专利名称：具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽、编码该蛋白质或多肽的 DNA、利用该 DNA制造 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及表现出使与粉碎或切洋葱等植物时发生的催泪成分的生成有关的1-丙烯次磺酸转变为催泪成分的作用的蛋白质或多肽、编码该蛋白质或多肽的DNA(催泪成分合成酶基因)。
本发明的催泪成分合成酶基因可用于例如，控制催泪成分的生成、在使破碎或切断时发生的催泪成分的量减少的植物的开发中作为材料或交配物等的筛选指标使用、提供用于抑制该酶表达量的信息，实现大量生产该酶、大量生产催泪成分等。
在本说明书中、“催泪成分”指的是Lachrymatory Factor(以下、记为LF)，具体来说，是硫代丙醛-S-氧化物。而所谓具有催泪成分合成酶活性与表现出将催泪成分合成酶的推定底物反-1-丙烯次磺酸转变为催泪成分的作用，或在蒜氨酸酶存在下具有由存在于洋葱等的反-S-1-丙烯基-半胱氨酸亚砜(PeCSO)生成催泪成分的作用是同义的。
背景技术：
关于粉碎或切断洋葱时发生的催泪成分，到目前为止已报道了许多研究成果，有关存在于洋葱等的催泪成分(Lachrymatory FactorLF)的形成及其的分解，人们一直认为是S-1-丙烯基-半胱氨酸亚砜(PeCSO)被蒜氨酸酶一分解，就生成催泪成分。即认为蒜氨酸酶作用于上述前体物质PeCSO，经1-丙烯次磺酸不经酶反应就转变为稳定的催泪成分。
然而，根据本发明人的研究，PeCSO只是被蒜氨酸酶分解，并不产生催泪成分，判明必须有其它酶(催泪成分合成酶)参与。因此，本发明人等不断进行深入研究，发现存在一种新酶(催泪成分合成酶)，该酶可使上述次磺酸异构化后生成催泪成分，由此可知，上述前駆物质通过该酶的某种作用变成了催泪成分或与此不同的别的风味成分。另外，在对该催泪成分合成酶(催泪性物质合成酶)的制造方法进行开发的同时，也弄清了催泪成分合成酶的理化性质，提出了专利申请(特开平10-295373号公报)。
另外，本发明人等为了阐明在蒜氨酸酶存在下，具有由存在于洋葱等中的PeCSO生成催泪成分的作用的催泪成分合成酶的构造为目标，不断进行深入研究，结果在催泪成分合成酶的多个同功酶、其氨基酸序列以及编码来自洋葱的该酶的基因序列的阐明中获得成功，提出了专利申请(国际公开第02/20808号公报)。
这样的催泪成分合成酶通常也存在于葱属(Allium葱属)植物，编码该酶的DNA信息在这些植物等品种开发中可用于基因重组或变异的诱导或交配等，可以在即使粉碎或切断时也难于产生催泪成分的植物的制作等中起作用。另外在生理活性物质硫代亚磺酸盐(thiosulfinates)乃至其反应物的生成量增大的植物制作等中也起到作用。
另外，如果利用编码具有催泪成分合成酶活性的蛋白质的DNA信息，可以通过基因重组技术大量生产该酶，例如，在有效制造在泪缺乏症(干眼症)等治疗有作用的催泪成分的技术开发中也有用。
发明内容
本发明的目的在于提供催泪成分合成酶基因、特别是葱属植物中含有的催泪成分合成酶基因。
另外，本发明的目的在于提供具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽、特别是葱属植物中含有的具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽。
此外，本发明的目的在于提供通过基因重组技术实现更有效地制造出催泪成分合成酶的同功酶的方法。
另一个目的是提供实现对由催泪成分的前体物质生成催泪成分的酶基因的表达进行抑制的手段。
用于达到上述目的的本发明由以下技术手段构成。
(1)编码表现出使1-丙烯次磺酸转变为催泪成分的作用的蛋白质或多肽的DNA。
(2)上述DNA是由序列1、5、7、9、13或15所示碱基序列构成的或由以下(a)～(c)中任一个构成的DNA。
(a)由在序列1、5、7、9、13或15所示碱基序列中付加、缺失、或置换1或多个碱基后的碱基序列构成的DNA。
(b)在严格条件下，可与由序列1、5、7、9、13或15所示碱基序列构成的DNA进行杂交的DNA。
(c)由与序列1、5、7、9、13或15所示碱基序列的同源性在60％以上的碱基序列构成的DNA。
(3)序列25所示的用于属于葱属植物的催泪成分合成酶基因的分离所使用的引物以及使用该引物分离该基因的方法。
(4)含有上述DNA的重组载体。
(5)包含含有上述DNA的重组载体的转化体。
(6)具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽的制造方法，其特征是对用含有上述DNA重组载体转化的宿主细胞进行培养，然后对产生在培养基中或细胞中的具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽进行分离。
(7)具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽，包含以下任一个序列(a)序列2、6、8、10、14或16所示的氨基酸序列、(b)在序列2、6、8、10、14或16所示的氨基酸序列中付加、缺失或置换1或多个氨基酸后的氨基酸序列、或
(c)与序列2、6、8、10、14或16所示氨基酸序列的同源性在65％以上的氨基酸序列。
(8)具有抑制mRNA翻译的功能的核酸分子，该mRNA是具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽的mRNA。
另外，在本发明中，关于以上的技术手段，包括DNA是除去由序列11所示碱基序列构成的DNA的情形。
另外，在本发明中，关于以上技术手段，包括DNA是除去编码含有序列12所示氨基酸序列的蛋白质或多肽的DNA的情形。
另外，在本发明中，关于以上技术手段，包括蛋白质或多肽是除去含有序列12所示的氨基酸序列的蛋白质或多肽的情形。
在本发明中，提取葱属植物的总RNA，以该总RNA中含有的mRNA为模板通过RT-PCR法合成cDNA，以国际公开第02/20808号公报中已经得到的编码洋葱催泪成分合成酶蛋白质或多肽的DNA(序列11)碱基序列为基础设计引物，以上述cDNA为模板，通过PCR法有选择地合成催泪成分合成酶基因。另外，对于通过以来自上述洋葱的碱基序列为基础设计的引物不能有选择地合成催泪成分合成酶基因的葱属植物，设计对其分离有效的其它引物，同样有选择地合成该基因。
由PeCSO的蒜氨酸酶的分解物使催泪成分(硫代丙醛-S-氧化物)生成的催泪成分合成酶是与植物风味改质或加工适应性提高有关的重要的成分。因此，在催泪成分合成酶的生产和植物育种领域中，该催泪成分合成酶基因的确定极其有意义。
作为获得催泪成分合成酶基因的序列的具体方法，例如以下的方法。
(1)(总RNA的提取、cDNA的合成)由各葱属植物的总RNA合成cDNA。用于该目的方法只要是本领域技术人员公知的任一方法都可以，例如、在下面叙述的实施例中采用使用RNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN Cat.no.74903)提取总RNA，使用Ready-To-Go T-Primed First-Strand试剂盒(AmerchamBiosciences code no.27-9263-01)合成cDNA的方法。
(2)(RACE法)通过使用一个以上含有洋葱催泪成分合成酶基因3′侧区域的序列的引物，对该葱属植物催泪成分合成酶基因的3′侧区域进行PCR扩增，使用一个以上含有洋葱催泪成分合成酶基因5′侧区域序列的引物，对该葱属植物催泪成分合成酶基因5′侧区域进行PCR扩增，可以确定葱属植物的催泪成分合成酶基因序列。作为含有上述洋葱催泪成分合成酶基因3′侧区域的序列的引物，如序列17所示寡核苷酸，作为含有上述洋葱催泪成分合成酶基因5′侧区域的序列的引物，如序列19所示的寡核苷酸，但不限定于这些。
(3)(TA克隆法)对于韭葱(A.ampeloprasum L.)，只从来自洋葱催泪成分合成酶基因序列的信息不能得到RACE产物。因此，需要洋葱、野薤、大葱3种催泪成分合成酶基因中均序列保守的区域，通过在有义引物中使用以该序列为基础设计的引物E2/uni/f/298(序列25)，初次实现对该cDNA的3′侧区域进行扩增成为可能。上述引物可以作为通用引物，在属于葱属植物的催泪成分合成酶基因的分离中使用(图5给出了通用引物的区域)。
另外，使用由洋葱序列设计的引物不能得到扩增产物的结果在5′RACE中也同样。因此，通过由使用上述E2/uni/f/298得到的韭葱3′RACE产物的碱基序列设计引物E2/r/580-Le(序列28)，用作5′RACE法的反义引物，初次实现对该cDNA的5′侧区域进行扩增成为可能。
另外，通过使用上述3′侧区域的引物E2/uni/f/298，能够确定韭葱催泪成分合成酶基因的cDNA全长序列这一点是新的认识。
本发明催泪成分合成酶基因是编码表现出将1-丙烯次磺酸转变为催泪成分的作用的蛋白质或多肽的DNA。
作为具有催化使催泪成分前体物质PeCSO转变为催泪成分的反应的性能的蛋白质，如有蒜氨酸酶和催泪成分合成酶。这些酶存在于由于切断等物理损伤而生成催泪成分的葱属植物洋葱、大葱、野薤、韭葱、亚实基隆葱(échalot)、大头蒜、细香葱等植物中。作为催泪成分合成酶基因如序列1的来自大葱的DNA、序列5的来自野薤的DNA、序列7的来自亚实基隆葱的DNA、序列9、13的来自韭葱的DNA、序列11的来自洋葱的DNA、序列15的来自大头蒜的DNA，但不限定于这些。也可以是在上述各个碱基序列中付加、缺失、或置换1或多个碱基后的DNA。例如，即使是编码在对应于上述各个DNA的序列2、6、8、10、12、14以及16所示的氨基酸序列中付加、缺失、或置换1或多个氨基酸后表现出使1-丙烯次磺酸转变为催泪成分作用的蛋白质或多肽的DNA也可以。
一般都知道在氨基酸序列中，对其功能没有影响的差别可以存在于株间或近缘种间等，在这些序列间，可观察到90％以上、或95％以上的氨基酸是一致的。该值通常相当于每100个氨基酸个有10个以下或5个以下氨基酸变异(付加、缺失、置换)。
另外，在本发明的催泪成分纯化酶蛋白质中，确定了葱属数种植物的催泪成分纯化酶基因的序列，由其推定氨基酸序列结果表明即使每100个氨基酸中存在相当于35个的变异，也具有催泪成分纯化酶活性，可以容许到氨基酸序列的35％变异。
另外，催泪成分合成酶基因是可与例如上述序列1、5、7、9、13或15所示碱基序列构成的DNA在严格条件下进行杂交的DNA。而上述可进行杂交的DNA中既包括与各序列所示碱基序列的DNA杂交的DNA，也包括与其互补的DNA。换言之，是由与上述序列1、5、7、9、13或15所示碱基序列的同源性在60％以上、更好的是在70％以上、最好是在75％以上的碱基序列构成的DNA。
(碱基序列的杂交条件)本发明中所谓“严格条件”是指序列1、5、7、9、13、15所示的碱基序列或其一部分与DNA进行特异性杂交，而且不会形成·检测到非特异性的杂化体形成的条件。明确将严格条件数值化是困难的，如果举一例的话，在使用42℃、30％(v/v)去离子化甲酰胺、0.6M的NaCl、0.04M的NaH2PO4、2.5mM的EDTA、7％的SDS组成的杂交缓冲液的杂交条件下形成杂化体，即使进一步用2×SSC、0.1％的SDS清洗也能维持杂化体的条件。有关核酸的杂交可以参考《分子克隆实验手册》Molecular CloningA laboratory manual(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York，USA等。
(碱基序列的同源性)碱基序列的同源性象以下那样进行判定。在对序列间的碱基的同源性进行判定的前段阶进行碱基序列的比对使用日本DNA数据库的Internet解析服务的CLUSTAL W 1.81 DDBJ扩展版(算法源于Gene 73，(1988)237-244。CLUSTAL W by DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology.html)。解析参数直接缺省进行(gapdist8、maxdiv40、gapopen15、gapext6.66)。使用得到的比对结果，通过计算ORF内一致的碱基数的对ORF总碱基数(除去由于比对产生的gap区域)的百分率，算出ORF内碱基的同源性。
图1给出了有关序列1、3、5、7、9、11、13以及15所示的碱基序列间的碱基序列同源性。其结果表明，碱基序列的同源性在序列15(大头蒜)和序列13(韭葱)间最低，为78.5％。这样一来，催泪成分合成酶基因的碱基序列相互间碱基同源性高，形成一个家族。而序列3的DNA与序列1的DNA之间表现出99.8％的高同源性，是来自大葱的DNA。另外关于序列1、3、5、7、9、11、13以及15所示的任一个催泪成分合成酶基因的碱基序列利用来自BLAST检索(算法，J.Mol.Biol.Vol.215，(1990)pp.403-410。直接使用解析参数缺省设定(Expect10、Word size11、Low complexity filterON))，对登录GenBank的基因序列进行同源性检索，在上述催泪成分合成酶基因以外没有找到表现出高同源性的基因序列(对拟南芥或果蝇、人的基因序列数据的一部分有4％左右的碱基同源性)。由此可知催泪成分合成酶基因的碱基序列是与至今为止报道的所有的基因序列没有亲缘关系的完全不同的序列。
而具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽是含有与例如序列2、6、8、10、14或16所示氨基酸序列的同源性为65％以上的氨基酸序列的蛋白质或多肽。
(氨基酸序列的同源性)氨基酸序列的同源性象以下那样进行判定。在对序列间的氨基酸的同源性进行判定的前段阶进行的氨基酸序列的比对使用日本DNA数据库(DNA data bank of Japan，DDBJ)的Internet解析服务的CLUSTAL W 1.81 DDBJ扩展版(算法源于Gene 73，(1988)237-244。CLUSTAL W by DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology.html)。解析参数直接缺省进行(gapdist8、maxdiv40、gapopen10、gapext0.2)。使用得到的比对结果，通过计算一致的氨基酸数对总氨基酸数(除去由于比对产生的gap区域)的百分率，算出氨基酸的同源性。
图2给出了有关序列2、4、6、8、10、12、14以及16所示各个推定氨基酸序列间的各个推定氨基酸序列间的同源性。其结果表明，推定氨基酸序列的同源性，序列16(大头蒜)和序列10(韭葱)间最低，为65.9％。这样一来，催泪成分合成酶蛋白质等氨基酸序列相互间同源性高，形成一个家族。而序列4的氨基酸序列是对应于上述序列3的来自大葱DNA的氨基酸序列。
另外，有关序列2、4、6、8、10、12、14以及16所示的任一个催泪成分合成酶基因的推定氨基酸序列来自BLAST检索(算法源于J.Mol.Biol.Vol.215，(1990)pp.403-410。直接使用解析参数缺省设定(Expect10、Word size3、Low complexity filterON))，对登录在GenBank的氨基酸序列进行同源性检索，除了催泪成分合成酶基因的推定氨基酸序列之间以外，即使是表现出最高同源性的氨基酸序列同源性也是35％以下的同源性(拟南芥和水稻(イネ)的功能不明基因的推定氨基酸序列)。由此可知催泪成分合成酶基因的推定氨基酸序列是与到目前为止报道的所有氨基酸序列没有高的亲缘关系、差异很大的序列。
通常在编码具有特定功能或生理活性的蛋白质或多肽的氨基酸序列中，即使是付加、缺失、或置换1个或多个氨基酸，有时也能维持其功能或生理活性的现象，本领域技术人员都广泛认识到。本发明也包括编码加上这样的修饰、而且具有催泪成分合成酶活性的蛋白质的DNA片段。
图3A～3C给出了上述序列1、3、5、7、9、11、13以及15的碱基序列的比对数据，图4A、4B给出了序列2、4、6、8、10、12、14以及16的氨基酸序列的比对数据。图3A～3C表示从ORF的5′末端开始的约50个碱基的区域存在着碱基保守性低的倾向。特别是在韭葱中，其中的15个碱基缺失了。另外，人们也知道在洋葱中存在着翻译成氨基酸后，来自该区域的肽被除去了的同功酶。而在该区域以外，对于催泪成分合成酶基因的cDNA找不到保守性特别低的区域。
本发明的催泪成分合成酶基因作为使例如控制催泪成分的生成的方法，以这些基因作为指标，对供交配的植物进行选拔的方法，制作降低催泪成分合成酶活性的植物和增大生理活性物质的植物品种的方法，通过基因重组技术大量生产催泪成分合成酶的方法等实现的基因是有用的。
在本发明中，通过RT-PCR由催泪成分合成酶基因的mRNA合成cDNA，确定其有义链的序列。反义链的序列从根本意义上讲是由有义链的序列确定的。因此，本发明的DNA包括有义链以及反义链两方的序列。即，包括上述具有序列1、3、5、7、9、13以及5的碱基序列的反义链序列的DNA或其片段。
作为本发明的催泪成分合成酶基因的应用例子，如以下给出的例子。
(1)催泪成分合成酶的生产将本发明的催泪成分合成酶基因整合到适当的表达载体，可以制作重组载体。
使用的载体可以在宿主细胞内自我复制，只要是具有可以整合上述DNA、即催泪成分合成酶基因的插入部位，以及可以使该整合DNA在宿主细胞内表达的区域的载体，其种类没有特别限制。作为表达载体可以使用在谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的序列下游具有多克隆位点的pGEX-4T-3(Amersham Bioscience公司生产)等。
另外为了促进在整合的生物种中的表达，有时配合整合生物种，改变密码子，不用说，这些密码子被改变的DNA也包括在本发明的范围内。以这样的氨基酸序列为基础的基因合成例如可以通过利用DNA自动合成仪，合成的寡核苷酸退火后进行连接等方法适当实施。
另外，就象国际公开第02/20808号公报也阐明的那样，催泪成分合成酶蛋白质即使付加、缺失1或多个一部分氨基酸，也有可能获得同样酶的性质。另外，即使置换一部分氨基酸残基，结果也有可能获得同样酶的性质。这样的基因改変可以通过使用市售基因部位特异的变异导入试剂盒，或插入合成基因等方法很容易实现。事实上，大葱、野薤、亚实基隆葱、韭葱、大头蒜中，已经证明即使相互间有一部分氨基酸不同，也可获得催泪成分合成酶活性。因此，作为整合到载体的催泪成分合成酶基因只要维持同样酶的性质，即使是其变异体也可以。然后将上述重组表达载体导入宿主细胞，得到转化体。重组表达载体向宿主细胞的导入可以通过惯用的方法进行。作为这样的方法，例如感受态细胞法、原生质体法、磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、微注射法、微脂粒融合法等各种方法，可以根据相应的宿主采用任意方法。作为产生本发明催泪成分合成酶的宿主，如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、曲霉菌等微生物、蚕培养细胞等细胞比较合适。
通过培养象上述那样得到的转化体，可以使催泪成分合成酶生产在培养物中。然后利用众所周知的方法对其进行分离，纯化，可以稳定获得催泪成分合成酶。
(2)抑制基因表达的手段(具有抑制催泪成分合成酶蛋白质或多肽的mRNA翻译功能的核酸分子)催泪成分合成酶在生成催泪成分上作为必需因子通过本发明人的研究已证实(特开平10-295373号公报)。因此，如果抑制该酶的作用，当然就不生成催泪成分了。
以抑制催泪成分生成为目的的各种研究迄今一直在进行，这些研究为了减少蒜氨酸酶底物S-1-丙烯基-半胱氨酸亚砜(PeCSO)的蓄积量，在将含有硫成分的肥料减少等栽培方法上动了脑筋，虽然可以通过将蒜氨酸酶钝化达到了目的，但还不是维持品质上的解决对策。
因此，在制作品质高、抑制催泪性的葱属植物上，抑制由编码催泪成分合成酶基因的转录到翻译的方法是非常有用的，这在酶的基因序列阐明后方可开始实施。
对于抑制催泪成分合成酶基因表达的方法可以使用本领域技术人员都知道的各种方法。其中基因表达的抑制包括基因转录的抑制、向蛋白质的翻译的抑制。要有效抑制基因的表达，对葱属植物的内在的催泪成分合成酶的mRNA翻译进行抑制是有效果的。
作为针对上述那样目标的技术，如熟知的通过导入基因与内源性催泪成分合成酶mRNA的全长或一部分杂交，使双链RNA形成，使得以下的翻译不发生的反义链法；以及通过导入基因预先使酶全序列、或其一部分序列生成双链RNA，使得内源性催泪成分合成酶mRNA被分解的现象发生的RNAi法。另外，通过导入基因使得催泪成分合成酶有义链或类似序列的全长或其一部分过量表达，利用与该基因存在同源性的基因可抑制表达的共抑制方法也有效。
即，只要是通过这些机制等使内源性mRNA的功能丧失的核酸分子，不管其长度，以及单链还是双链、有无与催泪成分合成酶基因的杂交都没关系，全部有效。而核酸分子的长度在18个核苷酸以上是合适的，最好是在22个核苷酸以上。反过来说，这样的核酸分子之所以可以设计或实施是由于催泪成分合成酶的基因序列已阐明，考虑到可以将该序列作为基础的缘故。
本发明中使用的有义、反义核苷酸的序列最好是与进行转化的植物带有的内源性基因(或其相同基因)或与其一部分互补的序列，只要是能有效抑制基因表达的，即使完全不互补的也可以。例如，优选由含有从本发明DNA序列中选出来的一个以上的DNA转录的RNA，或者是与由催泪成分合成酶基因、其上游的调节序列、以及其间的DNA序列转录的RNA进行杂交的序列。而该RNA无论是单链还是双链都可以。
(核酸分子抑制内源性mRNA翻译的效果的鉴定)某种核酸分子是否抑制内源性的催泪成分合成酶的mRNA翻译，有效的方法是对导入基因使该核酸分子翻译为RNA的植物组织的催泪成分合成酶活性或该酶蛋白质量进行测定，直接确认效果。如果催泪成分合成酶活性降低，或该酶蛋白质量降低，通过导入的核酸分子，出现内源性mRNA的翻译被抑制的现象，由此可以判定导入的核酸分子的有效性。
例如，催泪成分合成酶活性可以通过向不含有从蒜提取的该酶的蒜氨酸酶和蒜氨酸酶的底物PeCSO的反应体系中加入测定对象的植物组织提取物，对产生的催泪成分(LF)用HPLC等测定。更具体讲，转化的植物是否存在催泪成分合成酶活性，可以根据下面实施例所述的国际专利申请PCT/JP01/07465记载的方法进行确认。
另外，催泪成分合成酶蛋白质量减少的判定可以使用以该酶作为抗原做成的该酶的抗体的蛋白质印迹(Western Blotting)法。即，可以是将从测定对象的植物组织提取的级分经SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺电泳法)分级后、印迹于PVDF膜上，用催泪成分合成酶抗体有选择地进行检测的通常进行的蛋白质印迹(Western Blotting)法。催泪成分合成酶的标准蛋白质可以使用从各种葱属植物提取、纯化的蛋白质，也可以使用以酶的DNA序列为基础，在大肠杆菌等表达获得的重组催泪成分合成酶。酶活性的测定以及催泪成分合成酶的蛋白质量的测定方法不限于这里给出的一般的方法，可以使用任一种方法。
(2-1)利用反义链RNA不生成催泪成分的植物的生产将本发明的具有催泪成分合成酶基因的反向互补链序列的DNA导入葱属植物，使反义链RNA在植物内表达，可以抑制催泪成分合成酶基因的表达。反义链RNA由于带有对来自催泪成分合成酶基因的mRNA互补的碱基序列，通过与该mRNA形成碱基对，抑制作为最终产物的催泪成分合成酶蛋白质的合成。在本发明中可以使用的反义链RNA是可以与可翻译成催泪成分合成酶的mRNA进行特异杂交的寡核苷酸。
另外，以除去上述碱基序列的比对数据中保守性低的区域的部分碱基序列为基础可以设计反义链RNA序列。催泪成分合成酶基因在保守性低的区域以外由于在所有葱属植物中碱基序列被保存的倾向强，所以也可以进行使由大葱催泪成分合成酶基因序列的反向互补链设计的反义链RNA在洋葱内表达的所谓不同植物间的转用。
反义链RNA靶部位由于基因不同而各种各样，不存在所说的哪一个部位都可以的共有序列。然而，一般来说，ATG起始位点等可以作为靶部位的候补。另外，最近，由于有数种用于设计靶部位和反义链RNA的计算机解析软件(HYB simulator等)正在销售，利用这些软件，也可以设计反义链RNA。而反义链RNA的长度最好在18～23mer以上、GC含量最好在50％以上。
另外，除了上述反义链RNA法之外，也可以使用整合有义链的方法以及RNAi(RNA干扰，RNA interferense)法。上述有义、反义核苷酸的序列最好是与进行转化的植物带有的内源性基因(或其相同基因)或其一部分互补的序列，只要是有效抑制基因表达，即使完全不互补的也可以。
作为使上述反义链RNA在植物内发挥功能的方法，例如将cDNA反向整合到在真核生物表达的启动子的下游后，导入宿主细胞使反义链RNA合成的方法。
作为导入外来基因的方法可以使用利用土壤杆菌的转化方法，以及通过直接导入的转化法。
而在象上述那样抑制了催泪成分合成酶基因表达的植物中，由于1-丙烯次磺酸没有转变为催泪成分，所以硫代亚磺酸盐的生成量增大。洋葱的主要气味成分硫代亚磺酸酯被确认在体内具有抗哮喘作用，而在体外，也是环氧合酶(cyclooxygenase)和5-脂氧酶(5-lipooxygenase)的抑制剂(Wagner，H.，Dorsch，W.，Bayer，T.，Breu，W.和Willer，F.，Antiasthmatic effects of onionsinhibition of5-lipoxygenase and cyclooxygenase in vitro by thiosulfinates and″Cepaenes″.Prost.Leuk.Essential Fatty Acids 39，59-62(1990))。另外有报道说硫代亚磺酸盐可以转变为二硫化物(disulfides)、三硫化物(trisulfides)，这些化合物都具有使血液中脂质降低(Adamu，I.，Joseph，P.K.和Augusti，K.T.，Hypolipidemic action of onion andgarlic unsaturated oils in sucrose fed rats over a two-month period.Experientia 38，899-901(1982))、抑制血小板凝集作用(Ariga，T.，Oshiba，S.和Tamada，T.，Platelet aggregation inhibitor in garlic.Lancet 1，150-151(1981)以及Makheja，A.N.和Bailey，J.M.，Antiplatelet constituents of garlic and onion.Agents Actions 29，360-363(1990))。因此，制作上述硫代亚磺酸盐乃至其反应物生成量增大的转化植物也是有可能的。
(3)催泪成分合成酶蛋白质的大量生产作为整合cDNA的质粒如来自大肠杆菌的pBR322(Gene，2，95(1977))、pBR325(Gene，4，121(1978)、来自枯草杆菌的pUB110(Biochemical and Biophysical Research Communication)，112，678(1983))等，其它的只要是可保持在宿主内复制的质粒无论哪一种都可以使用。作为整合到质粒的方法，通常都是制备载体与插入片段的摩尔比为1∶1至1∶10的混合液，用T4连接酶进行处理的方法(细胞工学别册、生物实验提示(バイオ実験イラストレイテツド)(2)基因解析基础、p78、秀润社)。这样获得的质粒导入到适当的宿主、例如埃希氏(Escherichia)属菌、芽孢杆菌(Bacillus)属菌等。
作为上述埃希氏(Escherichia)属菌的例子，如大肠杆菌(大肠埃希氏菌，Escherichia coli)(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.60，160(1968))等。作为上述芽孢杆菌属菌如枯草杆菌(枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis)MI114(Gene，24，255(1983))等。作为转化方法如氯化钙法(Biochemical and Biophysical ResearchCommunication，49，1568(1972))等。从这样得到的转化体中使用众所周知的方法、例如菌落杂交法(Gene，10，63(1980))以及DNA碱基序列确定法(Proc.Natl.Acad.Sci.74，560(1977))等选出需要的菌落。这样操作后，可以得到克隆的保持含有编码催泪成分合成酶碱基序列的DNA的载体的微生物。
然后从该微生物分离质粒。作为分离法如碱法(Nucleic AcidsResearch，1513(1979))等。上述克隆的含有编码催泪成分合成酶的碱基序列的质粒可以直接利用或根据要求用限制性内切酶切出。被克隆的基因连接在适于表达的载体中启动子的下游后可以得到表达型载体。
作为载体如来自大肠杆菌的质粒(例如pBR322)、来自枯草杆菌的质粒(例如pUB110)、来自酵母的质粒(例如pSH19)或λ噬菌体等噬菌体以及逆转录病毒、牛痘病毒等动物病毒等。该基因可以在其5′末端含有翻译起始密码子ATG，而在3′末端含有翻译终止密码子TAA、TGA、或TAG。另外使该基因的5′末端结合在编码已知蛋白质的基因的3′末端，作为融合蛋白质表达时，不是必须要翻译起始密码子。另外为了使该基因表达，在其上流连接启动子。作为本发明使用的启动子只要是适合于基因表达，对应于宿主的启动子可以使用任一种。另外转化时的宿主为埃希氏菌属菌时，最好是trp启动子、lac启动子、recA启动子等，当宿主为芽孢杆菌属菌时，最好是SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等，宿主为酵母时最好是PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子等。特别是当宿主埃希氏菌属菌时，启动子最好是lac启动子。在宿主为动物细胞时是来自SV40的启动子、逆转录病毒的启动子等，特别是来自SV40的启动子最好。
用含有这样构建的DNA的载体制造转化体。作为宿主如埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌、酵母、动物细胞等。作为述埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌的具体例子如与上述同样的菌。作为上述酵母如酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)AH22R等。作为动物细胞如猴细胞COS-7、Vero、中国仓鼠细胞CHO等。经这样操作，可以得到用含有DNA的载体转化的转化体。
作为一个例子，对宿主为埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌的转化体进行培养时，培养使用的培养基，液体培养基合适，其中可以含有该转化体生育所必需的碳源、氮源、无机物等。
作为培养埃希氏菌属菌时的培养基，例如LB培养基或SOC培养基(细胞工学别册 生物指南(バイオイラストレイテツド)1.分子生物学实验的基础、P98-99、秀润社)最好。其中，根据需要为了使启动子有效地发挥作用，可以加入例如异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)那样的试剂。宿主为埃希氏菌属菌时，培养通常于15～43℃下进行3～24小时，根据需要，也可以加上通气或搅拌。宿主为芽孢杆菌属菌时，培养通常在约30～40℃下进行约6～24小时，根据需要，也可以加上通气或搅拌。对宿主为酵母的转化体进行培养时，作为培养基如バ一クホルダ一最小培养基(Proc.Natl.Acad.Sci..77，4505(1980))。培养基的pH最好调整到约5～8。培养通常于20℃～35℃下进行约24～72小时，根据需要，也可以加上通气或搅拌。对宿主为动物细胞的转化体进行培养时，作为培养基如含有约5～20％的胎牛血清的MEN培养基(Science 122，501(1952)DMEM培养基(Virology，8，396(1959))等。pH最好是约6～8。培养通常于约30℃至40℃下进行约15小时至60小时，根据需要，可以提高二氧化碳浓度。
从上述培养物分离纯化催泪成分合成酶蛋白可以通过例如下面的方法进行。当从培养菌体或细胞提取催泪成分合成酶蛋白时，可以适当采用培养后、通过众所周知的方法收集菌体或细胞，然后悬浮于含有盐酸胍等蛋白变性剂的缓冲液中，通过超声波、溶菌酶以及(或冻融)破碎菌体或细胞后，通过离心分离，得到催泪成分合成酶蛋白的方法等。要从上述上清液纯化催泪成分合成酶蛋白，可以将众所周知的分离、纯化方法适当组合进行纯化。作为这些众所周知的分离、纯化方法例如利用盐析或溶剂沉淀法等利用溶解性的方法、透析法、凝胶过滤法等利用分子量的差别的方法、离子交换层析等利用电荷差别的方法、亲和层析等利用特异亲和性的方法、反相高效液相层析等利用疏水性的差别的方法等。
如上所述，本发明的催泪成分合成酶基因可以作为在筛选、酶或蛋白质的生产、转化植物的生产等中的基因工程的工具广泛运用。这样的场合下，本发明的催泪成分合成酶基因在葱属植物相互之间，碱基序列类似性高。因此，例如来自大葱的DNA不能说只能应用于与大葱有关系的技术中，可以将基因在植物间相互转用。
附图的简要说明图1表示序列1、3、5、7、9、11、13以及15所示的各个碱基序列间的碱基序列同源性。
图2表示序列2、4、6、8、10、12、14以及16所示的各个推定氨基酸序列间的推定氨基酸序列同源性。
图3A表示序列1、3、5、7、9、11、13以及15的碱基序列的比对数据。
图3B表示序列1、3、5、7、9、11、13以及15的碱基序列的比对数据(图3A的续)。
图3C表示序列1、3、5、7、9、11、13以及15的碱基序列的比对数据(图3B的续)。
图4A表示序列2、4、6、8、10、12、14以及16的氨基酸序列的比对数据。
图4B表示序列2、4、6、8、10、12、14以及16的氨基酸序列的比对数据。(图4A的续)。
图5表示就E2/uni/f/298区域和其前后10碱基的区域，给出了对应于通用引物E2/uni/f/298序列的序列一览。
图6表示E2-AF、E3-AC以及E2-AA的cDNA制作以及亚克隆的步骤。
图7表示表达质粒的构建和转化体的制作步骤。
具体实施例方式
实施例1(来自大葱的催泪成分合成酶基因)(1)总RNA的提取用液氮将新鲜的大葱(A.fistulosum L.)瞬间冷冻后，用木槌敲碎。将敲碎的冷冻材料放入到经干热灭菌的乳钵中，用乳棒研磨成粉状。将100mg的成为粉状的冷冻材料按照RNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN Cat.no.74903)的程序进行处理，得到总RNA。
得到的总RNA的产量是13μg。
(2)cDNA的合成以得到的总RNA为材料，使用Ready-To-Go T-PrimedFirst-Strand试剂盒(Amercham Biosciences code no.27-9263-01)，按照试剂盒附带的程序，以5′末端衔接序列附带的寡(dT)(序列30)作为引物进行逆转录，合成1st strand cDNA。
(3)利用3′RACE法进行该cDNA的3′侧区域的扩增为了解析目的基因(cDNA)3′区域的碱基序列，以表1的组成进行3′RACE实验。通过(2)得到的1st strand cDNA具有在5′末端带有衔接序列的构造。因此，为了要通过PCR由1st strand cDNA只使目的cDNA扩增，使用由洋葱催泪成分合成酶基因(序列11)的3′侧区域的序列设计的ACE02f引物和与衔接序列互补的NotI引物进行PCR。
有义链(ACE02f)5′-TGG AGG GTC CTG AGC ACA AG-3′(序列17)反义链(NotI)5′-TGG AAG AAT TCG CGG CCG CAG-3′(序列18)
表1
PCR条件如下。
①94℃、9分→②94℃、1分→③54℃、1分→④72℃、1分→⑤72℃、5分→⑥4℃、保持反复进行②～④45次。
PCR后的反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭检测)，判定有无目的大小的PCR产物。
(4)通过5′RACE法进行该cDNA的5’侧区域的扩增为了解析目的基因(cDNA)的5’区域的碱基序列，用表2的组成进行5′RACE实验。5’RACE实验是用5’RACE System forAmplification of cDNA Ends，Version 2.0(InVirtogen life technologiesCat.no.18374-058)实施。
对(2)得到的1st strand cDNA进行RNaseH处理，变成单链cDNA后，在其3′末端使用末端转脱氧核苷转移酶(以下TdT)付加核苷酸均聚物(dC的聚合物)。以付加了PolyC的cDNA为模板，使用在3′末端带有与PolyC序列互补序列的衔接引物(AAP)和由洋葱催泪成分合成酶基因的5′侧区域的序列设计的引物(ACE02r)进行PCR，由5′末端付加了dC的聚合物的1st strand cDNA只扩增目的cDNA。
有义链(AAP)5′-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGIIGG GII GGG IIG-3′(序列19)反义链(ACE02r)5′-CTC TTC GAT TTT CTG ACC TAT CTCAGT AGC-3′(序列20)表2
PCR条件如下。
①95℃、10分→②94℃、1分→③55℃、1分→④72℃、1分→⑤72℃、7分→⑥4℃、保持反复进行②～④步骤40次。
PCR后的反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳(溴乙锭检测)，判定有无目的大小的PCR产物。
(5)通过3′RACE法、5′RACE法得到扩增产物的碱基序列解析和全长序列的确定以及氨基酸序列的推定对得到的3′RACE产物、5′RACE产物直接测序，进行碱基序列解析。对3′RACE产物的碱基序列和5′RACE产物的碱基序列进行组合，确定样品中催泪成分合成酶基因的cDNA全长序列(如序列1所示)。由cDNA全长序列确定开放读框(ORF)，推定对应于各个密码子的氨基酸序列(如序列2所示)。
(6)通过ORF区域的PCR扩增和其产物的TA克隆确定大葱催泪成分合成酶基因的碱基序列由上述(5)的碱基序列解析结果推测到序列1所示的cDNA的第244位的腺嘌呤(A)变为鸟嘌呤(G)的cDNA的存在(通过腺嘌呤(A)为高峰、而鸟嘌呤(G)低峰可以检测)。
根据ORF序列的推定，做成从其起始密码子(ATG)开始的正向引物E2-AF-F(ATGGAGCTAAATCCTGGTGCGC(序列21))。
使用做成的引物E2-AF-F和NotI引物，以大葱cDNA为模板进行PCR，将得到的扩增产物插入到pGEM-T Easy Vector(Promegu公司生产)后、导入大肠杆菌(XL1-Blue MRF′)，对碱基序列进行解析。结果确认了序列1的第244位变成了鸟嘌呤(G)的cDNA的存在。序列3给出了确定的序列。由序列推定了对应于各个密码子的氨基酸序列(如序列4所示)。
实施例2(来自野薤的催泪成分合成酶基因的cDNA全长序列)以新鲜的野薤(A.chinense L.)作为提取材料。总RNA的提取方法以及cDNA的合成、利用3′RACE法进行的该cDNA 3′侧区域的扩增、利用5′RACE法进行的该cDNA 5′侧区域的扩增、碱基序列的解析和氨基酸序列的推定用与实施例1同样的方法进行。序列5给出了解析的来自野薤的催泪成分合成酶基因的cDNA全长序列，序列6给出了对应于其密码子的氨基酸序列。
实施例3(来自亚实基隆葱的催泪成分合成酶基因的cDNA全长序列)以新鲜的亚实基隆葱(A.cepa L.)为提取材料。总RNA的提取方法以及cDNA的合成、利用5′RACE法进行的该cDNA 5′侧区域的扩增、碱基序列的解析和氨基酸序列的推定用与实施例1相同的方法进行。
但是，在利用3′RACE法进行的该cDNA 3′侧区域的扩增中，利用nested PCR法进行2次PCR。在第1次PCR中，将实施例1的有义引物由ACE02f变为E2-1-N(GGIGCI(A/C)GIAA(A/G)TGG(序列23))，PCR条件③的54℃、1分钟也变为43℃、1分。以这样获得的扩增产物作为模板进行第2次PCR，这第2次的PCR条件和使用的引物与实施例1给出的利用3′RACE法进行该cDNA的3′侧区域的扩增用的一样。
序列7给出了解析的来自亚实基隆葱的催泪成分合成酶基因的cDNA全长序列，序列8给出了对应于其密码子的氨基酸序列。
实施例4(来自韭葱的催泪成分合成酶基因的cDNA序列)将新鲜的韭葱(A.ampeloprasum L.)作为提取材料。总RNA的提取方法以及cDNA的合成、碱基序列的解析和氨基酸序列确定用与实施例1相同的方法进行。
但是在利用3′RACE法对该cDNA 3′侧区域的扩增中，不但通过实施例1的有义引物ACE02f，而且仅以洋葱催泪成分合成酶基因的序列为基础设计的其它有义引物也不能获得扩增产物。因此，找到洋葱、野薤、大葱3种催泪成分合成酶基因中序列保守的区域(图5)，通过在有义引物使用由该序列设计的E2/uni/f/298(GAATTTTGGGCCAAGGAGAAGCTGG(序列25))，才初次扩增该cDNA的3′侧区域。
用由洋葱序列设计的引物不能得到的扩增产物的结果在5′RACE中也同样得不到。因此，通过由作为有义引物使用E2/uni/f/298得到的韭葱3′RACE产物的碱基序列设计E2/r/580-Le(CACACAGCATCACA AATTGAC(序列28))，用作5′RACE法的反义引物，才初次扩增该cDNA的5′侧区域。
得到的3′RACE产物、5′RACE产物通过直接测序进行碱基序列解析。将3′RACE产物的碱基序列和5′RACE产物的碱基序列汇总，推定出韭葱催泪成分合成酶基因的cDNA全长序列。然而，由碱基序列解析结果判定韭葱中存在碱基序列不同的多个催泪成分合成酶基因cDNA，但韭葱的cDNA序列只通过RACE法还不能确定。
因此，做成从最靠近由RACE结果推定的cDNA全长序列的5′末端ATG开始的正向引物E2-AP-F2(ATGGCGCAAAATCCTGGTGTGC(序列29))。
使用做成的引物E2-AP-F2和NotI引物，以韭葱cDNA为模板进行PCR，将得到的扩增产物插pGEM-T Easy Vector后、导入大肠杆菌(XL1-Blue MRF′)中，对碱基序列进行解析。结果确定了2种cDNA序列。序列9、13给出了确定的韭葱的2种序列。就各个序列推定出对应于各个密码子的氨基酸序列(如序列10、14所示)。
实施例5(来自大头蒜的催泪成分合成酶基因的cDNA全长序列)以新鲜的大头蒜(A.ampeloprasum L.)为提取材料。总RNA的提取方法以及cDNA的合成、碱基序列的解析和氨基酸序列的推定用与实施例1相同的方法进行。
但是，利用3′RACE法进行该cDNA3′侧区域的扩增中，将实施例1的有义引物由ACE02f变为由其它葱属植物(洋葱、野薤、大葱)的催泪成分合成酶基因的3′侧区域找到的所有植物共通的序列设计的E2/uni/f/298(GAATTTTGGGCCAAGGAGAAGCTGG(序列25))。
另外，在利用5′RACE法进行的该cDNA的5′侧区域的扩增中，将实施例1的反义引物由ACE02f变为由洋葱的碱基序列设计的引物(E2-1-5R-1)(TCCTCGTACCCTGTAAAACACTCAG(序列26))。
序列15给出了解析的来自大头蒜的催泪成分合成酶基因的cDNA全长序列，序列16给出了对应于其密码子的氨基酸序列。
实施例6(蛋白质的制造方法)(1)表达质粒的构建(野薤、亚实基隆葱、大头蒜)使用由序列5、7以及15所示的催泪成分合成酶的基因序列的开放读框5′末端设计的正向引物和与附在寡dT引物的锚部分互补的反向引物，以来自各个葱属植物的cDNA为模板，进行PCR反应，得到约700bp的产物。作为葱属植物使用野薤、亚实基隆葱、大头蒜，作为正向引物，对于野薤使用E2-AC-F(ATGGAGCAAAATTCTGGTACGC(序列22))，对于亚实基隆葱使用E2-AA-F(ATGGAGCTAAATCCTGGTGCAC(序列24))、对于大头蒜使用E2-APEG-F(ATGATGACATATCCTGGAAATCG(序列27))，对于反向引物，所有场合下都使用与附着在寡dT引物的锚部分互补的引物。
将得到的产物按照先前叙述的碱基序列确定方法亚克隆到pGEM-T Easy Vector后，导入大肠杆菌(XL1-Blue)，解析碱基序列。图6给出了亚克隆的步骤。
从带有整合产物的pGEM-T-Easy Vector的大肠杆菌中得到了具有序列5、7、15所示的编码各多肽的碱基序列的大肠杆菌(XL-1 BlueMRF′/pGEM-T-E2-AC(野薤)、XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-AA(亚实基隆葱)、XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-APEG(大头蒜))。
(大葱、韭葱)对于大葱、韭葱使用实施例1、4制作的序列3、9、13所示具有编码各多肽的碱基序列的大肠杆菌(XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-AF(大葱)、XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-LK29A(韭葱29A)、XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-LK58E(韭葱58E))。
作为蛋白质的表达用载体使用在谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因序列的下游带有蛋白酶识别部位和多克隆位点的pGEX-4T(Amersham Pharmacia生产)(图7)。
将pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生产)和NotI(Takara公司生产)切断得到的大片段和上述pGEM-T-E2-AF(大葱)用EcoRI和NotI切断得到的约700bp片段连接，构建了表达质粒pGEX-4T-E2-AF(大葱)。
将pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生产)和NotI(Takara公司生产)切断得到的大片段和上述pGEM-T-E2-AC(野薤)用EcoRI和NotI切断得到的约700bp的片段连接，构建表达质粒pGEX-4T-E2-AC(野薤)。
将pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生产)和NotI(Takara公司生产)切断后得到的大片段和上述pGEM-T-E2-AA(亚实基隆葱)用EcoRI和NotI切断得到约700bp的片段连接，构建表达质粒pGEX-4T-E2-AA(亚实基隆葱)。
将pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生产)和NotI(Takara公司生产)切断得到的大片段和上述pGEM-T-E2-APEG(大头蒜)用EcoRI和NotI切断得到的约700bp片段连接，构建表达质粒pGEX-4T-E2-APEG(大头蒜)。
将pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生产)和NotI(Takara公司生产)切断后得到的大片段和上述pGEM-T-E2-LK29A(韭葱序列9)用EcoRI和NotI切断得到的约700bp片段连接，构建表达质粒pGEX-4T-E2-LK29A(韭葱序列9)。
将pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生产)和NotI(Takara公司生产)切断得到的大片段和上述pGEM-T-E2-LK58EA(韭葱序列13)用EcoRI和NotI切断得到的约700bp片段连接，构建表达质粒pGEX-4T-E2-LK58E(韭葱序列13)。
(2)使用表达质粒的大肠杆菌转化体制作和培养利用感受态细胞法将上述的pGEX-4T-E2-AF(大葱)导入大肠杆菌BL21-Gold(STRATAGENE公司生产)，得到转化体BL21-Gold/pGEX-4T-E2-AF(大葱)(图7)。
同样将上述的pGEX-4T-E2-AC(野薤)导入大肠杆菌BL21-Gold(STRATAGENE公司生产)得到转化体BL21-Gold/pGEX-4T-E2-AC(野薤)(图7)。
同样将上述的pGEX-4T-E2-AA(亚实基隆葱))导入大肠杆菌BL21-Gold(STRATAGENE公司生产)得到转化体BL21-Gold/pGEX-4T-E2-AA(亚实基隆葱)(图7)。
同样将上述的pGEX-4T-E2-APEG(大头蒜)导入大肠杆菌BL21-GOLD(STRATAGENE公司生产))，得到转化体BL21-GOLD/pGEX-4T-E2-APEG(大头蒜)。
同样将上述的pGEX-4T-E2-LK29A(韭葱序列9)导入大肠杆菌BL21-GOLD(STRATAGENE公司生产))，得到转化体BL21-GOLD/pGEX-4T-E2-LK29A(韭葱序列9)。
同样将上述的pGEX-4T-E2-LK58E(韭葱序列13)导入大肠杆菌BL21-GOLD(STRATAGENE公司生产))得到转化体BL21-GOLD/pGEX-4T-E2-LK58E(韭葱序列13)。
将得到的转化体于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基中在37℃下进行振荡培养。向培养基添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导生产，GST和各催泪成分合成酶蛋白质的融合蛋白质(以下，关于大葱的融合蛋白称为GST-E2-AF、关于野薤的融合蛋白称为GST-E2-AC、关于亚实基隆葱的融合蛋白称为GST-E2-AA、关于大头蒜的融合蛋白称为GST-E2-APEG、关于韭葱(序列9)的融合蛋白称为GST-E2-LK29A、关于韭葱(序列13)的融合蛋白称为GST-E2-LK58E)蓄积在菌体内。
(3)蛋白质的分离(纯化)象上述那样操作，对于所有的植物进行转化体培养，通过离心分离收集菌体后、进行超声破碎。对于大葱、野薤、亚实基隆葱，将通过离心回収的上清流过谷胱甘肽琼脂糖4 Fast Flow柱(AmershamPharmacia)，使GST融合蛋白质吸附于柱上。洗净柱子后，用含有还原型谷胱甘肽的洗脱缓冲液将融合蛋白质洗出，得到3种融合蛋白质样品(GST-E2-AF、GST-E2-AC、GST-E2-AA)的纯化物。
将2种融合蛋白质样品流过HiTrap Desalting柱(AmershamPharmacia)，除去还原型谷胱甘肽，再度吸附于谷胱甘肽琼脂糖4 FastFlow柱。洗浄柱后，用含有凝血酶的缓冲液充满柱，于室温下进行2小时蛋白酶处理，将GST标记从融合蛋白质切下来。将除去GST标记的重组GST-E2-AF、GST-E2-AC以及GST-E2-AA从柱上洗脱下来，再向该洗脱液中加入Benzamidine Sepharose 6 B进行混合，通过离心分离，除去洗脱液的凝血酶，得到3种重组样品(RC-E2-AF(大葱)、RC-E2-AC(野薤)、RC-E2-AA(亚实基隆葱))。
(4)重组蛋白质的催泪成分合成酶活性对融合蛋白质样品GST-E2-AF、GST-E2-AC、GST-E2-AA以及除去GST标记的重组样品RC-E2-AF、RC-E2-AC、RC-E2-AA 6样品测定催泪成分合成酶活性。对于大头蒜和韭葱，测定上述(3)中菌体超声破碎后的离心上清(GST-E2-APEG/sup(大头蒜)、GST-E2-LK29A/sup(韭葱序列9)、GST-E2-LK58E/sup(韭葱序列13))的催泪成分酶活性。
测定按照国际专利申请PCT/JP01/07465所述的以下方法进行。
即，将上述重组蛋白质样品用稀释用缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液pH6.5)稀释，向10μl稀释样品中加入40μl大蒜蒜氨酸酶(50units/ml)和PeCSO溶液(20mg/ml)20μl，于室温下反应3分钟后、将1μl反应液注入HPLC，测定催泪成分的生成量。在分析中使用ODS柱(4.6φ×250mm)(センシユウ科学公司生产)。此外，流动相为30％(v/v)的酸性MeOH、流速为0.6ml/min、柱温为35℃、检测波长为254nm。
测定结果表明，在所有的融合蛋白质样品中都检测到催泪成分合成酶活性。另外，对用没有导入催泪成分合成酶基因的表达质粒pGEX-4T制作的转化体(BL21-Gold/pGEX-4T-GST)进行培养，即使进行谷胱甘肽琼脂糖柱处理也没有检测到催泪成分合成酶活性。而取代样品使用磷酸缓冲液的空白中也没有催泪成分合成酶活性。
由以上结果可以确认即使在催泪成分合成酶基因的N末端结合了象GST(分子量约27000)那样的大蛋白质的融合蛋白质也具有催泪成分合成酶活性。
另外在RC-E2-AF、RC-E2-AC以及RC-E2-AA中也检测到催泪成分合成酶活性。
实施例7(转化植物的做成)(1)载体的制作载体的制作是通过在调节区域(启动子)的下游接上催泪成分合成酶基因的全长、或其一部分(最好是18bp以上)序列的有义取向序列、反义取向序列或含有两方取向序列的任一个，通过在其下游连上终止子，整合到质粒制作的。接上催泪成分合成酶基因序列的有义取向和反义取向的两方序列，在其下游接上终止子整合到质粒时，在有义和反义序列间最好插入“间隔”(spacer)(另外的碱基序列)。通过这样连接，会使在大肠杆菌内的稳定性提高。另外在上述间隔中，最好是含有“内含子”(非翻译区域的碱基序列)的序列。由此在个体中的表达抑制的左右变高，另外表达被抑制的个体的回收率上升。以下操作可以使用一般的基因克隆技术进行。
①将亚克隆了催泪成分合成酶基因的质粒导入大肠杆菌(例如、XL1-Blue)后使其增殖，以该质粒为模板进行PCR，使催泪成分合成酶基因的全长、或其一部分序列扩增。扩增的序列按照目的取向与启动子连接，付加终止子后整合到质粒中。含有有义取向和反义取向两方序列时，两者之间插入含有内含子的间隔。
作为启动子可以使用例如菜花样花叶病毒的35S启动子，只要是在植物细胞进行表达，也可以使用其它的启动子。而作为终止子可以使用例如正缬氨酸合酶(ノパリンシンテ一ス)的终止子，也可以使用其他的终止子。
作为整合基因的中间载体质粒可以使用pBI101等一般的质粒，对此没有特别限定。而作为整合基因的质粒通过使用加入适当的选择标记(潮霉素或卡那霉素等抗生素抗性标记)的质粒，可以使得筛选转化个体变得容易。
②将①的质粒整合到大肠杆菌(例如HB101、SURE2)后使其增殖，该大肠杆菌和带有辅助质粒的大肠杆菌(例如HB101(pRK2013))、以及带有辅助Ti质粒(例如、pAL4404)的土壤杆菌(例如根癌土壤杆菌LBA4404最好，此外也可以使用EHA105或EHA101等那样系统的土壤杆菌)进行三亲株交配、①的质粒内的插入基因被重组到土壤杆菌内。另外，即使不借助于辅助质粒的三亲株交配，也可以通过电穿孔法直接将整合了导入基因序列的质粒导入土壤杆菌中。
(2)在重组中使用的洋葱等植物材料的制作。
①植物材料只要是具有再分化能力(再生植物体的能力)的植物可以使用任一种。使用洋葱等葱属植物时，最好是使用从植物体诱导具有再分化能力的愈伤组织。对于洋葱等葱属植物，作为诱导愈伤组织的植物器官，可以使用来自种子的成熟或未熟胚、来自种子的发芽初生根、鳞片叶生长点、盘茎部等。
②诱导愈伤组织的培养基组成最好是使用植物培养中通常可以使用的MS培养基的组成，也可以使用其它培养基的组成。诱导愈伤组织的培养基中的必需成分是植物激素的植物生长激素。植物生长激素的浓度最好是1-100μM。作为植物生长激素如4-FPA(4-氟苯氧乙酸)、Picrolam(4-氨基-3，5，6-三氯-2-吡啶羧酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)等诱导愈伤组织的比较好，也可以使用其它的植物生长激素。
③愈伤组织的培养可以在适于培养的条件下进行，最好是在25℃、1000-3000lux左右的荧光灯照射下进行。诱导的愈伤组织可以通过继代培养进行维持。但是为了使用保持再分化能力的愈伤组织，最好是将用于愈伤组织诱导的培养期间缩短，减少继代培养的次数。具体来说，用于愈伤组织诱导的培养期间为3～4个月左右，继代培养的次数在3次以下为好。④对于洋葱等，由于品种不同，愈伤组织的再分化能力上存在很大的差距，最好使用再分化能力大的品种。例如泉州中甲高黄、红花(くれない)、红叶(もみじ)、天寿等。
(3)基因导入载体对愈伤组织的感染①使带有(1)中得到的基因导入载体的土壤杆菌菌体增殖，将愈伤组织浸入该菌液。此时，重要的是添加为了使土壤杆菌感染单子叶植物所需要的化合物乙酰丁香酮。乙酰丁香酮的浓度最好是100-200μM。
②对菌和愈伤组织进行共存培养3日以上、最好是4～6日左右后、使用头孢噻肟或羧苄青霉素抗生素，除去土壤杆菌。
(4)从受感染的愈伤组织挑选转化个体在与预先整合到载体的潮霉素或卡那霉素等抗生素抗性标记对应的培养基上培养愈伤组织，使其发育生长后、再分化。存活的是转化成功的个体。由愈伤组织再分化中使用的培养基组成可以使用植物培养通常使用的MS培养基组成，也可以使用其它组成的培养基。重要的是要从再分化培养基中除去植物生长激素。
(5)转化个体的确认目的基因是否导入再分化植物中可以利用从植物体提取DNA，Southern杂交法(中山広樹等著、生物实验提示(バイオ実験イラストレイテツド)②基因解析的基础，p137-151(1995))进行确认。
(6)转化个体的特性的评价可以确认再分化植物含有的硫代亚磺酸盐及其反应物的量。
工业实用性本发明的催泪成分生成基因抑制催泪成分合成酶的表达量，在为了增大具有抗哮喘作用等的硫代亚磺酸盐及其反应物的生成量所需要的反义核苷酸的设计等中是有用的，利用基因重组技术也可以有效地制造出催泪成分合成酶、可以实现有效地生产在泪缺乏症(干眼症)等的治疗起作用的催泪成分方面起到显著效果。
序列表<110>好侍食品株式会社<120>具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽、编码该蛋白质或多肽的DNA、利用该DNA制造具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽的制造方法以及具有抑制该蛋白质或多肽的mRNA翻译的功能的核酸分子<130>Y1K0092<150>JP 2002-56523<151>2002-03-01<150>JP 2002-56558<151>2002-03-01<150>JP 2002-275799<151>2002-09-20<160>30<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>739<212>DNA<213>Allium fistulosum L.
<220>
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atg gag cta aat cct ggt gcg cct gct gta gtc act gat ggt gct aac105Met Glu Leu Asn Pro Gly Ala Pro Ala Val Val Thr Asp Gly Ala Asn1 5 10 15gga gct cga aaa tgg agc ggc aaa gtc cat gct ttg ctt cca aat tca153Gly Ala Arg Lys Trp Ser Gly Lys Val His Ala Leu Leu Pro Asn Ser20 25 30aag cca gag caa gca tgg agg cta cta aag gac ttt att aac ctt cac201Lys Pro Glu Gln Ala Trp Arg Leu Leu Lys Asp Phe Ile Asn Leu His35 40 45aag atc atg cct tcg ttg tca gtc tgt gaa ctg gta gaa ggt aag gcc249Lys Ile Met Pro Ser Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Lys Ala50 55 60aat gtt gtt ggt tgt gtt cgc cac gtt aaa ggt ata atg cac cca ata297Asn Val Val Gly Cys Val Arg His Val Lys Gly Ile Met His Pro Ile65 70 75 80gaa gag gaa ttt tgg gcc aag gag aag ctg gtg gca ctg gat aat aag345Glu Glu Glu Phe Trp Ala Lys Glu Lys Leu Val Ala Leu Asp Asn Lys85 90 95aac atg agc tac agt tat att ttt act gag tgt ttt aca ggg ttc gag393Asn Met Ser Tyr Ser Tyr Ile Phe Thr Glu Cys Phe Thr Gly Phe Glu100 105 110gat tac acg gct acc atg caa ata gtg gag gga cct gag cac aag gga441Asp Tyr Thr Ala Thr Met Gln Ile Val Glu Gly Pro Glu His Lys Gly115 120 125tgt aga ttt gac tgg tct ttt cag tgc aag tat atc gag ggt atg act489Cys Arg Phe Asp Trp Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Met Thr130 135 140gaa tct gca ttc gcc gag att ctg cag cat tgg gct act gaa att ggt537Glu Ser Ala Phe Ala Glu Ile Leu Gln His Trp Ala Thr Glu Ile Gly145 150 155 160cag aaa atc gaa gag att tgc aat gct tgattatgaa tatcggttat 584Gln Lys Ile Glu Glu Ile Cys Asn Ala165
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<221>CDS<222>(1)..(492)<223>P<220>
<221>polyA位点<222>(637)..(661)<223>P<400>13atg gcg caa aat cct ggt gtg cct gct gtt gcc act gag cca aaa tgg48Met Ala Gln Asn Pro Gly Val Pro Ala Val Ala Thr Glu Pro Lys Trp1 5 10 15aca ggc aag gtc agt gca tcg ctt cca aat aca aag cca gag caa gca96Thr Gly Lys Val Ser Ala Ser Leu Pro Asn Thr Lys Pro Glu Gln Ala20 25 30tgg aca ctg cta aaa gac ttt gtt aac ctt gac aag gtt atg cct tca144Trp Thr Leu Leu Lys Asp Phe Val Asn Leu Asp Lys Val Met Pro Ser35 40 45ttg tca gtt tgt gaa ctt gta gaa ggt gaa ccc aat gcc gtt ggt tgt192Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Glu Pro Asn Ala Val Gly Cys50 55 60act cgc tac gtt aaa ggt atg atg cac cca atg gaa gtg gaa ttt tgg240Thr Arg Tyr Val Lys Gly Met Met His Pro Met Glu Val Glu Phe Trp
65 70 75 80gcc aac gag cag ctg gtg gag ctg gat gac gag acc atg acc tac agt288Ala Asn Glu Gln Leu Val Glu Leu Asp Asp Glu Thr Met Thr Tyr Ser85 90 95tat att ttt act aag gcc ttt aca ggg tat gag ggt tac atg ggt acc336Tyr Ile Phe Thr Lys Ala Phe Thr Gly Tyr Glu Gly Tyr Met Gly Thr100 105 110atg caa ctt gtg gag gaa agc gat cag aag gga act agg ttt gac tgg384Met Gln Leu Val Glu Glu Ser Asp Gln Lys Gly Thr Arg Phe Asp Trp115 120 125tct ttt cag tgc aag tac att gag ggt gtg act gcc aca tca ttc gct432Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Val Thr Ala Thr Ser Phe Ala130 135 140gct gtt ctg cag att tgg gca gat gag att gcc cag aaa att gaa gag480Ala Val Leu Gln Ile Trp Ala Asp Glu Ile Ala Gln Lys Ile Glu Glu145 150 155 160att tgc aaa gca tgatcatgaa tatgggtcaa tttgtgatgc tgtgtgcatg532Ile Cys Lys Alatgtgttttcc attctgtctt gtgatgtaat gaagtaacgt aattaccaga tgcatgtaat 592ctgtagtggc tgtgttttca ataaataaga atttgctttc ttgcaaaaaa aaaaaaaaaa 652aaaaaaaaa 661<210>14<211>164<212>PRT<213>Allium ampeloprasum L.
<400>14Met Ala Gln Asn Pro Gly Val Pro Ala Val Ala Thr Glu Pro Lys Trp1 5 10 15
Thr Gly Lys Val Ser Ala Ser Leu Pro Asn Thr Lys Pro Glu Gln Ala20 25 30Trp Thr Leu Leu Lys Asp Phe Val Asn Leu Asp Lys Val Met Pro Ser35 40 45Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Glu Pro Asn Ala Val Gly Cys50 55 60Thr Arg Tyr Val Lys Gly Met Met His Pro Met Glu Val Glu Phe Trp65 70 75 80Ala Asn Glu Gln Leu Val Glu Leu Asp Asp Glu Thr Met Thr Tyr Ser85 90 95Tyr Ile Phe Thr Lys Ala Phe Thr Gly Tyr Glu Gly Tyr Met Gly Thr100 105 110Met Gln Leu Val Glu Glu Ser Asp Gln Lys Gly Thr Arg Phe Asp Trp115 120 125Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Val Thr Ala Thr Ser Phe Ala130 135 140Ala Val Leu Gln Ile Trp Ala Asp Glu Ile Ala Gln Lys Ile Glu Glu145 150 155 160Ile Cys Lys Ala<210>15<211>726<212>DNA<213>Allium ampeloprasum L.
<220>
<221>CDS<222>(57)..(563)<223>P<220>
<221>polyA位点<222>(717)..(726)<223>P<400>15acacacaact cagacccaca tttcgttgta tttagtagat tattcagtca ggaaaa atg 59Met1atg aca tat cct gga aat cgt gct gta gcc act gat ggt gcc aaa gaa107Met Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Ala Val Ala Thr Asp Gly Ala Lys Glu5 10 15gct cca aaa tgg aaa ggc aaa gcc tat gcc ttg ctt cca aat aca aag155Ala Pro Lys Trp Lys Gly Lys Ala Tyr Ala Leu Leu Pro Asn Thr Lys20 25 30cca gag cac gcg tgg aaa cta cta aaa gac ttc att aac ctt cac aag203Pro Glu His Ala Trp Lys Leu Leu Lys Asp Phe Ile Asn Leu His Lys35 40 45acc atg cca tcg ctg tca gtt tgt gaa ctg gta gaa ggt gag gtc aat251Thr Met Pro Ser Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Glu Val Asn50 55 60 65gct gta ggt tgt gtt cgt cat gtt aaa ggt ata atg cat cca atg gag299Ala Val Gly Cys Val Arg His Val Lys Gly Ile Met His Pro Met Glu70 75 80cag gag ttt tgg gct aag gag aag ctg gtg gca gtc gat gac aag gcc347Gln Glu Phe Trp Ala Lys Glu Lys Leu Val Ala Val Asp Asp Lys Ala85 90 95atg agc tac agt tat att ttt act gag tgt ttt aca ggg tac gag gat395Met Ser Tyr Ser Tyr Ile Phe Thr Glu Cys Phe Thr Gly Tyr Glu Asp
100 105 110tac acg gcc acc atg caa att atg gat gga tgc gag cat aag gga agc443Tyr Thr Ala Thr Met Gln Ile Met Asp Gly Cys Glu His Lys Gly Ser115 120 125aga ttt gag tgg tcc ttc cag tgt aac tac atc gag ggt atg act gaa491Arg Phe Glu Trp Ser Phe Gln Cys Asn Tyr Ile Glu Gly Met Thr Glu130 135 140 145tct gcc ttc act gac att ctg cag cat tgg acc act gag att ggt cag539Ser Ala Phe Thr Asp Ile Leu Gln His Trp Thr Thr Glu Ile Gly Gln150 155 160aaa att gaa gag att tgc agt gct tgattatgaa tatcggttta tgctgtgatg 593Lys Ile Glu Glu Ile Cys Ser Ala165caatgtgtgt gtattaatcc ctgccttgtg atgtgataaa ataacttaat atgtcatatg 653catgtaatag gcaagccagg gtggtgttgt gttctcaata aaaagcattt gctttttgca 713taaaaaaaaa aaa 726<210>16<211>169<212>PRT<213>Allium ampeloprasum L.
<400>16Met Met Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Ala Val Ala Thr Asp Gly Ala Lys1 5 10 15Glu Ala Pro Lys Trp Lys Gly Lys Ala Tyr Ala Leu Leu Pro Asn Thr20 25 30Lys Pro Glu His Ala Trp Lys Leu Leu Lys Asp Phe Ile Asn Leu His35 40 45
Lys Thr Met Pro Ser Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Glu Val50 55 60Asn Ala Val Gly Cys Val Arg His Val Lys Gly Ile Met His Pro Met65 70 75 80Glu Gln Glu Phe Trp Ala Lys Glu Lys Leu Val Ala Val Asp Asp Lys85 90 95Ala Met Ser Tyr Ser Tyr Ile Phe Thr Glu Cys Phe Thr Gly Tyr Glu100 105 110Asp Tyr Thr Ala Thr Met Gln Ile Met Asp Gly Cys Glu His Lys Gly115 120 125Ser Arg Phe Glu Trp Ser Phe Gln Cys Asn Tyr Ile Glu Gly Met Thr130 135 140Glu Ser Ala Phe Thr Asp Ile Leu Gln His Trp Thr Thr Glu Ile Gly145 150 155 160Gln Lys Ile Glu Glu Ile Cys Ser Ala165<210>17<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>17tggagggtcc tgagcacaag 20
<210>18<211>21<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>18tggaagaatt cgcggccgca g21<210>19<211>36<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>修饰碱基<222>(24)..(24)<223>i<220>
<221>修饰碱基<222>(25)..(25)<223>i<220>
<221>修饰碱基<222>(29)..(29)<223>i<220>
<221>修饰碱基<222>(30)..(30)<223>i
<220>
<221>修饰碱基<222>(34)..(34)<223>i<220>
<221>修饰碱基<222>(35)..(35)<223>i<400>19ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng36<210>20<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>20ctcttcgatt ttctgaccta tctcagtagc 30<210>21<211>22<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>21atggagctaa atcctggtgc gc 22<210>22<211>22<212>DNA<213>人工合成序列
<220>
<223>PCR引物<400>22atggagcaaa attctggtac gc 22<210>23<211>15<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>修饰碱基<222>(3)..(3)<223>i<220>
<221>修饰碱基<222>(6)..(6)<223>i<220>
<221>修饰碱基<222>(9)..(9)<223>i<400>23ggngcnmgna artgg 15<210>24<211>22<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>24atggagctaa atcctggtgc ac 22<210>25<211>25<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>25gaattttggg ccaaggagaa gctgg25<210>26<211>25<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>26tcctcgtacc ctgtaaaaca ctcag25<210>27<211>23<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>27atgatgacat atcctggaaa tcg 23<210>28<211>21
<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>28cacacagcat cacaaattga c21<210>29<211>22<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>29atggcgcaaa atcctggtgt gc 22<210>30<211>45<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>30aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt ttttt 4权利要求
1.DNA，编码表现出将1-丙烯次磺酸转变为催泪成分的作用的蛋白质或多肽。
2.权利要求1所述的DNA，其中上述DNA是由序列1、5、7、9、13或15所示的碱基序列构成的，或由以下(a)～(c)中的任一个构成的(a)由在序列1、5、7、9、13或15所示碱基序列中付加、缺失、或置换1或多个碱基后的碱基序列构成的DNA；(b)在严格条件下与由序列1、5、7、9、13或15所示碱基序列构成的DNA可进行杂交的DNA；(c)由与序列1、5、7、9、13或15所示碱基序列的同源性在60％以上的碱基序列构成的DNA。
3.引物，由序列25所示，用于属于葱属植物的催泪成分合成酶基因的分离。
4.利用序列25所示引物，对属于葱属植物的催泪成分合成酶基因进行分离的方法。
5.含有权利要求1或2所述DNA的重组载体。
6.含有权利要求1或2所述的DNA重组载体的转化体。
7.具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽的制造方法，其特征是对用含有权利要求1或2所述的DNA重组载体转化的宿主细胞进行培养，然后对产生在培养基中或细胞中的具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽进行分离。
8.具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽，含有以下任一个序列(a)序列2、6、8、10、14或16所示的氨基酸序列、(b)在序列2、6、8、10、14或16所示的氨基酸序列中付加、缺失或置换1或多个氨基酸后的氨基酸序列、或(c)与序列2、6、8、10、14或16所示氨基酸序列的同源性在65％以上的氨基酸序列。
9.具有抑制权利要求8所述蛋白质或多肽的mRNA翻译的功能的核酸分子。
全文摘要
本发明涉及与粉碎或切断洋葱等植物时发生催泪成分的生成有关的表现出将1－丙烯次磺酸转变为催泪成分的作用的蛋白质或多肽、编码该蛋白质或多肽的DNA(催泪成分合成酶基因)、使用用于属于葱属植物的催泪成分合成酶基因分离的引物以及使用该引物分离该基因的方法、含有上述DNA的重组载体、包含含有上述DNA的重组载体的转化体、对用含有上述DNA的重组载体转化的宿主细胞进行培养制造具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽的方法、具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽、以及具有抑制具有催泪成分合成酶活性的蛋白质或多肽的mRNA翻译的功能的核酸分子。
文档编号C12N15/82GK1639337SQ0380504
公开日2005年7月13日 申请日期2003年2月28日 优先权日2002年3月1日
发明者今井真介, 柘植信昭, 镰田庸宏, 正村典也, 正野仁慈 申请人:好侍食品株式会社