专利名称：重组葡激酶的全dna序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组DNA序列，特别是涉及一种重组葡激酶的全DNA序列。
近年来国外如比利时、日本、德国等国家的研究人员在重组葡激酶的制备和医疗用途这方面作了大量研究工作，并进入临床试验研究阶段。如《核酸研究》(Nucleic Acids Research)1983年第22期11卷，题为《Nucleotide sequence of the staphylokinase gene from Staphylococcus aureus》报导了一种确定了葡激酶(Sak)的核苷酸序列，推论其多肽序列有163aa，信号肽有27aa，位于NH2·未端。
本发明的目的在于提供一种不含信号肽，且DNA的第33位碱基是A，第275位碱基是T的重组葡激酶的全DNA序列。
本发明重组葡激酶的全DNA序列是TCA AGI TCA TTC GAC AAA GGA AAASer Ser Ser Phe Asp Lys Gly LysTAT AAA AAA GGC GAT GAC GCG AGTTyr Lys Lys Gly Asp Asp Als SerTAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TATTyt Phe Glu Pro Thr Gly Pro TyrTTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTTLeu Met Val Asn Val Thr Gly ValGAT GGT AAA GGA AAT GAA TTG CTAAsp Gly Lys Gly Asn Glu Leu LeuTCC CCT CAT TAT GTC GAG TTT CCTSer Pro His Tyr Val Glu Phe Pro
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本发明重组葡激酶的全DNA序列组装表达载体，转化入宿主菌，在宿主菌内通过转录，翻译成重组葡激酶蛋白质。可用于治疗心肌梗塞、脑血栓、深度静脉血栓等血栓性疾病。
下面结合实施例详细说明本发明制备及测定。本发明重组葡激酶的全DNA序列的制备是1)金色葡萄球菌的筛选首先把金黄色葡萄球菌(S.aurens)接入50ml的LB培养基，37℃温度下培养8小时，然后划线在LB-琼脂1.5%的平板上，温度37℃下培养过夜。挑取单菌落扩增在5ml的LB培养液中，温度37℃下培养过夜，离心收集上清液。用发色底物法测定上清液中葡激酶(Sak)的活性，共获得Sak活性最高的两个单菌落作为所要筛选的金黄色葡萄球菌(S.aurens)的菌种，分别编号为S-1，S-29，其中S-29的纤溶活性更高，故为选择对象。
2)具有纤溶活性的金黄色葡萄球菌S-29染色体DNA的提取将金黄色葡萄球菌S-29以1100的比例接种在250ml的LB培养基中，于温度37℃，转速250转/分的条件下恒温振荡培养18小时，再加入DNAaseI和RNAase各250μg，室温反应30分钟，然后加入固体1.46gNacl，待溶解后置冰浴1小时，在温度4℃、转速11000转/分条件下离心10分钟，收集上清液。在上清液中加入25g聚乙二醇8000(PEG8000)，待溶解后再次冰浴1小时。然后在温度4℃、转速11000转/分条件下离心10分钟，收集沉淀。在沉淀中加入4ml的SM溶液(5.8gNacl、2gMgSO4·17H2O、50ml浓度1mmol/l、pH7.5的Tris-Hcl，2%的明胶5ml、加蒸馏水至1000ml)溶解沉淀得粗提液。在粗提液中加入等体积氯仿，混匀，温度4℃、转速3000转/分条件下离心15分钟，收集水相。再以2500转/分的转速离心2小时，收集沉淀。用100ml的SM溶液溶解沉淀，温度4℃下放置过夜。然后加入蛋白酶K(prote-inase k)至该蛋白酶K终浓度为50μ/μg，同时加入10%的SDS至其终浓度为0.5%，于温度56℃下反应小时，冷却至室温。分别用酚、酚-氯仿、氯仿各抽提一次。加入1/10体积浓度为3mol/l的醋酸钠(PH7.0)，再加入2.5倍体积的无水乙醇进行沉淀。最后用TE溶液(浓度为10mmol/l的Tris-hcl和浓度为1mmol/l的EDTA，PH8.0)溶解沉淀，得到噬菌体DNA，金葡菌噬菌体DNA图谱如
图1所示，于-20℃下保存备用。
3)重组葡激酶基因的扩增以噬菌体(S-phi-C DNA)为模板，通过引物1、引物2，采用PCR法扩增葡激酶基因，PCR反应液为双蒸水 33μlμ10×PCR缓冲液 5μldNTP(2.5mmol/l) 4μl引物1(100pmol) 1μl引物2(100pmol) 1μl噬菌体S-Phi-CDNA(0.22μg/μl) 5μl混匀，温度95℃下热变性5分钟，立即冰浴，加入1μl浓度为2.5u/ml的Taq聚合酶，50ml液体石蜡。
试剂盒PCR反应条件每一循环包括在温度92℃下反应52秒;在温度55℃下反应60秒;在温度72℃下反应70秒;共循环30次。最后在温度72℃下再反应15分钟。取5μl电泳检测，电泳检测(1%凝胶)PCR反应产物，出现400bp左右的DNA片断，SAK的PCR产物图谱如图2所示。
本发明葡激酶基因的克隆及其序列测定是将上述DNA片断用载体M13mp19分别用限制性内切酶EcoRⅠ和BamH1酶切，酶切后的两个片断再用连接酶T4DNA ligase连接，连接物涂板，挑出阳性克隆，命名为pDAGI，并进行序列测定。(测定试剂盒购自Promega DNA序列分析试剂盒，接试剂盒要示操作。测序由日本金沢医学院进行)。
测序仪器: DNA测序仪(A.L.F.DNA SegnncerTM)序列分析:
计算机软件 A.L.F.Manager V2.5 ExperinentalCOnditions电压 1500V电流 38mA功率 34W样品间隔 2秒时间 360分温度 40℃探头功率(激光强度) 3mW克隆所用载体 puc19(ECoRI-Sakgene-BamH1-Sakgene)克隆用引物 正向引物 Puc18 primer-40反向引物 puc18 Reverse primer测序结果如图3所示。
权利要求
1.一种重组葡激酶的全DNA序列，其序列为TCA AGT TCA TTC GAC AAA GGA AAASer Ser Ser Phe Asp Lys Gly LysTAT AAA AAA GGC GAT GAC GCG AGTTyr Lys Lys Gly Asp Asp Als SerTAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TATTyt Phe Glu Pro Thr Gly Pro TyrTTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTTLeu Met Val Asn Val Thr Gly ValGAT GGT AAA GGA AAT GAA TTG CTAAsp Gly Lys Gly Asn Glu Leu LeuTCC CCT CAT TAT GTC GAG TTT CCTSer Pro His Tyr Val Glu Phe ProATT AAA CCT GGG ACT ACA CTT ACAIle Lys Pro Gly Thr Thr Leu ThrAAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTCLys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr ValGAA TGG GCA TTA GAT GCG ACA GCAGlu Trp Ala Leu Asp Ala Thr AlaTAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAATyr Lys Glu Phe Arg Val Val GluTTA GAT CCA AGC GCA AAG ATC GAALeu Asp Pro Ser Ala Lys Ile GluGTC ACT TAT TTT GAT AAG AAT AAGVal Thr Tyr Phe Asp Lys Asn LysAAA AAA GAA GAA ACG AAG TCT TTCLys Lys Glu Glu Thr Lys Ser PheCCT ATA ACA GAA AAA GGT TTT GTTPro Ile Thr Glu Lys Gly Phe ValGTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATTVal Pro Asp Leu Ser Glu His IleAAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATTLys Asn Pro Gly Phe Asn Leu ILeACA AAG GTT GTT ATA GAA AAG AAAThr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys
全文摘要
本发明提供一种重组葡激酶的全DNA序列，不含信号肽，且DNA的第33位碱基是A，第275位碱基是T，该葡激酶DNA组装表达载体，转化入宿主菌，在宿主菌内通过转录，翻译成重组葡激酶蛋白质，用于治疗心肌梗塞、脑血栓、深度静脉血栓等血栓性疾病。
文档编号C12N15/52GK1109508SQ9511122
公开日1995年10月4日 申请日期1995年1月23日 优先权日1995年1月23日
发明者李伯刚 申请人:成都世新药物技术开发中心