专利名称：用柞蚕蛹生产外源基因产物的方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程的DNA或RNA、载体和质粒，或其分离、制备或纯化;其宿主的应用。
目前世界上广泛应用的由美国科学家G·E·Smith等于1983年建立的苜蓿尺蠖核多角体病毒(以下简写为AcNPV)载体表达系统，虽具有表达产量高，所表达的外源基因产物的抗源性，免疫原性和生物学功能均与其天然蛋白类似的优越性，但是由于AcNPV载体表达系统是以SF9等昆虫细胞为宿主，大量培养昆虫细胞培养基成本造价高，条件设备要求严，技术难度大，因此限制了该载体表达系统的实际应用。为此人们又寻找新的活体宿主，如在中国发明专利(1986年12月17日)公开的一种<生产有用物质的方法>(申请号85104701)，其主要特征是通过在家蚕细胞或宿主体内增殖重组的家蚕核多角体病毒(BmNPV)来生产有用物质，经体内重组而产生的该重组BmNPV DNA为双股DNA，其包含原先存在于多角体蛋白结构基因上游的5′末端启动子区域，翻译起始密码和一个产生有用物质基因及部分多角体蛋白结构基因和其下游3′末端BmNPV DNA片段，其不足之处是家蚕以卵越冬，蛹期不滞育，只能用幼虫来做表达宿主;而家蚕幼虫需人工于室内饲养，大量生产不仅成本高，工厂化管理难，操做麻烦;特别是感染病毒操作难度大，而且幼虫在感染病毒后易出血或相互间抓伤极易造成细菌感染;发生败血病，发病的幼虫不但不能表达产物，而且还会造成污染，此外其幼虫发病后即采血死亡，不能吐丝做茧，达到综合利用目的。
鉴于上述现有技术中的不足之处，本发明的目的在于提供一种利用柞蚕蛹为活体宿主，以柞蚕核多角体病毒(ApNPV)为载体大量表达生产外源基因工程产品的方法。
本发明的目的可通过以下措施来实现一种用于基因工程的用作蚕蛹生产外源基因产物的方法，它是将纯化的病毒粒子经抽提得到的ApNPVDNA进行限制性内切酶酶谱分析、琼脂糖凝胶电泳、Southern转印，并用OpNPV核多角体蛋白基因为探针进行分子杂交确定多角体蛋白基因在ApNPV基因组中的位置，其特征在于a.用大肠杆菌载体质粒(PAT153、Puc19)克隆、增殖所载该基因的DNA片段为5′端的PvuⅡ-BamHⅠ片段和3′端的BamHⅠ-PstⅠ片段，分别以单链DNA和双链DNA为模板采用双脱氧序列分析法对所克隆的DNA片段进行核苷酸序列分析，读出作蚕NPV核多角体蛋白的基因的全编码序列735bp和其两侧翼区部分非编码序列，采用PrimerExtension方法确定该基因mRNA转录起始点位于nt-50的A位点，进而确定该基因的5′末端基因表达调控序列的位置;
b、采用人工合成寡核苷酸引物引导点突变及PCR等技术将ApNPV多角体蛋白基因的起始密码子去掉(ATG突变为ATT)同时分别切掉nt+2～+140、nt+9～+140和nt+37～+1405′末端编码序列，组建了PAPM740、741、748和736等系列基因转移载体;
c、将外源基因分别克隆到所组建的四个载体中，抽提重组质粒DNA，并与抽提的APNPVDNA一起转染柞蚕卵巢细胞或柞蚕蛹，待柞蚕细胞或柞蚕蛹感染发病后取其病毒液分别用空斑法或末端稀释法分离外源基因重组病毒;
d将分离的重组病毒感染柞蚕蛹，经分离、纯化即可得到外源基因产物。
本发明组建了柞蚕核型多角体病毒表达载体，利用柞蚕蛹为活体宿主，将外源基因克隆到柞蚕NPV表达载体后，将野生APNPVDNA与重组质粒DNA一起转染柞蚕细胞或柞蚕蛹，形成载有外源基因的重组病毒，再将经纯化所得到的重组病毒感染柞蚕蛹，即可在柞蚕蛹体内大量表达生产该基因产品。
柞蚕NPV病毒基因组是一双链环状DNA分子。其中的核多角体蛋白基因是病毒的晚期表达基因，为单拷贝基因编码，无内含分子。该基因的启动子效率甚高;本身的表达水平高达整个细胞蛋白的50%左右;多角体基因编码区为非必需区，外源基因插入该区域并不影响病毒的复制，所形成的重组病毒为非包含体病毒。将用密度梯度离心纯化的病毒粒子，经酚/氯仿等常规方法抽提的APNPVDNA进行限制性内切酶酶谱分析，琼脂糖凝胶电泳，Southern转印，并用OpNPV核多角体蛋白基因为探针进行分子杂交，确定了多角蛋白基因在APNPV基因组中的位置;并用大肠杆菌载体质粒(PAT153、Puc19)克隆、增殖所载该基因的DNA片段;即5′端的PvuⅡ-BamHⅠ片段和3′端的BamHⅠ-PstⅠ片段，分别以单链DNA和双链DNA为模板，采用双脱氧序列分析方法对所克隆的DNA片段进行核苷酸序列分析，读出了柞蚕NPV核多角体蛋白基因的全编码序列735bp和其两侧翼区部分非编码序列;采用PrimerExteusion方法确定了该基因的mRNA转录起始点位于nt-50的A(腺嘌呤)位点，进而确定了该基因的5′末端基因表达调控序列(启动子)的位置，采用人工合成寡核苷酸引物引导点突变及PCR(PolymeraseChainReaction)等技术，将APNPV多角体蛋白基因的起始密码子去掉(ATG突变为ATT)，同时分别切掉了nt+2～+140、nt+9～+140和nt+37～+1405′末端编码序列，组建了PAPM740、741、748和736等系列基因转移载体，这些载体的组建，保留了对高效表达RNA的转录起重要作用的5′端基因调控序列(mRNA转录起点至翻译起始密码前全部核苷序列)和部分5′末端对外源基因表达的翻译有重大影响的编码序列(翻译起始密码(已突变成ATT)后部分核苷酸序列)。将外源基因(如人白细胞介素-4，人α-干扰素，DE糖蛋白基因)分别克隆所组建的四个载体中，抽提重组质粒DNA，并与抽提的APNPV DNA一起转染柞蚕卵巢细胞或柞蚕蛹，待柞蚕细胞或柞蚕蛹感染发病后，取其病毒液，采用空斑法(柞蚕NPV敏感细胞)或末端稀释法(柞蚕蛹)分离外源基因重组病毒(重组病毒不形成多角体)。将分离的重组病毒感染柞蚕蛹，室温孵育，待蚕蛹发病后收集病毒蛹体液，离心去杀质，利用已知的方法(如凝胶过滤、离子交换层析，疏水层析、亲合层析等方法)分离纯化所表达的外源基因产物。上述重组病毒也可感染柞蚕幼虫，表达外源基因物质，此外，经试验证实，天蚕核型多角体病毒(AyNPV)和蓖麻蚕核型多角体病毒对柞蚕蛹也具有感染力，并将天蚕NPV DNA和蓖麻蚕NPV DNA转染柞蚕蛹取得成功。柞蚕NPV载体PAPM740、741、748和736与ACNPV DNA转染SF9细胞获得成功。形成杂合病毒;即APNPV多角体蛋白基因取代了AcNPV多角体蛋白基因，并将DE糖蛋白的表达成功。柞蚕NPV病毒可感染天蚕幼虫，蛹及组织培养细胞及蓖麻蚕蛹、幼虫和组织培养细胞。
本发明的方法相比现有技术具有如下优点本发明的柞蚕NPV病毒载体-柞蚕蛹活体宿主表达系统是以柞蚕蛹为活体宿主进行外源基因的表达，因而显示出一系列的优越性。①首先该柞蚕为野蚕是我国特产的一种经济饲养昆虫，它有一整套生产销售体系，每年有上万吨蚕蛹可被利用，资源丰富、稳定。②柞蚕与家蚕等其他经济昆虫不同，它是以蛹滞育越冬，在2～4℃下可保存半年至一年，这一独特的特点，使柞蚕蛹成为优于其他经济饲养昆虫最理想的杆状病毒载体表达宿主。此外柞蚕茧皮剖开后(或活蛹缫丝)，仍可做短丝纤维出售，综合利用，③柞蚕蛹蛹体大，不需饲养，也不爬动，可实现机械化、工厂化生产外源基因物质，④柞蚕在蛹期体内主要组织为脂肪体，其对柞蚕NPV病毒十分敏感，柞蚕NPV病毒感染柞蚕蛹后整个蛹体组织几乎全部溃烂，液化形成大量多角体，这与杆状病毒感染组织培养细胞相比，其感染率要高得多;⑤柞蚕蚕蛹可识别哺乳动物(如人白细胞介素)及其他物种(如病毒DE糖蛋白)基因的信号序列，对所表达的蛋白能进行正确的修饰并分泌到细胞体液中，分泌到体液中的表达蛋白稳定易纯化。⑥柞蚕蛹的表达量按体积计算要高于AcNPV-SF9表达系统100倍以上。即一个蚕蛹相当于15个150平方厘米的细胞培养瓶(300ml昆虫培养基)，而一个蚕蛹(包括茧皮)只有5分钟左右(约1美分)，300ml昆虫培养基(包括30ml小牛血清)其价值要高达16.35美元，成本低于AcNPV-SF9细胞表达系统上千倍。⑦表达生产设备简单，易操作管理。利用柞蚕蛹为活体宿主进行外源基因产物的表达、设备简单、易操作管理，柞蚕茧可用机械剖开，蚕蛹经乙醇消毒后，可用机器自动进行重组病毒注射感染，感染后的蚕蛹只要置于室温(18～20℃)即可，20天后，蚕蛹组织基本全部液化，过滤除去几丁质外壳，离心去杂质即可进行蛋白纯化，而AcNPV-SF9细胞表达系统，大量培养昆虫细胞，需要高质量要求严格的培养罐，单是一个培养罐就需二、三十万美元，设备价格十分昂贵;另外培养过程中要控制温度，PH值等各项因素，严格防止其他微生物的污染，一旦污染，整个一罐细胞就做废，技术难度大，要求高，风险大;即使家蚕(BmNPV)病毒载体表达系统，由于用幼虫做活体宿主无论在管理上，注射感染重组病毒;防止污染上都有很大困难;⑧建立了柞蚕NPV DNA和重组质粒DNA直接转染柞蚕蛹的技术，使昆虫杆状病毒载体表达技术更加简便，重组率高，⑨研究表明柞蚕NPV核多角体比AcNPV和家蚕NPV核多角体个体大，柞蚕NPV核多角体蛋白基因启动子强，经核苷酸序列分析证实，柞蚕NPV核型多角体蛋白基因的启动子序列有近1/3与AcNPV和BmNPV不同，在对表达起决定性作用的8个高保守核苷酸序列中，柞蚕NPV就有2处发生替换，而AcNPV和BmNPV核多角体蛋白的基因的启动子序列几乎全部相同。
图面说明如下
图1是本发明柞蚕NPV载体到柞蚕蛹活体宿主表达系统示意图。
图2是本发明ApNPV核多角体蛋白基因的克隆和酶谱分析示意图。
图3是本发明ApNPV表达载体PAPM740的组建示意图。
图4是本发明ApNPV表达载体PAPM741、748、736的组建示意图。
图5是本发明中DE糖蛋白在柞蚕蛹体的表达示意图。
利用附图中所示的例子对本发明作进一步说明在图1所示的柞蚕NPV载体-柞蚕活体宿主表达系统示意图中，首先制备ApNPV-DNA将解除滞育的柞蚕蛹体壁穿刺接种APNPV病毒，置于18～20℃孵育，约7天后收集蚕蛹体液低速离心去渣质及病毒多角体，将上清在4℃下29K超速离心2小时，弃去上清将沉淀悬浮于0.1×TE(PH＝7.6)中，在4℃存放10～14小时，蔗糖密度梯度离心，先分别将配制的4.75ml50%蔗糖-0.1×TE和4.75ml10%蔗糖-0.1×TE依次缓缓加入到离心管中形成垫层，然后加入1.8ml病毒粒予样品，在4℃下20K离心90分钟后，通常在离心管中偏下处会有一清晰的病毒粒子带，小心吸出，并用0.1×TE稀释3倍，4℃下30K离心90分钟;弃掉上清，将病毒粒子悬浮于量10mMTris-Hcl(PH＝7.5)-1mMEDTA缓冲液中，加入1/10体积的10%SDS，1/10体积20mg/ml蛋白酶K，50℃保温2～5小时，用苯酚/氯仿，氯仿各抽提二次，水相DNA溶液可直接使用或乙醇沉淀后再溶于1×TE中待用，如此得到的ApNPV-DNA，可用于下一步的基因克隆和转染。
多角体蛋白基因的克隆，核苷酸序列分析及ApNPV核多角体蛋白基因RNA转录起始点的确定将ApNPV-DNA分别用限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ、HindⅢ、PvuⅡ酶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳，并将片段转移到硝酸纤维素滤膜上，与黄衫毒蛾核多角体病毒(OpNPV)核多角体蛋白基因探针杂交，结果BamHⅠ的D·E片段有特异性杂交，将这两片段分别克隆到PAT153质粒BamHⅠ位点上，组成PAPD和PAPE质粒。用同样方法进一步对D·E片段进行酶谱分析，核酸杂交，确定ApNPV核多角体蛋白基因分别位于D片段上的PvuⅡ-BamHⅠ(1.4Kb)片段和E片段上的BamHⅠ-PstⅠ(2.6Kb)片段，将两片段分别分离出来，并克隆到PUC19质粒的相应位点(SacⅠ-BamHⅠ-PstⅠ)上，组成PAP1426质粒，然后将该质粒用EcorⅠ(PUC19载体切点)和BamHⅠ酶解制备1.4Kb片段，并克隆到M13噬菌体载体中，提取单链DNA作为模板进行序列分析，从BamHⅠ位点读起，读出该基因5′端141bp编码序列和部分基因调控序列，根据阅读出的该基因核苷酸序列，人工合成寡核苷酸引物，直接以载有ApNPV核多角体蛋白基因的，PAP1426质粒双链DNA为模板进行APNPV核多角体蛋白基因全编码序列和5′端、3′端侧翼部分非编码序列的分析，如图2所示，根据ApNPV核多角体蛋白基因的序列(nt+142～+166)人工合成负链寡核苷酸引物，序列为5′GACCATGTAATTGTCTAAAGGATC3′以ApNPV核多角体病毒mRNA为模板，按Primerextension方法合成cDNA，并以相同引物和PAP1426质粒DNA为模板制备的DNAmarker同时进行序列分析PAGE电泳。结果ApNPVRNA转录起始点位于nt-50的杆状病毒核多角体蛋白基因高度保守调控序列的12个核苷酸第4个核苷酸的A(腺嘌呤)上(AATAAGTACATT)。
在图3和图4所示的ApNPV表达载体PAPM740、741、748、736的组建示意图中，根据对克隆的载有ApNPV核多角体蛋白基因的BamHⅠ D·E片段的酶谱和DNA序列分析以R mRNA转录起始点的确定等结果，分别将载有ApNPV核多角体蛋白基因编码序列及5′末端和3′末端非编码序列的Pstl-BamHⅠ(3.4kb)、BamHⅠ-PasⅠ(3.3kb)克隆到PUC19载体质粒中，组建了PD34和PE33质粒，然后将载有ApNPV核多角体蛋白基因5′端基因调控序列和141bP5′端编码序列的PD34质粒DNA SacⅠ-BamHⅠ(0.9kb)片段克隆到M13 mp18中，制备单链DNA。根据该基因起始密码(ATG)两侧的核苷酸序列合成寡核苷酸引物3′…GATATTGATAAGGTCT…5′，采用“Eckstein”方法进行寡核苷酸引物引导的点突变。将突变后的DNA转化大肠杆菌所得噬斑以32P标记的寡核苷酸引物为探针进行杂交，得到阳性突变株。将载有突变DNA序列的M13噬菌体在JM103宿主菌中扩增，抽提RFDNA，分离SacⅠ-BamHⅠ片段，并将此片段克隆回PD34载体质粒中。再将PE33质粒中载有ApNPV核多角体蛋白基因nt+142后部分编码序列和3′末端侧翼序列的BamHⅠ-PstⅠ片段，经过系列克隆将此片段克隆到PD34的BamHⅠ-PstⅠ位点，组建了PAPM740转移载体，外源基因克隆位点为nt+141BamHⅠ切点。将载有5′末端基因调控序列的PvuⅡ-BamHⅠ1.4kb片段克隆到PUC19载体中(P14)，并根据PUC19载体DNA序列合成正链引物5′…CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT…3′，然后根据ApNPV核多角体蛋白基因5′末端编码序列，分别合成了三个负链引物，将nt+2～nt+140、nt+9～+140和nt+37～+140序列)去掉，并加入BamHⅠ酶切点序列三个负链引物分别如下(+)1，5′…GTATGAGTAATGGATCCTAGTTATAGGAAATTTTAC…3′;(+)8，5′…GGTCGGCCGGTATGGATCCTCTGGAATAGTTATAGG…BamHI3′;(+36)，5′…CTTGTTGTCGGATCCAGATCTGCGACCAATGGTCGG…BamHI BgIⅡ3′以P14质粒DNA为模板分别以上述3对引物进行PCR反应，并将3个PCR产物片段分别用BamHⅠ-SacⅠ酶切，分离SacⅠ-BamHⅠ片段;将PAPM740转移载体用BamHⅠ-SacⅠ酶切，除去BamHⅠ-SacⅠ0.9Kb片段，并以此为载体，再将分离的PCRSacⅠ-BamHⅠ片段分别克隆到该载体中组建了PAPM741、748和736转移载体，其外源基因克隆位点分别在nt+1、nt+8和nt+36(BamHⅠ切点)。
在图5中，ApNPV载体所载外源基因的表达以载体PAPM748在柞蚕蛹体内表达DE糖蛋白基因为例将DE糖蛋白基因克隆到载体PAPM748的BamHⅠ位点上，经扩增，抽提重组外源基因质粒DNA，然后与ApNPV-DNA一起转染柞蚕蛹，并于室温孵育，约一周后，蚕蛹体表发生病理变化，约20天后蚕蛹组织溃烂。液化，取蚕蛹体液镜下观察，有大量多角体病毒存在，收集转染蚕蛹体液抽提DNA，以合成的DE蛋白基因特异序列的寡核苷酸为引物进行PCR测定，结果发现DE基因条带，将PCR放大合成的DE基因片段进行酶谱分析和序列测定其酶为DE蛋白基因，表明该基因已重组到ApNPV基因组中，为了证实转染蚕蛹形成的病毒的稳定性，将转染发病的蚕蛹体液以Grace培养基进行10倍稀释，分别为10、10-2、10-4和10-6浓度，再用此不同浓度的稀释液感染柞蚕蛹，半个月后感染的蚕蛹陆续发病，其发病顺序是感染高浓度稀释液至低浓度稀释液，发病蚕蛹呈典型病毒蛹病症和病变，为了进一步证实DE蛋白是否被表达取病毒蛹体液用DE蛋白特异抗体进行免疫沉淀和SDS-PAGE Western blotting检测，并以AcNPV-SF9载体表达系统表达的DE蛋白作为对照结果发现该DE蛋白基因确以非融合蛋白形成在柞蚕蛹体内表达，其表达量与AcNPV-SF9载体表达系统比较(V/V)高100倍以上。在图5中，A为重组DE基因的PCR检测结果(a1)1-未转染柞蚕蛹对照，2-ApNPV感染柞蚕蛹对照，3-PAPM748-DE质粒DNA转染柞蚕蛹对照，4、5、6-共转染的柞蚕蛹，7-DE基因PCR对照，B为所表达的DE蛋白的免疫沉淀和Westernblotting分析1，9-抗DE血清;2-未感染柞蚕蛹对照;3-ApNPV感染柞蚕蛹对照，4～8，10～16-重组病毒感染的柞蚕蛹;16-AcNPV载体在SF9细胞中表达DE蛋白对照。
权利要求
1.一种用于基因工程的用柞蚕蛹生产外源基因产物的方法，它是将纯化的病毒粒子经抽提得到的APNPV DNA进行限制性内切酶酶谱分析、琼脂糖凝胶电泳、Southern转印，并用OpNPV核多角体蛋白基因为探针进行分子杂交确定多角体蛋白基因在ApNPV基因组中的位置，其特征在于a.用大肠杆菌载体质粒(PAT153、Puc19)克隆、增殖所载该基因的DNA片段为5′端的PvuⅡ--BamHI片段和3′端的BamHI--PstI片段，分别以单链DNA和双链DNA为模板采用双脱氧序列分析法对所克隆的DNA片段进行核苷酸序列分析，读出柞蚕NPV核多角体蛋白的基因的全编码序列735bp和其两侧翼区部分非编码序列，采用Primer Extension方法确定该基因mRNA转录起始点位于nt--50的A位点，进而确定该基因的5′末端基因表达调控序列的位置；b、采用人工合成寡核苷酸引物引导点突变及PCR等技术将ApNPV多角体蛋白基因的起始密码子去掉(ATG突变为ATT)同时分别切掉nt+2～+140、nt+9～+140和nt+37～+140 5′末端编码序列，组建了PAPM740、741、748和736等系列基因转移载体；c、将外源基因分别克隆到所组建的四个载体中，抽提重组质粒DNA，并与抽提的ApNPV DNA一起转染柞蚕卵巢细脆或柞蚕蛹，待柞蚕细胞或柞蚕蛹感染发病后取其病毒液分别用空斑法或末端稀释法分离外源基因重组病毒；d将分离的重组病毒感染柞蚕蛹，经分离、纯化即可得到外源基因产物。
全文摘要
一种用于基因工程的用柞蚕蛹生产外源基因产物的方法，它组建了柞蚕核型多角体病毒表达载体，利用柞蚕蛹为活体宿主，将外源基因克隆到柞蚕NPV表达载体后，将野生的ApNPV DNA与重组质粒DNA一起转染柞蚕细脆或柞蚕蛹，形成载有外源基因的重组病毒，再将经纯化所得的重组病毒感染柞蚕蛹，即可在柞蚕蛹体内大量表达生产该基因产品。本发明采用柞蚕蛹作为活体宿主资源丰富稳定、可识别基因的信号序列，表达量高于苜蓿尺蠖100倍以上。
文档编号C12N15/12GK1078260SQ9210365
公开日1993年11月10日 申请日期1992年5月8日 优先权日1992年5月8日
发明者张春发, 刘淑珊, 范琦, 李广泽 申请人:辽宁省农业科学院大连生物技术研究所