公开专利第4517146号，单细胞绿小球藻的工业化培育是使用无菌淡水培养基并在排除二氧化碳和光照的条件下完成的。
法国专利2103462号也揭示了单细胞淡水绿藻的培育，其工业化的培育是使用含适当养分盐的营养液以光合成的方式来实现的。
据匈牙利公开专利第4613/84和4614/84号，藻类的培育是在天然来源的矿泉水、医用水或供热水中，或它们的混合物中，并添加金属化合物至10-2mole/L的浓度来实现的。
在任何已知的方法中，用于制造食品、饲料或医药的藻类均是在无菌条件下人工生产的。在这些方法中，培育藻类的条件所导致的结果是，所获藻类的性质与在无环境污染的天然条件下生长的藻类相似;或由于人工培育的方式不同，使所获藻类的性质稍差。
由现有技术的方法人工培育的藻类，如果含有几种元素，如硒，锌和银的话，也只是微量的。
已知的是硒具有多种生物学功能，参见ThressaetalNutritionReview35，7(1977)，Shamberger.J.ofEnv.Path.andTox.4，305(1980)，Masukawaetal.Experientia39，405(1983)。还知道的是，硒具有降低血压的效应，改善心脏的局部缺血，含氧量低和梗塞的状态，以及抑制中枢神经系统的蜡性脂褐质化(Ceroidallipofuscinosis);硒还对牙周炎有改善效应，降低患癌症的可能性;此外，硒还被认为是一种突变抑制剂。还已证实的是，缺硒可以引起多种疾病，例如，肝坏死，肌坏死，血红细胞膜破裂，心电图中的ST升高，恶性营养不良综合症及多种硬化症。
硒的有益作用主要是基于其激活谷胱甘肽过氧化酶的效应，该酶是抑制有害过氧化过程的重要内生抑制子。作为谷胱甘肽酶辅基的不可缺少的成分，硒是生命中最重要的不可缺少的物质之一，硒不在生物体内积聚，因此要不断地补充。直至今日，也只能通过无机化合物(二氧化硒，亚硒酸钠等)将硒引入生物体内。
本发明的目的是要提供具特殊生物学性质的藻类，而且，由于硒含量的增高，可以保证硒的生物学效应。
本发明基于这样的认识，即在某种条件下，藻类不仅能在含硒的溶液中生存(也就是不死去)，而且还能生长，因而，可在含高浓度硒的营养溶液中培育。这是令人惊奇的认识，因为，先有技术认为，藻类会被毒性的硒杀死。再者，本发明还基于这样的认识，即，硒被掺入到于某一条件下在含硒培养基中培育的藻类生物体内。
因此，本发明涉及制备具改善了的生物学效应的藻类的方法，其中，所选择出的藻类在无菌条件下，于含有淡水和营养盐分的培养基中，在有二氧化碳和光存在的情况下，以光合成的方式培育，或者，在无光条件下，在还含有碳，氮，氢，氧的培养基中培育，然后，分离所获的藻类。根据本发明，无机的或(和)有机的硒化合物以10-7至2×10-3摩尔/升的浓度加到培养基中，然后，在培养基上接种能掺入硒的藻类的纯培养物。该纯培养物的获取方法是，将所选定的藻类接种到液体培养基中，该培养基含有无机的(也可含有机的)营养成分，然后用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理。在通过突变所获的单个藻中，选择出能在含硒培养基中培养时即能掺入硒，并且生长率至少与野生品系相同的藻。用如此所获的纯培养物接种培养基后，经过培育期，分离出藻，如果需要、再干燥至最适含水量，用已知的超声方法或研磨方法使之分解。
根据本发明，能掺入硒的藻的纯培养物最好从单细胞绿藻或兰藻中制备，如小球藻(Chlorellasp)，栅藻(Scenedesmus sp.)及螺旋藻(Spirulina sp.)，具体方法为，在用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理后，小心地将细胞洗出来，分散到一系列固体培养基中，这些培养基经稀释而制成，并且补充了浓度为10-7至2×10-3摩尔/升的硒化合物。在所培养出的藻中，选择出迅速生长并又能掺入硒的最优选的品系，用液体培养基进一步培育，这样得到的纯藻培养物是可用于工业生产的。
这样，在生长期间，硒被掺入到按上述处理过的藻类生物体内，其浓度平均比原有藻高出104倍。
在工业化培育能掺入硒的藻的培养基中，以蒸馏水作为液体。在这类培养基中，除了常规的营养物质之外，还补充以无机的或(和)有机的硒化合物。如此制备的并经灭菌的培养基接种藻的种子培养物，即如上所述的能掺入硒的种类。在其生长过程中，藻将硒摄入到其生物体内，且没有以上所述的不期望的毒性污染。
将如此制备的藻从培养基中分离出，用已知方法，在温和条件下，以最适的65℃温度，最高不超过80℃，进行干燥。干燥后的藻，用研磨适当分解为约1微米大小的颗粒。另外，湿的藻类浓缩物也可经超声处理分解，然后以上述条件干燥。
这样得到的是含硒量为250-400μg/g的藻粉，它可以直接被应用或消费，或用于食品，饲料和化妆品中，或与药物和生物学活性物质一起使用，或(和)作为这些物质的添加剂，其形式可以是这些产物的任何商品形式，优选的是片剂、胶囊或其他剂型。
本发明方法的主要优点可以总结如下a)藻类可以按廉价易行的方法并用简便的设备来培育。
b)培育后不需纯化和多步骤的后处理。
c)藻类是于无菌条件下培育的，排除了环境污染，因而，毫无疑问的是这样获得的藻可被人类消费。
d)能够得到具有比现有藻类的含硒量更高且具有改善了的生物学和生理学效应的藻类。
e)依本发明方法所获的藻类可以广泛地(并且优选地)应用于营养品、化妆品、医药以及其它领域。
依本发明方法获得的藻类最优选的应用是治疗领域，因为硒是谷胱甘肽过氧化物酶辅基的活化剂。硒不在生物体内聚集，使用本发明方法所获的藻则可以补充硒，从而使由于缺硒所引起的各种健康损害均可得到治疗。
以下的非限制性的实例更详细地说明了本发明。
实例1在25-27℃，将栅藻(Scenedesmusobtisiusculus)接种在含100-500μg/mlN-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍的Bold氏液体培养基上，放在250ml烧瓶中摇振培养30分钟。然后，用水小心洗出细胞，分散到用琼脂固化的一系列Bold氏培养基上。这一系列的培养基中含有硒，其浓度为从3.125μg/ml开始，按成倍地增长直至400μg/ml。在这些培养基上生长并存活的群体被分离出来，将所选择的细胞系在含至少20μg/ml硒的Bold氏营养液中以实验室级进行繁殖。最适于掺入硒的且具有和野生(对照)品系几乎相导的生长率的群体在含有至少20μg/ml硒的培养基中繁殖。
将细胞分离出，小心地用水洗，超声分解，以65℃干燥，再以原子吸收法测定藻的含硒量。
按上述所获藻粉的含硒量如下所示品种含硒量(μg/g藻粉)未处理的野生Ⅰ号50未处理的野生Ⅱ号30FM-I-1201300FM-I-18712400FM-441/871600FM-449/871800实施例240mg亚硒酸钠加到装于10升容积的藻类繁殖玻璃瓶内的8升Knop-Pringsheim氏培养基上。将所获的营养液在超过一巴的压力下于121℃灭菌30分钟。将无菌液冷却，再用能掺入硒的栅藻(Scenedesmusobtisiusculus)的纯净培养物接种。在25℃，将含5%二氧化碳的无菌空气吹入培养基，整个系统用放电管照明，光照为4000lux，波长为440-520和640-700μm。
经14天培养后，从培养基中分离出藻，用水洗，超声处理分解，在65℃以下小心干燥。所获藻粉的含硒量为1200μg/g。
实施例3装于10升藻类繁殖器内的8升蒸馏水中，溶入8.0g硝酸钠，0.8g硫酸镁半水合物，0.8g磷酸氢二钾，2.5mlAron氏微量元素溶液，5g葡萄糖，0.1g半胱氨酸，0.1g甲硫氨酸。向该营养液中补充50mg亚硒酸钠，用无菌滤器过滤，在保证无菌条件下，接种纯净的可掺入硒的栅藻(Scenedesmusobtisiusculus)。经4天于25-28℃暗处繁殖后，从培养基中分出藻，用水洗，超声分解，65℃以下干燥。所获藻粉的硒含量为1380μg/g。
实施例4遵循实施例2所述方法，只是不用热处理，代之以G-5型消毒细菌滤器过滤消毒培养基。所获藻粉的含硒量为1300μg/g。
实施例5按实施例2或3所述方法，不同之处在于，用经过实施例1所述的突变处理而得到的能掺入硒的小球藻(Chloellavulgaris)取代栅藻(Scenedesmusobtisiusculus)。
所获藻粉的含硒量为品种含硒量(μg/g藻粉)“野生”Ⅰ型140“野生”Ⅱ型140DV-35-423200
DV-78-202300DV-104-211500实施例6遵循实施例2或3所述的方法，只是用能掺入硒的小球藻(Chlorellaminitissima)取代栅藻(Scenedesmusobtisiusculus)。所获藻粉的含硒量为1400μg/g。
实施例7遵循实施例2或3所述的方法，不同点在于，营养液升温最多至50℃，使用耐温且能掺入硒的藻(Aphanocapsathermalis))。所获藻粉的含硒量为品种含硒量(μg/g藻粉)“野生”型130DV-12-2201100DV-12-3401550实施例8遵循实施例2所述的方法，不同之处在于，使用属于兰藻的且能掺入硒的螺旋藻(Spiruliansp.)取代栅藻(Scenedesmusodtisiusculus)。所获藻粉的含硒量为
品种含硒量(μg/g藻粉)“野生”型130DV-12-2201100DV-12-3401550实施例8遵循实施例2所述的方法，不同之处在于，使用属于兰藻的且能掺入硒的螺旋藻(Spiruliansp，)取代栅藻(Scenedesmusobtisiusculus)。所获藻粉的含硒量为品种含硒量(μg/g藻粉)“野生”Ⅰ型50“野生”Ⅱ型30HE-87-1041100HE-89-2411200HE-89-3021500实施例9遵循实施例2所述的方法，不同之处在于，营养液的温度降低至8℃，使用耐寒且能掺入硒的丝状兰藻(Nostoccommune)。所获藻粉的含硒量为
品种含硒量(μg/g藻粉)“野生”型140BK-1218-21140实施例10在经过消毒过滤并装于10升藻类繁殖瓶中的8升Bold氏培养基中加入5×10-3亚硒酸钠。用按实施例1所述制备的能掺入硒的小球藻(Chlorella fusca)接种所获的培养基。按实施例2所述使藻繁殖14天。然后过滤，小心用水洗，在80℃以下干燥。所获藻粉的含硒量为2700μg/g。
实施例11用按实施例1所述繁殖的能掺入硒的栅藻(Scenedesmus obliquus)接种到含8升Bold氏营养液和10-7M亚硒酸钠的培养瓶中，然后，按实施例10所述方法，得到的藻粉的含硒量为300μg/g。
实施例12遵循实施例2的方法，不同之处在于，分离出的藻在65℃干燥，研磨分解至1μm颗粒，所获藻粉的含硒量为1200μg/g。
权利要求
1.一种制备具改善生物学效应的藻类的方法，其中，在无菌条件下，在有二氧化碳存在和光照条件下，于含有淡水和营养盐分的培养基中，以光合成的方式培育所选择的藻类，或者在无光条件下，在还含有碳、氢、氧和氮的培养基中培育所选择的藻，该方法包括，以10-7-2×10-3摩尔/升的浓度加入无机的或(和)有机的硒化合物，以能掺入硒的纯净藻种接种培养基，如果需要，在培育和用超声或研磨分解藻类之后，使其干燥，其中纯净的藻种获得方法是用所选择出的藻接种含无机(也可含有机的)养分的液体培养基，再以N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理，然后，在另外还含有硒的培养基中培育该种藻，最后，选择出即能掺入硒同时又具有至少与原来藻类相等的生长率的藻。
2.根据权利要求1所述的方法，其中包括在培养基中使用亚硒酸钠和(或)二氧化硒作为无机硒化合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中包括在培养基中使用硒代胱氨酸和(或)硒蛋氨酸作为有机硒化合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中包括使用小球藻(Chlorella)或栅藻(Scenedesmus)的品种作为所选择出的藻类。
5.根据权利要求1所述的方法，其中包括使用藻(Aphanocapsa thermalis)作为所选择的藻。
6.根据权利要求1所述的方法，其中包括使用地木耳(Nostoc commune)作为选择的藻。
7.根据权利要求1所述的方法，其中包括使用小球藻(Chlorella minitissim或Chlorella fusca)作为选择出的藻。
8.根据权利要求1所述的方法，其中包括使用淡水兰藻作为选择出的藻。
9.根据权利要求8所述的方法，其中包括使用螺旋藻(Spirulina sp.)作为兰藻。
10.根据权利要求1所述的方法，其中包括使用栅藻(Scenedesmus obtisiusculus或Scenedesmus oblignus)作为所选择出的藻。
全文摘要
本发明涉及制备富含硒的且具有改善了的生物学效应的藻，在无菌培养条件下，以光合成的方式或在排除空气的条件下，发展出适于掺入硒的藻类，以含硒浓度为10
文档编号C12R1/89GK1034842SQ88101399
公开日1989年8月23日 申请日期1988年3月18日 优先权日1988年2月9日
发明者彼得·利特瑞特·那格, 加保·宝加克, 埃塞比特·瑞得维尼, 米克劳斯·法毕安, 加保·尼·瑞泽, 加尼·丝勃毕瑞克 申请人:科拉·科麦蒂凯·哈茨塔尔塔维伊帕里·瓦拉尔