专利名称：具有低乙酸形成能力的微生物以及用该微生物生产有用物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种新型微生物，具体地说是大肠杆菌，与野生型大肠杆菌相比，该微生物的乙酸形成能力较低;本发明也涉及通过培养密度的该微生物而生产一种高产率的有用物质的方法。这里所用的“乙酸形成能力”、“形成乙酸的能力”等术语指在适宜的培养条件下培养大肠杆菌时按细菌干重计所积累乙酸的量。
利用化学方法合成象蛋白质或维生素等有用物质需要复杂的过程，因而花费过大。于是人们开始利用微生物发酵的方法生产这些物质。
生物素是一种动物、植物及微生物所必需的维生素，可用作饲料、输液等的添加剂。人们已指望通过这类发酵法获得生物素。日本未审专利公开(KoKai)号61-202686、62-155081以及WO87101391公开了利用经遗传工程技术改良的大肠杆菌菌株制备生物素的方法。
一般来说，当使用微生物生产该物质时，在带有分批进料培养物的液体培养基中产生高密度的微生物不失为一种有效方式，不管是从产物产量的增加来说，还是从发酵罐的有效利用及产物的有效回收来说，均是如此。对于大肠杆菌来说，通过高密度培养，可获得许多优点，尤其对于经遗传工程技术改良的大肠杆菌来说更是如此。但是，对于大肠杆菌来说，由于营养物的代谢而形成乙酸，且在液体培养基中大量积累，从而抑制了细胞的生长活性，难以实现高密度培养。能解决上述问题从而达到高密度培养的已知方法就是透析或过滤培养法，它是通过透析或过滤液体培养基而从培养系统中除去形成的乙酸。
还有人建议给培养物加压，也就是使用纯氧气气体而使液体培养基的溶解氧维持高浓度，从而抑制形成的乙酸量(Matsui等，SynopsesofPresentationsonConventionin1986，FernnertationEngineeringAssociationofJapan，p206)。
但不管怎样，透析或过滤培养必然带来一些问题，例如，必需使用排除设备，或进行复杂的设备检修，因而是不经济的，或不实用的。而且，被大肠杆菌产生且已积累的某些有用物质(如生物素)会与乙酸一起被从液体培养物中透析或过滤掉，从而在回收该有用物质的步骤中必需处理大量的含有低浓度该物质的液体。使得进行高密度培养而获得的优越性几乎完全丧失。通过给培养物加压来培养高密度大肠杆菌使得培养过程中的控制或条件复杂化，且不易达到。
从不同于现有技术的角度(即从对大肠杆菌进行遗传改良的角度)进行各种研究以弥补上述缺陷之后，本发明成功地获得了野生型大肠杆菌的人工突变菌株，该菌株显示了低乙酸合成能力，其合成能力仅为野生型的1/5或更少。本发明人发现，当使用该突变菌株生产有用物质时，能够很容易的达到高密度培养，而不会遇到形成的乙酸对生长活性的抑制，即使不使用特异的培养方法(如透析、过滤、培养物加压法等)时也是如此。而且，本发明人发现，这些突变菌株可被具有与有用物质的产生有关的遗传信息的重组质粒转化，例如，当将含有生物素操纵子的重组载体引入突变菌株且培养产生的菌株时，不仅该菌株的细胞能够达到高密度，其生长活性不被乙酸抑制，而且还能够维持该生长活性，从而使中间代谢物脱硫生物素(dethiobiotin)有效地代谢为生物素，极大地增加生物素的产量。而在常规的培养方法中，脱硫生物素是作为生物素生物合成的中间物保留和积累于液体培养基中的。另外，本发明人还发现，通过向液体培养物中加入预定量的丙氨酸可极大地增加所产生的脱硫生物素及生物素的产量。
因此，本发明涉及大肠杆菌，该大肠杆菌的特征在于其形成乙酸的能力最多为野生型大肠杆菌的1/5。
本发明进一步涉及其特征在于其形成乙酸能力最多为野生型大肠杆菌的1/5的大肠杆菌，并且该大肠杆菌含有携带与有用物质的产生有关的遗传信息的重组质粒。
本发明也涉及生产有用物质的方法，其特征在于培养高密度的大肠杆菌(该大肠杆菌具有至多为野生型大肠杆菌1/5的形成乙酸能力，且含有携带与有用物质的产生有关的遗传信息的重组质粒)，然后回收产生的有用物质。
图1表示了如实施例3所解释的pXBA312质粒的制备方法。
本发明微生物的制备其形成乙酸能力至多为野生型大肠杆菌的1/5的大肠杆菌菌株(下面称作AD突变株)可通过下述方法获得对野生型大肠杆菌进行常规的诱变处理，将产生的细菌细胞在合适的液体培养基中振荡培养，然后测定液体培养基中细菌细胞的浓度以及所积累的乙酸量，筛选乙酸形成能力为野生型大肠杆菌1/5的AD突变株。在一最佳实施方案中，首先从经诱变处理而获得的细菌细胞中筛选氟乙酸钠抗性大肠杆菌突变株(以下称作FR突变株)，然后从这些FR突变株中筛选乙酸形成能力比大肠杆菌低的菌株。这是因为，在许多情况下低乙酸形成能力的大肠杆菌能够在FR突变株中发现。
具体地说，首先将野生型大肠杆菌进行常规诱变处理，例如用诱变剂N-甲基-N′-硝基-N亚硝基胍处理，将产生的细胞用缓冲液适当稀释，然后在含有氟乙酸钠及作为唯一碳源的脯氨酸的基本琼脂平板上进行培养。再通过钓取菌落法分离产生的菌落，它们为FR突变菌株。在合适的液体培养基中振荡培养分离出的FR突变菌株，通过液相层析或使用酶反应的试剂盒(F试剂盒BoehringerMannheimYamanouchi)或其他类似方法测定每一培养基积累的乙酸量，然后筛选并收集其乙酸形成能力至多为野生型大肠杆菌1/5的AD突变株。产生的该菌株具有低乙酸形成能力且对氟乙酸钠具有抗性。如果在溶解氧不可不足的条件下于常规培养基中进行培养，对于野生型大肠杆菌而言，培养基中每份细菌干重所积累的乙酸量一般为0.5-1.5，而对本发明的AD突变株来说，则为0.1或更少。每份细菌干重所积累的乙酸量为积累的乙酸量(g/l)除以细胞浓度(g/l)所得的商。
解除了生物素的反馈抑制的大肠杆菌株(以下简称为DR突变株)可取代野生型大肠杆菌株，用作进行同样的诱变处理亲代菌株，以获得具有低乙酸形成能力且对氟乙酸钠具有抗性的突变株，其生物素反馈抑制已被解除，这种DR突变株包括大肠杆菌DRK-332〔FERMBP-2113;这里所引用的所有编号如“FERM-332”指发酵研究所(FRI)的保藏号，该研究所为布达佩斯条约指定的国际保藏机构，它是从最初保藏于作为日本国内保藏机构的FRI的FERMp-8585内部转换而来，这里作用的编号，如“FERMP”，指作为国内保藏机构的FRI的编号〕。按上述方法所获得的AD突变株可列举大肠杆菌DRK-3323(FERMBP-2116;FERMp-9675)按照未审日本专利公开(KoKai)号62-155081所公开的方法，可通过将自产生物素大肠杆菌分离的生物素操纵子插入一载体DNA而制备重组质粒，这种重组质粒可包括例如pKHN31质粒。而且，还可使该重组质粒的载体表型为四环素抗性，以获得一种稳定的重组质粒，它在随后的高密度培养时不被消失。
也可采用另一种方法获得含有重组质粒的AD突变株，即通过常规方法(如MandalM.等J.Mol.Biol.，53，109(1970)上所公开的氯化钙法)将如上述所获得的重组载体引入AD突变株，再在琼脂培养基平板上培养产生的转化株，由于其中载体的表型，含有重组质粒的细菌细胞的菌落能够选择性地生长;然后挑选该菌落。
含有产生的重组质粒的AD突变株包括，例如大肠杆菌DRK-3323〔pXBA312〕(FERMBP-2117FERMp-9676)。
如果所需要的有用物质为人降钙素(以下简称hCT)时，可制备含有相应重组质粒的AD突变株。例如，可从大肠杆菌M15〔pZT32〕(FERMBP-2115FERMP-9266)分离出质粒pZT32，这种大肠杆菌含有携带编码融合蛋白(含有胶原酶断裂位点的hCT-肽-β-半乳糖苷酶)基因及tac-启动子的重组质粒，然后将其引入AD突变株，如大肠杆菌NA-75(FERMBP-2105)，从而获得大肠杆菌NA-75〔pZT32〕。
如果需要其它的有用物质，可从与所需物质的产生有关的基因及载体DNA制备重组DNA，然后将其引入AD突变株，以获得所需的微生物。
高密度培养按照本发明，可很容易地将上面所制备的大肠杆菌培养至高密度，而不会遇到乙酸对生长活性的抑制。
作为培养本发明的大肠杆菌的培养基，可使用含有碳源、氮源和/或无机物的合成培养基，也可使用天然培养基。可使用的碳源包括碳水化合物如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、淀粉的水溶液、糖蜜或其类似物。可被利用的氮源包括氨、各种无机或有机铵盐(如氯化铵、磷酸铵、硫酸铵或其类似物)、天然有机氮源(如氨基酸、肉膏、酵母膏、玉米浸出液、酪蛋白水解物、脱脂大豆或其水解物)或其类似物。许多天然氮源不仅含有氮源，而且还含有碳源。可使用的无机物包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化镁、硫酸亚铁、氯化钙、氯化锌、硫酸铜、氯化锰、氯化钴、钼酸铵、硼酸或其类似物。
当给制备的微生物提供一种抗菌素性质时，通过向培养基中加入相应的抗菌素可防止污染。
上述营养物可在培养之前以培养所需总量一次性加入。而某些营养物引起大肠杆菌生长活性或其它类似活性减少，当使用这类物质时最好在培养前先向培养基中加进一部分，然后在培养的过程中加进与生长所消耗的量相对应的剩余部分。
当利用本发明的微生物产生物素时，通过向培养基中加入丙氨酸可提高产量。所用的丙氨酸可为D-化合物、L-化合物或DL-化合物，它们均具有相似的效果。从成本的角度考虑，DL-化合物更好。加到培养基中的丙氨酸量较好为1-10g/l，最好为3-7g/l。如果其浓度超过10g/l，丙氨酸会引起细胞生长的抑制，尤其是生物素的产率下降。丙氨酸可在培养前一次性加入，或在培养过程中分批加入。
本发明的微生物表现出低乙酸形成能力，而不受通气及搅拌条件的影响。因此，不必象先有技术那样在培养基中维持高浓度的溶解氧，以抑制乙酸的积累，但无论如何，最好将溶解氧的浓度维持在3-6ppm，以使营养物充分代谢。培养温度最好为25-38℃，且培养过程中最好将pH值维持在基本中性。约16-48小时的培养时间通常是充分的。培养结束后，细胞浓度的干重为50g/l或更大。
生物素的生产通过将含有重组质粒(通过将生物素操纵子插入载体DNA而制备)的本发明大肠杆菌培养至如上所述的高密度，就可产生大量的生物素。培养完成之后，根据生物素的性质而采用与从天然材料中提取和纯化物质相类似的提取纯化方法，可从液体培养基中提取和纯化生物素。从培养基中除去细菌细胞后，生物素就可吸附于活性碳上，然后通过离子交换树脂进行洗脱和纯化。也可直接用离子交换树脂处理培养物的过滤物而纯化生物素。从水或乙醇中重结晶后，就可获得纯化的生物素。
下面通过实施例进一步说明本发明，但并不限制本发明。
实施例1AD突变菌株的制备在L-培养基(10g/l胨，5g/l酵母膏，1g/l葡萄糖，5g/l氯化钠，调至pH7.2)中，于37℃将大肠杆菌W3110菌株(IFO 12713)振荡培养3小时。在对数生长期收集细菌细胞，洗涤后悬浮在含有100μg/mlN-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍的TM缓冲液(0.61%tris-碱，0.5%马来酸，pH值调至6.0)中，让其在37℃维持30分钟以进行诱变。收集和洗涤之后，将细胞放至L培养基中，于37℃进行复原培养3小时。收集并洗涤细胞后，悬浮于灭菌水中，至约107个细胞/毫升。以每平皿0.1毫升的量将悬浮液涂布于含有5g/l氟乙酸钠的脯氨酸基本琼脂平板(1g/l脯氨酸，4g/l硫酸铵，2g/l磷酸二氢钾，1g/l磷酸氢二钾，0.1g/l七水硫酸镁，5g/l氯化钠，15g/l琼脂)，于37℃培养48小时。用钓取菌落法分离形成的菌落，其为FR突变菌株。由于获得抗性的机制不同，FR突变株中包括AD突变株。与亲代菌株及具有不变的乙酸形成能力的菌株相比，AD突变株的乙酸形成能力降低。
为了比较分离的FR突变株及亲代菌株W3110的乙酸形成能力，在一含有50ml用于试验乙酸形成能力的培养基(5g/l硫酸铵，13.2g/l NaH2PO4·12H2O，1.8g/l K2HPO4，1g/l MgSO4·7H2O，10g/l胨，10g/l酵母膏，10g/l葡萄糖)的500ml SaKaguchi摇瓶中，于37℃将细胞振荡培养24小时。振荡速度为120次/分。培养完成之后，用分光光度计测定每一液体培养基在波长660nm处的光密度(OD660)、然后根据在细胞干重及OD660之间制备的标准曲线，将其换算成细胞浓度(g/l)。离心细胞，通过利用酶反应的定量分析试剂盒(F试剂盒，Boeringer Manhecin Yamanouchi)测定每一培养物上清液中的乙酸量，获得乙酸形成能力至多为亲代菌株1/5的AD突变株NA-75(FERM BP-2105)。对亲代菌株W3110及AD突变株NA-75的乙酸形成能力进行比较的结果列于表1。
表1乙酸的菌株细胞浓度累积量乙酸的/细菌干重(g/l)(g/l)累积量亲株大肠杆菌W31105.14.50.88(IFO12713)AD突变株大肠杆菌NA-754.50.40.09(FERMBP-2105)
实例2由消除了生物素反馈抑制的大肠杆菌制备AD突变株消除了生物素反馈抑制的大肠杆菌DRK-332(FERMBP-2113)在L-培养基(10g/l胨，5g/l酵母膏，1g/l葡萄糖，5g/l氯化钠，调pH至7.2)中于37℃振荡培养3小时。收集对数生长期的细菌细胞，洗涤，然后是悬浮于含有100μg/ml N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍的TM缓冲液(0.61%三羟甲基氨基甲烷碱，0.5%马来酸;调pH至6.0)中，并置于37℃下诱变30分钟。收集并洗涤细胞后，将细胞放入L-培养基，于37℃进行3小时恢复培养。收集细胞，洗涤，然后悬浮于灭菌水中至大约107个细胞/ml。将该悬浮液涂布于含有5g/l氟代乙酸钠的脯氨酸基本琼脂平板(1g/l脯氨酸，4g/l硫酸铵，2g/l磷酸二氢钾，1g/l磷酸氢二钾，0.1g/l硫酸镁·7H2O，5g/l氯化钠，15g/l琼脂)上，涂布量为0.1ml/培养皿，并于37℃培养48小时。钓取长出的菌落，作为FR突变株。由于获得抗性的机制不同，FR突变株包括形成乙酸能力比亲株低的AD突变株和乙酸形成能力无变化的菌株。
为了比较分离的FR突变株和亲株DRK-332的乙酸形成能力，在一个含有10ml或100ml检测其乙酸形成能力的培养基(5g/l硫酸铵，13.2g/l磷酸二氢钠·12H2O，1.8g/l磷酸氢二钾，1g/l硫酸镁·7H2O，10g/l胨，10g/l酵母膏，10g/l葡萄糖)的500ml坂口烧瓶中于37℃振荡培养细胞24小时。振荡速度为120冲程/分钟。通气条件随所用两种培养基量的不同(100ml或10ml)而变化。培养完成后，用分光光度计测量各培养液在660nm波长处的光密度(OD660)，然后根据以细胞干重对OD660所制成的标准曲线换算成细胞浓度(g/l)。将细胞离心，用进行酶反应所用的定量分析试剂盒(F试剂盒;Boeringer Mannheim Yamanouchi)测定各培养液上清液中乙酸的量，所获得的AD突变株DRK-3323(FERM BP-2116)的乙酸盐形成能力比亲株小1/5。亲株DRK-332和AD突变株DRK-3323的乙酸形成能力的对比结果示于表2。从表2可明显看出，AD突变株DRK-3323不受通气条件的影响，甚至在通气条件差(溶解氧不足)情况下，乙酸累积量/细菌干重也小于0.25。
表2亲株AD突变株菌株大肠杆菌DRK-332大肠杆菌DRK-3323(FERMBP-2113)(FERMBP-2116)在低通气条细胞浓度2.02.5(g/l)件下培养＊1 乙酸累积量 4.5 0.6(g/l)乙酸累2.250.24积量/细菌干重
(接上表)在高通气条细胞浓度2.25.8(g/l)件下培养＊2 乙酸累积量 3.3 0.5(g/l)乙酸累1.500.09积量/细菌干重＊1500ml培养瓶中装有100ml培养基。
＊2500ml培养瓶中装有10ml培养基。
实例3含有携带生物素操纵子的重组质粒的AD突变株的制备(1)载体DNA的制备含有质粒pBR322的大肠杆菌K-12株(Peden，K.，Gene，22，277，1983)在LB培养基〔1%Bacto胰胨(Difco生产)，0.5%Bacto酵母膏(Difco生产)，1%氯化钠;用氢氧化钠调pH至7.2〕中于37℃振荡培养一天，得到细胞，然后用碱溶法(Birnboim，H.C.etal，Nucl.AcidRes.，7，1513，1979)得到质粒DNApBR322。
如图1所示，用两种限制性核酸内切酶PvuⅡ和BalⅠ酶解所得质粒DNApBR322(1ug)，通过1%低胶凝温度琼脂糖凝胶(Ⅶ型，Sigma生产)电泳处理，然后用溴化乙锭染色。切下DNA片段(约3.7Kb)，于70℃加热5分钟。加入几乎等量的用TE缓冲液(10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，pH8.0，1mMEDTA)饱和的苯酚，彻底混匀，离心，得到水相，向水相中，加入两体积乙醇，沉淀的载体DNA片段用DNA连接试剂盒(TaKaraShuzo生产)连接。
用所得重组DNA溶液转化大肠杆菌M15(△〔lac-Pro〕，thi，φ80d，lacZM15，ara，rpsl，recA，)〔从Pharmacia获得〕。用氯化钙法进行转化。通过在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基〔1%Bacto胰胨(Difco生产)，0.5%Bacto酵母膏(Difco生产)，1%氯化钠，1.5%琼脂;用氢氧化钠调pH至7.2〕的平板上培养，得到转化株大肠杆菌M15〔PBRR-B4〕。
在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养大肠杆菌M15〔PBRR-B4〕，并用上述碱溶法获取质粒PBRR-B4。
用两种限制性核酸内切酶EcoRI和PstⅠ酶解所得质粒pBRR-B4(1ug)，并用1%低胶凝温度琼脂糖电泳处理。这样，如上所述分离得到-DNA片段(大约3.0Kb)。
另一方面，用两种限制性核酸内切酶EcoRI和PstⅠ酶解质粒DNAPUC13(得自Pharmacia)(2ug)，经15%聚丙烯酰胺凝胶(NaKarai生产)电泳处理，然后用溴化乙锭染色。切下一DNA片段(大约40b)并在Dounce均化器(WheatonScientific生产)中用0.5M乙酸铵(含有1mMEDTA)和等量用TE缓冲液饱和的苯酚溶液使之均化，彻底混匀后，离心，得到水相。向水相中加入两体积乙醇，离心后，分离出沉淀的DNA片段。
如上得到的两种DNA片段用DNA连接试剂盒(TaKaraShuzo生产)连接。
按照上述氯化钙法，用所得连接溶液转化大肠杆菌M15菌株，让生长于含有10ug/ml四环素的LB琼脂平板上的菌落在含有10ug/ml四环素的LB培养基中充分生长，按如上所述的碱溶法得到质粒DNAPBM16。
(2)带有生物素操纵子的重组质粒的制备将含有重组质粒的大肠杆菌DRK-332〔pKHN31〕(FERMBP-2114;FERMP-8586)，其中的重组质粒是通过将在日本未审查专利
发明者土师信一郎, 伊福欧二, 岸本治郎 申请人:株式会社资生堂