专利名称：无放射性dna序列测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种确定核酸分子核苷酸碱基顺序并使之可见的方法。更具体地说，本发明涉及一种用银染技术确定和观察DNA或RNA分子的核苷酸碱基顺序的方法。本发明特别地涉及用一种超敏感性的银染方法实现DNA序列测定产物的直接的、非同位素的胶内检测。本发明是一个两部分组成的系统，它包括(1)核酸序列测定和(2)银染。
核酸是由核苷酸序列化学交联的一种聚合物，是所有细胞的基本遗传物质。核酸有两种形式脱氧核糖核苷(DNA)和核糖核苷(RNA)。两种形式都在它们的结构中携带确定蛋白质结构的遗传信息，蛋白质则是一切细胞的基本组成部分。
DNA和RNA的基本结构由四种核苷酸碱基组成。在DNA，核苷酸碱基是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)。在RNA，脲嘧啶(U)代替了胸腺嘧啶。核苷酸碱基由一糖和磷酸基团交替构成的骨架连成一条多核苷酸链。正是核酸的碱基排列顺序或序列决定基团的存在及最终哪一种蛋白将被合成。
精确确定核苷酸碱基的顺序是进一步了解由核苷酸编码的信息所产生的蛋白质的结构和功能的前提。一种这样的方法，即DNA序列测定涉及到确定在一定长度DNA上的核苷酸碱基排列顺序。现在被广泛了解并使用的两种DNA序列测定技术是Maxam和Gilbert(1977，1980)的化学降解法以及Sanger(1977)等的酶促双脱氧链终止法。
现有几种对Sanger(1977)等人的方法加以改进的技术，包括在两步合成反应中使用修饰的T7 DNA聚合酶(美国专利第4，994，372号，Tabor和Richardsom)，以及在两步合成反应中使用热稳定的DNA聚合酶(美国专利第5，075，216号，Brow等)，还有Craxton(1991)的热循环DNA序列测定法。两步标记方法和热循环技术可以用来减少DNA模板二级结构引起的问题。
传统的DNA序列测定方法采用放射性标记的寡聚核苷酸引物或直接掺入放射性标记的核苷酸。这些方法虽然灵敏，但需要附加的曝光时间，同时带来废物处理的问题。
在灵敏的DNA片段检测方面，荧光标记的寡聚核苷酸引物可以代替放射性标记的引物(美国专利第4，855，255号，Smith等)。同样地，DNA序列测定产物也可以用荧光双脱氧核苷酸(美国专利5，047，519，Prober等)或直接掺入荧光标记的脱氧核苷酸(Voss等，1992)来标记。荧光序列测定法免去了使用放射性核苷酸的很多问题，但需要技术上复杂而又昂贵的检测仪器。
化学发光检测法避免了与使用贵重仪器有关的许多问题。在一种具体做法中，化学发光序列测定法把一个生物素化的引物用于引物延伸反应。生物素标记的延伸产物在测序凝胶上电泳，转移到一个固态支持物如尼龙膜上，然后用链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酯酶复合物作为探针检测。生物素-链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酯底物检测到，例如，可用3-(4-甲氧基螺[1，2-二氧杂环丁烷-3，2'-三环[3.3.1.1.3，7]癸(烷)-4-基苯基磷酸酯酸二钠(AMPPD)或3-(4-甲基螺｛1，2-二氧杂环丁烷-3，3'-(5'-氯)三环[3.3.1.1.3，7]癸(烷)｝-4-基)苯基磷酸二钠(CSDD)(Martin等，1991)，这一方法经得起多重处理，但需要昂贵的试剂和困难的凝胶处理过程。
本发明的目的就在于提供一个通过银染技术确定DNA分子核苷酸碱基顺序系统。本发明的另一个目的在于用敏感的银染技术直接在变性聚丙烯酰胺凝胶上使电泳分离的序列测定产物得到直接的、非同位素的检测。
本发明涉及一种确定核酸分子核苷酸碱基排列顺序的方法，该方法包括形成一系列核酸分子的片段，将凝胶浸没于银染溶液中使片段足以同银染溶液反应，并观察片段的银染生成物从而确定DNA分子的顺序。
本发明也涉及确定DNA分子核苷酸碱基顺序的方法，该方法包括把一个引物与DNA模板分子杂交，用DNA聚合酶进行引物延伸，在延伸的引物上掺入一个链终止核苷酸，产生一定数量的核苷酸片段，所有片段起始于位置相同的核苷酸，但有不同长度的末端，终止于四个核苷酸碱基A，C，G，T中的一个，按大小在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离这些片段，使至少有一部分核苷酸碱基排列顺序能被测定，把凝胶浸入银染溶液中，使片段可检测到，通过直接观察银染片段确定DNA分子的序列。
本发明还涉及一个DNA序列测定试剂盒，包括一个装有DNA聚合酶的容器，一个装有测序缓冲液的容器，装有脱氧和双脱氧核苷酸混合物的容器，一个装有测序终止溶液的容器，一个装有固定/停止溶液的容器，一个装有银染试剂的容器，以及使用方法。
本发明的DNA序列测定及银染技术提供了一个在凝胶上使DNA序列可见的快速、安全和廉价的方法。本发明的一个主要优点在于银染后序列条带就能在凝胶上直接用肉眼看到。DNA序列也可用扫描仪器或电视成像从凝胶的照相复制片上看到。
此外，其灵敏度可与传统的放射性序列测定法相比。本发明也避免了同位素如32P，33P，35S的使用，它们是放射自显影检测序列测定产物所必需的。
本方法是非常快速的，因为凝胶电泳后，用最少的操作时间仅需90分钟就可使电泳条带可见，所以可以在同一天读取数据。而用标准的放射自显影胶片，为得到足够的曝光灵敏度，标准的同位素技术有时需要几个小时至几天时间。
本发明不需要使用特殊的、昂贵的仪器，如基于光电倍增管的检测器，磷光成像仪，或激光荧光检测器等来检测银染条带。
本发明的银染测序系统完全适用于所有已知的酶促DNA序列测定方法。
本发明的序列测定系统可用于在形成和观察核酸序列测定产物中用到的多种不同的模板，例如单链(ss)M13和噬菌体质粒的克隆单链或双链(ds)模板，PCR扩增的DNA，质粒和大的ds DNA模板如λ和柯斯质粒(cosmid)以及GC丰富的和多聚腺苷酸丰富的模板。
本发明的测序系统也可以与已知的在双脱氧DNA序列测定中普遍使用的酶一起使用。这些酶包括E.Coli DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，逆转录酶(RT)，噬菌体T7 DNA聚合酶如 SEQUENASETM和SEQUENASETM第2.0版(United States Biochemical Corporation，Cleaveland，OH)，热稳定的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶或AMPLITAQTM，Hoffman-La Roche，Inc.，Nutley，NJ)，经修饰的Taq DNA聚合酶，如Promega的测序级Taq DNA聚合酶(SG Taq)，AMPLITAQTMDNA聚合酶，Stoffel片段(Hoffman-La Roche，Inc.)或△TaqTM(United States Biochemical Corporation)，Thermus thermophilus(Tth DNA聚合酶)，Bacillus caldotenax(Bca DNA聚合酶)，Thermococcus litoralis[VentTM(exo-)DNA聚合酶(New England Biolabs，Inc.，Beverley，MA)]，Bacillus stearothermophilus(BstRDNA聚合酶，Bio-Rad Laboratories，Inc.凝胶电泳后，就可立刻用银染方法检测序列条带。其它与测序无关的银染相关技术是众所周知的，它们本身并不构成本发明的一部分。
Somerville和Wang(1981)及Boulikas和Hancock(1981)首次描述用银染手段检测核酸。1982年，Biedler等提出银染可能对在测序凝胶上检测DNA条带有用。尽管如此，Biedler等与其他研究人员都没有证明用银染可使DNA序列条带可见。Bassam等(1991)及相应的国际专利申请公布WO 92/17611(Caetano-Anolles等)描述了检测聚合酶链式反应(PCR)扩增的DNA片段的银染技术。但没有文献描述或提到用银染技术检测DNA测序凝胶上的条带。另外，本发明除了在需要获得模板材料时外，并不要求使用PCR扩增技术。
把电泳后带有DNA序列的凝胶浸入足以淹没凝胶的溶液。溶液体积取决于胶的大小。凝胶首先在固定溶液中固定，即在10%乙酸中浸泡至少30分钟，然后用双蒸水浸泡两到三次，每次2分钟。
用水浸泡之后，把凝胶完全浸入银染溶液中。优先选择的银染溶液是硝酸银和甲醛(lg/L AgNO3，0.0055%HCOH)。这里介绍的发明优先使用银进行测序DNA片段的染色。用银之外的还原金属离子属于本发明范围之内。其它的还原金属离子可与核酸形成胶内复合物，然后可在原位用化学方法还原，镍离子溶液已被用于蛋白复合物的染色(Yudelson，J等，1984)。镍和其它金属离子可能具备染色核酸的能力。这些金属可能以一种特异的方式与核酸组分相互作用，能够象银离子一样在凝胶上被化学还原，产生一种可见的大分子金属元素团块。这里的一般概念是，核酸序列片段能够在变性聚丙烯酰胺凝胶上用不同的金属染色溶液检测到，银只是其中一例。其它几种金属离子如铂、镍、铜或金可以用于与核酸形成复合物，可以电泳凝胶上用化学方法还原，使DNA序列测定片段染色。
银染及简略的水洗之后，把凝胶放入显影液中(30g/L碳酸纳，0.0055%HCOH，2mg/L NaS2O3)，浸泡时间取决于凝胶厚度。一般约20秒，直至DNA条带显示。为能更好地控制显影过程，显影液可冷至10°-15℃。然后加入终止溶液(10%V/V乙酸)终止显影。
凝胶可晾干或用对流加热方法干燥。DNA条带可用显象密度测定法直接在凝胶上或照像复制后检测。其它本过程已知的形象化方法也在考虑之中。
本发明也牵涉到一个DNA序列测定试剂盒。试剂盒包括测序必需的试剂，银染试剂，以及使用方法。
测序试剂测序必需的试剂包括DNA聚合酶，脱氧核糖核苷酸，链终止物，DNA序列测定物，反应缓冲液及有关的混合物。
银染与DNA序列条带相对应的银离子定位沉淀由银染溶液处理后生成。银染溶液包括以下的一种或多种(1)固定、停止溶液;(2)银染试剂或溶液;(3)显影试剂或溶液;和、或准备凝胶所需的试剂或溶液，即粘合溶液(95%乙醇，0.5%冰乙酸，0.5%甲丙烯酰基丙氧基三甲基硅烷)和SIGMACOTETM(Sigma Intermational，Ltd.，圣路易斯，密苏里州)。银染溶液包括一种银盐，即硝酸银或高氯酸银，和甲醛，它们与DNA条带反应产生一种在还原性溶液或显影液中呈深棕黑色的复合物。颜色可以很容易地用肉眼看出。
DNA测序缓冲液优选的DNA测序缓冲液是Promega的SILVER SEQUENCETM5×缓冲液，含250mM Tris-HCl(pH9.0，25℃)和10mM MgCl2。其它已知的测序缓冲液也能使用。
脱氧、双脱氧核苷酸混和物。
终止混合物含有适量的7-去氮-dGTP(美国专利4，804，748号，Barr等)，dATP，dTTP，dCTP和适量ddNTP(ddGTP用于d/ddGTP反应，ddATP用于d/ddATP反应，ddTTP用于d/ddTTP反应，ddCTP用于d/ddCTP反应)。
测序技术所知的终止溶液可在本过程中使用。例如95％甲酰胺 20mM EDTA,0.05% 溴酚蓝,0.02%二甲苯兰FF；95％甲酰胺 20mM EDTA,0.05% 溴酚蓝,0.05%二甲苯兰FF；95％甲酰胺 20mM EDTA,0.05% 溴酚蓝,0.1%二甲苯兰FF；一种优先选择的测序终止溶液是Promega的SILVER SEQUENCETM终止溶液，含10mM NaOH;95%甲酰胺(V/V)，0.05%溴酚蓝(V/V)，及0.05%二甲苯兰FF(V/V)。其它本技术已知的终止溶液也能使用。
凝胶固定/停止溶液凝胶固定/停止溶液含约5%至30%的乙酸。优先选择的银染固定和或停止液是10%V/V(冰乙酸)。其它本技术已知的固定/停止溶液也能使用。
以下实施例用以详细描述本发明，但并不局限于此。
实施例1优选的测序方法例1列举了用本发明的银染法测定DNA分子核苷酸碱基序列的一个较好的方法。
质粒模板DNA的制备热循环方法由于采用了热变性，避免了双链模板的碱变性及乙醇沉淀。
测序方法每组序列反应的四个0.5ml小离心管标记为G，A，T，C，每管中加入2μl相应的d/dd NTP混合物，终止混合物含有40μmol7-去氮-dGTP，40μmol dATP，40μmol dTTP，40μmol dCTP和相应的ddNTP(45μmol ddGTP用于d/ddGTP反应，525μmol ddATP用于 d/ddATP反应，900μmol ddTTP用于d/ddTTP反应，300μmol ddCTP用于d/ddCTP反应。试管加盖置于冰浴或4℃直至用时取出。
每组四个序列反应中，小离心管要混合以下试剂0.02-1.00pmol模板DNA(见下一段)，5μl5×缓冲液(250mM Tris-HCl，pH9.0，25℃;10mM MgCl2)，4.5p mol引物和无菌水至最终体积为16μl。
下表列出了DNA模板的参考量(以纳克(ng)为单位)模板 ng200bp 8ng(PCR产物) (0.06 pmol)3，000-5，000 bp 2000ng(超螺旋质粒 DNA) (1 pmol)48，000 bp 750 ng(λ，柯斯质粒 DNA) (0.02 pmol)由于超螺旋质粒产生的信号比松弛型dsDNA微弱，所以需要较大的量，如每个反应1 pmol。计算相当于1pmol模板DNA微克数的一般公式如下dsDNA1pmol＝(6.6×10-4μg)×n，n是模板的碱基对数。
ssDNA1pmol＝(3.3×10-4μg)×n，n是模板的碱基数。
计算相当于4.5pmol的引物纳克数的一般公式如下4.5pmol＝1.5ng×n，n是引物的碱基数小离心管中混合了这些试剂后，在引物和模板的混合物中加入1.0μlSG Taq(5μ/μl)，稍吸几次混匀。
从酶、引物、模板的混合物中各取4μl加至每个含有dd/dNTP混合物的试管内壁。
每个试管中加一滴(约20μl)石蜡油，在小离心机稍微离心一下。
把反应试管置于热循环仪加热至95℃开始循环过程。热循环仪预热至95℃很重要，以避免由SG Taq引起的非专一性退火引物的延伸。升温时间越短越好。根据引物、模板的组成来优化循环模式。以下的循环模式可供参考模式一适于小于24碱基或GC含量＜50%的引物。
95℃ 2分钟，进入下列循环95℃ 30秒 (变性)42℃ 30秒 (退火)70℃ 1分钟 (延伸)45～60次循环，然后保存于4℃模式二适于大于24碱基或GC含量≥50%的较短引物。
95℃ 2分钟，进入下列循环95℃ 30秒 (变性)95℃ 30秒 (退火/延伸)45～60次循环，然后保存于4℃这些程序一般可使序列读到从引物起1-400碱基。
完成热循环过程后，在每个试管内壁上加3μl终止溶液(10mM NaOH，95%甲酰胺，0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯兰)，试管在小离心机中稍离心以终止反应。样品可在加终止溶液前置于4℃过夜。
反应物在上样子测序凝胶前需70℃～95℃加热2分钟。每个反应上样2.5至6.0μl，不必去除盖在上面的石蜡油，只要在吸取时小心地只吸石蜡油下面的兰色样品。
测序凝胶板的准备短的测序凝胶玻璃板用粘合溶液进行处理，使凝胶化学交联于玻璃板(Kobaya-shi，Y.1988)，以防银染过程中凝胶脱落。为提供一个使凝胶具有较好机械稳定性的表面，用1ml新鲜配制的粘合溶液(95%乙醇，0.5%冰乙酸，0.5%甲丙烯酰基丙氧基三甲氧基硅烷)，擦拭极其洁净的玻璃板。4至5分钟后，用95%乙醇擦拭玻璃板去除多余的粘合溶液。凝胶固定于玻璃板，因而能制备4-5%聚丙烯酰胺/脲素凝胶以增加阅读长度。
长凝胶玻璃板用SIGMACOTE 薄膜介质(Sigma International Ltd.，圣路易斯，密苏里州)处理以防凝胶粘合于长玻璃板。用SIGMACOTE 溶液擦拭极其洁净的玻璃板，5至10分钟后，用薄纸擦拭玻璃板去除多余的SIGMACOTER测序凝胶银染除了显影反应，所有反应过程都在室温不断轻摇下进行。显影溶液要预冷以控制显影反应并减少本底染色。所定时间适于标准0.4mm厚凝胶。步骤依据Bassam等(1991)和国际专利申请公布WO92/17611，Cactano-Ano-lles等。
1.电泳以后，用塑料楔子小心分开玻璃板，凝胶牢固地粘附于短玻璃板。
2.把短玻璃板连同附着的凝胶放入装有足以浸没凝胶的固定/停止溶液(10%冰乙酸)的浅底塑料盘。凝胶至少摇动20分钟。凝胶可置于固定/停止溶液过夜，这也属本发明范围之内。
3.凝胶再用双蒸水(ddH2O)洗涤三次，每次2分钟。
4.凝胶在染色溶液中浸泡30分钟[1g/L硝酸银(AgNO3);0.056%甲醛(1.5ml 37%甲醛/升)]。凝胶可浸泡更长时间，直至几小时，这也属本发明范围之内。
5.用双蒸水洗涤凝胶20秒。注意保持这一步骤不超过20秒，如超过20秒有时会导致染色深度明显下降。较薄的凝胶可能需要相应地缩短水洗时间。
6.把适量的显影溶液(30g/L碳酸钠(Na2CO3);0.056%甲醛(1.5ml 37%甲醛/升);2mg/l五水硫代硫酸钠(Na2S2O3.5H2O))预冷至10-12℃，凝胶在显影溶液中显影直至可见条带，一般少于10分钟。
7.加入等体积固定/停止溶液终止显影反应，至少需2至3分钟。
8.凝胶再用ddH2O洗涤二次，每次2分钟。
9.凝胶可吹风干燥，对流热干燥或室温凉干。
用以上技术进行的四个试验结果参见
图1。图1显示了在6%聚丙烯酰胺/7M脲素测序凝胶上两份相同的DNA测序样品。
样品1和5显示了用以上测序步骤及pUC/M13正向24聚体测序引物对含有鼠α-1-抗胰蛋白酶cDNA插入的2μg重组pGEM -5Zf(+)质粒的测序结果。反应采用循环模式一进行了60次循环，但以50℃的退火温度代替42℃。
样品2和6显示了用以上测序步骤及pUC/M13正向24聚体测序引物对含有鼠α-1-抗胰蛋白酶cDNA插入的2μg重组pGEM -5Zf(+)质粒的测序结果。反应采用循环模式二进行了60次循环。
样品3和7显示了用上述测序步骤及T7 20聚体测序引物对含有α-1-抗胰蛋白酶cDNA插入的750ng重组λpGEM -12噬菌体获得的DNA的测序结果。反应采用循环模式一，但以50℃的退火温度代替42℃。
样品4和8显示了用上述测序步骤和一种用于PCR扩增的引物(20聚体)对22ng(60fmol)，550碱基对的人β-珠蛋白PCR产物的测序结果。反应采用循环模式二进行了60次循环。
实施例2SILVER SEQUENCETM测序反应SILVER SEQUENCETM测序反应按下述方法进行混合2μgPromegapGEM -3Zf(+)质粒模板(未变性)、3.75μl(37.5ng;4.7pmol)pUC/M13正向24聚体测序引物，5.0μl SILVER SEQUENCETM5×缓冲液(250mM Tris HCl，pH9.0，25℃;10mM MgCl2)，加蒸馏水至15μl，加SGTaqDNA聚合酶(2μl，10单位)，取4μl加入各个含有2.0μl相应终止混合物的0.5ml小离心管。终止混合物含有40μM7-去氮-dGTP，40μM dATP，40μM dTTP，40μM dCTP和相应ddNTP(45μM ddGTP用于d/ddGTP反应，525μM ddATP用于d/ddATP反应，900μM ddTTP用于d/ddTTP反应，300μM ddCTP用于d/ddCTP反应)，用一滴石蜡油覆盖样品，置于预热的热循环仪(95℃)，热循环模式由最初的95℃保温2分钟及95℃30秒、70℃ 30秒，45次循环组成。加入3μl SILVER SEQUENCETM终止混合物(10mM NaOH;95%甲酰胺;0.05%溴酚兰;0.05%二甲苯兰)终止反应。反应物在70℃保温2分钟，按实施例1所述取6.0μl上样于6%聚丙烯酰胺/7M脲素测序凝胶，电泳，染色。
图2的样品1是用此方法测序的DNA银染序列阶梯状图谱。图2是用35cm×43cm电泳复制胶片(Eastman Kodak Company，Publication KP8317a，收编作为参考)对银染凝胶的复制照片。
实施例3VentTMR(exo-)测序反应VentTMR(exo-)测序反应技术在New England Biolabg CIRCUMVENTTM热循环双脱氧DNA测序盒的技术手册中有描述，收编于此作为参考。简要地来说，2μg Promega pGEM -3Zf(+)质粒模板(未变性)同3.75μl(37.5ng;4.7pmol)pUC/M13正向24聚体测序引物、1.5μl 10×CIRCUMVENTTM测序缓冲液，1.0μ130×Triton X-100混合，加蒸馏水至最终体积为12.0μl。加入VentR(exo-)DNA聚合酶2.0单位，取3.2μl分别加至4个0.5ml小离心管，每管含有3.0μl相应的终止混合物。在样品上加一滴石蜡油进行热循环，循环模式由95℃ 20秒，50℃ 20秒，72℃ 20秒循环25次组成。加4μl停止混合物停止反应。反应物在70℃保温2分钟，取6.0μl上样于6%聚丙烯酰胺/7M脲素测序凝胶，按实例1所述进行电泳染色。
图2的样品2表示用此方法所显示的银染DNA测序阶梯状图谱。
实施例4AMPLITAQTM测序反应
AMPLITAQTM测序反应技术在Perkin-Elmer/Cetus AMPLITAQTM测序盒的技术手册中有描述，收编于此作为参考。简要说，4μg pGEM -3Zf(+)质粒模板DNA(Promega Corp.)加0.1体积2M NaOH碱变性。室温保温5分钟，加0.2体积3M醋酸钾中和。加4体积乙醇沉淀变性模板，用70%乙醇洗涤一次，干燥。模板DNA再悬浮于15μl蒸馏水，1μl引物(10ng;1.25pmol)和4μl标记的混合物(含有AMPLITAQTMDNA聚合酶，缓冲液和核苷酸)。样品在45℃保温5分钟。取4μl分别加至4管中的每一管，每管含有4μl相应的终止混合物，在72℃保温5分钟。加4μl停止混合物，停止反应。反应物在70℃保温2分钟，取6.0μl上样于6%聚丙烯酰胺/7M脲素测序凝胶，按实施例1所述进行电泳染色。
图2的样品3显示了用本方法测序的DNA序列阶梯状银染条带。
实施例5TAQTRACK 测序反应TAQTRACK 测序反应技术在Promega的TAQTRACKR测序系统的技术手册中有描述，收编于此作为参考。简要地说，4μg质粒模板用碱变性，如AMPLTAQTM反应(实施例4)中所述。再将模板DNA悬浮于5.5μl蒸馏水，5.0μl5×反应缓冲液和2.0μl(2.5pmol)引物中。样品在37℃保温10分钟以利于退火，然后加入1μl(8单位)SG Taq DNA聚合酶。取6μl分别加至4管中的每一管，每管含有1.0μl相应的终止混合物，在70℃保温15分钟。加4μl停止混合物，停止反应。反应物在70℃保温2分钟，取6.0μl上样于6%聚丙烯酰胺/7M脲素测序凝胶，按实施例1所述进行电泳，染色。
图2的样品4表示用此操作方法测序的DNA银染序列阶梯状图谱。
实施例6美国生化试剂公司(USB)测序酶TM(SequenaseTM)变体2测序方法。
这种测序反应技术在USB公司的测序酶TM变体2的技术手册中有描述，收编于此作为参考。
简要地说，4μg质粒模板DNA按AMPLITAQ反应(实施例4)中所述方法用碱变性，再将模板悬浮于7μl蒸馏水，2μl测序酶TM反应缓冲液和1μl pUC/M13正向24聚体测序引物(10mg;1.25pmol)中。65℃保温2分钟。取缓慢冷至室温以利于退火。将下列试剂加至退火的引物-模板的混合物中1.0μl 0.1M DTT，2.0μl稀释的标记混合物和2.0μl稀释的测序酶TM变体2.0。反应物在室温保温2至5分钟，取3.5μl加入4管中的每一管，每管含有2.5μl相应的终止混合物。反应物37℃保温3至5分钟，再加4μl停止溶液停止反应。反应物在70℃保温2分钟，取6.0μl上样于6%聚丙烯酰胺/7M脲素测序凝胶，按实施例1所述进行电泳，染色。
图2的样品5表示用此操作方法测定的DNA序列的阶梯状银染图谱。
实施例7Bst 测序反应BstR测序反应技术在BioRad的Bst DNA测序盒手册中有描述，收编于此作为参考。简要地说，将4μg质粒模板DNA用碱变性，如AMPLITAQTM反应(实施例4)所述。再将模板悬浮于5.5μl蒸馏水，1.5μl反应缓冲液和2.0μl引物中。样品在65℃保温5分钟，再加1μl Bst DNA聚合酶，2μl标记混合物和1μl蒸馏水。样品在65℃保温5分钟，取3μl加至4管中的每一管，每管含有6.0μl相应的终止混合物，65℃温育10分钟。加4μl停止混合物停止反应。反应物在70℃保温2分钟，取2.5μl上样于6%聚丙烯酰胺/7M脲素测序凝胶，按实例1所述进行电泳，染色。
本发明并不局限于这里所描述的特定的组成方式和设置，还包括属于权利要求范围以内的那些改进方式。
权利要求
1.一种确定核酸分子核苷酸碱基顺序并使之可见的方法，其特征是包括a.通过形成一系列核酸片断测定核酸序列；b.在凝胶介质上电泳分离一系列片断；c.把凝胶浸入印染溶液中一段时间，使序列片断与印染溶液充分反应；及d.通过观察银染后的一系列片断确定核酸序列。
2.根据权利要求1所述方法中的核酸其特征是按照酶促双脱氧链终止法测定序列的。
3.根据权利要求2所述方法中确定核酸分子核酸苷酸碱基序列的步骤其特征是包括a.把一个引物杂交到要测定序列的核酸模板上;b.在序列测定的条件下延伸引物;以及c.按大小分离生成的片断，使至少核酸分子的一部分碱基顺序能被确定。
4.根据权利要求3所述方法的引物其特征是一种寡聚核苷酸引物。
5.根据权利要求4所述方法其特征是还包括在延伸的引物上掺入一个链终止核苷酸，在该反应条件下产生的一定量的核苷酸片断，具有相同的5'核苷酸起始位置，但有不同长度的末端，结束于A，C，G，T四个核苷酸碱基的任何一个。
6.根据权利要求3所述方法的测序条件其特征是包括用以下任何一种DNA聚合酶进行的引物延伸E.Coli DNA聚合酶Klenow片段，逆转录酶，SEQUENASETM，SEQUENASETM第2.0版，噬菌体T7DNA聚合酶，热稳定性DNA聚合酶及其有关的经修饰的聚合酶。
7.根据权利要求6所述方法中的热稳定性DNA聚合酶其特征是包括选自以下酶类Thermus aquat icus DNA聚合酶，AMPLITAQTM，测序级Thermus aquaticus DNA，聚合酶(SG Taq)，△TaqTM DNA聚合酶，DNA聚合酶Stoffel片段，Thermus thermophilus DNA聚合酶，Thermococcus litoralis DNA聚合酶，Bacillug caldotenax DNA聚合酶，Thermus flavus DNA聚合酶，Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶及有关的经修饰的聚合酶。
8.根据权利要求3所述方法中的DNA序列测定条件其特征是包括在热循环条件下用一种热稳定性的DNA聚合酶进行引物延伸。
9.根据权利要求3所述方法的DNA序列测定条件其特征也包括在非热循环条件下用一种DNA聚合酶进行引物延伸。
10.一种确定DNA核苷酸碱基顺序并使之可见的方法其特征是包括a.把一个引物与要测定序列的DNA模板杂交;b.用一种DNA聚合酶进行引物延伸;c.在延伸的引物中掺入链终止核苷酸使之形成具有相同5’核苷酸起始位置而有不同长末端的片断，末端终止于四种核苷酸碱基A，C，G，T中的一个。d.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离生成的片断，至少有一部分DNA序列能被确定;e.把凝胶浸没于银染溶液中，时间足以使片断与银染溶液反应;以及f.通过观察银染反应的片断确定DNA序列。
11.根据权利要求10所述测序条件其特征是包括用下列酶类中的一种DNA聚合酶延伸引物E.Coli DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，逆转录酶，SEQUENASETM，SEQUENASETM第2.0版，噬菌体T7 DNA聚合酶，热稳定的DNA聚合酶及其有关的经修饰的聚合酶。
12.根据权利要求10所述DNA聚合酶其特征是一种热稳定的DNA聚合酶。
13.根据权利要求12所述热稳定的DNA聚合酶其特征是选自以下酶类Thermus aquaticus DNA聚合酶，AMPLITAQTMDNA聚合酶，DNA聚合酶的Stottel片段，测序级Thernusaquaticus DNA，聚合酶(SG Taq)，△TaqTMDNA聚合酶，Thernococcus litoralis DNA聚合酶，Thermus thermophilus DNA聚合酶，Bacillug caldotenax DNA聚合酶，Thermus flavus DNA聚合酶，Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶及经过修饰的聚合酶。
14.根据权利要求10所述DNA模板其特征是选自单链DNA和双链DNA。
15.根据权利要求10所述方法中DNA序列的确定其特征是还包括一组四个不同的测序反应，每个测序反应含有一个不同的链终止核苷酸，它使核苷酸链的合成终止于一个相应的核苷酸碱基，每个反应产生一组不同的核苷酸片段。
16.一种用于DNA序列测定的银染测序试剂盒，其特征是包括a.装有DNA聚合酶的容器;b.装有DNA测序缓冲液的容器;c.装有固定、停止溶液的容器;d.装有测序终止溶液的容器;e.装有脱氧核糖核苷酸和双脱氧核糖核苷酸混合物的容器;f.装有银染溶液的容器;g.装有显影溶液的容器;以及h.使用方法。
17.根据权利要求16所述的试剂盒其特征是还包括做对照反应使用的测序引物和DNA模板。
18.根据权利要求16所述试剂盒其特征是包括其中的引物pUC/M13正向24聚体，DNA模板是pGEM①-32f(+)。
19.根据权利要求16所述试剂盒中的银染溶液其特征是包括硝酸银和甲醛。
20.根据权利要求16所述试剂盒中的显影溶液其特征是包括碳酸钠，甲醛和硫代硫酸钠。
全文摘要
本发明把生成DNA分子核苷酸碱基顺序的方法与一种超敏感的银染方法相结合，提供一种新的DNA序列测定方法及试剂盒。这一新的技术组合使电泳分离的序列片段不依赖于仪器就直接可见。这种无放射性的系统包括通过用酶促双氧链终止反应形成一系列DNA序列片段，凝胶电泳分离这些片段，并把凝胶浸入超敏感的银染溶液中，观察引物延伸产物的银染条带，从而确定DNA分子的序列。
文档编号C12Q1/25GK1098746SQ9311251
公开日1995年2月15日 申请日期1993年8月10日 优先权日1993年8月10日
发明者利奥柏多·G·门多萨, 道格拉斯·R·斯多兹 申请人:上海普洛麦格生物产品有限公司