专利名称：表达动物细胞来源(2'－5')寡腺苷酸合成酶和核糖核酸酶l的抗病毒植物及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种采用重组DNA技术构建表达动物细胞来源(2′-5′)寡腺苷酸合成酶和动物细胞来源核糖核酸酶L的抗病毒植物的技术。更准确地说，本发明涉及一种构建对病毒有抗性的植物的方法，该方法包括将编码动物细胞来源的(2′-5′)寡腺苷酸合成酶和动物细胞来源的核糖核酸酶L的DNA顺序整合入该植物的一条或多条染色体，并表达这些DNA顺序；涉及用上述方法得到的一种抗病毒植物。
背景技术：
病毒是危害植物的主要原因之一。由于病毒病的破坏而使作物产区转移或使栽培品种复壮的情况并不少见。目前，没有直接作用于病毒的有效药物。所以，受病毒感染的植物要进行焚化。尽管抗病毒是育种的重要目标，但是在野生型或相关种中找不到抗性基因源时，不可能用常规育种技术例如杂交培育出抗病毒的栽培品种。
作为这类常规育种技术的补充方法，近来开发了一种采用重组DNA技术将抗病毒性授予植物的方法。重组DNA技术使转基因成为可能，超越了上述常规杂交的僵局。另外，该技术单独将一抗病毒基因导入现有栽培品种，可以极大地节省育种的时间。
作为采用重组DNA技术构建抗病毒植物的方法，已发表了表达编码病毒外壳蛋白或病毒复制蛋白的基因、一种反义基因、一种卫星RNA编码基因等等的方法(参见，例如，Arch.Virol.115，1，1990)。这些方法授予的只是对一种病毒或其相关病毒的抗性。授予对不同种类病毒抗性的方法仍在开发之中。
作为同时授予对许多病毒抗性的方法，已发表了采用双链RNA专一性核糖核酸酶的方法(国际专利说明书WO93/20686)和采用一种(2′-5′)寡腺苷酸合成酶的方法(Bio/Technology，11，1048，1993)。
关于采用(2′-5′)寡腺苷酸合成酶的方法，据报道得到的转化体植物的抗病毒性极弱(The Proceedings of XVIIIth Eucarpia Symposium，Section Ornamentals，1995)。简单地说，(2′-5′)寡腺苷酸合成酶被导入烟草植株(cv Samsun)，然后向得到的表达(2′-5′)寡腺苷酸合成酶的植株接种烟草花叶病毒(以下称为“TMV”)OM株。结果，与对照相比，没有发现病征发展的推迟。另外，有许多报道说明在植物细胞中没有发现类似核糖核酸酶L的分子存在(Biochem.Biophys.Res.Commun.，108.1243，1982；J.Biol.Chem.，259，3482，1984；The Proceedings ofXVIIIth Eucarpia Symposium，Section Ornamentals，1995)。
本发明说明书本发明人进行了广泛深入的研究，期望通过在植物中同时表达动物细胞来源(2′-5′)寡腺苷酸合成酶基因和动物细胞来源核糖核酸酶L基因，抗病毒性比仅表达(2′-5′)寡腺苷酸合成酶基因的抗病毒性显著增加。由此，完成了本发明。
本发明涉及一种构建对RNA病毒有抗性的植物的方法，该方法包括将编码动物细胞来源(2′-5′)寡腺苷酸合成酶(以下称为”2-5Aase″)的DNA顺序和动物细胞来源的核糖核酸酶L(以下称为”RNaseL″)的DNA顺序整合入该植物的一条或多条染色体，并表达这些DNA顺序；涉及用上述方法构建的一种抗病毒植物。
以下，将详细描述本发明。
(1)分别编码2-5Aase和RNaseL的DNA顺序现已知动物细胞中2-5Aase/RNaseL系统的存在部分地参于由干扰素诱导的抗病毒状态(Annu-Rev.Biochem.，51，251，1982)。2-5Aase蛋白是一种在识别双链RNA时被激活时、具有从其底物三磷酸腺苷(ATP)合成(2′-5′)寡腺苷酸(通常为三聚体或四聚体；以下称为“2-5A”)的酶活性的蛋白。编码2-5Aase的cDNA已从人(EMBO J.，4，2249，1985)、小鼠(J.Biol.Chem.266，15293，1991；Nuc.Acids.Res.，19，1919，1991)和大鼠(EMBL Acc.No.Z18877)克隆。此次，本发明人成功地从牛克隆了编码2-5Aase的cDNA。其它编码2-5Aase的DNA顺序也可以用于本发明，只要它们可以提供上述2-5Aase活性。也就是说，只要它们可以提供上述2-5Aase活性，从以上所列举的之外的动物物种克隆的编码2-5Aase的DNA顺序、甚至在其编码的氨基酸中有置换、缺失、添加或插入的上述DNA顺序也可以用于本发明。RNaseL蛋白是一种具有与2-5A结合活性并在与2-5A结合时表现RNA降解活性的蛋白。已从人克隆编码RNaseL的cDNA(Cell，72，753，1993)。本发明人此次也成功地从牛克隆了编码RNaseL的cDNA。其它编码RNaseL的DNA顺序也可以用于本发明。只要它们可以提供上述RNaseL活性，那么从上述之外的动物物种克隆的编码RNaseL的DNA顺序、甚至在编码的氨基酸中有置换、缺失、添加或插入的上述DNA顺序也可以用于本发明。
在下述实施例中，使用人或牛来源的cDNA克隆作为编码2-5Aase和RNaseL的DNA顺序。然而不用说，可以用于本发明的编码2-5Aase和RNaseL的DNA顺序不限于这些人或牛来源的2-5Aase和RNaseL。
一般来讲，当一DNA顺序编码一具有氨基酸顺序的多肽时，则存在许多与该单一氨基酸顺序对应的DNA顺序(简并异构体)，因为对应一个氨基酸存在多个遗传密码(密码子)。在本发明使用的编码2-5Aase和RNaseL的DNA顺序中，不用说任何密码子都可以使用，只要它不改变由该DNA顺序编码的多肽的氨基酸顺序。
(2)编码2-5Aase和RNaseL的DNA顺序的分别表达为在转基因植物中分别表达编码2-5Aase和RNaseL的DNA顺序，至少这些DNA顺序必须转录成RNA。现已知当将外源基因整合入植物染色体时，有一定可能性的是这些基因被整合到染色体的一个转录区(EMBO J.，6，3891，1987)。因此，可以将编码2-5Aase或RNaseL的一DNA顺序单独整合入植物染色体并在该植物中表达它。不过，最好是将这一DNA顺序与合适的启动子和终止子顺序连接后再行整合。
这种情况下，作为启动子，已知在植物细胞中起作用的任何启动子都可以使用。具体例子包括编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基基因的启动子、胭脂碱合成酶基因的启动子、使花椰菜花叶病毒35S-RNA产生的启动子(CaMV 35S启动子)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，2358，1986；Plant Cell Rep.，4，355，1985；Cell，30，763，1982；Nature，313，810，1985)等等。作为终止子，已知在植物细胞中起作用的任何终止子都可以使用。具体例子包括胭脂碱合成酶基因的终止子、章鱼碱合成酶基因的终止子(J.Mol.AppL Gen.，1，561，1982；EMBO J.，3，835，1984)等等。
(3)将编码2-5Aase和RNaseL的DNA顺序整合入植物关于编码2-5Aase或RNaseL的DNA顺序的引入，可以使用已发表和建立的各种方法。例如，使用根癌农杆菌的Ti质粒作为载体的方法，直接将DNA顺序引入植物切片或植物原生质体的方法，或诸如此类的方法都可以根据目的植物种使用(参见例如，“植物遗传转化和基因表达；实验手册”，Draper，J.et al，Blackwell Scientific Publications，1988)。对已转化的植物组织或细胞在适合该植物种的条件下进行组织培养，可以再生该转化植物。作为得到同时表达2-5Aase和RNaseL的转化植物的方法，可以考虑这个方法，它包括检查引入2-5Aase植物和引入RNaseL植物的每个目的基因的表达，并在表达2-5Aase和表达RNaseL的植物之间进行杂交。或者，将引入2-5Aase或RNaseL的转化植物用RNaseL基因或2-5Aase基因分别再次转化。也可用2-5Aase基因和RNaseL基因同时转化一植物。
附图简要说明
图1是显示植物转化载体的简图，载体分别包含一人源2-5AasecDNA或人源RNaseL cDNA。
NOSpro胭脂碱合成酶基因启动子NOSterm胭脂碱合成酶基因终止子CaMV35S花椰菜花叶病毒35S启动子NPTII新霉素抗性基因HYG潮霉素抗性基因2-5Aase2-5Aase cDNARNaseL(T)部分长度RNaseL cDNARNaseL(F)全长RNaseL cDNARB右边界LB左边界图2是一图表，显示引入2-5Aase的转化体烟草植株(cv Xanthi nc)叶中的2-5Aase活性。
对照非转化体2-5Aase#11b转化体2-5Aase#12a转化体2-5Aase#13b转化体图3是一图表，显示引入部分长度RNaseL的转化体烟草植株(cvXanthi nc)叶中的RNaseL活性。
对照非转化体RNaseL#H1转化体RNaseL#H2转化体RNaseL#H3转化体RNaseL#H4转化体脾脏小鼠脾脏粗提物图4是一图表，显示引入全长RNaseL的转化体烟草植株(cv Xanthinc)叶中的RNaseL活性对照非转化体RNaseL(F)#23a转化体RNaseL(F)#14a转化体RNaseL(F)#27a转化体RNaseL(F)#12b转化体RNaseL(F)#30b转化体脾脏小鼠脾脏粗提物图5是一图表，显示引入2-5Aase的烟草(2-5Aase#11b)单株与引入[2-5Aase+部分长度RNaseL]的烟草(2-5Aase#11b+RNaseL#H1，2-5Aase#11b+RNaseL#H4)植株在接种CMV(Y株)后，上部未接种叶子出现病征的比例(％)。
图6是一照片，显示检测接种了CMV(Y株)烟草叶内CMV外壳蛋白的电泳结果。
2-5Aase#11b引入2-5Aase的烟草2-5Aase#11b+RNaseL#H4引入[2-5Aase+部分长度RNaseL]的烟草图7是植物形态照片，显示接种CMV Y株和三天，引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草、引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草出现或不出现坏死斑点。
A. 2-5Aase#13bB. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23aC. RNaseL(F)#23aD. 2-5Aase#13bE. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#27aF. RNaseL(F)#27aG. 2-5Aase#13bH. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30b
I.RNaseL(F)#30b↑接种的叶子图8是植物形态照片，显示接种CMV Y株后十二天，引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草、引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草出现或不出现系统病症。
A. 2-5Aase#1 3bB. 2-5Aase#1 3b+RNaseL(F)#23 aC. RNaseL(F)#23aD. 2-5Aase#13bE. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#27aF. RNaseL(F)#27aG. 2-5Aase#13bH. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30bI. RNaseL(F)#30b图9是一照片，显示接种后五天不同转化体烟草植株出现坏死斑点的接种叶中检测无坏死斑点区的CMV电泳结果。
1. 2-5Aase#13b2. RNaseL(F)#23a3. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23a坏死斑点形成区4. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23a无坏死斑点区5. RNaseL(F)#30b6. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30b坏死斑点形成区7. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30b无坏死斑点区8. RNaseL(F)#27a9. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#27a坏死斑点形成区10. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#27a无坏死斑点区图10是一照片，显示接种后十二天，检测不同转化体烟草植株上部未接种叶内CMV的电泳结果。
1. 非转化体2. 2-5Aase#13b3. RNaseL(F)#23a4，5 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23a6 RNaseL(F)#27a7，8 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#27a9 RNaseL(F)#30b10，11 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30b图11一是植物形态照片，显示用感染CMV Y株的叶片粗提物接种后五天，引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草、引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草出现或不出现坏死斑点。
A.2-5Aase#13bB.2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23aC.RNaseL(F)#23aD.2-5Aase#13bE.2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30bF.RNaseL(F)#30b↑ 接种的叶图12是植物形态照片，显示用感染CMV Y株的叶片粗提物接种后十六天，引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草、引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草出现或不出现系统病症。
A. 2-5Aase#13bB. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23aC. RNaseL(F)#23aD. 2-5Aase#13bE. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30bF. RNaseL(F)#30b图13是植物形态照片，显示用感染PVY T株的叶片粗提物接种后五天，引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草、引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草出现或不出现坏死斑点。
A. 2-5Aase#13bB. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23aC. RNaseL(F)#23aD. 2-5Aase#13bE. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30bF. RNaseL(F)#30b↑ 接种的叶图14是植物形态照片，显示用感染PVY T株的叶片粗提物接种后十四天，引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草、引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草出现或不出现系统病症。
A. 2-5Aase#13bB. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23aC. RNaseL(F)#23aD. 2-5Aase#13bE. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#27aF. RNaseL(F)#27aG. 2-5Aase#13bH. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30bI. RNaseL(F)#30b图15展示照片，显示检测不同转化体烟草植株接种后五天上部未接种叶内(A)和接种后十天上部未接种叶内(B)的PVY T株的电泳结果。
1.非转化体2，3 2-5Aase#13b4，5 RNaseL(F)#23a6，7 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23a
8，9 RNaseL(F)#30b10，11 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30b图16是植物形态照片，显示用感染PVY O株的叶片粗提物接种后三天，引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草、引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草出现或不出现坏死斑点。
A. 2-5Aase#13bB. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23aC. RNaseL(F)#23aD. 2-5Aase#13bE. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#27aF. RNaseL(F)#27aG. 2-5Aase#13bH. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30bI. RNaseL(F)#30b↑ 接种的叶图17是植物形态照片，显示用感染PVY O株的叶片粗提物接种后十五天，引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草、引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草出现或不出现系统病症。
A. 2-5Aase#13bB. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23aC. RNaseL(F)#23aD. 2-5Aase#13bE. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#27aF. RNaseL(F)#27aG. 2-5Aase#13bH. 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30bI. RNaseL(F)#30b图18展示照片，显示检测不同转化体烟草植株接种后五天接种的叶内(A)和接种后六天上部未接种叶内(B)的PVY O株的电泳结果。
1. 非转化体2. 2-5Aase#13b3. RNaseL(F)#23a4，5 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23a6 RNaseL(F)#27a7，8 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#27a9. RNaseL(F)#30b10，11 2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30b图19显示一个牛2-5Aase cDNA碱基顺序和由此推断的氨基酸顺序。
图20显示一个牛RNaseL cDNA碱基顺序和由此推断的氨基酸顺序。
图21是一图表，显示引入2-5Aase的转化体烟草(cv Samsun)叶内的2-5Aase活性。
对照非转化体#13-4 引入2-5Aase的转化体#13-5 引入2-5Aase的转化体#13-7 引入2-5Aase的转化体#13-9 引入2-5Aase的转化体#13-10引入2-5Aase的转化体#13-11引入2-5Aase的转化体图22是一图表，显示引入RNaseL(F)的转化体烟草(cv Samsun)叶的RNaseL活性。
对照非转化体#57-4a引入RNaseL(F)的转化体#57-6b引入RNaseL(F)的转化体#57-11引入RNaseL(F)的转化体
#58-7引入RNaseL(F)的转化体#58-11引入RNaseL(F)的转化体#58-18引入RNaseL(F)的转化体图23是植物形态照片，显示用感染CMV Y株的叶片粗提物接种后三天，引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草、引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草出现或不出现坏死斑点。
A. 2-5Aase(S)#13-10B. 2-5Aase(S)#13-10+RNaseL(S)#57-6bC. RNaseL(S)#57-6b↑ 接种的叶图24是植物形态照片，显示用感染CMV Y株的叶片粗提物接种后十天，引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草、引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草出现或不出现系统病症。
A. 2-5Aase(S)#13-10B. 2-5Aase(S)#13-10+RNaseL(S)#57-6bC. RNaseL(S)#57-6b实施本发明的最佳方式下面，参考以下实施例对本发明进行更详细的说明，这些实施例不应理解为限制本发明。
在以下实施例中，用人源cDNA作为2-5Aase和RNaseL的DNA顺序，用CaMV 35S启动子作为在植物中表达上述基因的启动子。为表达2-5Aase cDNA，使用了pBI121载体(EMBO J.，6，3901，1987)，使用前其β-葡糖苷酸酶基因(β GUS)被2-5Aase cDNA取代。为表达RNaseL cDNA，使用了pBIB-HYG载体(得自Cologne大学遗传研究所的Detlef Becker博士)，使用前通过将CaMV 35S启动子连接在RNaseLcDNA 5′端上游得到的DNA顺序引入到该质粒中。
作为确认本发明效果的宿主植物，使用了烟草栽培品种(Xanthinc).使用农杆菌介导叶盘法或烟草原生质体电穿孔，从上述品系得到烟草转化体(“植物遗传转化和基因表达；实验手册”，Draper，J.et al，Blackwell Scientific Publicatiohs，1988)。
通过制备转化体叶粗提物并分别测定2-5Aase活性(J.Biol.Chem.，259，1363，1984)和RNaseL活性(Anal.Biochem.，144，450，1985)，检测转化体中是否有2-5Aase或RNaseL表达。
将表达2-5Aase活性的烟草植株与表达RNaseL活性的烟草植株杂交，得到表达2-5Aase cDNA和RNaseL cDNA两者的转化体烟草。仅表达2-5Aase的烟草植株和表达2-5Aase和RNaseL两者的烟草植株用黄瓜花叶病毒(CMV Y株)接种时，后者表现出的抗病毒性明显比前者高。(实施例1)构建用于制备转化体植物的质粒(图1)基于Proc.Natl.Sci.USA，80，4904，1983描述的人源2-5Aase的DNA顺序(SEQ ID NO1)，制备了用于cDNA克隆的探针(SEQ ID NO2)。用200单位/ml人β干扰素(Paesel Loreal GMBH & CO.，Frankfurt)处理HeLa细胞(得自东京大学药理学系生理化学部Enomoto助理教授)12小时，由此提取mRNA，由该mRNA用Pharmacia cDNA合成药盒制备cDNA，使该cDNA与λgt10载体连接，而制备用于cDNA克隆的文库。据报道有两种2-5Aase mRNA(1.6kb和1.8kb)。为在植物中表达，使用对应于1.6kb mRNA的cDNA。用2-5Aase cDNA(EcoRI片段)取代pBI121的βGUS，制备用于在植物中表达的pBI2-5Aase质粒。
在Cell，72，753，1993公开的DNA顺序(SEQ ID NO3)的基础上，制备探针(SEQ ID NO4)，用此探针筛选一人脾cDNA文库(Clontech)而得到人源RNaseL cDNA。从该人脾cDNA文库得到两个cDNA克隆部分长度克隆(缺C末端61个氨基酸残基)和全长克隆。在此两个RNaseL cDNA(HindIII-EcoRI片段)的N末端连接CaMV 35S启动子，然后得到的片段用pBIB-HYG载体的HindIII-SacI片段置换，得到用于在植物中表达的质粒。含有部分长度RNaseL的质粒和含有全长RNaseL的质粒分别命名为pBIBRNaseL(T)和pBIBRNaseL(F)。(实施例2)烟草植株的转化使用烟草(Nicotiana tabacum)cv Xanthi nc进行转化。图1所示的pBI2-5Aase和pBIBRNaseL(F)质粒分别用电穿孔法引入根癌农杆菌LBA4404株。用叶盘法以该农杆菌感染烟草叶切片，将该切片置于含有250μg/ml claforan、100μg/ml卡那霉素或20μg/ml潮霉素的MS-B5培养基[添加维生素B5的Murashige&Skoog基础培养基(Physiol.Plant.，15，473，1962)]上以筛选转化体。生苗时，将植株转移到无激素MS培养基诱导生根。在植物培育箱内体外无菌培养产生的转化体植株。盆栽后，进行自花传粉或杂交(2-5Aase+RNaseL)得到R1种子。
用电穿孔法向从烟草叶制备的原生质体引入pBIBRNaseL(T)质粒。将烟草(cv Xanthi nc)叶肉细胞于室温在酶溶液[1％纤维素酶Onozuka RS(Yakult)，1％Driselase(Kyowa Hakko Kogyo)，0.1％果胶酶(Seishin Pharmaceutical)，0.4M D-甘露醇(pH5.7)]中处理过夜制备原生质体。用冷0.4M D-甘露醇洗涤原生质体三次，将1×108原生质体悬浮在0.8ml含有大约10微克该DNA质粒的电穿孔缓冲液中(0.3M D-甘露醇，5mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸，pH5.8，70mM KCl)。然后将该悬浮液转移到电穿孔样品池(Bio-Rad，宽0.4cm)中，在电容为125μF下施以300V电压。经电穿孔的原生质体在含1％琼脂糖原生质球培养基(Murashige & Skoog培养基，含1％蔗糖、0.4M D-甘露醇、0.2μg/ml2，4-二氯苯氧基乙酸)中于28℃黑暗下培养一周。接着，用潮霉素(20μg/ml)筛选转化体。当得到的克隆生苗时，将这些克隆转移到无激素培养基以得到转化体植株。在植物培养箱内体外无菌培养产生的转化体植株。盆栽后，它们与引入2-5Aase的植株杂交得到F1种子。(实施例3)检测引入2-5Aase的转化体烟草的2-5Aase活性(图2)用Wells等的方法(J.Biol.Chem.，259，1363，1984)，分别从体外培养的烟草叶和干扰素处理的HeLa细胞制备粗提物。测量湿重后，在液氮中压碎叶子。然后，加入等体积的裂解缓冲液
，用Teflon Pestle匀浆器匀浆，于4℃15,000rpm离心两次，每次20分钟，得到上清液。将40μl polyIpolyC纤维素悬浮液加入由此得到的1ml叶粗提物(若是HeLa细胞提取物，用裂解缓冲液将提取物稀释十倍)，在4℃反应2小时。然后，将该反应液通过离心用洗涤缓冲液(20mM Hepes，pH7.0，10mM醋酸镁，5mM KCl)洗涤三次，悬浮于含0.2μl32P-rATP(10mCi/ml，3000Ci/mmol；NEN)的50μl反应混合物(20mM Hepes，pH7.0，20％甘油，7mM 2-巯基乙醇，2mM ATP，5mM KCl，10mM醋酸镁)中，于30℃反应过夜(16-20小时)。采用Wells等的方法(J.Biol.Chem.259，1363，1984)，用DEAE纤维素纯化反应液中产生的32P标记的寡腺苷酸。然后，用液闪计数器测量放射性。用Wells等的方法(J.Biol.Chem.，259.，1363，1984)制备polyIpolyC纤维素。用Bio-Rad蛋白测定试剂盒测定粗提物中的蛋白量。
引入2-5Aase的转化体表现的活性显著高于非转化体的活性。干扰素处理的HeLa细胞粗提物中，ATP的摄取量是219nmol/mg蛋白/4小时，显示其2-5Aase活性显著高于引入2-5Aase的烟草植株。(实施例4)检测引入RNaseL的转化体烟草的RNaseL活性(图3和图4)用Silvermen等的方法(J.Biol.Chem.，263，7336，1988)，分别从体外培养的烟草叶和小鼠脾脏分别制备粗提物。测量湿重后，在液氮中压碎叶子。然后，加入等体积的低渗缓冲液
，用PolytronTM匀浆，匀浆液于4℃15,000rpm离心两次，每次20分钟，收集上清液得到粗提物。基本按照实施例3制备polyIpolyC纤维素的所述方法制备2-5A(5′-三磷酸四聚体；Seikagaku Kogyo)纤维素和对照(ATP)纤维素。向1ml烟草叶提取物(若是引入全长RNaseL的烟草，则为0.5ml)或小鼠脾提取物(用低渗缓冲液稀释四倍)加入2.5μl 0.1MATP和7.5μl3MKCl，并与25μlATP纤维素悬浮液混合。该混合液在4℃反应1小时，然后离心收集上清液。将25μl 2-5Aase纤维素悬浮液加A该上清液，于4℃反应2小时。然后弃该上清液。反应后经离心沉淀的ATP纤维素和2-5Aase纤维素分别通过离心用A缓冲液(11.5mM Hepes，pH7.6，104 mM KCl，5.8mM醋酸镁，8.8mM 2-巯基乙醇，10μM PMSF，20μg/ml亮抑酶肽)洗涤三次，悬浮于50μl A缓冲液。按照Silverman的方法(Anal-Biochem.，144，450，1985)制备32P标记的polyC底物。将20μl上述悬浮液与20μl反应液(4μl 100μM 2-5A，2μl5x A缓冲液，0.25μl32P-polyUpCp，0.05μl 10μM冷polyC，13.7μl水)混合，于37℃反应过夜(16小时)。然后，加入50μl10mg/ml酵母RNA和1ml三氯乙酸(TCA)终止反应。将反应液置于冰上超过15分钟。然后，不溶于TCA的部分被截留在Whaman GF/C滤膜上，用液闪计数器测量其放射性。依赖于2-5A的RNase活性(即RNaseL活性)用ATP纤维素部分放射性减去2-5A纤维素部分放射性所得差值表示。用Bio-Rad蛋白测定试剂盒测定粗提物中的蛋白量。非转化体烟草表现的活性值小于0(0)，引入部分长度RNaseL的转化体表现正值(图3)。引入全长RNaseL的转化体表现的活性更加高于引入部分长度RNaseL的转化体的活性。(实施例5)黄瓜花叶病毒(CMV Y株)感染实验(图5和图6)将R1种子(引入2-5Aase的烟草和引入2-5Aase+RNaseL(T)的烟草)播种于含有800μg/ml卡那霉素或800μg/ml卡那霉素+100μg/ml潮霉素的MS琼脂培养基上，以分别筛选引入2-5Aase的植株和引入2-5Aase+RNaseL的植株。盆栽幼苗后，从其部分叶提取DNA(Nuc.Acids Res.，21，4153，1993)。然后，用PCR证实2-5Aase cDNA或RNaseLcDNA的存在。盆栽后约二周时，用3μg/ml的CMV Y株接种单株，并观察接种病毒后的病征发展。每种转化体使用5个单株。接种后上部未接种叶出现病征的植株的比例用百分比表示。证实有活性的引入部分长度RNaseL的烟草(见实施例3和图3)与引入2-5Aase的烟草杂交得到的引入2-5Aase+RNaseL(T)的烟草表现的抗病毒性显著强于仅引入2-5Aase的转化体烟草(图5)。接种后8天，从每种转化体烟草(2-5Aase#11b和2-5Aase#11b+RNaseL#H4)的5个单株上剪下其上部叶，用5倍体积SDS缓冲液(2％SDS，80mM Tris-HCl，pH6.8，2％2-巯基乙醇，10％甘油)从叶中提取总蛋白。将由此得到的每个样品用SDS电泳样品缓冲液稀释100倍，10μl等分试样用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)上，用抗CMV兔血清(约稀释2000倍)和蛋白A-碱性磷酸酶，通过颜色形成检测受感染植株叶中的CMV。在引入2-5Aase#11b的烟草上部未接种叶中，所有5个样品单株中都观察到有大量的CMV积累。另一方面，在引入2-5Aase#11b+RNaseL#H4的烟草中，5个单株中只有2个观察到有CMV积累(图6)。(实施例6)黄瓜花叶病毒(CMV Y株)感染实验将R1种子[一个引入2-5Aase的烟草品系(2-5Aase#13b)、三个引入RNaseL(F)的烟草品系(RNaseL(F)#23a，RNaseL(F)#27a，RNaseL(F)#30b]和F1种子[三个引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系(2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23a，2-5Aase#13b+RNaseL(F)#27a，2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30b)]播种于含有100μg/ml潮霉素的MS琼脂培养基上以筛选引入RNaseL(F)的烟草。幼苗盆栽后，从其部分叶提取DNA。然后，用PCR证实2-5Aase cDNA或RNaseL(F)cDNA的存在(见实施例5)。盆栽后约四周时，用15μg/ml的CMVY株接种植株。然后观察接种病毒后的进程和病征发展。每种转化体品系使用5个单株做此接种实验。结果接种后三天，在所有引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系的所有单株的接种叶上都观察到坏死斑点。另一方面，在引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草没有观察到坏死斑点(图7)。接种后12天，在所有引入2-5Aase的烟草品系和引入RNaseL(F)的烟草品系的所有单株的上部未接种叶都观察到病征，而在所有引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系的所有单株的上部未接种叶都没有观察到病征(图8)。按照实施例5所述的相同方法，从感染5天的每种转化体烟草出现坏死斑点的接种叶的无坏死斑点区提取总蛋白，并从接种后12天的每种转化体烟草的上部未接种叶提取总蛋白，以检测受感染植物叶内的CMV。结果，感染5天，在引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草的接种叶内有大量CMV积累，尽管在引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草的坏死斑点内检测到少量CMV，但其无坏死斑点形成区内检测不到CMV(图9)。同样，接种后12天，在引入2-5Aase和引入RNaseL(F)的烟草的上部未接种叶内有大量CMV积累，而在所有引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草的上部未接种叶内都检测不到CMV(图10)。从这些结果认为引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草在CMV接种叶上形成坏死斑点，受感染的细胞因坏死而伤亡，从而防止病毒扩散；因此，没有发展病征。(实施例7)使用受感染叶粗提物作接种物的黄瓜花叶病毒(CMV Y株)感染实验使用R1种子[一个引入2-5Aase的烟草品系(2-5Aase#13b)；二个引入RNaseL(F)的烟草品系(RNaseL(F)#23a，RNaseL(F)#30b)]和F1种子[二个引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系(2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23a，2-5Aase#1 3b+RNaseL(F)#30b)]，按照实施例5所述的相同方法培育植株。盆栽后约2周，用CMV Y株感染烟草植株，在十倍于叶重的提取缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，pH7.0，20mM 2-巯基乙醇)中磨碎有病征的烟草叶(cv Xanthi nc )，制备粗提物。盆栽后约2周，用该粗提物接种烟草植株，观察接种后的进程和病征发展。每种转化体品系使用2个单株做此接种实验。结果观察到与实施例6中用15μg/ml纯病毒感染类似的进程。简单地讲，接种后三天，在所有引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系的所有单株的接种叶上都观察到坏死斑点。另一方面，在引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草中没有观察到坏死斑点。接种后5天的接种叶示于图11。感染12天，在所有引入2-5Aase的烟草品系和引入RNaseL(F)的烟草品系的所有单株的上部未接种叶都观察到病征，而在所有引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系的所有单株的上部未接种叶都没有观察到病征。接种后16天的植株示于图12。这些结果证明引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草对CMV Y株的抵抗反应不因接种物的形式(即纯病毒或受感染叶粗提物)而变化。(实施例8)马铃薯Y病毒T株(PVY T株)感染实验使用R1种子[一个引入2-5Aase的烟草品系(2-5Aase#13b)；三个引入RNaseL(F)的烟草品系(RNaseL(F)#23a，RNaseL(F)#27a，RNaseL(F)#30b)]和F1种子[三个引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系(2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23a，2-5Aase#13b+RNaseL(F)#27a，2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30b)]，按照实施例6所述的相同方法培育植株。用PVY T株感染烟草植株，在十倍于叶重的提取缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，pH7.0，20mM 2-巯基乙醇)磨碎有病征的烟草叶(cvSamsun)制备粗提物。盆栽后约2周，用该粗提物接种烟草植株，观察接种后的进程和病征发展。每种转化体品系使用5-7个单株做此接种实验。结果就象用CMV Y株接种所观察到的，接种后三天，在所有引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系的所有单株的接种叶上都观察到坏死斑点。另一方面，在引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草中没有观察到坏死斑点。接种后5天的接种叶示于图13。接种后5天，在所有引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系的所有单株的上部未接种叶都开始出现坏死。坏死逐渐扩散，接种后20天植株几乎完全枯萎。接种后14天的植株示于图14。另一方面，引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草没有植株枯萎。这些烟草植株表现出PVY T株独具的病征。
按照实施例5所述的相同方法，从接种后5天和10天的每种转化体烟草的上部未接种叶提取总蛋白，以检测PVY T株的积累。结果，接种后5天和10天，在引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草的上部未接种叶内都检测到有PVY T株积累，而引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草检测不到PVY T株积累(图15)。从这些结果认为引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草在接种叶上形成坏死斑点，受感染的细胞因坏死而伤亡；另一方面，因某种未知原因，上部未接种叶发生RNaseL激活，导致系统性枯萎。然而，在接种后5天坏死刚发生时和接种后10天坏死进行时的上部未接种叶内都未检测到PVY T株积累的事实说明，系统性枯萎的直接原因不是PVYT株的过分积累。在农业实际中，尽早地除掉感染病毒的植株，以避免病毒向周围植株扩散(继发性感染)。引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草受PVY T株感染后枯萎而不经历病毒积累过程的事实说明，引入2-5Aase+RNaseL(F)的植株即使受PVY T株感染也不会成为继发性感染源，它将自然枯萎。因此，可以预见，实际种植这类植物时会减少工作量。(实施例9)马铃薯Y病毒O株(PVY O株)感染实验使用R1种子[一个引入2-5Aase的烟草品系(2-5Aase#13b)；三个引入RNaseL(F)的烟草品系(RNaseL(F)#23a，RNaseL(F)#27a，RNaseL(F)#30b)]和F1种子[三个引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系(2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23a，2-5Aase#13b+RNaseL(F)#27a，2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30b)]，按照实施例6所述的相同方法培育植株。用PVY O株感染烟草植株，在十倍于叶重的提取缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，pH7.0，20mM 2-巯基乙醇)磨碎有病征的烟草叶(cvSamsun)制备粗提物。盆栽后约2周，用该粗提物接种烟草植株，观察接种后的进程和病征发展。每种转化体品系使用5个单株做此接种实验。结果，观察到与用PVY T株接种几乎相同的结果。简单地讲，接种后三天，在所有引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系的所有单株的接种叶上都观察到坏死斑点。另一方面，在引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草中没有观察到坏死斑点(图16)。接种后5天，在所有引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系的所有单株的上部未接种叶都开始出现坏死。坏死逐渐扩散，接种后20天植株几乎完全枯萎。接种后15天的植株示于图17。另一方面，引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草没有观察到植株枯萎。这些烟草植株表现出PVY O株独具的病征。
按照实施例5所述的相同方法，从接种后5天每种转化体烟草的接种叶和接种后6天的每种转化体烟草的上部未接种叶提取总蛋白，以检测PVY O株的积累。结果，引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草接种后5天的接种叶和接种后6天的上部未接种叶内都检测到有PVY O株积累，而引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草中检测不到PVYO株积累(图18)。从这些结果发现，尽管引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草因PVYO株感染也在接种叶上形成坏死斑点，受感染的细胞因坏死而伤亡，但是该烟草枯萎而不经历病毒积累过程。因此，认为引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草受病毒感染后枯萎的特性不因PVY菌株而变化，而是针对PVY的。由于不仅针对PVY T株感染也针对PVY O株感染，可以预见种植引入2-5Aase+RNaseL(F)烟草时会减少工作量，我们认为这种烟草不会成为继发性感染源。(实施例10)缓冲液接种使用F1种子[三个引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系(2-5Aase#13b+RNaseL(F)#23a，2-5Aase#13b+RNaseL(F)#27a，2-5Aase#13b+RNaseL(F)#30b)]，按照实施例5所述的相同方法培育植株。盆栽后约2周，用提取缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，pH7.0，20mM2-巯基乙醇)接种植株，观察接种后的进程和病征发展。每种转化体品系使用2个单株做此接种实验。结果，甚至到接种后10天，接种叶和未接种叶都没有观察到变化。
这证明引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草上述在病毒感染后的系列反应是由病毒引起的，而不是缓冲液的某些成分或接种行为引起的。(实施例11)克隆牛源2-5Aase cDNA和牛源RNaseL cDNA及其碱基顺序测定按照Ishida等的方法(“基因表达实验手册”，第二章，Kodansha出版，1994)从牛脾来源的噬菌体λgt10cDNA文库(Clontech)提取噬菌体DNA，并用该DNA作为PCR的DNA模板。根据人2-5AasecDNA(EMBO J.，4，2249，1985)和人RNaseL cDNA(Cell，72，753，1993)的碱基顺序设计下列用于PCR克隆牛2-5Aase和RNaseL cDNA片段的引物。
牛2-5Aase剪贴英文本第22页4行，中文本第17页有关内容。
牛RNaseL根据Ishida等的方法进行PCR，将扩增的DNA片段亚克隆于pBluescript SKII+质粒(Stratagene)(“基因表达实验手册”，第二章，Kodansha出版，1994)。测定这些PCR扩增的DNA片段(2-5Aase455bp；RNaseL292bp)的碱基顺序。将这些碱基顺序分别与人2-5Aase和RNaseL的碱基顺序比较。结果确认了同源性[2-5Aase80％；RNaseL73％(计算时未包括引物顺序)]。因此，证实这些PCR扩增的DNA片段分别是牛源2-5Aase cDNA和牛源RNaseL cDNA的一部分。
用这些PCR扩增的DNA片段做探针，筛选牛脾来源的cDNA噬菌体文库，以分离分别编码全长2-5Aase cDNA和RNaseL cDNA的噬菌体克隆。从每个分离的噬菌体克隆提取DNA并作为cDNA插入亚克隆于pBlueseript SKII+质粒。使用Applied Biosystems的DNA顺序分析仪373A，采用荧光染料终止子法测定DNA顺序，并推断得到氨基酸顺序(图19牛2-5Aase cDNA；图20牛RNaseL cDNA)。结果发现牛2-5Aase与人2-5AaseE18(EMBO J.，4，2249，1985)和小鼠2-5AaseL3(Virology，179，228，1990)有同源性。
通过在植物中表达由此得到的牛2-5Aase cDNA和牛RNaseLcDNA，可以培育抗病毒植物。(实施例12)烟草栽培品种Samsun(Nicotiana tabacum cv Samsun)的转化用烟草栽培品种Samsun(N基因的基因型nn)进行转化。采用实施例2描述的方法(即使用引入pBI2-5Aase或pBIBRNaseL(F)的农杆菌LBA4404)构建转化体[2-5Aase(S)烟草和RNaseL(S)烟草]。将产生的转化体盆栽。随后，经自花传粉得到R1种子，经杂交得到F1种子[2-5Aase(S)+RNaseL(S)烟草]。(实施例13)检测引入2-5Aase的转化体烟草(Samsun)和引入RNaseL(F)的转化体烟草(Samsun)的2-5Aase活性和RNaseL活性按照实施例3描述的方法检测2-5Aase活性，按照实施例4描述的方法检测RNaseL的活性。结果示于图21和图22中。2-5Aase(S)烟草的2-5Aase活性和RNaseL(S)烟草的RNaseL活性都显著高于非转化体的活性。(实施例14)使用受病毒感染叶粗提物作接种物的黄瓜花叶病毒(CMVY株)感染Samsun转化体实验使用R1种子[引入2-5Aase的烟草(2-5Aase(S)#13-10)、引入RNaseL(F)的烟草(RNaseL(S)#57-6b)]和F1种子[引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草(2-5Aase(S)#13-10+RNaseL(S)#57-6b)]，按照实施例6所述的相同方法培育植株。盆栽后约2周，按照实施例7描述的方法用受CMV Y株感染的叶粗提物接种植株，观察接种后的进程和病征发展。每种转化体品系使用3个单株做此接种实验。结果观察到与实施例6和实施例7中用CMV Y株接种Xanthi(N基因的基因型NN)转化体类似的进程。简单地讲，接种后三天，在所有引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系的所有单株的接种叶上都观察到坏死斑点。另一方面，在引入2-5Aase的烟草和引入RNaseL(F)的烟草中没有观察到坏死斑点(图23)。接种后10天，在所有引入2-5Aase的烟草品系和引入RNaseL(F)的烟草品系的所有单株的上部未接种叶内都观察到病征，而在所有引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草品系的所有单株的上部未接种叶内都没有观察到病征(图24)。这些结果表明，引入2-5Aase+RNaseL(F)的烟草对CMV Y株的抵抗反应不因宿主烟草N基因的基因型而变化。
工业应用性当识别到细胞受病毒感染产生的双链RNA时，2-5Aase/RNaseL系统在细胞质表达核糖核酸酶活性，从而抑制病毒增殖。由于RNA病毒在复制阶段一般都形成双链RNA，该系统可以对所有的RNA病毒都有效。
因此，本发明通过重组DNA技术将2-5Aase和RNaseL引入植物以构建抗病毒植物的技术可以广泛应用于培育抗病毒植物品种。
顺序表SEQ ID NO1顺序长度1322顺序类型核酸链型双链拓扑学线形分子类型cDNA来源有机体人顺序描述GAGGCAGTTCTGTTGCCACTCTCTCTCCTGTCAATGATGGATCTCAGAAATACCCCAGCCAAATCTCTGGACAAGTTCATTGAAGACTATCTCTTGCCAGACACGTGTTTCCGCATGCAAATCGACCATGCCATTGACATCATCTGTGGGTTCCTGAAGGAAAGGTGCTTCCGAGGTAGCTCCTACCCTGTGTGTGTGTCCAAGGTGGTAAAGGGTGGCTCCTCAGGCAAGGGCACCACCCTCAGAGGCCGATCTGACGCTGACCTGGTTGTCTTCCTCAGTCCTCTCACCACTTTTCAGGATCAGTTAAATCGCCGGGGAGAGTTCATCCAGGAAATTAGGAGACAGCTGGAAGCCTGTCAAAGAGAGAGAGCACTTTCCGTGAAGTTTGAGGTCCAGGCTCCACGCTGGGGCAACCCCCGTGCGCTCAGCTTCGTACTGAGTTCGCTCCAGCTCGGGGAGGGGGTGGAGTTCGATGTGCTGCCTGCCTTTGATGCCCTGGGTCAGTTGACTGGCAGCTATAAACCTAACCCCCAAATCTATGTCAAGCTCATCGAGGAGTGCACCGACCTGCAGAAAGAGGGCGAGTTCTCCACCTGCTTCACAGAACTACAGAGAGACTTCCTGAAGCAGCGCCCCACCAAGCTCAAGAGCCTCATCCGCCTAGTCAAGCACTGGTACCAAAATTGTAAGAAGAAGCTTGGGAAGCTGCCACCTCAGTATGCCCTGGAGCTCCTGACGGTCTATGCTTGGGAGCGAGGGAGCATGAAAACACATTTCAACACAGCCCAAGGATTTCGGACGGTCTTGGAATTAGTCATAAACTACCAGCAACTCTGCATCTACTGGACAAAGTATTATGACTTTAAAAACCCCATTATTGAAAAGTACCTGAGAAGGCAGCTCACGAAACCCAGGCCTGTGATCCTGGACCCGGCGGACCCTACAGGAAACTTGGGTGGTGGAGACCCAAAGGGTTGGAGGCAGCTGGCACAAGAGGCTGAGGCCTGGCTGAATTACCCATGCTTTAAGAATTGGGATGGGTCCCCAGTGAGCTCCTGGATTCTGCTGGTGAGACCTCCTGCTTCCTCCCTGCCATTCATCCCTGCCCCTCTCCATGAAGCTTGAGACATATAGCTGGAGACCATTCTTTCCAAAGAACTTACCTCTTGCCAAAGGCCATTTATATTCATATAGTGACAGGCTGTGCTCCATATTTTACAGTCATTTTGGTCACAATCGAGGGTTTCTGGAATTTTCACATCCCTTGTCCAGAATTCATTCCCCTAAGAGTAATAATAAATAATCTCTAACACCAAAAASEQ ID NO2顺序长度50顺序类型核酸链型单链拓扑学线形分子类型其他核酸 合成DNA顺序描述TTATTGAAAA GTACCTGAGA AGGCAGCTCA CGAAACCCAG GCCTGTGATC50SEQ ID NO3顺序长度2378顺序类型核酸链型双链拓扑学线形分子类型cDNA来源有机体人顺序描述CTTTGATTAAGTGCTAGGAGATAAATTTGCATTTTCTCAAGGAAAAGGCTAAAAGTGGTAGCAGGTGGCATTTACCGTCATGGAGAGCAGGGATCATAACAACCCCCAGGAGGGACCCACGTCCTCCAGCGGTAGAAGGGCTGCAGTGGAAGACAATCACTTGCTGATTAAAGCTGTTCAAAACGAAGATGTTGACCTGGTCCAGCAATTGCTGGAAGGTGGAGCCAATGTTAATTTCCAGGAAGAGGAAGGGGGCTGGACACCTCTGCATAACGCAGTACAAATGAGCAGGGAGGACATTGTGGAACTTCTGCTTCGTCATGGTGCTGACCCTGTTCTGAGGAAGAAGAATGGGGCCACGCCTTTTATCCTCGCAGCGATTGCGGGGAGCGTGAAGCTGCTGAAACTTTTCCTTTCTAAAGGAGCAGATGTCAATGAGTGTGATTTTTATGGCTTCACAGCCTTCATGGAAGCCGCTGTGTATGGTAAGGTCAAAGCCCTAAAATTCCTTTATAAGAGAGGAGCAAATGTGAATTTGAGGCGAAAGACAAAGGAGGATCAAGAGCGGCTGAGGAAAGGAGGGGCCACAGCTCTCATGGACGCTGCTGAAAAAGGACACGTAGAGGTCTTGAAGATTCTCCTTGATGAGATGGGGGCAGATGTAAACGCCTGTGACAATATGGGCAGAAATGCCTTGATCCATGCTCTCCTGAGCTCTGACGATAGTGATGTGGAGGCTATTACGCATCTGCTGCTGGACCATGGGGCTGATGTCAATGTGAGGGGAGAAAGAGGGAAGACTCCCCTGATCCTGGCAGTGGAGAAGAAGCACTTGGGTTTGGTGCAGAGGCTTCTGGAGCAAGAGCACATAGAGATTAATGACACAGACAGTGATGGCAAAACAGCACTGCTGCTTGCTGTTGAACTCAAACTGAAGAAAATCGCCGAGTTGCTGTGCAAACGTGGAGCCAGTACAGATTGTGGGGATCTTGTTATGACAGCGAGGCGGAATTATGACCATTCCCTTGTGAAGGTTCTTCTCTCTCATGGAGCCAAAGAAGATTTTCACCCTCCTGCTGAAGACTGGAAGCCTCAGAGCTCACACTGGGGGGCAGCCCTGAAGGATCTCCACAGAATATACCGCCCTATGATTGGCAAACTCAAGTTCTTTATTGATGAAAAATACAAAATTGCTGATACTTCAGAAGGAGGCATCTACCTGGGGTTCTATGAGAAGCAAGAAGTAGCTGTGAAGACGTTCTGTGAGGGCAGCCCACGTGCACAGCGGGAAGTCTCTTGTCTGCAAAGCAGCCGAGAGAACAGTCACTTGGTGACATTCTATGGGAGTGAGAGCCACAGGGGCCACTTGTTTGTGTGTGTCACCCTCTGTGAGCAGACTCTGGAAGCGTGTTTGGATGTGCACAGAGGGGAAGATGTGGAAAATGAGGAAGATGAATTTGCCCGAAATGTCCTGTCATCTATATTTAAGGCTGTTCAAGAACTACACTTGTCCTGTGGATACACCCACCAGGATCTGCAACCACAAAACATCTTAATAGATTCTAAGAAAGCTGCTCACCTGGCAGATTTTGATAAGAGCATCAAGTGGGCTGGAGATCCACAGGAAGTCAAGAGAGATCTAGAGGACCTTGGACGGCTGGTCCTCTATGTGGTAAAGAAGGGAAGCATCTCATTTGAGGATCTGAAAGCTCAAAGTAATGAAGAGGTGGTTCAACTTTCTCCAGATGAGGAAACTAAGGACCTCATTCATCGTCTCTTCCATCCTGGGGAACATGTGAGGGACTGTCTGAGTGACCTGCTGGGTCATCCCTTCTTTTGGACTTGGGAGAGCCGCTATAGGACGCTTCGGAATGTGGGAAATGAATCCGACATCAAAACACGAAAATCTGAAAGTGAGATCCTCAGACTACTGCAACCTGGGCCTTCTGAACATTCCAAAAGTTTTGACAAGTGGACGACTAAGATTAATGAATGTGTTATGAAAAAAATGAATAAGTTTTATGAAAAAAGAGGCAATTTCTACCAGAACACTGTGGGTGATCTGCTAAAGTTCATCCGGAATTTGGGAGAACACATTGATGAAGAAAAGCATAAAAAGATGAAATTAAAAATTGGAGACCCTTCCCTGTATTTTCAGAAGACATTTCCAGATCTGGTGATCTATGTCTACACAAAACTACAGAACACAGAATATAGAAAGCATTTCCCCCAAACCCACAGTCCAAACAAACCTCAGTGTGATGGAGCTGGTGGGGCCAGTGGGTTGGCCAGCCCTGGGTGCTGATGGACTGATTTGCTGGAGTTCAGGGAACTACTTATTAGCTGTAGAGTCCTTGGCAAATCACAACATTCTGGGCSEQ ID NO4顺序长度51顺序类型核酸链型单链拓扑学线形分子类型其他核酸 合成DNA顺序描述AATGGGGCCA CGCTTTTTAT CCTCGCAGCG ATTGCGGGGA GCGTGAAGCT G51SEQ ID NO5顺序长度32顺序类型核酸链型单链拓扑学线形分子类型其他核酸 合成DNA顺序描述TCCAAGGTGG TAAAGGGTGG CTCCTCAGGC AASEQ ID NO6顺序长度32顺序类型核酸链型单链拓扑学线形分子类型其他核酸 合成DNA顺序描述CTCTTGAGCT TGGTGGGGCG CTGCTTCAGG AASEQ ID NO7顺序长度35顺序类型核酸链型单链拓扑学线形分子类型其他核酸 合成DNA顺序描述CTGGGGTTCT ATGAGAAGCA AGAAGTAGCT GTGAASEQ ID NO8顺序长度35顺序类型核酸链型单链拓扑学线形分子类型其他核酸 合成DNA顺序描述GACAAGTGTA GTTCTTGAAC AGCCTTAAAT ATAGASEQ ID NO9顺序长度1170顺序类型核酸链型双链拓扑学线形分子类型cDNA来源有机体牛顺序描述9 18 27 36 45 545′ATG GAA CTC AGA TAT ACC CCG GCC GGG TCT CTA GAC AAG TTC ATC CAA GTC CAC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---M E L R Y T P A G S L D K F I Q V H63 72 81 90 99 108CTC CTG CCA AAC GAA GAA TTC AGC ACG CAG GTC CAA GAA GCC ATC GAC ATC ATC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---L L P N E E F S T Q V Q E A I D I I117 126 135 144 153 162TGC ACT TTC CTG AAG GAA AAG TGT TTC CGA TGT GCC CCT CAC AGA GTT CGG GTG--- --- --- --- --- 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108910981107111611251134AGA CAG CAC TAT AGA CCC TCT CCA GGA ATC CAG TTC CAC GGA GGA GCC TCT CCC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---R Q H Y R P S P G I Q F H G G A S P1143115211611170CAG GTG GAA GAG AAC TGG ACA TGT ACC ATC CTC TGA 3′--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Q V E E N W T C T I L *SEQ ID NO10顺序长度2157顺序类型核酸链型双链拓扑学线形分子类型cDNA来源有机体牛顺序描述9 18 27 36 45 545′ATG GAG ACT GAG AGC CAT AAC AAC CCT CAG GAA AGA CCC ACA CCC TCT AGT AAT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---M E T E S H N N P Q E R P T P S S N63 72 81 90 99 108GGG AAG GCT TCA ATG GGA GAC AAT CAT TCG TTG ATT AAA GCT GTT AGA GAT GAA--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---G K A S M G D N H S L I K A V R D E117 126 135 144 153 162GAC ATT GAG TCG GTC CAG CAA TTG CTA GAA AGA GGG GCT GAT GTC AAT TTC CAG--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---D I E S V Q Q L L E R G A D V N F Q171 180 189 198 207 216GAA GAA TGG GGC TGG TCA CCT TTG CAT AAT GCA GTA CAA GTT GAC AGA GAG GAC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---E E W G W S P L H N A V Q V D R E D225 234 243 252 261 270ATT GTG GAA CTT CTG CTT AGT CAT GGT GCT GAG CCT TGT CTG CGG AAG AAG AAT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---I V E L L L S H G A E P C L R K K N279 288 297 306 315 324GGG GCC ACT CCC TTC ATC ATT GCT GGG ATT GTG GGA AAC GTG AAG TTG CTC AAA--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---G A T P F I I A G I V G N V K L L K
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权利要求
1.构建抗RNA病毒植物的方法，包括将编码一种动物细胞来源的(2′-5′)寡腺苷酸合成酶的DNA顺序和编码一种动物细胞来源的核糖核酸酶L的DNA顺序整合入所述植物的一条或多条染色体，并表达所述DNA顺序。
2.权利要求1的方法，其中编码动物细胞来源(2′-5′)寡腺苷酸合成酶的DNA顺序来源于人、小鼠、大鼠或牛中的任何一种。
3.权利要求2的方法，其中编码动物细胞来源(2′-5′)寡腺苷酸合成酶的DNA顺序是来源于人、小鼠、大鼠或牛中的任何一种的cDNA。
4.权利要求1的方法，其中编码动物细胞来源核糖核酸酶L的DNA顺序来源于人或牛。
5.权利要求4的方法，其中编码动物细胞来源核糖核酸酶L的DNA顺序是来源于人或牛的cDNA。
6.权利要求1的方法，其中编码动物细胞来源(2′-5′)寡腺苷酸合成酶的DNA顺序来源于人、小鼠、大鼠或牛中的任何一种，编码动物细胞来源核糖核酸酶L的DNA顺序来源于人或牛。
7.权利要求6的方法，其中编码动物细胞来源(2′-5′)寡腺苷酸合成酶的DNA顺序是来源于人、小鼠、大鼠或牛中的任何一种的cDNA，编码动物细胞来源核糖核酸酶L的DNA顺序是来源于人或牛的cDNA。
8.用权利要求1的方法构建的植物。
9.一种植物，其染色体上整合了编码动物细胞来源(2′-5′)寡腺苷酸合成酶的DNA顺序和编码动物细胞来源核糖核酸酶L的DNA顺序。
全文摘要
本发明涉及一种构建对RNA病毒有抗性的植物的方法,包括将编码一种动物细胞来源的(2′—5′)寡腺苷酸合成酶的DNA顺序和编码一种动物细胞来源的核糖核酸酶L的DNA顺序整合入该植物的一条或多条染色体,并表达该DNA顺序,以及涉及用上述方法构建的植物。本发明可以广泛应用于培育抗病毒植物品种。
文档编号C12N15/82GK1191464SQ9619582
公开日1998年8月26日 申请日期1996年5月31日 优先权日1995年5月31日
发明者小川俊也, 吉冈正阳, 石田功 申请人:麒麟麦酒株式会社