薄膜中的化学、生化和生物学加工的制作方法

专利名称：薄膜中的化学、生化和生物学加工的制作方法
技术领域：
本申请涉及薄膜中的化学、生化或生物学加工。它依赖于使用诸如光陷捕捉器之类的装置，相对于薄膜移动粒子。
背景技术：
光陷捕捉器是一种装置，在此粒子可以在强聚焦光束(诸如激光束等)焦点附近陷获一个粒子。通过与光强度和较强强度方向中的点数成正比的轴向梯度力，将粒子保持在该捕捉器中。一般来说，大小为大约10μm至小于大约10nm的粒子可以进行单束光陷捕捉。
美国专利4,893,886和5,079,169(通过引用结合到本文中)描述了用来在液态细胞或薄膜中平移陷获粒子的光陷捕捉器。这可以通过在激光束中陷获粒子，然后相对于激光束平移细胞(’886专利的第3栏第31-34行)或相对于细胞平移激光束(’886专利的第4栏第18-20行，’169专利的第2栏第35-40行)来完成。’886专利描述了用光陷捕捉器来操纵诸如病毒、酵母、细菌大肠杆菌、血细胞和细胞部分之类的生物学粒子(第4栏第45-49行)。’169专利描述了使用光陷捕捉器来操纵包括核酸片断在内的“聚合物单丝”(第1栏第1-10行)。
Buican等，1989，SPIE血细胞计数的新技术，1063190-197；Tashiro等，1993，光学工程32(11)2812-2817(通过引用结合到本文中)中描述了采用多激光束的光陷捕捉器。
这类采用这种技术的光陷捕捉器系统的市售实例包括CellRobotics，Inc.(Albuquerque，New Mexico)的Laser TweezerTM2000、德国S+L GmbH(Heidelberg)的小型质子镊子(Compact Photoic Tweezer)和德国.P.A.L.M.GmbH(Wolfratshausen)的PALM激光显微镜系统。
发明概述在本发明的一个推荐实施方案中，光陷捕捉器用来将粒子平移通过光学平坦的表面上的薄膜涂层。该薄膜涂层最好是不均匀的，光陷捕捉器用来将粒子移动通过薄膜涂层连续的不同区域，在该薄膜涂层上进行化学、生化和/或生物学加工。按照本发明可以实现的化学、生化和/或生物加工包括寡核苷酸的合成和测序、多肽的合成和测序、糖类的合成和测序、组合文库的合成和筛选、常规(即Sanger或Maxam-Gilbert)DNA测序或单分子DNA测序。在本发明的一个实施方案中，当粒子移动通过薄膜涂层时，留下反应产物。最好，这些产物可以用适当的方法进行鉴别。
附图简述从以下本发明推荐实施方案的详细描述，会更容易地看出本发明的这些和其它目的、特征和优点，其中

图1为常规光陷捕捉器的示意图；图2A-2H为用于实施本发明的光陷捕捉器的说明性结构的示意图；图3A-3C为用于实施本发明的薄膜涂层和试剂位置的示意图；图4A-4E为本发明推荐实施方案的示意图；图5为用于实施本发明的推荐荧光系统的示意图。
本发明推荐实施方案的详细说明图1由’169专利复制，描述了用于实施本发明类型的常规光陷捕捉器10。捕捉器包括一个修正荧光显微镜12，后者包括一个含有液态细胞的、进行粒子操作的室14。该室固定于常规显微镜台16上，后者可以在与显微镜轴垂直的平面中沿两个直角方向移动以及沿光学轴移动。
由激光器22，通过一个高度会聚物镜48在室14中聚焦的激光束形成光陷捕捉器。作为说明，激光器为氩离子激光器、二极管激光器或NdYAC激光器。透镜48的数值孔径通常大于0.8，最好大于大约1.2或1.2以上。透镜48最好为浸液型，透镜48和室14覆盖物之间的油滴大约与透镜和覆盖物的折射率匹配，以便减小表面上的光损失。
室14中光陷捕捉器的位置可以通过沿X或Y方向移动平台24来移动。另一方法是，台16可以相对于光陷捕捉器移动。
图1的仪器还包括一个象亮化视频照相机60或其它电光成象装置、诸如氩激光器或汞灯之类的荧光光源62和可见光光源66。
‘169专利中提出涉及该光陷捕捉器的进一步的细节。’886专利的图1中说明了相似的这种捕捉器。
图2A-2H中提出了可以用于实施本发明的几种光陷捕捉器的几何学。图2A-2E中的每个图都描述了一个物镜130、一个光束132、一个基片134、一个液态薄膜136和陷获粒子138。在图2A和图2B中，光束132由物镜130通过基片134导向陷获粒子138的薄膜。在这些图中，匹配折射率的浸油140减少在其它情况下在物镜和空气之间的界面以及空气和基片之间的界面上产生的光损失。图2A描述了将薄膜涂在基片底面的情况，而图2B描述了将薄膜涂在基片顶面的情况。正如明显看出的，在图2A和图2B中，基片必须对光束透明。
在图2C和图2D中，光束由薄膜外表面入射到薄膜上。在这种情况下，不使用浸油，基片也无需对光束透明。然而，为了让使用光陷捕捉器(诸如’169专利和’886专利的光陷捕捉器)的观察者观测薄膜，基片应该对可见光透明。
图2E与图2A相似，但描述将薄膜加在两个基片134、144中间的情况。
也可以采用多束光陷捕捉器实施本发明。三个这类的几何学示于图2F、2G和2H中。这些图中的每个都描述了一个第一物镜150、一个第一光束152、一个基片154、一个液态薄膜156、一个陷获粒子158、一个第二物镜160和一个第二光束162。这些元件中的每个都与图2A-2E中的相应元件相似。图2F描述了将薄膜涂在基片底面的情况，而图2G描述将薄膜涂在基片顶面的情况。图2H描述了将薄膜加在两个基片154和164之间的情况。在物镜由薄膜起在基片另一面的情况下，可以可选地使用匹配折射率的浸油目标。
基片最好很薄(例如标准显微镜盖玻片的通常厚度范围130-250μm)并且是光学平坦的，以便允许使用高数值孔径的物镜，以形成光陷捕捉器。对于物镜由薄膜起在基片对面的情况，该基片必须在陷获波长(例如在1064nm的红外下)高度透明。对于荧光应用，基片应该或者在激发陷获粒子中荧光的光波长下、激发荧光的波长下、或者在这两个波长下是透明的。基片也应该或者在主体(例如色心)或者在表面(即荧光沾染物质)上无荧光背景。推荐的材料是例如显微镜盖玻片形式或变薄的HOYA T-4040石英晶片形式(Hoya Electronics Corporation，Woodcliff Lake，New Jersey)的石英玻璃或石英。
在实施本发明中，根据在薄膜中进行化学、生化或生物学反应的性质，表面涂层可以或者为含水液态膜，或者为有机液态膜。酶促反应通常在与酶相容的缓冲的含水薄膜中进行，而诸如寡核苷酸合成之类的有机合成反应在无水有机薄膜中进行。薄膜的厚度通常大约与粒子的直径相同，这通过光陷捕捉器来操作。该薄膜必须足够厚，以允许粒子沿位于固态基片之下的表面转移。液态膜可以加在两个基片之间，或可以作为表面薄膜涂在单一的基片上，产生薄膜的游离界面。在后一种情况下，涂薄膜的基片可以形成能够控制相对湿度或薄膜形成材料蒸汽压“潮湿室”的一面，以便防止薄膜不需要的蒸发和控制薄膜厚度。形成捕捉器的光束可以由薄膜的游离面表面或由基片面入射到薄膜上。
可以单独或组合利用几种不同的方法，以在基片上产生不均匀的液态表面薄膜。在一个实施例中，光学上平坦的基片用本领域众所周知的多种方法(包括旋涂、手术刀或简单的润湿)中的任何一种涂上薄膜。然后用微量移液管，或者手工或者自动将各种试剂加入预先涂上的薄膜中，在本领域中很好地建立了包括能够输送亚微升体积(诸如用于单细胞微注射的体积)的那些方法，或基于喷墨印刷技术的各种方法。或者，通过将细针头浸入试剂溶液中，然后将润湿溶液的针尖与薄膜接触，将试剂转移到薄膜上。根据沉积方法和试剂所需的特殊要求，试剂体积通常为显微镜下的大小，但可以覆盖大至1mm2或更大的面积。各种试剂可以包含在溶剂试剂溶液中，以减小它们在薄膜中展开。这类试剂包括粘度增加剂(诸如甘油或聚合物)或控制试剂在薄膜中溶混性或分配系数。不同的试剂例如作为小滴沉积在具有足够空间分离和/或暂时分离的薄膜中，以便在完成必须反应步骤所需的时间框期间防止不良的展开和/或试剂的混合。
关于这里所用的薄膜上含试剂的“小滴”，由于尽管可以达到给定试剂浓度的可选实施方案不是唯一的方法，但很明显小停留在薄膜上，因此该“小滴”应该相信可与“给定试剂浓度”互换。
按照本发明的一个方面，诸如图1的光陷捕捉器之类的光陷捕捉器用来陷获不均匀液态薄膜涂层的一个区域中的粒子，将粒子移过液态薄膜涂层的连续不同区域，在此进行化学、生化和/或生物加工。例如，参考液态薄膜涂层100的顶视3A，一系列小滴112、114、116、118可以沉积在薄膜涂层100中。每个小滴含有一个不同的化学试剂或生化试剂或不同的生物学试剂。使用光陷捕捉器，可以选择小滴112中的粒子，然后将其连续通过薄膜涂层100移至小滴114、小滴116和小滴18，如箭头120所示。在每个连续的小滴中，进行一些化学、生化或生物加工，以便在小滴118中产生所需产物。
在固态基片中可以形成诸如势阱102、104之类的不同特征，以便于试剂小滴的放置和分离，如图3B和3C的侧面图中所描述的。可以用各种方法，包括平版印刷和蚀刻、冲压或模塑或微机制，在基片中形成这类特征。这一预定型基片可以涂上上述薄膜，然后通过薄膜涂层、负载适当试剂的各种样品阱、微槽或微室或试剂室可以首先加样，然后应用薄膜涂层。试剂可以包括各种试剂，以增加它们的密度，使其高于薄膜涂层的试剂密度，使得试剂沉淀到基片中的凹处并转移薄膜。这与电泳凝胶的槽通常加样的方式相似。指示染料通常加入这类试剂中，以便更容易地目测加样过程。这类染料如果使用，必须明显与试剂和在试剂位置中发生的加工步骤相容。粒子可以用光陷捕捉器垂直移动，将它引入试剂池，然后垂直取出，通过薄膜水平运输到相邻的试剂位置。如果要通过诸如图3B的阱102或图3C的阱104之类的含有预定型特征的基片进行光陷捕捉，那些特征必须以这样的方式设计和形成，使得它们不干扰陷获束。例如要避免表面特征中突然的垂直变化。如果要从薄膜侧面进行光陷捕捉，那么这类约束是不大重要的，如图3C所述。
有效地产生不均匀液态薄膜和/或不均匀基片表面化学的另一方法包括分子的自我装配和纳化学(nanochemistry)(1992)，Abbot等，Science 2571539；(1991)，Whitesides等，Science 2541312(通过引用结合到本文中)。
在另一具体实施方案中，使用一个薄膜卷筒，它由一个上盖板和一个下盖板(例如由用于显微镜的高度平坦的玻璃或石英玻璃制成)组成，具有在两个板之间含有的体积分配到大量反应区的沉积线和结构(由电镀金或另一金属、或象旋涂光刻胶一样的聚合材料制成)。这些区域由用来限制任一区域的主体材料不扩散另一区域的到小槽相连。
本发明在许多常规化学、生物和生化操作中是有用的，提供一个简单的方法，以按比例将反应缩小到亚微升水平，而没有能够以该水平操作的管道系统的困难和复杂性。
例如，寡核苷酸合成用来合成用作杂交探针和DNA测序引物的短的单链DNA分子。目前的方法由于合成规模的限制，通常产生大量过量的产物。诸如直接的DNA测序之类的应用，目前受这类合成成本的限制。在本发明中，寡核苷酸合成可以在单一的市售珠粒粒子上进行，该珠粒与所需顺序的第一个核苷酸连接。连续核苷酸用标准磷酰胺化物化学的连接可以容易地在该薄膜版本进行。
具体地说，一系列的小滴沉积在薄膜上，一个小滴含有粘附所需顺序的第一个反应核苷酸的珠粒，而其它小滴每个含有大量相同反应性核苷酸，每个含有一种不同核苷酸。连接试剂、去封闭试剂、封端试剂或洗涤剂可以位于不同的小滴中。然后用光陷捕捉器从含有珠粒的小滴中选择一个珠粒。将陷获珠粒相对于薄膜移动，然后将陷获珠粒通过薄膜，移至一个小滴，后者含有下一个待连接到已粘附于珠粒的核苷酸上的核苷酸。该过程重复另外几次，总是按照所需装配核苷酸顺序的顺序，将陷获珠粒和粘附的核苷酸移至下一个小滴。
合成完成时，寡核苷酸可以从其珠粒上切下，直接连接到也在一个珠粒上进行的Sanger DNA测序法固相形式的薄膜型式中。然后将最终的测序反应产物释放到毛细管电泳系统(微制到相同的基片中)的样品室。这一方法也可以应用于编码的组合文库(Brenner & Lerner，ProcNatl.Acad.Sci.USA 895381-5383(1992)，通过引用结合到本文中)的寡核苷酸标记的测序中。
同样地，可以使用于多肽的Edmann测序化学适应直接由一个珠粒测序的编码格式。这类方法对于进一步减小多许多天然产生的蛋白质测序特别重要，对来自组合文库的多肽标记测序(Lam等，Nature 35482-84(1991)；Lam等，Bioorganic*Medicinal Chemistry Letters 3(3)419-424(1993)，通过引用结合到本文中)也是特别重要的。
多肽(Furka等，Int.J.Peptoids(Simon等，Proc Natl.Acad.Sci.USA899367-9371(1992)，Bartlett等，WO 91/19735)、大分子(Schrober等，BioTechniques 18(4)652-660(1995))和其它组合文库(例如Ellman，美国专利5,288,514；Bunin和Ellman，J.Am.Chem.Soc.114L 10997-1-998(1992))的合成也可以适应本发明的薄膜格式，所有文献通过引用结合到本文中。可以在固相支持体(通常为一个珠粒)上进行的任何化学合成或生化合成或测序反应都可以按比例缩小，以采用本发明在一个珠粒水平上进行操作。
在反应产物必须监测(例如测定结合常数)的那些情况下，Rigler的荧光相关分光镜法可以用来分析薄膜中的亚微升样品的含量(Eigen和Eigen和Rigler，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915740-5747，通过引用结合到本文中)。
本发明也可用于生物学操作中，该操作包括涉及从带动不需要的物质中分离所需物质的步骤。作为说明，这类生物学操作的实例是单克隆抗体的生产、噬菌体显示多肽文库的筛选和核酸的克隆。
对于单克隆抗体的生产，本发明可以容易地改造，以用来从产生不需要的单克隆抗体或不产生单克隆抗体的大量细胞背景中筛选产生所需单克隆抗体的单一细胞。单克隆抗体的产生涉及抗原的筛选，该抗原需要具有能够与该抗原特异性结合的单克隆抗体。这一抗原可能是一个蛋白质、核酸、多糖或需要具有特异性地结合该物质的单克隆抗体的任何其它物质。在方便面的一个特别实施方案中，该抗原连接到在光陷捕捉器中适用于陷获的一个粒子上。这一粒子可能是例如一个胶乳珠粒。
将本发明应用于单克隆抗体的生产时，第一小滴112含有一种或多种连接适当粒子的抗原。然后在光陷捕捉器中的光束中陷获其中一个这些连接粒子的抗原，将其通过薄膜110移至第二小滴114。第二小滴114含有多种产生单克隆抗体的细胞，其中一些细胞产生与该抗原特异性结合的单克隆抗体。这类单克隆抗体可以用本领域众所周知的方法产生。参见例如Kohler和Milsteinm Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 472(1983)；Cole等，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，第77-96页(Alan R.Liss，Inc.1985)。
在第二小滴114中选择条件，使得连接粒子的抗原与含有单克隆抗体(与连接到粒子的抗原特异性结合)的单克隆抗体产生细胞连接。然后用光陷捕捉器将连接粒子的抗原与结合的单克隆抗体产生细胞一起，通过薄膜110移至下一个小滴116，由此从不需要的细胞背景中分离所需的单克隆抗体产生细胞。然后从小滴116收集所需的单克隆抗体产生细胞，将其置于适当的培养条件下，以将细胞复制成产生所需单克隆抗体的细胞系。
以相似的方法，可以用本发明来筛选噬菌体显示多肽文库，以便从表达不需要多肽的大量噬菌体背景中选择显示所需多肽的一个噬菌体、需要用于获得与该配体结合的多肽一个配体兰到一个粒子上。以第一小滴112的形式将一种或多种连接粒子的配体加到薄膜110上。用光陷捕捉器陷获光束中的一个连接粒子的配体，将其通过薄膜110移至第二小滴14。第二小滴114含有一等份的噬菌体显示多肽文库。该文库可以由多种众所周知方法中的任一种制备。参见例如Smith，Science 2281315-1317(1985)；De la Cruz等，J.Biol.Chem.2634318-4322(1988)；Parmley和Smith，Gene 73305-318(1988)；Parmley和Smith，Adv.Exp.Med.Biol.251215-218(1989)；Scott就Smith，Science 249386-390(1990)。
如果该等份噬菌体显示多肽文库含有的一个显示出能够特异性与配体结合的多肽，那么该噬菌体将与连接粒子的配体结合，与连接粒子的配体一起被携带。然后用光陷捕捉器将连接粒子的配体通过薄膜110移至下一个小滴116。从小滴116中，可以回收所需的噬菌体并让其生长在适当的细菌宿主中，用于分析和/或所需多肽的分离。
本发明也可以用来从收集的核酸片断(诸如基因组文库或cDNA文库等)纯化所需的核酸片断。例如当制备基因组文库时，现有技术通常涉及以下步骤分离生物体总DNA，然后用适当的限制性内切酶切割该DNA。随后的步骤允许由不需要的DNA片断背景中识别和分离所需的DNA片断。这里所述的光陷捕捉器可以用来简化或消除这些随后的步骤。
关于常规操作，一个探针(特异性地与所需核酸片断结合的核酸片断)是必须的。将该探针连接到一个适用于在光陷捕捉器中陷获的粒子上。然后将一个或多个连接粒子的探针加到薄膜110的第一小滴112中。然后用光陷捕捉器在光束中选择其中一个连接粒子的探针，将该连接粒子的探针通过薄膜110移至第二小滴114中。第二小滴114含有一种降解生物体DNA的限制性内切酶。选择第二小滴114的条件，使得如果该探针能够特异性地结合生物体DNA任一片断，那么那么该探针与该片断结合，由此形成连接粒子的探针和所需DNA片断的复合物。然后用光陷捕捉器将该复合物通过薄膜110移至另一小滴116，在此，它可以按照所述方法进行收集和操作。
本发明的一个推荐应用是基于1次一个分子DNA测序。用一个光陷捕捉器，由含有大量这类珠粒和粘附链的薄膜涂层中的小滴选择一个这种珠粒和粘附的DNA分子。通过相对于薄膜涂层移动光陷捕捉器，然后将选择的珠粒通过薄膜移至含有加工性核酸外切酶的小滴，在此一个核酸外切酶结合到该DNA分子的游离端。然后光陷捕捉器将珠粒、DNA分子和核酸外切酶移至薄膜涂层的一部分上，在此核酸外切酶被激活。结果，核酸外切酶开始从DNA分子上，一次一个地切割一个核苷酸。然后光陷捕捉器将珠粒、分子和核酸外切酶拖过薄膜，同时核酸外切酶从DNA分子上切割一个核苷酸，将它们留在DNA分子移动限定的途径中。该DNA分子可以是单链或是双链。
然后适当的检测系统再跟踪DNA的途径，以检测和识别适当顺序中的核苷酸。这种系统的例证是一种脉冲激光器(它重复刺激单个核苷酸的荧光)和光学检测系统(它检测不同时间-分辩的与不同核苷酸有关的荧光光谱。
在图4A-4E中更详细地说明了该应用。为了说明，小滴210和212大小上进行了图示发达放大，其厚度通常与薄膜厚度相似。
对于或者激发单一核苷酸的荧光和/或检测单一核苷酸发射的荧光的那些单一核苷酸的识别方案，基片必须在分别用于天然核苷酸激发和/或检测的UV(240-300nm)下和/或接近UV(300-450nm)下是透明的。对于该方法使用一种或多种荧光核苷酸类似物和/染料标记的核苷酸的变化而言，该基片必须在相应的激发和发射波长区域是高度透明的。
为了将一个DNA分子平移穿过基片表面，必须在基片表面上提供最小厚度的含有薄膜。由于粘附到DNA的珠粒直径可以为0.2-1.0μm，可比较厚度的薄膜是适当的。液态膜可以简单至一个纯的适用于核酸外切酶的含水缓冲液，或可以包括与核酸外切酶相容的各种试剂，以增加薄膜的粘度(例如甘油)。该薄膜也可以在包括聚合物或预聚物，或者游离在溶液中，或者共价连接到基片上(Hjerten，J.Chromatography 347191-198(1985)，通过引用结合到本文中)。这类薄膜较高的粘度会降低适当的单一核苷酸的扩散(Pratt和Keller，J.Phys.chem 9710254-10255(1993)，通过引用结合到本文中)。为了防止单一核苷酸presentaion期间表面薄膜蒸发，可以将薄膜按图2E或2H夹在适当分离的两个基片之间。这可以防止将近场光学使用单一核苷酸的检测，但可以与远场光学相容。另一方法是，该薄膜可以具有一个游离表面，在此控制与薄膜接触的气相的相对湿度，以便防止蒸发和冷凝。这类具有游离表面的薄膜可以用本领域众所周知的方法(诸如旋涂)涂在基片上(Betzig和Chichester，Science 2621422-1425(1993)，通过引用结合到本文中)。
单一的大DNA分子用我的共同未决的美国专利08/376,761；Perkins等，Science 264819-822(1994a)，Science 264822-825(1994b)，Science 26883-87(1995)(通过引用结合到本文中)或中描述的各种方法本领域已知的方法，连接到珠粒上。
导入粘附到珠粒的DNA样品的最简单的方法是使用倒显微镜构型，其物镜用于透明基片下面的陷捕捉器，该薄膜在基片上表面上，如图2B所示。如图4A所示，含有连接到珠粒222的DNA220的微升或亚微升小滴210沉积到基片234上的薄膜上。从物镜230在光束232中目测选择一个用于陷获的珠粒+DNA分子238。如图4B所示，然后将该单一的珠粒+DNA分子平移出该小滴，对底物和物镜进行相对运动而通过薄膜。其它未选择的珠粒和DNA保持在该小滴位置上。相似的方法可以改变用于图3A-3H的其它几何学。
如图4B所示，将一个含有适当浓度核酸外切酶224的第二微升或亚微升小滴212立刻置于薄膜上，与含有珠粒和DNA的小滴210相邻。如图4C所示，将选择的单一珠粒+DNA复合物通过该第二小滴平移，让加工性核酸外切酶单一分子224与DNA的游离端结合。如图4D所示，然后将该珠粒+DNA+核酸外切酶复合物通过薄膜，平移穿过表面，在此进行核酸外切酶酶切。如图4E所示，当珠粒-DNA-核酸外切酶移过薄膜时，这产生留在薄膜236中的核苷酸270的顺序。
需要小滴的高度不大于薄膜的高度。例如，在移过实施方案中，小滴的该度等于波美度高度。
单一珠粒+DNA+核酸外切酶复合物可以按不搅乱单个切割的核苷酸痕迹的任何方式，通过薄膜移穿过基片表面。例如，该途径可以在圆片形状的基片表面上限定一个与留声机的沟槽图案相似同心螺旋或与我的’761申请的图13中描述的光栅扫描相似的往返图案。最简单的是，该复合物可以单向平移通过薄膜，限定一个简单的线性路径。关于含有聚合物的那些薄膜，单个DNA复合物reptate通过聚合物基质(即DNA分子的核酸外切酶结合端将严格按照DNA珠粒结合端的运动限定的路径)Perkins等，1994a supra。
需要最大限度地减小单个切割的核苷酸通过该表面的二维扩散，以便提供可能隔开切割的核苷酸的小室，而不搅乱核苷酸适当连续的顺序(Pratt和Keller，supra)。多种方法可以用来减小扩散。其中一个最简单的方法是增加上面概述的液态表面膜的粘度和通过调节核酸外切酶的转换数(即改变温度)和单个DNA分子平移通过该薄膜的速率，控制适当单个核苷酸的间隔。此外，可以在薄膜表面上，通过用光致搅乱聚合物、但不光致漂白适当的单个核苷酸的第二聚焦激光束，按照路径将聚合物膜到DNA后含有单个核苷酸的痕迹中。适当的选择聚合物，如果将搅乱时间调至足够长，以允许延伸的DNA通过第一个，可以用红外陷获束进行光致交联。也可以将基片表面化学改性，以便提供非常高的结合单磷酸核苷酸的能力，例如通过与带负电荷的磷酸根的静电作用(Matheja和Degens，“磷酸盐的结果分子生物学”，Forschritte Der Evolutionsforxchung，Band V，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1971，第180页，通过引用结合到本文中)。可以使用通常用来结合核苷酸单磷酸的阴离子交换剂。另一方法是，可以将特异性与不同核苷酸单磷酸结合的蛋白质或有机和无机络合剂(Kyogoku，Lord和Rich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 57250-257(1967)；Kyogoku，Lord和Rich，Nature 21869-72(1968)；Kim和Rich，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 60402-408(1968)；Terron和Moreno，Inorganica Chimica Acta 56L57-L59(1981)，这些通过引用结合到本文中)结合到基片表面，作为适当的单核苷酸的有效的陷获器。可以利用基片上自我装配的单层来提供这种核苷酸结合能力。这类自我装配单层的定向性质也将用来使结合的核苷酸定向，以便于探测。
通过将基片冷却至低温温度(大约77°K)，以便由陷获分离的单个核苷酸的薄膜形成一个刚性的嗪水性玻璃基质，进一步降低释放的单个核苷酸的扩散。在我的共同未决’761申请中发现进一步的相接。低温和高度内聚的基质还用来大大增强核苷酸荧光的光致稳定性和量子场，以便于它们随后的探测和鉴别。冷却薄膜的仪器包括与Grober等，Rev.Sci.Instrum.65626-631(1994)(通过引用结合到本文中)的仪器相似的设计或诸如CF2102型显微镜低温恒温器(Oxford Instruments，Concord，Massachustts)的市售仪器。在图4E中，用低温恒温器280将薄膜冷却至低温温度。
如果各个切割的核苷酸足够分离，那么正如我的共同未决’761申请中以及最近在Tellinghuisen等，Anal.Chem.66(1)64-72(1994)和Nie等，Science 2661018-1021(1994)(通过引用结合到本文中)详细描述的，用常规衍射限光学在该表面可探测到它们。如果可以将核苷固定化酸，以便防止搅乱它们甚至以较接近的间隔的适当连续顺序，那么可以使用近场扫描陷获显微镜。然而在后一种情况下，核苷酸必须定位在薄膜表面上，使得扫描探头尖端可以达到大约3倍探头孔径的直径内。这可能需要薄膜的某些部分或全部蒸发或升华。较大的距离应用远场光学条件。表面上使用近场光学的单分子荧光光谱学的最近实例包括Betzig和Chichester，supra；Ambrose等，Phys.Rev.Lett.72(1)160-163 (1994a)；Trautman等，Nature 36940-42(1994)；Xie和Dunn，Science 265361-364 (1994)；以及Ambrose等，Science 265364-367(1994b)(这些通过引用结合到本文中)。
在图4E中描述的荧光光谱学系统包括激光器系统300、探测器350和计算机400。在图5中提出该系统进一步的细节，该图取自我的’761申请的图9。简单地讲，该系统是一个时间分辨单质子计数系统，其中激光束305反复地激发每个核苷酸270产生荧光，而探测器350测定单荧光质子在每个激光脉冲后的到达时间的延迟。通过这一步对每个待探测核苷酸进行多次，可以累积单荧光质子事件的大量统计学样品，由此可以测定每个核苷酸的荧光半衰期。然后由计算机400将该半衰期的测量值与预先测定的已知核苷酸的半衰期进行比较，以定位最佳匹配，并由此识别该核苷酸。
激光束305由相干辐射源(最好为锁模激光器310)产生。在一个推荐实施方案中，激光器310包括一个氩离子抽运的锁模Ti蓝宝石激光器，将其输出增至三倍，以提供240-300nm波长范围内，以81.5MHz的锁模速率提供可调飞秒脉冲或微微秒脉冲。适当的氩锁模Ti蓝宝石激光器为分别由Spectra-Physics的市售2080-15型和3960型。适用于由Ti蓝宝石激光器产生第二谐波输出和第三谐波输出的装置为可得自INRAD(Northvale，New Jersey)的5-050型频率三倍频器。
在将荧光核苷酸类似物、染料标记核苷酸或坦然核苷酸、荧光核苷酸类似物和/或染料标记核苷酸的各种组合物加入待测序DNA的本发明的另一实施方案中，本领域技术人员会明显看出，激光激发源需要由supra所述分激发源进行修改以提供所用的各种类型核苷酸的最适激发波长。与天然核苷酸不同，荧光核苷酸类似物和染料标记核苷酸通常在UV附近或可见光范围内具有激发最大值。一般来说，这类波长比较深的UV更容易用可利用的激光技术产生。在最复杂的情况下，可能需要四个离散激光源来提供四个不同类型核苷酸的最适激发。
通过在探测器350中使用高速扫描摄影机，记录每个单独的核苷酸的全时间分辩发射光谱。这种布置提供荧光强度对时间和波长的3-D恒值线。在核苷酸270受激光束305辐照时，产生一个信号337，表示发动激光脉冲。作为说明，通过将射束分离器315插入激光束307的通路中，以便分离出辅助激光束307，产生信号337。激光束307入射到一个固定光电二极管320上，后者产生一个供给鉴频器322的输出信号。设定鉴频器322产生一个输出信号，表示仅仅当入射到光电二极管320的光电子数超过一定阈值时，由激光器310产生一个激发脉冲，由此消除假探测。
来自核苷酸的荧光发射330由高数值孔径的透镜345收集，进行空间滤波和分光滤光，指导通过光栅摄谱仪370或其它色散成分(诸如一个棱镜或一个单色仪)，聚焦到光阴极375上。棱镜370将入射的质子色散，沿x轴按照它们的波长使质子通路偏移。用这类方法排除核苷酸荧光发射带之外的波长。
信号337用来使激光器的锁模频率与正弦电压发生器380同步，以触发穿过正交电极对的高压扫描，其中一个电极对作为电极382A和382B示于图5中，而另一电极对在其直角位置。另一方法是，扫描频率使得在连续激光脉冲之间只进行一个扫描。但单个荧光质子入射光阴极375时，发射的单个质子-电子在streak tube内的高度真空中，由提取栅极377加速，并经历一个独特的电场，后者为单个质子在激光脉冲后发射时间的函数。结果，单个质子-电子在沿y轴与其发射时间成正比的点入射微通道板385。因此，入射到微通道板385上的光电子的空间坐标表示每个探测质子的延迟时间和波长。这些坐标由数字转换器数字化，并提供给计算机400。
只要核苷酸保持在激发区内，那么核苷酸通过重复的激发和发射循环。对于每个探测的荧光质子，探测时间转换为沿x轴的空间坐标，而波长转换为沿y轴的空间坐标。这些空间坐标由数字转换器390数字化，并提供给计算机400。结果，大量的探测发展出一个条带图，它记录辐射后在适当的时间间隔内和适当的波长下探测的质子数。四种核苷酸中的每种，其条带图具有其特征。
因此，为了鉴别每个核苷酸，将每个探测核苷酸产生的条带图与预先记录的参考条带图进行比较。为此，预先记录的参考条带图贮存在计算机400中，当产生一个探测核苷酸的每个条带图时，计算机400可以将其与贮存的条带图比较。
作为说明，摄谱仪370为Chromex 250i-FX，高速扫描摄影机为Hamamatsu Photonics of Bridgewater(New Jersey)供应的C1587型。数字转换器为CCD摄影机，而计算机为Macintosh Quadra 840 A/V。
在’761申请的图9的讨论中，提出了图5仪器进一步的细节(通过引用结合到本文中)。
正如将从上述说明中明显看出的，我的发明可以以多种方式实施。可以使用不同类型的光陷捕捉器，可以用不同方法产生光陷捕捉器和基片之间的相对运动，也可以按照多种不同的运动图案。是否基片运动而捕捉器保持不动或捕捉器运动和基片保持不动没有差别。尽管本发明以单个光陷捕捉器的角度进行描述，但可以用多位光陷捕捉器达到更大的通过量。
多位扫描激光捕捉器(Miswa等，Macromolecules 26282-286(1993)，通过引用结合到本文中)可以用来平行平移多个单分子络合物，以增加样品的通过量。这种陷由获计算机控制的单聚焦激光束以一定的速度和图案通过目的平面来形成。如果连续扫描之间的时间足够短，那么可以同时陷获几个粒子。如果每个连续的扫描图案稍微不同，那么这些粒子可以独立地运动。可以得到这类多位光陷捕捉器的上手型式(例如多束质子镊子III，S+L Heidelberg，Heidelberg，德国)。在这些多陷获构型中的相邻扩展的DNA分子必须足够分离，以便防止扩散搅乱来自两股线中的任一股的释放核苷酸。其它方法可以用来将粒子从一个小滴通过薄膜转移到另一小滴。例如，通过采用磁性粒子或具有由诸如铁等吸附于磁铁的材料制成的核心的粒子，可以用磁场代替光陷捕捉器将粒子通过薄膜移动。
在结合图4A-4E描述的本发明的实施方案中，提供一些操作参数，以供每个天然核苷酸的探测和鉴别之用。大家会认识到有许多可选择的实施方案由于各种原因(例如增加测序速率或简化仪器)，可能达到它们的理想条件。然而，可以实施图4A-4E实施方案的仍允许可行测序的多种变化。
一般来说，在有三类核苷酸可以用于图4A-4E实施方案的实施。天然核苷酸是推荐型式，它提供唯一的机会进行直接的基因组测序，并进一步消除可能的错误源，消除将非天然核苷酸加上合成测序模板所涉及的时间和费用。第二类核苷酸为荧光核苷酸类似物，而第三类涉及通过Jett等研究的接头(美国专利4,962,037)共价连接到核苷酸的荧光发色团。必须认识到，在后两种情况下，必须首先用能够掺入核苷酸类似物或染料标记核苷酸的适当的聚合酶合成待测序DNA的拷贝。此外，必须使用可以切割这类含核苷酸类似物或染料标记核苷酸的合成模板的核酸外切酶。
除只利用天然核苷酸、核苷酸类似物或染料标记核苷酸的方法外，还有四种采用这些核苷酸组合物的一般可能性天然核苷酸加核苷酸类似物、天然核苷酸加染料标记核苷酸、核苷酸类似物加染料标记核苷酸和天然核苷酸加核苷酸类似物加染料标记核苷酸。在这四类中的每一类中，所有可能的组合物都是可以的(例如3个天然加1个类似物，2个天然的加2个类似物，1个天然的加3个类似物等)。将各类核苷酸混合的能力克服了试图仅掺入染料标记核苷酸的技术人员遇到的许多困难(1992 Harding和Keller，Trends in Biotechnology 1055-57，通过引用结合到本文中)。
多通测序提供了其它可能性，其中通过将同一链测序多次，得出该顺序。在每个单独的通过中，通过改变仪器的操作参数和/或通过采用可探测核苷酸的不同组合物，获得关于异状或多种核苷酸的资料。通过组合来自这种多次通过的资料，获得最后的顺序。通过包括互补DNA链的顺序，进一步增强和扩展该方法。多通测序所需的精确的组合物取决于(a)该核苷酸是否可以由其它三种核苷酸中进行唯一性鉴别，(b)该核苷酸是否可以作为或者嘌呤或者嘧啶鉴别，(c)该核苷酸是否可以作为核苷酸探测，或(d)该核苷酸根部不能探测。本领域技术人员会明显看出，有这些条件的多种组合用于探测和鉴别，这允许用本发明进行测序。下面提供几个一般的实例用于说明，但它们不意味着限制可能组合的范围。
例如，如果可以鉴别每个核苷酸互补对中的一个，而它们的互补物(例如G和T)可以作为核苷酸探测，但不能鉴别，那么如下所述两个互补链的测序将提供足够的资料，以重建全顺序。这与这些核苷酸是否为天然的、类似物、染料标记的或它们的任何组合物无关。
5’-ACGTTCAG-3’3’-TGCAAGTC-5’5’-ACXXXCAX-3’3’-XXCAAXXC-5’在只有一个核苷酸可以鉴别而其它三种可以作为核苷酸探测时，将需要至少三个、最好是四个种单独的顺序进行组合，以重建最后的顺序。通过调整含核苷酸基质71的操作参数和/或探测站90的操作参数和/或通过将不同可鉴别核苷酸掺入用于每个单独通过的DNA模板的拷贝中，可以完成在每次单独的通过中鉴别不同核苷酸。
甚至当一种或多种核苷酸不能探测时，如果所用核酸外切酶的切割速率足够一致，那么可以进行测序。随着单个核苷酸的均匀产生，可以预测激发区100中下一个核苷酸的到达时间。因此，不能探测的核苷酸将作为顺序中的缺口出现。然后，或者如果与不能探测的核苷酸互补的核苷酸本身可探测并可鉴别，那么通过互补链的测序可以填上这类缺口，或者如果不能探测的核苷酸在随后的通过中，可以用supra所示的任何方法制成可探测和可鉴别的，可以填上这类缺口。
很明显，可以进行上文提出的本发明的多种修改和变化，而不违反方便面的精神和范围。上述具体实施方案仅仅通过实例给出，本发明仅仅受所附的权利要求书条款所限制。权利要求书中所用的术语“DNA”或“脱氧核糖核酸”除非另外陈述，应该作为集体解释，包括含天然核苷酸的DNA、含一种或多种修饰核苷酸(例如含有一个化学修饰或酶促修饰碱基、糖和/或磷酸的染料标记核苷酸)、含一种或多种核苷酸类似物的DNA和上述组合物。权利要求书中所用的术语“核苷酸”除非另外陈述，应该作为集体解释，包括天然核苷酸、核苷酸类似物、修饰核苷酸(例如含有一个化学修饰或酶促修饰碱基、糖和/或磷酸的染料标记核苷酸)、和上述的组合物。
权利要求
1.进行化学、生化或生物学反应的方法，包括以下步骤至少在含有不同化学、生化或生物学试剂的第一区和第二区提供一层液态膜，在第一区提供至少一个粒子，在第一区形成一个光陷捕捉器，陷获单个目的化学、生化或生物学粒子，使用光陷捕捉器将陷获粒子通过液态膜移至第二区，在此该粒子与第二区的试剂相互作用。
2.权利要求1的方法，其中将陷获粒子通过薄膜移至使用该粒子的位点。
3.权利要求1的方法，其中液态膜至少与光陷捕捉器中陷获的粒子一样厚。
4.权利要求1的方法，其中陷获粒子的大小小于大约10μm。
5.权利要求1的方法，其中陷获粒子为直径小于大约1μm的珠粒。
6.用于寡核苷酸合成的权利要求1的方法，其中第一区含有多个连接第一个反应性核苷酸的珠粒，在液态薄膜上提供多个附加区，每个区含有一种类型的反应性核苷酸、或偶联剂、或去封闭剂、或封端剂、或洗涤剂，而陷获粒子以所需的顺序，从一个附加区移至另一个附加区，以合成所需的寡核苷酸。
7.用于筛选的权利要求1的方法，其中来自第一区的粒子用来从第二区的多个不同分子中选择具有特殊特征的分子。
8.权利要求1的方法，其中至少一个区为一个小滴。
9.在一个表面上进行化学、生化或生物学反应的方法，包括以下步骤至少提供含有不同化学、生化或生物学试剂的第一离散区和第二离散区，提供一个与至少所述第一离散区和所述第二离散区互连的液态薄膜，在至少所述第一离散区中提供一个第一粒子，将第一粒子通过液态膜移至第二区，在此第一粒子与第二区的试剂相互作用。
10.权利要求9的方法，其中第一粒子从第二区移至使用第一粒子的液态薄膜区域。
11.权利要求9的方法，其中液态膜至少与第一粒子一样厚。
12.用于寡核苷酸合成的权利要求9的方法，其中第一区含有多个各自连接第一个反应性核苷酸的珠粒，提供多个由液态薄膜互连的附加区，每个区含有一种类型的核苷酸、或偶联剂、或封端剂、或去封闭剂、或洗涤剂，而陷获粒子以所需的顺序，从一个附加区移至另一个附加区，以合成所需的寡核苷酸。
13.用于筛选的权利要求9的方法，其中第一粒子用来从第二区的多个不同分子中选择具有特殊特征的分子。
14.权利要求9的方法，其中至少一个区为薄膜中的一个小滴。
15.形成单个核苷酸通路的方法，包括使单个DNA分子连接在其一端的单个珠粒，通过液态薄膜在固态基片表面上移动，而连接到DNA分子上的加工性核酸外切酶从DNA分子上连续切割单个核苷酸，其中固态基片的表面与单个核苷酸连接，由此在所述表面上以它们切割的连续顺序形成单个核苷酸的通路。
16.权利要求15的方法，其中用一个光陷捕捉器移动该珠粒。
17.权利要求15的方法，其中液态薄膜至少与该珠粒一样厚。
18.权利要求15的方法，其中该珠粒的大小小于大约10μm。
19.权利要求15的方法，其中该珠粒的直径小于大约1μm。
全文摘要
使用一个光陷捕捉器将一个粒子通过光学平坦的表面上的薄膜涂层平移。该薄膜涂层最好为不均匀的,该光陷捕捉器用来将粒子通过薄膜涂层连续的不同区平移,在此进行不同的化学、生化和/或生物学加工。可以按照本发明实现的化学、生化和/或生物学加工的实例包括:寡核苷酸的合成和测序、多肽的合成和测序、糖类的合成和测序、组合文库的合成和筛选、常规(即Sanger或Maxam－Gilbert)DNA测序或单分子DNA测序。在本发明的一个实施方案中,当粒子通过薄膜涂层移动时,留下反应产物。这些产物最好用适当的方法进行鉴别。
文档编号C12Q1/68GK1192745SQ96196054
公开日1998年9月9日 申请日期1996年6月4日 优先权日1995年6月5日
发明者K·M·厄尔默 申请人:西克有限公司