专利名称：储存真菌培养物和分生孢子的方法
技术领域：
本发明涉及改良的储存和再活化昆虫病原真菌，特别是绿僵菌属(Metarhizium)真菌培养物及分生孢子的工具和方法。
本申请是1992年5月27日提交的David W.Miller，Paul Perry和CarolAnn Johnson的名称为“昆虫感染室的保存条件”的美国专利申请序号07/889，594的部分继续申请。
有许多种昆虫可造成严重的农业经济损失，并可在人和其他动物群间传播疾病。近来，已使用了不同的化学杀虫剂来控制这些昆虫。但不幸的是，杀虫剂价格很高而且会不断地对环境造成危害，特别是这种危害性可长期存在。另外，还有可能产生杀虫剂抗性昆虫，以致需要使用大量杀虫剂并需用不同的杀虫剂再次处理。使用化学杀虫剂还可导致非靶昆虫的伤亡。
可使用常用高毒性化学杀虫剂以外的昆虫病原体来控制有害昆虫。可使用细菌如苏云金杆菌喷洒在对昆虫如舞毒蛾感染敏感的植物上，并获得了一定的成功。真菌是另一类适于作为控制昆虫的生物杀虫剂的有希望的昆虫病原体。真菌的最常见的生长和繁殖方式是植物性或无性繁殖，包括孢子形成，然后是孢子发芽。无性孢子，包括分生孢子，在菌丝上造孢细胞的顶端和两侧形成多细胞菌丝体的丝状结构。在适宜环境中，分生孢子发芽，变大，并产生芽管。一定时间后芽管发育或菌丝，继而形成菌丝体。当通过与昆虫病原真菌的活繁殖体接触而接种昆虫时，即发生感染同时建立起真菌与靶昆虫间的寄生关系。随着感染过程的发展，真菌便逐渐杀死昆虫。
美国专利5，057，316和5，057，315号公开了控制和消灭包括
蠊、家蝇等飞行昆虫以及其他昆虫如玉米根虫的成虫在内的昆虫的方法。借助感染室，用以足够高的浓度使用时即可对昆虫有致病性的真菌感染昆虫，从而达到控制昆虫和消灭昆虫的目的。小室中保留有对昆虫有致病力的活的真菌孢子，防止真菌受到环境(包括雨、紫外光和风)的破坏，或作为昆虫的引诱物以便用大量孢子接种昆虫。真菌培养物可在长时间内连续提供孢子。孢子附着在昆虫上，并有芽管穿入昆虫体内，从而使昆虫在3到4天内死亡。小室的设计，如其形状和颜色可使之成为昆虫的独特引诱剂。另外，食物或诱饵也可用来提高小室对昆虫的吸引力。虽然主要感染是通过外部接触，但也可通过昆虫彼此接触或摄食孢子来感染昆虫。在某些情况下，被摄食的真菌分生孢子也是有毒性的。
昆虫病原真菌取得商业成功的一个历史性限制是它们缺少良好的保存特性。虽然已证明美国专利5，057，316和5，057，315号中所描述的小室在实验室和真正田野试验条件下都是很有效的，但它们必须能够经受长途运送，并且能够在室温下长期储存时保持稳定或能成为活的商品。
两种最可取的昆虫病原性真菌是绿僵菌(Metarhizium aniso-pliae)和白僵菌(Beauveria bassiana)。然后，由于在真菌繁殖体如分生孢子的稳定化、储存及储存后再活化中所遇到的限制，迄今为止这两种真菌产品的商业化只取得了很有限的成功。
分生孢子的生活史包括有6个阶段形成、成熟、成熟后、活化、休眠和发芽。在休眠阶段中，随着静止 期间的延长，孢子处于不断降低的生理活性状态，并对外部环境条件有最大的耐受性。有两种类型的休眠结构休眠包括不能简单地通过提供适于生长的条件得以克服的内在强制性休眠;外因性休眠是由环境施予的，当出现适于生长的条件时即终止休眠。可通过不给予发芽所需的特定营养素或存在抑制剂来抑制外因性休眠，并可在某些环境条件下保持。
此前已了解到，干燥的微生物孢子、细胞及其他类型繁殖体可比新鲜的保存更长时间。但大多数科学家都接受这样一个观点，即活细胞脱水可导致膜的整体隆起，不可逆地丧失结构和功能的完整性(Croωe&Croωe，Stabilization of Membranes in Anhydro-biotic Orga nisms，Membranes，Metabolism and Dry Organism-s，A..C.Leopold，Comstock Publishing Co.，Ithica，NY，pp.188-209(1986);Beker&Rapoport，Conservation of Yeast by Dehydra-tion，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Vol.35，Biotechnology Methods，ed.A.Fiechper，Springer Verlag，pp.127-171(1987)。这一观点得到了当孢子或其他类型微生物繁殖体干燥时发芽速率明显降低这一事实的支持。有关由脱水引起结构损害的大多数研究工作集中在酵母上(Beker&Rapoport，1987)。丝状真菌可产生不同类型的繁殖体，分生孢子则是一种可在短时间内大量产生的繁殖体。但分生孢子都不能耐受脱水。已以发现，各种昆虫病原真菌的分生孢子对干燥处理是很敏感的，而且会很快丧失其存活力(Eyal等人的欧洲专利申请92100010.5号)。已为开发菌丝体配制品作了很多努力(Andersch等人的澳大利亚专利申请AU-8-81286/87;欧洲专利申请92100019.5号)，但因为菌丝体配制品在高温度下不稳定，而限制了它们的应用。
已就储存温度和相对湿度(R.H.)对分生孢子稳定性和绿僵菌与白僵菌的效能影响进行了一些研究(Bell，1975;Clerk&Madelin，1965;Daoust&Roberts，Effect of formulation on the Viabili-ty of Metarhiziun anisopliae Conidia，J.of Invertebrate Patholo-gy，Vol.41，pp.151-160(1983);Kaωakami，1960;Kaωakami&Kikuni，1965;Steinhaus，1960;Walstad，J..D.，“Effects of Envi-ronmental Conditions on Tωo Species of Muscardine Fungi(Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae)”，J.of Inver-tebrate Pathology，Vol.16，221-226(1970))。这些研究的结果表明，绿僵菌的分生孢子于有高R.H.的中等温度下(26℃±97%R.H.或19℃+97%R.H.)存活时间最长。但在37℃下分生孢子可在短时间内失去其发芽能力。发芽是长成昆虫病原真菌中的第一个阶段。
在运输和仓库储存期间，温度可高达37℃。现有技术并没有仔细研究没有发芽的分生孢子的状态。虽然已使用新鲜分生孢子材料研究了加速和同时造成绿僵菌分生孢子发芽的技术，但还需要在蒸馏水中浸渍10-44小时，并提供适当的营养素源(Dillon&Charn-ley，1985)。绿僵菌和白僵菌等昆虫病原真菌的分生孢子是天然疏水的。当将它们悬浮于水中时，水和分生孢子表面间的介面上存在高的表面张力，阻止分生孢子吸收发芽所必需的水。通过仔细检查不同的表面活性剂，有可能缓和这一问题。表面活性剂的特征是其分子结构可在不同的清楚程度上分为不同的部分。一个部分是亲水的，另一个是疏水的。用于定量表面活性剂之亲水-疏水性质的方法是亲水物-亲脂物平衡(HLB)法。该方法中，HLB数值是分配于各表面活性剂的，并通过换算而与适当地应用表面活性剂相关联。设计比例，以使更亲水的表面活性剂具有更高的HLB数值。虽然已将筛选表面活性剂的HLB方法用于化学杀虫剂配制，但将用于筛选适当表面活性剂的HLB方法应用于干燥并储存后的再活化微生物繁殖体即是一个新的领域。另外，有关当在不同温度-R.H.并存条件下储存分生孢子时O2水平对分生孢子存活性影响所知甚少。氧对于真菌孢子发芽是十分重要的。
因此，本发明的一个目的是提供一种增加在营养培养基上的病原性真菌，特别是绿僵菌的贮存期限的方法和工具。
本发明的另一个目的是提供改良的用于病原性真菌的昆虫感染小室的包装。
本发明的再一个的目是提供在较高温度下储存昆虫病原性真菌之分生孢子以增加其贮存期限的方法。
本发明的再一个目的是提供储存后重新活化分生孢子的适用方法。
本发明介绍了包装含有真菌培养物或昆虫病原性真菌特别是绿僵菌属真菌之分生孢子的感染小室的方法。这些方法可以在高达37℃的温度下长期储存分生孢子，并可有继后使之重新活化以控制蟑螂、苍蝇、蚂蚁、软体昆虫、草场害虫，毛虫等昆虫，而没有或很少丧失真菌感染和引起敏感昆虫死亡的能力。
研究证明，绿僵菌的分生孢子在于大气氧含量(20%O2)和室温及高相对湿度(90-100%R.H.)条件下保存时有良好的存活性，但在37℃下其他R.H.和氧含量条件下则丧失存活能力。在低含氧水平(0-5%O2)，1-10%R.H.水平条件下，分别有56%和26%的分生孢子能在25℃和37℃下储存2个月后发芽。当将绿僵菌的分生孢子浸渍在适当的表面活性剂混合物，如亲水物-亲脂物平衡(HLB)数为10的乙氧基化醇中时，在25℃和37℃下的发芽率分别从56%增加到77%和从26%增加到74%。用控制蜡蛾，大蜡暝(Galleria mellonella)幼虫的生物检测法试验在三种不同环境条件下储存两个月的分生孢子。储存条件分别是(1)25℃，90-100%R.H.和大气氧水平;(2)25℃，0-10%R.H.和0-5%O2;(3)37℃，0-10%R.H.和0-5%O2。用这三组不同的分生孢子处理的活幼虫的百分率显示，储存的分生孢子与新鲜的分生孢子差不多或更好些。在低相对湿度下包装，给分生孢子提供一个迅速脱水并呈现休眠状态的环境。将脱水的分生孢子储存于低氧环境中使之在储存期间保持体眠，因而在升高的温度下仍可存活。然而，随着脱水而导致的表面张力增加，在储存后降低了发芽率。使用适当的表面活性剂则降低了分生孢子的表面张力并有利于再水化而中断休眠。
因此，在包装含分生孢子之感染小室的一优选实施方案中，包装是用不透气的，不透水蒸汽的，柔韧的袋材料如铝箔和低密度聚乙烯涂层的铝箔制成的。包装可确保在储存期间有始终不变的氧和R.H.水平。可使用干燥剂以产生0-10%的低R.H.环境。可包装某种能与干燥剂一起加入各小袋中的氧吸收剂以造成低氧环境。可用含水琼脂片来保持90-100%R.H.。可在含有35-40%R.H.空气的包装内密封分生孢子以提供35-40%的R.H.。
可在例如感染小室这样的装置中以所需的氧和R.H.条件包装分生孢子。也可在适当条件下大批量包装分生孢子，然后悬浮在适当喷雾使用以杀灭害虫的混合罐中。在此实施方案中，可望包括用于降低真菌分生孢子的表面张力的表面活性剂，以有利于其在施用载体中发芽而又不影响真菌分生孢子的存活率。将分生孢子与施用载体混合后，即可使用常规装置和方法将此配制好的真菌剂喷洒在欲进行昆虫控制的植物上和其他地方。
在包装含真菌培养物之感染小室的优选实施方案中，所提供的柔韧的袋材料是不透水蒸汽和水的，并且在高湿度条件下包装真菌培养物。
图1α显示四批绿僵菌在非控制的条件下在感染小室内保温不同时间(天数)后的百分存活率。
图1b显示与含有真菌的感染小室接触的蟑螂的百分存活率，其中真菌已在有氧(-黑色菱形-)或缺氧(-O-)条件下保存不同时间(天)。未与真菌接触的蟑螂的存活率标示为(-空正方形-。
图2是感染小室内于不同相对湿度下保温之真菌的存活率的三维图百分存活率对百分相对湿度对时间作图。
图3图解显示与含有绿僵菌培养物的感染小室接触不同时间(天)后蟑螂(Blatella germanica)的百分存活率，其中真菌分别储存在22℃和0%R.H.(黑正方形)、33%R.H.(黑圆圈)、100%R.H.(黑菱形)和对照R.H.(空圆圈)条件下。
图4a，4b和4c图解显示绿僵菌菌株ESF53(图4a)，绿僵菌菌株ESF1(图4b)和白僵菌菌株ESF2(图4c)在22℃(黑正方形)、27℃(空正方形)、32℃(黑菱形)和37℃(空菱形)下储存不同时间(周)后的百分存活数。
图5是相对于造成不同储存条件的包装系统，绿僵菌在25℃和37℃下储存1和2个月后的百分发芽率的关系曲线。包装系统是单用箔、箔+DrieriteTM，箔+水琼脂，箔+AgelessTM，箔+DrieriteTM+AgelessTM，箔+水琼脂+AgelessTM条件(从左到右)是25℃，40%R.H.+20%O2;37℃，40%R.H.+20%O2;25℃，0%R.H.+20%O2;37℃，0%R.H.+20%O2;25℃，40%R.H.+0%O2;37℃，40%R.H.+0%O2;25℃，0%R.H.+0%O2;37℃，0%R.H.+0%O2;25℃，100%R.H.+0%O2，和37℃，100%R.H.+0%O2。
图6是绿僵菌分生孢子的百分发芽率对包装系统的关系曲线，所说的包装系统在25℃和37℃下2个月时间内造成不同的储存条件，其中确定于储存后用或不用表面活性剂处理。包装系统是单用箔片、箔+DrieriteTM，箔+水琼脂，箔+AgelessTM，箔+DrieriteTM+AgelessTM，箔+水琼脂+AgelessTM。所用的表面活性剂是乙氧基化的十三醇。储存条件同图5中所述。
图7显示用在两个月的不同环境条件下储存的绿僵菌的分生孢子处理的蜡蛾，大蜡暝(Galleria mellonella)幼虫所处的外部条件。分生孢子是(1)新鲜的;(2)用水琼脂片包装以保持100%R.H.，并储存于25℃下，(3)用DrieriteTM+AgelessTM包装，并储存于25℃或(4)37℃下。将在其躯体上有新形成的分生孢子的幼虫鉴定为有分生孢子形成的幼虫。所有处理组的死亡率为100%。
本发明描述了为储存昆虫致病性真菌，特别是绿僵菌菌属及其分生孢子所需的包装方法。使用这些方法得以长期储存真菌分生孢子，并在继后用于控制蟑螂、苍蝇、蚂蚁、软体昆虫、草场害虫及毛虫等昆虫。
在生物学控制系统的商业开发中，一个基本要素是制剂必须有合理的贮存期限。用于确保合理贮存期限的包装系统必须是经济的，并且易于组装、运输和储存。包装必须保持所需真菌繁殖体如分生孢子能在合理的温度范围内存活并有毒力。
在保持存活性中，表现有最大重要性的因素是相对湿度(R.H.)、氧和温度。本文中所说的“低”R.H.是指R.H.小于10%，或为0-10%;“高”R.H.是指R.H.大于90%，或为90-100%。中度R.H.是指35-40%。氧水平一般是在大气氧含量范围内，即20%;低氧水平为0-5%;高氧水平为90-100%。
真菌培养物的储存条件美国专利5，057，315和5，057，316号描述了使用如包括绿僵菌和白僵菌在内的昆虫致病性真菌，控制和消灭
蠊及其他昆虫的方法。使用由关闭的有昆虫入口并含有对昆虫有致病性之真菌活培养物的小室组成的污染小室，对待处理的环境施用真菌。该装置的几何形状是使昆虫进入小室后即与有效剂量的致病真菌的培养物接触。已发现，不管小室或储存容器的结构如何，用在该昆虫感染小室内的昆虫在室温和无氧条件下储存能力很差。在没有连续得到氧的情况下，真菌丧失其存活力，致使小室不能有效地致死性感染昆虫，虽然真菌有可能降低到分生孢子的1%存活率并且仍然是有效的。真菌还需要高的湿度。当储存温度从室温即22-25℃增加到42℃时，即需要增大相对湿度。
为了适应这些要求，已设计了能提供足够氧和高湿度，以及真菌培养物的昆虫储存小室的包装材料，这样的材料可保持大多数水蒸汽，同时允许包括氧和二氧化碳在内的气体交换。所用材料最好可以透过包括真菌孢子，细菌和病毒在内的微生物体。
现对得以延长绿僵菌之贮存期限的条件叙述如下。这些条件是通过在大气和100%R.H.下包装而达到的。所选用的包装材料能使气体达到平衡，同时可保持100%R.H.。
包装材料就其屏障性质来说具有限定之特征的各种材料都可从市场上购得;即，它们能够保留并使之不同的气体通过一层材料运动。这些材料可以坚硬和可揉曲的两种规格得到。可很容易地制得有各种不同的性质和结构的柔韧屏障膜的袋。
用于包袋小室的最可取的材料是可以热封的2至8密耳厚的低密度和高密度聚乙烯(指聚合物分支的程度)。其他材料包括比聚乙烯有较低空气通透性的聚丙烯。如下所示，这些市售材料的特征在于有低水蒸汽传输能力和高气体通透性。
表1真菌培养物包装材料的性质材料水蒸汽传输a气体通透性b水吸收O2N2CO2聚乙烯(低密度) 1.3 550 180 2900 低聚乙烯(高密度) 0.3 600 70 4500 低聚丙烯 0.7 240 60 800 低a.在95°F，90%R.H.条件下丢失克数/24小时/100平方英寸/密耳;
b.在77°F，50%R.H.条件下的CC数/24小时/100平方英寸/密耳;ASTM D1434-63。
可用市售的其他材料代替聚乙烯和聚丙烯，用以提供等值的气体和水蒸汽传递能力。这些材料可得自D&B Plastics，Fair-mouth，MN或其他塑料膜供应商。
真菌分生孢子的储存条件真菌孢子、分生孢子并不是“惰性”的，而是要消耗足够量的氧。但所消耗的氧的量比活性生长的真菌菌落所消耗的量少得多。在高R.H.条件下，分生孢子得不到氧就会失去存活力。但于25℃，高R.H.和大气氧含量条件下包装的分生孢子，在于37℃下储存2个月后将失去其发芽能力。现已研究证明，如果直接环境是几乎没有氧的(0-5%)，则分生孢子可在低R.H.(小于10%)条件下保持其存在活力。为了适应低氧和低相对湿度的要求，可使用不透过任何气体或水蒸汽的包装材料并合用干燥剂，并且可在使用除去氧的化合物或方法的同时使用之。
用于耗尽或除去氧的材料有多种氧消耗剂(如氧吸收剂)可以与分生孢子一起包装。用于除去袋中或任何其他类型容器中氧的氧吸收剂必须是对真菌分生孢子无毒性的。例如可使用购自Mitsubishi International Cor-poration，Food division“B”，520Madison Avenue，New York，N.Y.10022的AgelessTM。AgelessTM的主要成分是粉末状活性氧化铁，其可在吸收氧后变成铁氧化物和氢氧化物。在气密容器中，AgelessTM可使氧降低到0.01%(100ppm)或更少。所选用的氧吸收剂还必须是与干燥剂相容的。Z型AgelessTM特别适合与干材料一起使用，并可与干燥剂一起使用。氧吸收剂除去密闭容器内氧的容量是应考虑的另一个因素。一袋AgelessTM-Z300具有吸收300ml氧的容量，此相当于空气体积1500ml。
另外，可在密封时借助真空抽吸或在密封前向包装内充氮而从包装中除去氧。
用于耗尽或除去湿气的材料可用各种干燥剂如购自W.A.Hammond Drierite Company，P.O.Box 60，Xenia，Ohio 5385的DrieriteTM(无水硫酸钙)，从包装中除去湿气。DrieriteTM是一种可用于微生物杀虫包装系统的适宜的干燥剂，因为当其暴露于高室温条件下时，将不能释放任何被其吸收的水份。水被牢固地保持在半水合化形式的硫酸钙中;如从中去掉水份则需超过350°F(177℃)的温度。对于在可变的气候条件下运送微生物产品来说，这是一个重要的特征。为了干燥气体，DrieriteTM具有10-14%(重量)的水容量。一个DrieriteTM干燥剂袋可在大约10小时或更少时间内使密封的包围物中的湿度降低到-100°F(-73℃)露点。24cm×14cm体积约200-250cm3的容器使用一个袋。也可使用硅胶，某些粘土、聚丙烯酸衍生物等其他化合物和其他干燥剂来造成低R.H.环境。
包装材料与用来包装真菌培养物的材料相反，用于包装分生孢子的材料应该是不透气的。用于包装分生孢子的优选材料是可从Laminated Foil and Packaging，Portsmouth，N.H.购得的厚度至少为0.003英寸，最好0.007英寸的聚乙烯-铝箔-聚乙烯。
也可使用氧传输速率小于0.005cc/100平方英寸/天，水蒸汽传输速度低于0.005cc/100平方英寸/天的其他材料。在这里，将具有这些传输特性的材料看作是“不透过”水和气体的。
表2包装分生孢子的聚乙烯-铝箔-聚乙烯袋的性质厚度 氧通透性 水蒸汽通透性O2CC/100平方英寸/ g/m2/24小时24小时0.003″或3密耳 0.005 00.005″或5密耳 0.000 00.007″或7密耳 0.000 0
可用市售的相似材料替代板层箔，以提供等值的气体和水蒸汽通透性。可由供应商处得到这些材料。
包装待储存的真菌培养物和分生孢子的方法使用本领域技术人员已知的常规方法如热封法将真菌培养物或分生孢子密存在袋材料内。可使用超声波密封法，但这不是优选的方法。尽可能地将分生孢子封装在可容纳它们的最小的袋内，且在封口时不使另外的空气或水加入进去。
在一优选实施方案中，装在不透气材料内的分生孢子可与足够量的干燥剂和氧吸收剂一起包装，以在袋内造成小于10%R.H.和少于5%O2的条件。另外，在一有用但不是优选的实施方案中，将装在不透气材料内的分生孢子与有限量的干燥剂一起包装，而不包装氧吸收剂，以在袋内产生小于10%R.H.的条件。
此包装可包含多个分隔空间和用于将各空间之内容物混合在一起的工具。例如，为形成施用于待处理之地域的真菌繁殖体悬浮液，第一个分隔空间可含有表面活性剂，而第二个分隔空间含有真菌繁殖体。相似地，为形成干真菌繁殖体配制物，第一个分隔空间可含有干燥的表面活性剂，而第二个分隔空间含有真菌繁殖体。
表面活性剂可用表面活性剂(亦称为润湿剂)重新活化储存后的分生孢子。表面活性剂可分为五大类(1)阴离子的，(2)阳离子的，(3)非离子的，(4)两性的，和(5)非水溶性的。在大多数情况下，优选阴离子和非离子型表面活性剂。各种非离子型表面活性剂均在尺度内指定一个HLB数值，其中更亲水的表面活性剂具有更高的HLB数值。HLB方法大多适用于非离子型表面活性剂，如HLB为10的I-conol TDA，即乙氧基化的十三醇(BASF Corporation，Persippany，N.J.07054)，其似乎可使储存的绿僵菌的分生孢子得以最好的再活化。可将Iconol TDA6(HLB＝11)和Iconol TDA3(HLB＝8)按2∶1(W/W)的比例混合，以达到HLB为10。为此目的，也可单独或混合使用HLB在8-13之间，具有不同化学结构的其他非离子型表面活性剂，如嵌段共聚物、乙氧基化的醇，乙氧基化的烷基酚、乙氧基化的胺和/或酰胺、乙氧基化的脂肪酸、乙氧基化的脂肪族酯和油(动物和植物的)、脂肪族酯;甘油醇、甘醇酯、羊毛脂基衍生物、单甘油酯及衍生物、聚合物(多糖、丙烯酸、丙烯酰胺)、丙氧基化和乙氧基化的脂肪酸、醇或烷基酚、脱水山梨醇衍生物、蔗糖和葡糖酯及衍生物。还可使用HLB在8-14之间的某些阴离子和阳离子型表面活性剂。在阴离子型或其他类别中，也有某些适于再活化分生孢子的表面活性剂，如磺基琥珀酸的盐如二辛烷基磺基琥珀酸钠、磺酸的盐如十二烷基苯磺酸盐、萘磺酸的盐及酒石酸盐(Igepon T-77)。这些表面活性剂的例子包括嵌段聚合物如Pluronic 25R4;乙氧羰基化的醇如Tergitol 15 S-5、乙氧基化的烷基酚如Triton N-57，乙氧基化的胺和酰胺如Ethomid 0-17、乙氧基化的脂肪酸如PEG油酸、乙氧基化的脂肪酸和油如Alkamuls EL-L20、甘油酯如Emerest 2421、甘醇酯如Ethox DO-9、聚多糖、多聚丙烯酸和丙烯酰胺如APG325 Glycoside、丙氧基化和乙氧基化的脂肪酸、醇或烷基酚、脱水山梨醇衍生物如Span60，以及蔗糖和葡糖酯及衍生物如Crodesta F-50。阴离子表面活性剂的例子包括磺基琥珀酸的盐(如二辛基磺基琥珀酸盐)、磺酸的盐(如十二烷基苯磺酸的盐、烷基苯磺酸的钠盐)、磷酸酸及酒石酸盐。
对于绿僵菌来说，表面活性剂的HLB数最好在9-11范围内。对于白僵菌来说，表面活性剂的HLB最好在9-14范围内。
根据所用表面活性剂的不同，为再活化分生孢子所需的一种或多种混合表面活性剂的量可低至分生孢子的0.01%，并高至100%(W/W)(即比例范围从1∶1000到100∶1)。在筛选表面活性剂时最好仔细了解HLB值，因为一旦确定了某一适当的HLB数值，便也可以在再活化分生孢子中使用具有对相应类型真菌繁殖体、细菌细胞或其他微生物无害之同一HLB数值的其他不同的表面活性剂。
在一优选实施方案中，将分生孢子包装在有足够在包装内产生低R.H.量的干燥剂，以及足够在包装内造成低氧环境量的氧吸收剂的箔片内。然后将此包装与含有表面活性剂混合物或混合物悬浮液的第二包装的内容物混合，以在应用前再活化分生孢子。另外，必要时可将优选的表面活性剂与分生孢子及某些惰性材料混合，作为最后的配制品并按上述方法储存。可将后来与表面活性剂混合的分生孢子，或配制好的含分生孢子及表面活性剂的材料制成喷雾剂、粉剂、片剂、颗粒剂或凝胶使用。例如，可分别包装分生孢子和表面活性剂这两种最后配制品的成分，并在应用前混合之。然后可将完全配好的真菌剂制成喷雾剂、药水或粉剂施用，以对抗蟑螂、家蝇、蚜虫、白蚁或蚂蚁。
现借助下列证明本方法及包装材料之各种特征的重要性的非限制性实施例进一步阐述本发明。
下列实施例中使用下述材料和方法来确定各种储存条件对真菌培养物的存活性和效力的影响。
存活性使用马铃薯右旋糖凝胶(Potato Dextrose Agar，PDA)平板按下述程序测定绿僵菌分生孢子的百分存活率(发芽)。
制得新鲜、无菌的PDA平板。用小的无菌漆刷的尖端轻轻接触分生孢子菌苔以收集分生孢子。使刷子顶端接触到无菌平皿的内部以除去过多的分生孢子。只需要小量分生孢子。将分生孢子小心并轻轻地刷到PDA平板的四分之一部分上，使用得自不同地区来源的绿僵菌重复刷其他四分之三部分。每四分之一刷一或两刷即可。将平皿于28℃下保温11-13小时。保温13小时后，在复合显微镜下于200倍放大检查各接种区域的表面。找到可以检查单个分生孢子的视野。至少计数200个分生孢子并记录存活和不存活之分生孢子的数目。存活分生孢子具有一个长度至少如分生孢子直径的芽管。计数每个四分之一接种部分的存活分生孢子/总分生孢子数，求四次计数的平均值并乘以100以确定存活分生孢子的百分数。
效力在实施例1至6中，使用德国蠊(Blatella germanica)以鞋状盒生物检测法(Shoe box bioassay)确定效力。
材料聚苯乙烯鞋状储存盒(12.5×6.75×3.6英寸)，在盖有聚酯蚊虫网筛的顶部有气孔。
成年德国蟑螂(德国蠊;JK-Consulting，Amherst，MA)，饲以Purina Lab Chow(Purina ＃5001，Purina Mills，Inc.，St.Louis，MO)，可在用织物塞住的试管内自由得到蒸馏水。
在带有温度和湿度(128℃和75%R.H.)制及连续数据记录器的环境室内放入鞋状盒。
方法用薄层矿脂涂敷鞋状盒的垂直侧面。向各鞋状盒中加入高压灭菌的Purina Lab Choω团块和水管。各盒内放入20个蟑螂。将放有蟑螂的鞋状盒置于环境室中。四个蟑螂的鞋状盒内各放一个如美国专利5，057，315和5，057，316号所述的感染小室。用另外四个鞋状盒作为对照组。
将鞋状盒置于28±3℃和75±15%R.H.环境和10小时光周期下保温。每周记录蟑螂死亡率，共观察6周。当用钝器戳昆虫时看不出昆虫运动即认为已死亡。
实施例1当小室在室温和未受控制的湿度下不受保护地放置时真菌存活力的丧失情况将四批不同的真菌小室于室内温度和湿度下放入盒内。以数日间隔取样检查真菌的存活性。
图1a中所示结果表明，当在任何较长时间未受保护地储存时，真菌失去其存活力。
实施例2当在无氧条件下储存小室时对真菌存活性的影响。
将5个感染小室放在一系列配有气密盖/夸脱陶瓷罐内。作为对照的小室暴露于大气环境，将罐盖松开。暴露于无氧条件的小室内引入AgelessTM(Mitsubishi)氧清除剂包，并将罐盖塞紧。AgelessTM包由细碎的、未氧化的铁填料组成，当后者与空气接触时即开始氧化。当此过程发生在密封的环境如这些罐中时，即除去了所有的氧而造成无氧环境。
表3和图1b所示数据显示了在这些条件下储存42天后的平均存活率及感染小室的效力。结果证明，为在室温和正常大气湿度下为成功地长期储存真菌需要有氧气存在。
表3感染小室内真菌的存活率百分存活率14天 对照组 72.06Ageless 69.9442天 对照组 81.54Ageless 7.00实施例3确定在允许氧流动情况下真菌培养物的适当包装材料试验几种材料，以确定感染小室内活真菌如何消耗氧，以及当包装真菌时，不同包装材料如何因允许氧通过而能或不能减缓对氧供入的要求。
进行两项研究1)将6个有真菌的小室放入(a)RubkermaidTM容器(7.5×7.5×2.75英寸)，(b)4密耳(0.004英寸)低密度聚乙烯袋(LDPE)(D&B Plastics，Fairmouth，MN)或(c)8密耳LDPE袋。其中各有两份样品，称为“A”和“B”。虽然RubbermaidTM容器是用厚聚丙烯低氧通透材料制成的，但可在容器盖口部分的周围发生氧转移。如表1所示，LDPE的特征主要在于它的低水蒸汽通透性，和其高氧和二氧化碳通透性。
将包装的小室置于30℃储存14天。在此时间结束时，使用ServomexTMCompany，Norωood，MA气体分析仪取样分析包装内部的氧和二氧化碳含量。然后检查小室内真菌的平均存活率。结果示于表4中。
表4感染小室在30℃储存14天后包装内的条件%O2%CO2%存活率Rubbermaid TM A 16.0 5.5 95.0B 11.4 10.4 92.24密耳LDPE A 12.5 2.2 86.3B 12.3 2.3 86.18密耳LDPE A 5.9 3.8 93.0B 5.0 4.0 94.12)在几个铝箔层压袋内各密封20个小室(Laminated Foil and Packaging，Portsmouth，NH)。层压制品是聚乙烯-铝箔(0.0007英寸)-聚乙烯;该包装材料被看作是完全不透任何气体或蒸汽的。储存袋并在其后检测其中的氧和二氧化碳含量。每个取样点均测重复的两个袋。
如表5所示的结果证明已消耗了所有的氧并富集了二氧化碳。然后确定真菌的平均存活率。
表5三个月后箔袋内的条件
%O2%CO2%存活率22℃ A 0.3 23.4 15.0B 0 22.9 11.1530℃ A 0 23.7 0.0B 0 22.0 0.25这两项实验的结果证明了真菌消耗氧的程度;并且与其他实施例结合起来看，还证明提供适宜包装的重要性。得到氧的真菌仍是活的。
实施例4高湿度对真菌之储存稳定性的重要作用将5个有真菌的感染小室放入一系列RubbermaidTM容器内，以确定容器内相对湿度(R.H.)对真菌的长期储存稳定性的影响。一个容器系列的内部已放入湿海绵以确保容器内保持100%R.H.，另一个容器系列中已放入饱和的氯化镁(MgCl2)溶液以保持30%R.H.。最后一个容器系列内部则放入大量硅胶以保持0%R.H.。所有容器均储存于室温下，且定时从容器内感染小室中取样检查真菌存活率和延长时间后小室的效率。
结果示于表6和图2中。这些结果以表格和图形形式显示在储存14个月期间测得的平均存活率。表3中还示出了9个月时感染小室的效率。
结果证明，为成功地长期储存真菌，100%R.H.显著地好于其他湿度。
表6在各相对湿度条件下的百分存活率相对湿度时间 100% 33% 0%1周 81 61.1 69.12周 69 74 513周 68.5 73.1 19.21个月 67.3 30.5 12.76周 58.4 11.4 0.542个月 53.5 28 23.93个月 78.3 15.3 29.86个月 82.33 0.08 0.749个月 80.54 2.33 0.7514个月 84.29 0 0实施例5比较不同商品包装材料为真菌提供适当的长期储存条件方面的能力。
在两系列袋中各放入20个感染小室。一个袋系列为8密耳LDPE。另一个系列为如实施例3所述的箔层压制品。将袋储存于22℃或30℃。由真菌发育后留在小室内的真菌琼脂生长培养基提供袋内所需的100%R.H.。定期从有不同储存条件的系列中取袋并作为测定气体含量的样品。每个样品均用重复的两个袋(A和B)。所得结果与实施例3中获得的数据相符;即，在短期内箔层压袋中没有保留氧，但LDPE袋内则有相当量的氧。然后打开袋，从其内的小室中取样检查真菌存活率。结果显示，在3个月时，透氧(LDPE)袋和不透氧(箔)袋之间出现明确的不同。
可得出这样的结论，即真菌培养物需要氧，而且LDPE袋能进行足够的气体交换以长期保持真菌的存活力。
表7A3个月时箔袋内的条件%O2%CO2%存活率22℃ A 0.3 23.4 15.00B 0 22.5 11.1530℃ A 0 23.7 0.00B 0 22.0 0.00表7B3个月时LDPE袋内的条件%O2%CO2%存活率22℃ A 8.5 3.0 92.1B 8.8 2.5 90.930℃ A 8.7 3.0 86.0B 4.5 4.2 87.8
实施例6比较包装条件对不同真菌存活率的影响图4a，b和c证明在实施例3所述的条件下储存的三种不同真菌在不同时间的百分存活率。菌株ESF2是白僵菌菌株，菌株ESF1和ESF53是绿僵菌菌株。
在同样条件下，使用保存绿僵菌菌株的同样包装材料，白僵菌菌株并不能很好地存活。这些结果表明，就包装在增进真菌存活中的效率来说，不可能将基于包装其他类型微生物的数据外延到真菌。
实施例7确定各种储存条件对真菌分生孢子之存活力和效力的影响使用下述材料和方法确定各种储存条件对真菌分生孢子存活力和效力的影响。
将在各袋中储存的分生孢子划痕在上述的马铃薯右旋糖琼脂(Potato Dexztrose Agar)(PDA)平板上，以检测白僵菌或绿僵菌分生孢子的存活率。将PDA平板上的白僵菌分生孢子于22℃保温18小时，并将绿僵菌的分生孢子于25℃保温15小时。保温后，计数各PDA平板上发芽的分生孢子数目。各复制袋内分生孢子的存活率以百分发芽率表示。然后根据四个复制组的数值计算各处理组的平均百分发芽率，并给出数值的标准差。
使用绿僵菌的ESC-1菌株和白僵菌的ESC-170菌株，且所用的真菌繁殖体类型是保持在小称重盘中的分生孢子。此类型由已刷掉了菌丝体层并放在称重盘中的分生孢子组成。使用AgelessTM产生直接的低氧(＜5%)环境。使用Z-300型AgelessTM是因为它特别适于干燥材料并可与干燥剂一起使用。1袋AgelessTM-Z300具有吸收300ml氧的容量，此相当于空气体积1500ml。箔袋的体积约为250ml。在实验期间，由没有真菌的水琼脂平板中产生并且没有与分生孢子直接接触的水蒸汽保持某些袋内的高R.H.。用DrieriteTM装入需要提供低R.H.环境的袋内。在这样的箔袋中没有气体交换。
所有处理组均在25℃和37℃下保温4或8周。各处理组均重复4份，结果用平均数加减标准差表示。
图5中显示用绿僵菌在大气氧水平(20%O2)条件下测得的结果。绿僵菌的分生孢子比白僵菌的分生孢子稳定性小。虽然它们在37℃正常大气氧水平和90-100%R.H.条件下包装时有好的存活力，但在37℃的其他R.H.和氧水平条件下则会丧失存活性。在0-5%氧和0-10%R.H.条件下包袋后，于25℃和37℃储存2个月后，分别有56%和26%的分生孢子可以发芽。
实施例8确定适用于再活化储存之干绿僵菌分生孢子的表面活性剂其于对百分发芽率的影响筛选有不同化学特征的HLB数值的表面活性剂。
将100ml具有一定HLB数值或化学特征的表面活性剂溶液/悬浮液加在250ml烧杯中。将0.01g至0.5g干燥的分生孢子粉洒在表面活性剂溶液或悬浮液的表面上。一旦分生孢子样品在表面活性剂溶液中润湿，即将溶液转移到100ml量筒中并反复颠倒(1分钟内30次)以混合之。使分生孢子在室温下沉到量筒的底部。弃去上清并用无菌棉拭子取沉淀的分生孢子样品。然后将含有各分生孢子样品的PDA平板于25℃保温25小时，检查每100个总分生孢子中已发芽之分生孢子的数目。
结果示于表8和图6中。图6是绿僵菌分生孢子的百分发芽率相对在25℃和37℃下2个月时间内造成各种储存条件之包装系统之间的关系曲线，其中发芽率是在储存后用或不用表面活性剂处理而决定的。包装系统是单用箔、箔+DrieriteTM、箔+水琼酯、箔+AgelessTM、箔+DrieriteTM+AgelessTM、箔+水琼脂+AgelessTM。所用的表面活性剂是亲水物一亲指物平衡(HLB)数为10的乙氧基化十三醇。将分生孢子旋转10秒种并在该表面活性剂中浸渍15分钟。
表8在HLB数为10的0.05%(W/V)乙氧基化十三醇溶液中浸渍分生孢子对重新活化储存之绿僵菌干燥分生孢子的影响处理 %发芽率 标准差干燥分生孢子,对照 20.6 2.7与Iconol TDA旋转10秒钟的干燥分生孢子 88.2 2.8与Iconol TDA旋转10秒钟并加上15分钟浸渍的干燥分生孢子 85.8 5.3与Iconol TDA旋转10秒钟并加上6小时浸渍的干燥分生孢子 84.7 3.5结果清楚地表明，当在适当的表面活性剂和亲水-亲脂物平衡(HLB)数为10的乙氧基化十三醇中浸渍绿僵菌时，发芽率分别从56%增加到77%，和从26%增加到74%。
实施例9以生物检测法确定储存之分生孢子的效力在生物检测法中试验储存的分生孢子控制蜡蛾，大蜡暝(Galle-ria mellonella)的效力。蜡蛾的末龄幼虫由Northern Bait，1520Knapp St.，P.O.Box 216，Chetek，Wisconsin 54728供给。
将蜡蛾末龄幼虫浸在于小烧杯中的预先搅拌的分生孢子悬浮液中并保持15秒钟。在茶叶滤网中一起处理10只一组的昆虫，并放在有用1ml蒸馏水润湿之蛭石的100mm塑料平皿中。分别于4天和11天后记录死亡率。所有昆虫均再放一周并记录外在分生孢子形成情况。
以生物检测法试验在三种不同环境条件下储存之分生孢子控制蜡蛾，大蜡暝(Galleria mellonella)幼虫的能力。三种储存条件是(1)25℃，90-100%R.H.和大气氧水平;(2)25℃，0%R.H.和0-5%氧;(3)37℃，0%R.H.和0-5%氧，储存时间为2个月。
图7中显示了有用这三组不同的分生孢子处理的绿僵菌外在分生孢子形成之幼虫的百分数，证明它们与新鲜分生孢子差不多或更好些。
表92个月后绿僵菌存活率与箔袋内气体组成和相对温度(R.H.)的关系封口时气体组成 储存两个月后的气体组成和存活率%O2%CO2%存活率25℃R.H. 0-10%+20% O220.9 0.0 0.0R.H. 0-10%+0% O20.4 0.0 56.1R.H. 35-40%+20% O220.2 0.5 20.1R.H. 35-40%+0% O20.4 0.0 15.2R.H. 90-100%+20% O219.3 1.2 95.0R.H. 90-100%+0% O20.5 0.0 37.137℃R.H. 0-10%+20% O220.5 0.0 0.0R.H. 0-10%+0% O20.4 0.0 26.4
R.H. 35-40%+20% O220.4 0.3 0.0R.H. 35-40%+0% O20.4 0.0 0.0R.H. 90-100%+20% O216.7 3.3 0.0R.H. 90-100%+0% O20.4 0.0 0.0总之，低R.H.包装为分生孢子提供了一个迅速脱水并确保进入休眠状态的环境。在低氧环境下储存的脱水的分生孢子在储存期间保持在休眠期，因此它们即使在升高的温度下仍能很好地存活。然而，因脱水而使之表面张力增加，而于储存后降低了发芽率。使用适当的表面活性剂可降低分生孢子的表面张力并有利于再水合而中断休眠。
在该优选实施方案中，包装是用不透气，不透水蒸汽而且可揉曲的袋材料如铝箔和包有铝箔的低密度聚乙烯制成的。包装可保证储存期间有恒定不变的氧和R.H.水平。在低氧和0-10%R.H.条件下，白僵菌的分生孢子可在25℃和37℃存活2个月。但于同样条件下(25℃和37℃，低氧和0-10%R.H.)储存的绿僵菌的发芽率分别只有56%和26%。但将这些分生孢子在表面活性剂如HLB为10的0.05%(W/V)乙氧基化十三醇中浸渍15分钟，可使发芽率分别显著地增加到77%和74%。
根据上面的详细描述对本发明包装昆虫致病性真菌的方法和材料所作的发动和改变，对于本领域技术人员来说将是显而易见的。这些改动和改变亦应包括于本发明待批权利要求范围内。
权利要求
1.长时期储存绿僵菌培养物的方法，包括在100%相对湿度条件下在不透气、不透水蒸汽的材料内密封真菌培养物。
2.根据权利要求1的方法，其中材料是柔韧的膜。
3.根据权利要求2的方法，其中材料选自低密度聚乙烯、高密度聚乙烯和聚丙烯，其中材料厚度在2到8密耳之间。
4.根据权利要求1的方法，其中材料是环绕含真菌培养物之营养培养基的热封袋。
5.根据权利要求1的方法，其中真菌培养物包含在昆虫的感染小室内。
6.根据权利要求1的方法，其中真菌是绿僵菌(Metarhiz-ium anisopliae)。
7.包装的绿僵菌属真菌培养物，包括在营养培养基上的活的真菌培养物和包裹真菌培养物的包装材料，其中材料是可透过O2和CO2但不透过水蒸汽的，且被包裹的真菌培养物的相对湿度为100%。
8.根据权利要求7的培养物，其中材料是柔韧的膜。
9.根据权利要求7的培养物，其中材料选自低密度聚乙烯、高密度聚乙烯和聚丙烯，且厚度在2至8密耳之间。
10.根据权利要求7的培养物，其中培养物被包含在对昆虫有吸引力的感染小室内，并设计成当昆虫进入小室时以致死剂量的真菌感染昆虫。
11.根据权利要求7的培养物，其中真菌是绿僵菌(Metarhizium anisopliae)。
12.在室温和较高温度下在包装中长时期稳定地储存真菌繁殖体的方法，其中包装具有小于5%的氧含量，小于10%的相对湿度，且包装材料是不能透过气体和水蒸汽的。
13.根据权利要求12的方法，其中在干燥剂和氧吸收剂的存在下包装繁殖体。
14.根据权利要求12的方法，其中在密封前应用真空或用氮气充溢包装来排尽氧。
15.根据权利要求12的方法，其中真菌繁殖体是绿僵菌属的。
16.在室温和较高温度下长时期稳定地储存真菌繁殖体的配制物，包括氧含量小于5%，相对湿度小于10%的包装，其中包装材料是不能透过气体和水蒸汽的。
17.根据权利要求16的配制物，其中在干燥剂和氧吸收剂存在下包装繁殖体。
18.根据权利要求16的配制物，其中真菌繁殖体是绿僵菌属的。
19.根据权利要求16的配制物，其中包装材料具有(ⅰ)低于0.005cc O 2 /100平方英寸/天的氧传输速率，和(ⅱ)低于0.005cc水蒸汽/100平方英寸/天的蒸汽传输速率。
20.在不影响其存活性的情况下改变真菌繁殖体之表面性质的方法，特征在于在分生孢子配制物中掺入表面活性剂，并在低相对湿度和氧的条件下包装分生孢子。
21.根据权利要求20的方法，其中表面活性剂选自亲水-亲脂物平衡数在8-14范围内的非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂及其组合。
22.根据权利要求21的方法，其中非离子表面活性剂选自嵌段聚合物、乙氧基化醇、乙氧基化烷基酚、乙氧基化胺和酰胺、乙氧基化酯肪酸、乙氧基化脂肪族酯和油、甘油酯、甘醇酯、多糖的聚合物、丙烯酸的聚合物、丙烯酰胺的聚合物、丙氧基化和乙氧基化脂肪酸、醇性苯酚、烷基苯酚、脱水山梨醇衍生物、以及蔗糖和葡萄糖酯及其衍生物。
23.根据权利要求21的方法，其中，阴离子表面活性剂选自磺基琥珀酸的盐、磺酸的盐、磷酸酯、酒石酸盐和其混合物。
24.根据权利要求21的方法，其中表面活性剂与真菌繁殖体以1∶1000至100∶1的比例混合。
25.根据权利要求21的方法，其中真菌繁殖体是由选自白僵菌和绿僵菌属的昆虫致病性真菌得到的。
26.在不影响其存活性的情况下改变真菌繁殖体之表面性质的方法，特征在于将含有表面活性剂的溶液与真菌繁殖体混合，以形成施用于待处理之区域的真菌繁殖体的悬浮液。
27.根据权利要求26的方法，其进一步包括将悬浮液施用于待处理的区域。
28.在不影响其存活性的情况下改变真菌繁殖体之表面的性质的方法，特征在于使干燥表面活性剂与真菌繁殖体混合，以形成适合施用于待处理区域或重新悬浮的干燥配制品。
29.根据权利要求28的方法，其进一步包括将干燥配制品施用于待处理的区域。
30.形成真菌繁殖体悬浮液的装置，其包括多个分隔空间，其中第一个分隔空间含有表面活性剂且第二个分隔空间含有真菌繁殖体，以及使分隔空间的内容物相混合以形成施用于待处理之区域的真菌繁殖体悬浮液的工具。
31.形成干燥真菌繁殖体配制品的装置，其包括多个分隔空间，其中第一个分隔空间含有干燥的表面活性剂且第二个分隔空间含有真菌繁殖体，以及使分隔空间的内容物相混合以形成干燥真菌繁殖体配制品的工具。
全文摘要
描述了包装绿僵菌属真菌培养物或分生孢子的方法。在一个实施方案中，在吸引昆虫的昆虫感染小室内提供真菌培养物，然后以致死剂量的真菌感染之，其中包装保持小室内有高的湿度，允许自由交换气体，并且不能透过包括真菌孢子、病毒和细菌在内的微生物。在第二个实施方案中，在低相对湿度和氧含量条件下包装真菌分生孢子。然后即可重新活化用于控制蟑螂、苍蝇、蚂蚁、软体昆虫、草场害虫和毛虫等昆虫的分生孢子。
文档编号C12N1/14GK1095758SQ9311679
公开日1994年11月30日 申请日期1993年8月23日 优先权日1993年5月27日
发明者金锡萱, K·E·格里格斯, C·A·约翰逊, P·佩里, D·W·米勒 申请人:艾克科技公司