专利名称：用柞蚕蛹制取抗病活性物质及其组分的提纯方法
技术领域：
本发明属用生物学方法制取抗病物质及其组份提纯的领域。
昆虫没有专一的免疫系统。缺乏真正的免疫球蛋白，也没有产生免疫球蛋白的细胞，但是昆虫能在世界各地处处生存。据统计，目前有生命的生物约有110万种，其中昆虫就有100万种，占五分之四，昆虫分布之广，数量之多，显然昆虫自身有其独特的抗病物质。柞蚕也饲养于野外，长年遭受各种生物因子(细菌、病毒、原虫等)的侵染和非生物因子(风、雨、干旱、霜冻等)的袭击，但柞蚕却能适应如此恶劣的生态环境得以生存和发展;在实验中观察到，给五令壮蚕口服上亿个致病细菌、10万柞蚕NPV病毒多角体，其仍能存活，这都说明柞蚕具有很强的感染抵抗性和诱发抵抗性。
近年来，国外学者对昆虫的防御免疫机制进行了广泛的研究。日本东大名取教授，从别尾蝇蛹中提取一种具有抗病、抗癌作用的物质;瑞典斯德哥尔摩大学波曼教授从异比古天蚕蛹和柞蚕蛹中提取能抗九种以上革兰氏阳性和阴性菌的物质;日本林屋教授从家蚕消化液中提取抗病毒的赤色萤光蛋白质。
柞蚕蛹是滋补药膳的珍品，我国古代的医学家就记载着“核桃炖蚕蛹”有补气养血的功效。广大蚕民多年来就有吃蚕蛹的习惯，并流传着蚕蛹能治心血管病、肝炎、肾炎、糖尿病和补阴益气等民间验方。
以上无不证明昆虫的药用价值，为此，世界上有名的科学家对昆虫的药用价值引起极大的重视，认为能治愈有些疑难病和顽固病。
那么，如何使昆虫大量产生抗病活性物质而应用到临床中呢？人们进一步发现给惜比古天蚕，柞蚕和家蚕等鳞翅目昆虫注射非致病菌，不溶性粒子或可溶性化学物质以及体壁穿刺等物理处理方法均能诱导其血淋巴产生一类新的制取抗病物质(抗菌肽和抗菌蛋白)它们有较强的杀菌能力，能杀死10种以上革兰氏阳性和阴性细菌。
目前，国际上通用的诱导源为大肠杆菌，但是，用大肠杆菌诱导柞蚕蛹存在着诱导活性低、活性不稳定等问题。并观察到，诱导活性与菌量有很大的关系。如果给蚕蛹注射的大肠杆菌菌量过大，会导致蚕蛹败血而死亡;注射的菌量小了，该蛹体血淋巴中诱导产生的抗病物质又会很快地将注射到蛹体内的大肠杆菌消灭掉，其结果导致活性低，组份少且活性不稳定;从应用角度来考虑，大肠杆菌对人、畜有害，不宜使用。
另外，在柞蚕抗病活性物质的主要组份抗菌肽D纯化方面，已报道的方法，只适用于小批量样品的纯化，大批量样品的提取，困难很大，主要原因是原方法第一步采用葡萄糖凝胶过滤，葡萄糖凝胶需要量大，价格很贵，上样量小，费时，纯化效率低。
柞蚕是中国的特产，产茧量占世界野蚕总产量90%。采用本发明柞蚕链球菌(Streptococcuspernyi)作为诱导源刺激柞蚕蛹产生抗病物质，并研制出治疗人乙肝和鸡白痢等人畜疾病的TAPⅠ号和Ⅱ号，未见国内外报道。用超声波刺激柞蚕蛹，也能产生抗病活性物质，但不如柞蚕链球菌诱导的效果好。
本发明的目的寻找一种对人、畜安全能刺激柞蚕蛹持久地大量地产生抗病物质的诱导源;建立大批量抗病活性物质制取工艺;寻找一种实用的抗菌肽D的提纯工艺;寻找抗癌、抗病毒药物及其制取方法，促进人民身体健康，促进畜牧业的发展。
本发明采用的柞蚕链球菌，是从患病的柞蚕本身提取出来的，用柞蚕链球菌能刺激柞蚕蛹持久地大量地产生抗病物质其原因有21、柞蚕链球菌喜碱忌酸，在柞蚕蛹血淋巴偏酸(PH6.4)的条件下，不能很快大量增殖，因而不致使柞蚕蛹死亡。2、柞蚕链球菌对柞蚕蛹诱导产生的抗病物质不敏感所以不能被杀死。这样柞蚕链球菌注射到柞蚕蛹体内后，能给柞蚕蛹的免疫系统以稳定的、足够强的刺激，最大限度地调动了柞蚕蛹的免疫机能，合成大量的抗病活性物质。
柞蚕蛹经柞蚕链球菌诱导后，其防兔庖呦低逞杆俦患せ睿诤芏淌奔淠谘杆俸铣煽咕摹⒖咕鞍住⑷芫浮⒛氐 5种以上抗病活性物质，总称TAP。其中活性蛋白，肽类绝大部分在脂肪体内合成。
由于本发明采用了柞蚕链球菌作诱导源，对人、畜安全，故可建立大批量生产工艺。诱导的柞蚕蛹经制取TAPⅠ号后，剩下的蛹壳，蛹组织和少许血淋巴占全蛹的五分之四，在实验中发现正常未经诱导的蚕蛹，采取血淋巴后，余下蛹壳，蛹组织部分在室温下会很快腐烂发臭，但经柞蚕链球菌诱导后的柞蚕蛹，放出血淋巴后，余下的蛹壳、蛹组织在室温下放置数天也不腐烂和发酵。这说明，诱导后的蚕蛹除去血淋巴后的组织中仍具有很强的抗病、抗菌能力。为充分发挥柞蚕的抗病作用，增加效益，降低成本，本发明将剩下的蛹壳、蛹组织和少许血淋巴经处理后制成成品称为TAPⅡ号，用在畜牧业防病上。
柞蚕抗病活性物质TAP的制取工艺一、TAPⅠ号制取工艺1、诱导源的制备用柞蚕链球菌作诱导源，将柞蚕链球菌接种于液体培养基中，(蛋白胨1.5%，葡萄糖1.5%，酵母膏0.3%，NaCl0.5%，PH7.6)37℃培养过夜，次日转接，37℃培养4-5小时，然后用无菌昆虫生理盐水稀释20倍，制成菌悬液。
2、把制备的菌悬液注射到柞蚕蛹体内进行诱导(102-4/头蛹);
3、将诱导后的柞蚕蛹置于18℃-22℃培养4-6天;
4、冰浴下采取血淋巴;
5、5krpm，0℃，15min，离心得血淋巴上清;
6、血淋巴上清冷冻真空干燥制成为抗病活性物质TAPⅠ号。
7、制成胶囊颗粒成品。
二、TAPⅡ号制取工艺将TAPⅠ号制取工艺第5步剩下的蛹壳、蛹组织和第6步的沉淀物混合捣碎再冷冻真空干燥或喷雾干燥经包装即成TAPⅡ号成品。
柞蚕蛹经诱导处理产生新的一类抗病活性物质，主要的组份是抗菌肽D。抗菌肽D为一碱性多肽，分子量为3300左右，由33个氨基酸组成。国外抗菌肽D的提纯方法第一步采用葡萄糖凝胶过滤，故上样量小，费时，纯化效率低。
经实验发现，抗菌肽D对热较稳定，将纯化的抗菌肽D分别在100℃水浴中经加热10-120分钟以及进行8磅30分，10磅20分的蒸气高压处理后，活性没有显著降低。但是如果对诱导后的血淋巴直接进行加热处理，其活性却明显降低其原因是在加热过程中血淋巴中大量蛋白变性，离心时，变性蛋白将部分抗菌肽包裹在一起，沉淀除去。将血淋巴进行稀释，就克服了这一现象，当进行1∶2(血淋巴∶水)稀释后，再进行加热处理对活性基本没有影响。因此建立了新的抗菌肽D的提纯方法。
原提纯方法新的提纯方法↓↓经诱导的血淋巴经诱导的血淋巴↓↓凝胶过滤血淋巴∶水＝1∶3(100℃加热10分钟)↓↓
离子交换层析离子交换层析↓↓↓↓疏水层析疏水层析↓↓透析硫酸胺盐析↓↓冻干葡聚糖G-25脱盐↓冻干原方法在疏水层析后，其活性部分含有很高浓度的甲酸胺，由于抗菌肽D分子量较小，透析损失较大，所以，冻干问题一直不好解决。本发明的方法采用硫酸盐析，然后用葡聚糖G-25脱盐，即解决了脱盐问题，又使抗菌肽D的纯度得以进一步提高。本发明的优点和积极效果一、由于本发明不用致病的大肠杆菌而采用对人、畜安全的柞蚕链球菌作诱导源，冲破了昆虫抗病物质只能应用科研的局限性，实现了大量生产、普遍应用到临床上的目的。
二、采用柞蚕链球菌作诱导源比大肠杆菌作诱导源诱导柞蚕蛹产生的抗病物质组份多。
将大肠杆菌和柞蚕链球菌诱导产生的抗病物质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱比较结果柞蚕链球菌诱导产生的抗菌蛋白(Ps)和抗菌肽A·B的量均比大肠杆菌高得多。
三、以柞蚕链球菌作诱导源，诱导活性高，在柞蚕蛹体内持续时间长，并且诱导剂量容易掌握。
四、柞蚕链球菌诱导的制取抗病物质组份多，因而抗病力强。
五、本发明在柞蚕抗病活性物质的应用研究上，在分别纯化其组份及进行有关性质作用的测定后，冲破了国外关于昆虫抗菌肽、凝集素应用研究的局限，采取诱导抗病活性物质总体全用的方式，制取TAPⅠ号和Ⅱ号，分别应用于治疗人乙型肝炎及防治鸡白痢等人畜疑难疾病上，并发现TAPⅠ号在抗癌药物应用方面有很好的应用前景。
(一)经体外实验证明，柞蚕抗病活性物质对癌细胞(S180及艾氏腹水癌)有杀伤作用。
本实验采用同位素标记测定方法，分别将柞蚕链球菌诱导后的血淋巴(5、25、50稀释液)稀释液与癌细胞一起孵育，同时加入H2标记物，培养一定时间后，除去游离的同位素，用液闪对进入细胞内的同位素进行计数结果见附表1表1柞蚕免疫活性物质体外抗癌作用测定
从表中可看出，柞蚕诱导血淋巴不同稀释倍数的cpm值均低于阳性对照的一半以下，1∶5稀释最好，接近阴性对照，说明柞蚕诱导血淋巴对S180和S180艾氏腹水癌癌细胞有一定的杀伤作用。
(二)柞蚕抗病物质应用在畜牧业上前景广泛。
柞蚕抗病物质对沙门氏菌属特别敏感，发现在体外能杀死鸡白痢病原菌。应用柞蚕TAPⅡ号防治小鸡白痢，发病死亡率;明显和显著低于常规免疫区和普通对照区，取得了很好的防治效果。对防治鸡球虫病，鸡新城疫也有显著的作用。本发明的柞蚕TAPⅡ号除了有一定的抗菌和抗病毒作用外，还能调动鸡的防御免疫和抗病能力而且柞蚕蛹本身是高蛋白物质，是很好的营养物质添加剂。
(三)、柞蚕AIPⅠ号在治疗人乙型肝炎和癌症等顽固病、疑难病有前途。
柞蚕诱导后合成新的活性蛋白和肽类与脊椎动物的不同，是非专一性的，具有激活人体免疫细胞产生抗病物质和直接杀死某些病原微生物的作用。经医药部门临床试验结果表明柞蚕TAPⅠ号对治疗人乙型肝炎有很好的疗效(乙肝“2对半”指标阴转率达50%，有效率达75%，这样的疗效是少见的。2、对15例不同癌症患者临床试验结果表明，具有一定的疗效，有延长癌症患者寿命，增强食欲和体质，无付作用等功能。临床其特征在于认为有很好的应用前景。
四、本发明对抗菌肽D的提纯方法，具有提纯效率高、速度快、操作简便、成本低等优点。
权利要求
1.用柞蚕蛹制取抗病活性物质及其组份的提取方法，其特征是用柞蚕链球菌作诱导源，首先制成菌悬液，然后按103-4/头蛹的比例把菌悬液注射到柞蚕蛹体内，置于18℃-22℃培养4-6天，冰浴下采取血淋巴，5krm、15mim离心得血淋巴上清，经冷冻真空干燥，即得抗病活性物质TAP1号；将剩下的蛹壳、蛹组织、沉淀物混合捣碎再冷冻真空干燥即得抗病活性物质TAPⅡ号；在血淋巴中，加入3倍水，加热到100℃10分钟，加硫酸胺盐析，再用葡聚糖G-25脱盐、冻干后，即得到抗菌肽D。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是菌悬液的制备是将柞蚕链球菌接于液体培养基中，置于37℃培养过夜，次日转接，37℃培养4-5小时，然后用无菌昆虫生理盐水稀释20倍，即得到菌悬液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是液体培养基配方为蛋白胨1.5%、葡萄糖1.5%、酵母膏0.3%、Nacl0.5%、PH7.6。
全文摘要
用柞蚕蛹制取抗病活性物质的方法及其主要组分抗菌肽D的提纯方法，本方法采用柞蚕链球菌为诱导源，能诱导作蚕蛹持久地，大量地产生具有抗病力的活性物质，产生的活性物质组分多，活性强，经临床试验，对乙型肝炎“2对半”阴转率达50％，有效率达75％，对S180和艾氏腹水癌的癌细胞有显著的杀伤作用。本发明的抗菌肽D提纯方法采用加热法，具有纯化效率高、速度快、操作简便、成本低等优点。
文档编号C12P21/02GK1036407SQ8810158
公开日1989年10月18日 申请日期1988年4月4日 优先权日1988年4月4日
发明者张春发, 丁杰, 李敬涛 申请人:辽宁省蚕业科学研究所