专利名称：识别α2→3键的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种新的杂交细胞瘤，制造它的方法，以及通过该杂交细胞瘤制备抗含唾液酸糖脂的单克隆抗体。
迄今为止，都是用各种抗原免疫动物，收集其血来制备抗血清。然而，抗血清含有大量来源于不同B淋巴细胞的抗体分子(多克隆抗体)，并经常与其他抗体交叉反应。因此，很难得到专一性很强的抗血清。
在此背景下，Koehlo于1975年制备出能产生抗羊红血细胞抗体的杂交细胞瘤，它是将免疫动物的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到的。由于杂交瘤高增殖率，可从这样的杂交瘤细胞分离出来自单个细胞的一个杂交细胞瘤的克隆(所谓“克隆化”)。所有由这个克隆的杂交细胞瘤产生的抗体都是一致的，具有对某一抗原的专一性，能识别某特异抗原的同一部位。此外，杂交细胞瘤可以冷冻态保存，如在液氮中。因此，可以保证稳定地供应每种抗体。根据细胞融合技术，有可能获得对某一特异抗原高度特异性的单克隆抗体。
抗体是能够识别被称为“抗原”的一种分子或物质，并与其结合的蛋白质。单克隆抗体的意思是具有识别一种特异抗原的一个部位的抗体，换言之，它仅识别一个抗原决定簇。当今各种生产单克隆抗体的技术及制备能生产单克隆抗体的杂交细胞瘤技术均是先有技术。这方面可参考最近出版的“单克隆杂交细胞瘤抗体技术与应用“JohnG.Huooell编著，1983。
哺乳动物细胞的糖脂是属于鞘糖脂类，包括(a)被称为神经酰胺的类脂结构，该酰胺是由一个称为鞘氨醇的长链氨醇与脂肪酸以酰胺键结合构成，(2)选自葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、岩藻糖和唾液酸的各种组合物，它们通过糖苷键与结构(a)结合。它们当中，携有唾液酸残基的糖脂被叫作神经节苷脂。
绝大多数该类化合物多位于细胞外膜，最新研究认为神经节苷脂在接收信息，识别，受体动能，分化，增殖，癌变或其他细胞行为方面都起重要作用。
神经节苷脂中，GD3神经节苷脂已知为神经细胞分化的抗原，并进一步鉴定为人黑色素瘤细胞的肿瘤相关抗原。
由于单克隆抗体具有针对一种特异抗原的高度特异性，因此能如上述高敏感检测该抗原。如果得到一种单克隆抗体对GD3是特异的，则可应用该抗体诊断癌症和免疫治疗，以及用来解释糖链在细胞功能中的作用。
因此，本发明的首要目的是提供能产生对GD3神经节苷脂上的一个特异抗原决定簇特异的单克隆抗体的杂交瘤，该苷脂被确定与一种癌-人类黑色素瘤细胞有关。
本发明另一个目的是提供生产这种杂交瘤的方法。
本发明再一个目的是提供对GD3神经节苷脂上特异抗原决定簇显示特异性的单克隆抗体。
本发明人进行了一系列研究，以排除不利方面，发现在细胞融合技术中可将纯化的GD3神经节苷脂用作抗原，制备能产生所需单克隆抗体的杂交瘤，从而完成了本发明。
根据本发明的一个方面，提供能产生对含唾液酸的糖脂特异的单克隆抗体的杂交瘤，该糖脂带有内含α2→3键的N-乙酰神经氨酸残基。
根据本发明另一方面，提供生产能制备一种单克隆抗体的杂交瘤的方法，该方法包括将用一种含唾液酸的糖脂(该糖脂携有内含α2→3键的N-乙酰神经氨酸残基)免疫动物得到的B细胞(ⅰ)(即B淋巴细胞)与骨髓瘤细胞(ⅱ)融合。
根据本发明的再一个方面，还提供了对含唾液酸的糖脂特异的单克隆抗体，该糖脂携有内含α2→3键的N-乙酰神经氨酸残基作为抗原决定簇，该单克隆抗体是用上述杂交瘤生产的。
图1表示用酶标抗体技术测定的该单克隆抗体对抗原GD3和GM3决定簇的特异性。
图2和图3表示各种神经节苷脂对本发明单克隆抗体的抗原特异性。
图4表示用于本发明单克隆抗体分类的图解。
本发明将在下面进一步详述。
本发明的杂交瘤是根据Koehle和Millstein的方法(见“自然”1975)通过一种抗原免疫动物，再从该动物得到融合B细胞而产生。这里的抗原是如携有内含α2→3键的N-乙酰神经氨酸残基的神经节苷脂，优选的是携有内含α2→3键的N-乙酰神经氨酸残基的神经节苷脂的糖脂。如
用本发明的杂交瘤产生的单克隆抗体将含有α2→3键的N-乙酰神经氨酸识别为抗原决定簇，并与其特异结合。因此，用该杂交瘤生产的单克隆抗体显示与携有含α2→3键的N-乙酰神经氨酸残基的含唾液酸糖脂有很高的反应性，特别是与GD3和GM3神经节苷脂。此外，该单克隆抗体对任何不同动物来源的含唾液酸糖脂均显示同一特异性。
用前述含唾液酸糖脂抗原免疫的动物可以是任何动物。作为特定例子，可举家兔，人类，小鼠和大鼠，最好为小鼠Balb/C。
生产本发明单克隆抗体的B细胞(B淋巴细胞)最好来源于脾细胞。另一方面，用于本发明的骨髓瘤细胞来源于任何动物，如人类，小鼠，大鼠和家兔。优选小鼠，最好是来源于Balb/C小鼠的骨髓瘤细胞(X63-Ag8.653)。这些骨髓瘤细胞增殖力特别强，从而当其与B细胞融合得到的杂交瘤细胞可连续不断地产生本发明的单克隆抗体。
本发明的杂交瘤细胞可通过下述方法制备。
首先将GD3神经节苷脂经腹膜内，皮下，或静脉注射于小鼠以免疫，最好是静脉注射。在此免疫过程中，可使用完全佐剂或不完全佐剂作为一种加强免疫剂，如油剂，乳化剂，死结核杆菌，杀死的沙门氏菌或其混合物，优选的是杀死的明尼苏达沙门氏菌作为佐剂经腹膜内，皮下或静脉注射。这些佐剂最好以生理上可接受的组合液，如磷酸盐缓冲盐水等形式应用。
在此免疫过程，要注意到用自身成分很难使动物对免疫敏感，因此原则上要选用遗传学上与抗原物质亲缘较远的动物。然而，免疫也可在体外进行以避免这种困难。
然后，将B细胞与骨髓瘤细胞融合，作为融合剂可用聚乙二醇和HVJ，最好是分子量6000的聚乙二醇。此外，最好用HAT基质作为培养基，这样较容易将杂交瘤细胞与残留的未融合细胞分开。
另外，要用甲基纤维素技术，软琼脂糖技术或有限稀释技术将所得杂交瘤细胞克隆，以分离出所需单个杂交瘤细胞克隆。
可用常规方法检验所得杂交瘤细胞的抗体效价，选择那些抗体效价高的杂交瘤细胞，将其贮存。
本发明杂交瘤细胞产生的单克隆抗体可用于探测人或动物癌组织中天然产生的糖脂抗原。因此，该单克隆抗体可用于酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫试验(RIA)之中以检测与癌相关联的神经节苷脂。该单克隆抗体还可用于亲合层析中以纯化与其结合的抗原。若将该单克隆抗体以放射性同位素标记，则可用以诊断肿瘤或鉴定其正确部位，高剂量还可以治疗肿瘤。也可与化疗剂结合加强对癌细胞的毒性。本发明的单克隆抗体可用于治疗和诊断具有该抗原的人或诸如小鼠的动物。本发明的单克隆抗体也有希望用于神经细胞的基础研究及其它临床应用。
将用下面的例子更详细地解释本发明，但它们不构成对本发明的限制。
例(A)抗原的制备(1)GD3和GM3神经节苷脂的提取和纯化将猪肾上腺组织于冷丙酮中被匀浆化并干燥后，以常规方法将该干燥制品用氯仿甲醇萃取。
所得样品碱化处理后，GD3神经节苷脂用DEAE-葡聚糖A-25离子交换树脂和Latrobeads柱纯化。
GM3神经节苷脂的制备过程为离心肝素化的狗血清，以磷酸盐缓冲盐水(PBS(-))冲洗所得沉淀物三次，冷冻干燥，然后将其用氯仿甲醇萃取。纯化操做按上述同法进行。
GD1a，GD1b和GQ1b购自DIATRON公司，半乳糖-神经酰胺神经节苷脂和葡萄糖-神经酰胺神经节苷脂购自Sigma公司，GT1b和GM2神经节苷脂购自FUNaKOSHI公司，它们未经再纯化而直接使用。
这些神经节苷类糖脂溶于氯仿-甲醇(1∶1(V/V)或乙醇中，-20℃下贮存(2)动物将6只雌性、6周龄Balb/C品系小鼠在常规条件下饲养后用于实验。
(3)抗原溶液的制备自猪肾上腺提取和纯化得到的GD3神经节苷脂和用醋酸(重量比为1∶4)及二乙醚处理的明尼苏达沙门氏菌R595被混合于PBS(-)中，使GD3神经节苷脂浓度为100μg/ml，该溶液作为抗原液使用。
(4)培养基培养基NissuiRPMI1640(购自Nissui公司，东京，日本)作为培养基使用。用前向其中加入硫酸卡那霉素和胎牛血清(FBS)，佟浓度分别为50μg/ml和10%。HAT培养基加热下向100ml蒸馏水中加入0.0388g胸腺嘧啶和0.1361g次黄嘌呤使其溶解，所得溶液(a)作为比实用溶液浓缩100倍的贮存液保存于20℃下备用。0.0176g氨基喋呤溶解于100ml蒸馏水中并滴加小量1N的氢氧化钠液，然后该液被用RPMI1640液稀释10倍，所得溶液(B)作为比实用溶液浓缩100倍的贮存液于-20℃下避光保存。
HAT培养基系将上述二种母液分别以1/100体积加于含10%FBS的RPMI1640液中制成现用。
此外，HT培养基系将贮存液(a)以1/100容量加于含10%FBS的RPMI1640液中制成。
(5)亲代细胞作为供细胞融合的亲代细胞，使用取自Balb/C小鼠的骨髓瘤细胞(C63-Ag8-6·5·3细胞)。这些细胞置于含10%FBS的RPMI1640培基中再次培养，同时加入6-硫代鸟嘌呤于该培养基中(终浓度为3μg/ml)以抑制细胞突变体的产生。
(B)杂交瘤的制备(1)免疫方法雌性、6周龄Balb/C小鼠按下列免疫程序向静脉内注射下列免疫原溶液来免疫(注射剂量用神经节苷脂量表示)首次5μg，首次后第四天10μg，第七天15μg，第十二天20μg，第七十九天20μg。在最后一次免疫后第三天处死小鼠以摘除脾脏，制备单个脾细胞悬液，由此随后用于细胞融合。
免疫原溶液自猪肾上腺提取和纯化的GD3神经节苷脂100μg与作为佐剂的明尼苏达沙门氏菌R595 400μg混合于不含Ca2+和Mg2+的PBS(-)1ml中，所得溶液适当稀释后作为免疫原溶液使用。
(2)细胞融合上述所得脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的融合按Kohler和Millstein方法进行。更确切地说用1×108脾淋巴细胞与2×107骨髓瘤细胞在含50%聚乙二醇(PEG6000)的培养基中融合。
(3)杂交瘤的选择和繁殖细胞融合后，所得细胞培养于HAT培基中(次黄嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶)，37℃和5%CO2下培养。
由此产生的杂交瘤已保存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登记号ATCCHB9475。
(C)单克隆抗体与神经节苷脂反应性的鉴定96孔平底塑料板(购自Falcon公司)在用前以乙醇预处理。向每孔内吸量加入已用乙醇稀释的抗原溶液(免疫原溶液)50μl，使GD3神经节苷脂浓度调整为20μg/ml(最适浓度)，然后，溶剂被蒸发，再向每孔加入含1%卵清蛋白的PBS(-)溶液200μl，并在室温下静置30分钟。振荡并倾弃溶液，然后加入50μl杂交细胞瘤培养液的上清液作为原始抗体，该板在室温下静置1.5小时。随后从孔内移除该原始抗体，向孔内加入150μl PBS(-)溶液来冲洗，共三次，并在加入100μl/每孔含1%卵清蛋白的PBS(-)溶液后在室温下静置30分钟。移除该液后，向每孔加入50μl经含1%卵清蛋白的PBS(-)溶液稀释至最适浓度的第二抗体，并在室温下静置1.5小时。如对原始抗体那样，每孔也以PBS(-)液冲洗三次，再加入反应液100μl/孔，以引起在黑暗中的反应。反应液是将邻苯二胺(OPD)和过氧化氢(H2O2)分别以0.4mg/ml和0.01%浓度溶于柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(PH＝5)中而制成。向每孔中加入8N的硫酸30μl以终止该反应，然后，终溶液经比色计在500nm波长下检测。作为第二抗体，可使用以辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，IgM和IgA抗体。
所获结果显示于图1，其中实心环代表GM3神经节苷脂，空心环代表GD3神经节苷脂。
如图1所见，GD3和GM3神经节苷脂都与本发明的单克隆抗体以高敏感性发生抗原-抗体反应。如此，GD3和GM3神经节苷脂都带有对应于本发明之单克隆抗体的抗原决定簇。在这一点上，GD3神经节苷脂与该单克隆抗体的反应性高于GM3神经节苷脂。据此认为GD3神经节苷脂具有对本发明的单克隆抗体有更高特异性的一个表位或抗原决定簇。
(2)TLC免疫染色技术二氧化硅凝胶薄层层析板(TLC(poly gram SIL G))被切割成适当大小的片，并用一小滴于氯仿-甲醇(1∶1(V/V))中的糖脂液沾染。依赖于目的，凝胶板用一种显色液来冲洗显影，如氯仿-甲醇-水(60/40/10 V/V)，氯仿-甲醇-0.5%CaCl2(55/45/10;V/V)溶液，或氯仿-甲醇-2.5NNH40H(60/40/9;V/V)溶液，然后置于含1%卵清蛋白和1%聚乙烯吡咯烷酮(K-30)的PBS(-)溶液中4℃下过夜。随后，室温下振荡2小时，同时浸于原始抗体溶液之中。以PBS(-)充分冲洗之后，再被浸于含1%卵清蛋白和1%聚乙烯吡咯烷酮(K-30)的PBS(-)溶液中室温静置30分钟。该板吸干后再浸于已预先用含3%聚乙烯吡咯烷(K-30)的PBS(-)稀释到最适浓度的第二抗体溶液之中，振荡2小时，再用PBS(-)充分冲洗后加入反应液。该反应液的制备系将4mg4-氯-1-萘酚溶解于甲醇1ml之中，再加入50毫摩尔的tris(羟甲基)-氨基甲烷，200毫摩尔NaCl和5ml缓冲液(PH＝7.4)，然后再加过氧化氢使其终浓度为0.01%。用水冲洗该板来终止反应，随后空气中干燥。
(3)对本发明的单克隆抗体特异的抗原决定簇的鉴定由TLC染色技术(苔黑酚染色)(A)和TLC免疫染色技术(B)所获各种类型糖脂的免疫反应及定性试验结果显示于图2。从图2所示结果中发现，第5道的GD3神经节苷脂具有对本发明的单克隆抗体特异的抗原决定簇。
此外，被活化的霍乱弧菌唾液酸分解产生的CDH(Gal-GlC-Cer)在施以TLC免疫染色时未能于第3道的GD3神经节苷脂上检出。这就明确地指出，CDH结构不是本发明的单克隆抗体的抗原决定簇。此外，出现于TLC免疫染色第3道的着色带表明为不受上述唾液酸酶的作用的GD3神经节苷脂。图2中，第1道的CMH表示Gal-Cer和Glc-Cer，第4道的CTH表示，Gal-Gal-Glc-Cer。
由此可见，这些结构不是对应于本发明单克隆抗体的抗原决定簇，因为它们不被TLC免疫染色技术所染色。
如上所见发现，对应于本发明单克隆抗体的抗原决定簇是N-乙酰神经氨酸残基。
图2的每一道如下(1)第1道CMH(Gal-Cer，Glc-Cer1μg(人脑)(2)CDH(活化的霍乱弧菌唾液酸酶作用于GD3) 1μg(3)第3道CDH1μg(4)第4道CTH(化学人工合成产物)1μg(5)第5道GD31μg用TLC免疫染色技术染色各种带有N-乙酰神经氨酸残基的神经节苷脂所得结果总结在表1如下。
表1TLC免疫染色试验结果抗原(100微微克分子)ATCCHB9475GM3++++++GD3++++++GD1a++GD1b+GT1b++GQ1b+++未检出样品578nm对照710nm抗体效价+＜20，00020，000＜++＜10，00040，000＜+++＜60，00060，000＜++++＜80，00080，000＜+++++＜100，000100，000＜++++++(4)针对本发明的单克隆抗体的抗原决定簇的鉴定如图2，图3显示了由TLC染色技术(A)和TLC免疫染色技术(B)所得各种类型糖脂的免疫反应和定性试验结果。图3中，第2和3道表明了天然形成的神经节苷脂的结果，换言之，即带有α2→3键的N-乙酰神经氨酸。这些道清楚地表明了带有α2→3键的N-乙酰神经氨酸对本发明的单克隆抗体有强烈特异性。
此外，第4和5道显示了化学合成的N-乙酰神经氨酸衍生物的结果。这些结果指出，人工合成的神经节苷脂不具有本发明的单克隆抗体对应的特异性。
综合分析本观察和条目(3)所得结果，结论是本发明的单克隆抗体识别作为抗原决定簇的N-乙酰神经氨酸的α2→3键。
图3中的各道详述如下(1)第1道GM31μg(2)第2道N-乙酰神经氨酸1μg(NANA)α2→3半乳糖
β1→1神经酰胺(3)第3道N-乙酰神经氨酸1μg(NANA)α2-3半乳糖α1→1神经酰胺(4)第4道N-乙酰神经氨酸0.5μg(NANA)β2→3半乳糖α1→1神经酰胺(5)第5道N-乙酰神经氨酸1μg(NANA)β2→3半乳糖β1→1神经酰胺(6)第6道CD31μg(5)定性免疫扩散技术(Ouchterlony技术)图4显示了免疫扩散技术所得结果。从图4可见，由本发明的杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体是IgM类抗体。本方法所用的抗血清抗MIgM，抗MIgG1，抗MIgG2a，抗MIgG2b和抗MIgG3购自Miles公司。
(1)抗MIgM(2)抗MIgG1(3)抗MIgG2a(4)抗MIgG2b(5)抗MIgG3(6)本发明的单克隆抗体是IgM类抗体这一事实也被用酶标抗体技术检测的结果所证实，本方法结果总结表Ⅱ如下。
表Ⅱ第二抗体杂交瘤细胞分泌抗体+-抗鼠IgM0.977±0.0790.066±0.007抗鼠IgG10.131±0.011 0.062±0.011抗鼠IgG2a0.137±0.013 0.109±0.010抗鼠IgG2b0.121±0.003 0.072±0.006抗鼠IgG30.131±0.007 0.046±0.003OD于500nm抗原GD3500μg/每孔第三抗体辣根过氧化物酶-羊抗兔Ⅰg结合物
权利要求
1.产生对携有含α2→3键的N-乙酰神经氨酸残基的含唾液酸的糖脂特异的单克隆抗体的杂交细胞瘤。
2.根据权利要求1的杂交瘤，该杂交瘤细胞为ATCCHB9475。
3.制备能生产对携有含α2→3键的N-乙酰神经氨酸残基的含唾液酸的糖脂特异单克隆抗体的杂交细胞瘤的方法，包括用(ⅰ)携有含α2→3键的N-乙酰神经氨酸残基和含唾液酸的糖脂免疫动物得到B细胞或淋巴细胞，与(ⅱ)骨髓瘤细胞融合。
4.根据权利要求3的方法，其中通过细胞融合所得的杂交细胞瘤进一步克隆。
5.根据权利要求3的方法，所述含唾液酸的糖脂是神经节苷脂。
6.根据权利要求5的方法，所述的神经节苷脂是GD3神经节苷脂或GM3神经节苷脂。
7.根据权利要求3的方法，其中所述动物是Balb/c小鼠。
8.根据权利要求3的方法，其中所述B细胞是Balb/c小鼠的脾细胞。
9.根据权利要求3的方法，其中所述骨髓瘤细胞来源于人，大鼠或小鼠。
10.根据权利要求3的方法，其中的骨髓瘤细胞来源于Balb/c小鼠。
11.根据权利要求3的方法，其中的细胞融合时所用融合剂是聚乙二醇。
12.根据权利要求3的方法，用作免疫佐剂的是明尼苏达沙门氏菌R595。
13.对携有含α2→3键为抗原决定簇的N-乙酰神经氨酸的含唾液酸的糖脂特异性的单克隆抗体。
14.根据权利要求13的单克隆抗体，其中含唾液酸的糖脂是神经节苷脂。
15.根据权利要求14的单克隆抗体，其中的神经节苷脂是GD3或GM3。
16.根据权利要求13的单克隆抗体，它为IgM型免疫球蛋白分子。
17.根据权利要求13的单克隆抗体，用于纯化神经节苷脂。
18.根据权利要求13的单克隆抗体，其中与黑色素瘤细胞表面抗原特异反应的。
19.根据权利要求17的单克隆抗体，用于治疗黑色素瘤患者。
20.根据权利要求18的单克隆抗体，用于血清学诊断。
全文摘要
揭示了能产生对携有含α2→3键的N-乙酰神经氨酸的含唾液酸的糖脂特异的单克隆抗体的杂交细胞瘤。该杂交瘤可通过将用携有含α2→3键的N-乙酰神经氨酸的含唾液酸的糖脂免疫动物得到B细胞或淋巴细胞，将其与骨髓瘤细胞融合。通过该杂交瘤细胞制备的单克隆抗体可用于纯化神经节苷脂，治疗黑色素瘤和血清诊断。
文档编号C12N5/20GK1042734SQ8810788
公开日1990年6月6日 申请日期1988年11月16日 优先权日1987年11月17日
发明者永井克孝, 山本英树, 高田欣二, 伊藤正善, 志鸟善保 申请人:美克德株式会社