一种检测烟气总粒相物对细胞炎症效应因子影响方法与流程

本发明属于烟草制品生物学效应评价技术领域，特别涉及一种检测烟气总粒相物对细胞炎症效应因子影响方法。

背景技术：

随着人们对健康的关注越来越高，对烟草产品提出了更高的要求，不但要有较好的口感，而且要尽可能的减少人体的不良感受。卷烟产品研发人员在烟油产品配方设计初期将不同组份按照不同比例组合调配，形成具有不同风格的初选配方，再结合化学评价和感官评价对配方进行不断筛选调整形成最终的产品配方。然而初选配方数量众多，全部进行感官评价耗时耗力，且感官评价侧重于对产品的风格口感进行筛选，如何利用生物学测试指标对产品初选配方进筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方，目前尚属探索阶段，无统一的标准方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测烟气总粒相物对细胞炎症效应因子影响方法，为电子烟制品的安全性评估提供参考。

一种检测烟气总粒相物对细胞炎症效应因子影响方法，包括以下步骤：

(1)受试物的前处理；

(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备；

(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；

(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种；

(5)受试物的分组；

(6)受试物检测剂量的设定；

(7)受试物培养品的制备；

(8)受试物的孵育；

(9)受试物孵育品的收集；

(10)标准溶液配制；

(11)添加待测样；

(12)添加抗体；

(13)添加结合液；

(14)显色；

(15)测量吸光值；

(16)细胞因子分泌量测定。

本发明优选的实施方案中，上述的方法，包括以下具体步骤：

(1)受试物的前处理：参照中华人民共和国国家标准GB/T 19609-2004《卷烟用常规分析用吸烟机测定总粒相物和焦油》制备卷烟烟气总粒相物样品，样品浓度为10mg/mL；

(2)人肺成纤维细胞HPF单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)人肺成纤维细胞HPF单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)人肺成纤维细胞HPF单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人肺成纤维细胞单细胞悬浮液加入成纤维细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为1mL/孔，接种到12孔细胞培养板中，将12孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO₂培养箱内培养24h；

(5)受试物的分组：将受试物分为两组：细胞对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞；检测样品组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加受试物；

(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为5非个非零剂量：20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL；

(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中12孔细胞培养板内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞；检测样品组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；并且2组培养品用成纤维细胞培养基将每孔中的液体体积补足到1mL/孔；

(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的12孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO₂培养箱中孵育24h；

(9)受试物孵育品的收集：吸取步骤(8)细胞板中的上清液，离心20min，转速1000rpm，取上清；

(10)标准溶液配制：梯度稀释法配制炎症效应因子的标准曲线溶液，

(11)添加待测样：空白对照孔加蒸馏水100μL，其余孔分别加步骤(10)配制的标准品溶液或步骤(9)获得的待测样品100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育90分钟；

(12)添加抗体：将步骤(11)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，每孔加入抗体工作液100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育60分钟；

(13)添加结合液：将步骤(12)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，用磷酸盐缓冲液PBS洗板三次，每次浸泡大约2分钟，350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干，每孔加酶结合工作液100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育30分钟；

(14)显色：将步骤(13)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，用清洗液洗板五次，每次浸泡大约2分钟，350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干，每孔加底物工作液90μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育，观察每孔颜色变化，适时加入终止液50μL/孔；

(15)测量吸光值：于酶标仪450nm下检测吸光度；

(16)细胞因子分泌量测定：根据标准溶液吸光度值绘制标准曲线，计算细胞因子分泌量。

本发明优选的实施方案中，步骤(10)中的标准曲线溶液的配制过程为：将抗体用抗体工作液配制成相应浓度，其中IL-6标准曲线范围为0-500pg/mL，IL-8标准曲线范围为0-2000pg/mL,IL-10标准曲线范围为0-500pg/mL，TGF-β1标准曲线范围为0-2000pg/mL，TNF-α标准曲线范围为0-500pg/mL，GM-CSF标准曲线范围为0-500pg/mL，抗体购买于伊莱瑞特公司。

本发明优选的实施方案中，步骤(12)中的抗体工作液属于商品化商品，能够在市场上购买于伊莱瑞特公司。

本发明优选的实施方案中，步骤(13)中的酶结合工作液属于商品化商品，能够在市场上购买于伊莱瑞特公司。

本发明有益效果：

本发明对样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测卷烟烟气总粒相物对细胞炎症效应因子分泌影响。

附图说明

图1为4种卷烟烟气总粒相物对HPF细胞IL-6细胞因子分泌的影响；

图2为4种卷烟烟气总粒相物对HPF细胞IL-10细胞因子分泌的影响。

具体实施方式

下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。

本发明针对4种国内市售卷烟的烟气总粒相物对人肺成纤维细胞IL-6、IL-10两种炎症效应因子分泌量的影响测试。

(1)受试物的前处理：参照中华人民共和国国家标准GB/T 19609-2004《卷烟用常规分析用吸烟机测定总粒相物和焦油》制备卷烟烟气总粒相物样品，样品浓度为10mg/mL；

(2)人肺成纤维细胞HPF单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约2min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)人肺成纤维细胞HPF单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)人肺成纤维细胞HPF单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人肺成纤维细胞单细胞悬浮液加入成纤维细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为1mL/孔，接种到12孔细胞培养板中，将12孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO₂培养箱内培养24h；

(5)受试物的分组：将受试物分为两组：细胞对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞；检测样品组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加受试物；

(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为5非个非零剂量：20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL；

(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中12孔细胞培养板内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞；检测样品组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；并且2组培养品用成纤维细胞培养基将每孔中的液体体积补足到1mL/孔；

(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的12孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO₂培养箱中孵育24h；

(9)受试物孵育品的收集：吸取步骤(8)细胞板中的上清液，离心20min，转速1000rpm，取上清；

(10)标准溶液配制：梯度稀释法配制炎症效应因子的标准曲线溶液，

(11)添加待测样：空白对照孔加蒸馏水100μL，其余孔分别加步骤(10)配制的标准品溶液或步骤(9)获得的待测样品100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育90分钟；

(12)添加抗体：将步骤(11)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，每孔加入抗体工作液100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育60分钟；

(13)添加结合液：将步骤(11)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，用磷酸盐缓冲液PBS洗板三次，每次浸泡大约2分钟，350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干，每孔加酶结合工作液100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育30分钟；

(14)显色：将步骤(11)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，用清洗液洗板五次，每次浸泡大约2分钟，350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干，每孔加底物工作液90μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育，观察每孔颜色变化，适时加入终止液50μL/孔；

(15)测量吸光值：于酶标仪450nm下检测吸光度；

(16)细胞因子分泌量测定：根据标准溶液吸光度值绘制标准曲线，计算细胞因子分泌量。

结果见图1和图2。由试验结果可以看出，在本发明方法给出的样品处理方法、检测剂量条件下，样品1#、2#、3#、4#在检测剂量范围内对HPF细胞IL-6炎症效应因子的分泌量存在影响，且有剂量效应关系，与0剂量组相比存在显著差异(p<0.05)；样品4#与样品1#、2#、3#间存在显著差异。而对HPF细胞IL-10炎症效应因子的分泌量无影响，且与0剂量组相比无显著差异(p>0.05)；以上结果不同的卷烟烟气总粒相物对HPF细胞不同的炎症效应因子的分泌量的影响存在差异。