确定猪皮毛颜色基因型的方法

专利名称：：确定猪皮毛颜色基因型的方法
技术领域：
：本发明涉及筛选猪的核酸以确定猪的皮毛颜色的基因型的方法，并涉及用于实施这一方法的试剂盒。白色在欧洲商用猪种中，如LargeWhite及Landrace，是主导的皮毛颜色。然而，有许多种带颜色的商用重要猪种，表现多种颜色及其组合。与肉质细嫩有关的Duroc种是红色的；肌肉结实的、在屠宰之后生产出无脂肪躯体的Pietrain种是带斑点的；而多产的中国梅山种(ChineseMeishan)是黑色的。由于多种原因，皮毛颜色在猪的饲养业上很重要。首先，在许多市场上人们都偏爱白皮肉。这源于一个事实，就是猪肉常常是带皮销售的，而有色猪的皮甚至在经过去毛后仍能显示带色的毛根，这就导致顾客一个负面感觉，因为肉的表面可能看起来象是被泥弄脏了。这样，在这些市场上，就需要将皮从这种躯体上去掉从而增加了费用。例如，在美国，大约有1％的有色的屠宰后的猪的躯体由于皮毛的缺陷而需要去毛和去皮来去除着色。因此，有色的猪通常打折扣。其次，被认为对皮毛颜色外的特征具有遗传一致性的猪外表(即皮毛颜色的范围)的大差异能导致在生产猪的主顾意识中产生有关猪的一致性及质量的疑问。另外，猪饲养员愿意能够在繁殖的种群中确保一致性。这样，饲养员可能希望确保通过杂交繁殖的后代一直是白色。或者，一个Pietrain猪的饲养员可能希望确保杂交繁殖一直产出Pietrain毛色的特性。在过去，传统的动物繁殖技术被用于尝试从猪身上消除颜色(白色以外的)。决定动物是带颜色的还是带期望的白色的基因被称为I(抑制皮毛颜色)。此基因防止任何颜色表达的形式(I)支配那些允许颜色发展的形式(i)。传统的对白色动物的挑选减少了i的频数，但它仍存在于白色杂合动物的群体中。这些动物只有当它们通过与其他杂合动物交配生产出带颜色的后代时才能被确认出。只有通过一个检测交配程序才能确定杂合子，这样就能将这个隐性等位基因从给定的群体中消除掉。这样的一个工程将是耗费时间与金钱的，而且并不很有效。因此，将必然生产i/i型的动物。此外，情况由于另外一个称为IP(I-斑点)的I等位基因的存在而更加复杂。此IP等位基因对于I是隐性的，对于i是显性的。因此，带有IP/IP或IP/i基因型的动物将会在颜色上显示出斑点。应用一个从European野猪和一个巨大白种(SwedishYorkshire)杂交发展而来的参考家族，I基因在猪的遗传图谱上的位置已被确定。此基因位于猪的第8号染色体，紧邻决定白蛋白和血小板来源的生长因子(PDGFRA)的α-亚单位的基因(参见Johansson等，《基因组》(Genomics)14965-969(1992))。小鼠的遗传图谱包括一个位于小鼠第5号染色体的同源区。此区内包含许多具有决定小鼠皮毛颜色的基因，称为W(支配白色斑点)，Ph(斑点)和Rw(臀部白色)。小鼠的W基因已证明与KIT基因在一起，一些W上的突变基因型是由于KIT基因的结构改变(参见Chabot等，《自然》(Nature)33588-89(1988)，Geissler等《细胞》(Cell)55185-192(1988)和Nocka等《EMBO杂志》91805-1813(1990))。我们现在已经发现猪的KIT基因涉及决定皮毛颜色。更具体地，我们已经发现I或IP与i之间的区别在于I或IP的等位基因中的KIT基因至少一部分是重复的。这一重复性能导致出现KIT基因一个特殊区的两个或更多的拷贝。因此，这就允许我们开发用于区分等位基因I，IP和i的方法，并用于确定有关不同的猪的皮毛的基因型。因此，在第一方面，本发明提供了一种确定猪的皮毛颜色基因型的方法，包括(i)获得猪核酸的样品；及(ii)分析从(i)获得的核酸以确定是否存在全部或部分KIT基因的重复。KIT基因序列中重复的存在提示存在I或IP等位基因。我们知道，在一些猪的群体中，IP的发生率低或根本不存在。在这些群体中，确定重复的存在或不存在将足以对特定猪的基因型提供相当程度的证据。因此，通过简单地确定KIT基因的重复(不论是完全的还是部分的)存在或不存在，就能以相当高的把握确定特定猪的皮色基因型。然而，在另外的群体中则需要区分I和IP的存在。我们已经发现，虽然I和IP两者都有一个KIT基因中的重复，只有I而不是IP在重复的片段之一中显示一个缺失。基于这一点，就有可能区分这些等位基因。因此，这一方法可能进一步包括以下步骤(iii)确定这个重复是因为I或IP的存在造成的。合适地，这种确定方法是通过分析在至少一个重复的片段之中存在或不存在缺失来实施的。合适地，本发明的这种方法将在猪的基因组DNA上实现，虽然猪的RNA也可能用于分析确定KIT基因中的重复存在或不存在。可能有许多影响从此基因产生RNA的因素，这是由于此DNA序列部分的重复造成的。这些可能包括RNA产生的抑制，RNA合成水平的改变，RNA大小或加工过程动力学的改变或者遍及动物身体的RNA产物的分布状态的改变。也可能会由于此重复的上位效应对从其他基因产生RNA造成影响。优选地，此确定方法在实施的步骤(ii)中包括PCR技术的应用，利用一对合适的引物。PCR，或聚合酶链式反应，是被普遍应用的一种步骤，在此步骤中，利用热稳定的DNA聚合酶，一个限定的DNA分子片段可在体外进行扩增。选择两条位于要扩增的片段的侧面的已知序列并合成与这些区域相对应的引物寡核苷酸。如果这对引物在同一DNA片段上的位置足够近，位于它们之间的片段将被扩增。一个聚合酶链式反应由许多个扩增循环组成。每一个循环由一步变性开始，典型地在94℃，在这步中，模板DNA分子的两条链被分开。接着，温度降到一个能使合成的寡核苷酸引物退火到模板上的温度(典型地在50-60℃)。通过相对模板的引物的高浓度，此引物在模板-模板杂交形成之前退火到模板上。此退火温度是这样选择的退火只发生在模板中的互补的DNA片段，而不发生在其他不是完好地互补的片段。然后将温度提高到72℃，在此温度下，热稳定的DNA聚合酶能够延伸结合的引物，这样就生产出与模板互补的DNA链。在此反应的早期，每个循环产生出所提供的模板的两倍的扩增。由于每一条这些新合成的链也具有作为模板的功能，与限定片段相应的分子呈指数增加。然而，在此反应的后期(典型地25循环后)，由于反应成分(如引物)的消耗以及模板分子的浓度的增加导致在退火期模板-模板杂交的形成增加而使反应停止指数性增长。在这种反应中，产物的量与开始提供的模板的量直接相关，但仅仅是在指数增长期。正如这里所描述的，量的应用是很关键的，所用的循环的数量应保证反应保持在指数增长期内。PCR能按几种方法使用以确定KIT基因的重复是否存在。首先，所用的引物可这样选择可扩增在I或IP而不在i中重复的部分KIT基因。此PCR与第二种利用允许扩增一段对照序列的PCR进行对比，此对照序列是已知的存在于任何染色体的单拷贝。对比各自的PCR反应产物的比率就能够估测重复KIT片段的存在，如果有的话。很清楚，如果假设问题中的DNA片段在I或IP中存在2个拷贝并在等位基因i中只存在一个拷贝，那么KIT的产物与对照产物的比率将为基因型KIT/对照I/I2IP/I2IP/IP2I/i1.5IP/i1.5i/i1在实践中，所得到的比率可能会因为在两个扩增反应的反应动力学中出现的不同而与上面出现变化。用于上面描述的方法的合适的引物对包括GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCCKIT1—正向CCGCTTCTGCGTGATCFTCCTGKIT1—反向及GG(C/T)AATCACATGAATATTGTGAAKIT2—正向TCACCATAGCAACAATATTCTGTKIT2—反向及TC(A/G)TACATAGAAAGAGA(C/T)GTGACTCKIT—3正向CCTTT(A/G)ACCAC(A/G)TAATT(A/C)GAATCKIT—3反向及GTGATG(A/G)T(G/T)CT(C/G)ACCTACAAATAKIT—4正向GTCTATGTAAACATAATTGTTTCCKIT—4反向如上面所描述的，优选包含一种允许直接比较以确定扩增产物的比率的对照PCR反应。这可通过与所选的对照序列参照来达到，因为已知猪的染色体只载有一个此对照序列拷贝。因此，通过使用合适的用于那段对照序列的引物，PCR产物能够形成并被定量。与KIT基因PCR产物对比就能提供一个重复程度的直接数值。一个合适的对照序列的例子是肌肉钙释放通道基因(CRC)的一个外显子的一部分，并且一对合适的引物是CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGTCRC—正向AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTCCRC—反向另一个合适的对照序列的例子为猪干扰素-β基因的一部分(参见Artursson等，《干扰素研究杂志》(JournalofInterferonResearch)12153-160(1992))，并且一对合适的引物是GATGAACTTTGAGGTCCCTGAGGAG干扰素-β正向TTTCTTCTGAGAATGCCGAAGATCTG干扰素-β反向其他用于对照引物的合适的序列包括正常猪垂体糖蛋白激素β亚单位基因中的片段(Kato等，《分子内分泌学杂志》(JournalofMolecularEndocrinology)727-34(1991))，猪黄体生成素β亚单位基因(Ezashi等，《分子内分泌学杂志》5137-146(1990))或其他任何单拷贝的猪的基因。最优选地，用于KIT基因和对照序列的PCR同时在一个单一的猪DNA样品上进行。第二种确定是否有任何KIT基因(包括它的一部分)重复存在的方法依赖于一个事实，即在任何重复的片段边界将存在一个对I等位基因为唯一的核苷酸序列。因此，利用对这种边界核苷酸序列或接头特异的引物就可能确定此I等位基因出现的频数。第三种用于确定KIT基因结构的方法是利用一个与此重复存在或不存在紧密相关的连锁遗传多态现象。这样的一种多态现象可能出现在KIT基因本身或与KIT连锁的一段染色体片段中。通过利用一个单一的与此重复的存在/不存在完全相关的连锁标记或者显示部分相关性的几种标记的组合，能够开发一个高效试验。例如，SSCP(单链构象多态性)方法可能用于开发这种多态性。此方法的原理是，通过PCR方法产生的双链DNA被变性为单链DNA，然后用非变性的凝胶电泳分离此DNA。在非变性的条件下，由于链内的相互作用此单链的DNA形成一个二级结构，但此单链DNA的一部分将复性并形成双链DNA。这种方法可能揭示多态性的两种类型。首先，两个等位基因的核苷酸序列的不同可能会影响单链DNA的二级结构，这在电泳的时候可通过迁移率的不同而显现出来。其次，核苷酸序列的不同常常影响DNA异源双链(异源双链是由代表不同等位基因的两条单链分子形成的)的迁移率。第四种确定与此重复片段的拷贝数相关的KIT基因结构的方法包括应用脉冲电场凝胶电泳。脉冲电场凝胶电泳是一种能够分析大DNA片段的大小的一种技术。在此申请中，利用一种在特异位点将基因组DNA切开的限制性内切酶，此特异性位点位于已发现的与带有KIT基因的I等位基因的动物的DNA重复片段的侧翼。用这种酶切割后的基因组DNA须经脉冲电场电泳，然后转移到DNA结合性膜上。然后能利用一个与重复片段特异的探针来确定在凝胶上最初的位置以及通过与合适的DNA大小标准比较来确定此片段的大小。如果从一个动物获得的DNA含有一个部分KIT基因的重复，那么这段特异的片段将在大小上增加。杂合的动物将被发现显示出两条不同大小的特异性带，小的这一条代表非重复的等位基因i，大的这一条代表重复的等位基因I或IP。这一技术还可通过在大小上以此重复的单位长度进一步增加的片段的存在显示含有此重复片段两个以上拷贝的等位基因。第二方面，本发明提供了一种确定猪的皮毛颜色的基因型的方法，包括(i)获得猪基因组DNA的样品；(ii)将从(i)获得的基因组DNA与一个或多个适当引物杂交；(iii)利用从(ii)获得的杂交的核酸进行一个或多个PCR循环；及(iv)确定PCR反应产物的量。此方面的这一方法可能还包括下面一步(v)确定任何重复的存在是由于I或者是IP的存在造成的。合适地，这种确定是通过分析在至少一个此重复的片段中的一个缺失的存在或不存在来实现的。遗传标记和与一种特殊性状有关的基因之间的联系能被遗传重组打乱。因此，问题中的标记与基因之间的距离越近，重组将分开它们的可能性就越小。还有可能建立选择的DNA标记的特异性等位基因与已知的与一个特定的已经在以前显示与某个特定性状相关的基因(如这里探讨的KIT基因)相联系的DNA标记的等位基因之间的联系。因此，在目前的情形下，就KIT基因而言，这很有可能，至少在短期内，通过不同的8号染色体标记的特异性等位基因的选择来选择一个KIT基因相关标记的某些等位基因，间接地筛选具有特定皮毛颜色的猪。这种已知的与猪的8号染色体上的KIT基因相连的标记的例子包括KIT基因本身或紧密相连的血小板来源的生长因子(PDGFRA)的α-亚单位基因及白蛋白基因的遗传多态性。与KIT基因相关的特殊的遗传标记是微随体。这些只是4个、3个或更常见的是2个核苷酸的简单序列的重复，在染色体组周围基本随机地约每50,000个碱基对(每个单倍体染色体组大约有60,000个微随体)出现(一次)。在复制期间DNA聚合酶的重复考贝及重组期间的非等位交换被认为是造成丢失或获得重复单位的原因。这意味着随体通常是多态性的而且能有几个重复长度的等位基因。连锁的随体序列的例子包括S0086(Ellegren等，《基因组》(Genomics)，16431-439(1993))，S0017(Coppieters等，《动物遗传学》(AnimalGenetics)24163-170(1993))，Sw527，Swr750和SW916(Rhorer等，《遗传学》(Genetics)，136231-245(1994))。这就有可能利用上述的任意一个标记或实际上在猪第8号染色体上的其他连锁标记间接地选择与皮毛颜色连锁的KIT基因的等位基因。如这里所讨论的，本发明依靠KIT基因DNA序列拷贝数的确定。为此可以应用一个代表重复的KIT片段或其部分的核苷酸探针，或者实际上其他任何显示出对这样的猪探针有足够的相似性的核苷酸探针。例如，下面的方法能够用来完成这样的确定(i)利用从例如小鼠(Gokkel等，《肿瘤基因》(Oncogene)7，1423-1429(1992))和/或人(Giebel等，《肿瘤基因》7，2207-2217(1992))来源于至少是KIT基因DNA核苷酸序列一部分的核苷酸探针，及从其来源的RNA。由于其保守性，这种探针将与猪的这种基因杂交。(ii)如果已知一种动物的KIT蛋白的氨基酸序列，就能推断编译这种蛋白质或其一部分的可能的DNA核苷酸序列。基于这一点，混合的寡核苷酸制剂能用作猪KIT基因的探针。(iii)能够按照此蛋白质序列(及相应的核苷酸序列)设计探针，此探针用与全部或部分的KIT基因的有功能同源性的蛋白质，例如v-KIT(Besmer等，《自然》(Nature)320415-421(1986))。所有来源于如上所描述的探针可能用于探查动物来源的核酸制剂，这些核酸制剂通过DNA印迹法(Southernblotting)、RNA印迹法(Northernblotting)或斑点印迹法(Dotblotting)转移到合适的用于杂交的基质上，如尼龙膜(如HybondNAmershamInternational)。与结合于基质上的核酸发生杂交的KIT与对照探针的数量的比率能够用于确定KIT的拷贝数。结合的探针能通过对探针用放射性同位素进行标记来定量。另外，现在也可得到并能利用非同位素标记核酸的试剂盒。包括将动物来源的核酸与基质杂交在内的这一过程的相反的步骤也是可能的。在此过程中，将探针结合于基质上并通过杂交过程来捕获如前所描述的这种方法标记的基因组DNA或RNA，这样就可对所结合的总和进行定量。如果条件正确，所结合的总和与存在的KIT及对照核酸序列的总数(或拷贝数)相关。其他用于定量PCR扩增的DNA的方法包括基于放射标记的方法。一个例子是对寡核苷酸引物的一条或两条进行放射标记，然后通过DNA凝胶放射自显影的光密度测定来对PCR产物的放射活性进行定量。一个可选择的步骤是用不同的同位素对用于PCR两个产物的寡核苷酸进行差别标记，这样在通过沉淀、过滤、差速离心或其他步骤去除未被利用的标记寡核苷酸后，允许对每个不同产物进行定量。PCR产物还能通过利用其他染色的步骤(利用如溴化乙锭或SYBR绿(MolecularProbes，Inc))进行定量，这是利用与光密度测定法或荧光测定法组合进行的。另一种对差别PCR产物进行定量的方法是利用TaqManTM系统(PerkinElmer公司)，差别PCR是如本专利中所描述的那样两个PCR反应在同一个试管中进行，产生两个不同的产物。在这个系统中，除了位于要扩增的片段的侧翼的两个寡核苷酸引物外，还利用了结合扩增片段的第三个寡核苷酸探针。侧翼的引物不标记而探针带有两个荧光标记。在探针的3′末端是一个指示染料，它的荧光被连接于探针5′末端的一个不同的荧光团抑制。在PCR反应过程中，此探针与产物DNA分子结合。随着PCR反应的继续进行，这些产物被用作模板，在此期间，TaqDNA聚合酶将探针5′端的抑制染料切掉并取代它。这一对抑制试剂的去除允许指示染料发出的荧光被检测。荧光的强度与PCR产物的量成比例，并因此是它的量度。一个反应可包括两组单独的PCR引物和两个探针，每一组相应于一个不同的基因组DNA片段。在此方法中，只要遵循定量PCR的标准，每个模板片段的相对量就能被检测。蛋白质核酸也许能够用于任何上述的杂交过程中(PerSeptiveBiosystems公司Cambridge，MA)在第三个方面，本发明提供了一种确定猪的皮毛颜色的基因型的方法，包括(i)获得猪KIT蛋白的样品；及(ii)分析从(i)获得的蛋白以确定是否存在KIT基因全部或部分的重复。通过蛋白质印迹法或ELISA法，利用针对KIT或相关蛋白质抗原决定簇的抗体可以确定存在于动物中的c-KIT蛋白的水平或存在形式。还可以培育针对不同DNA结构的抗体，这些结构包括KIT基因的各种等位基因及通过ELISA技术确定的基因型。第四个方面，本发明提供了一个用于确定猪的皮毛颜色基因型的试剂盒，包括一种或多种能够指示在猪的基因组DNA中存在全部或部分KIT基因序列重复的试剂。还可从上面的涉及I与IP之间的不同的讨论中了解到，这种不同也能被用以区分基因型。由于缺失似仅仅存在于I的重复片段之一(当I含有两个拷贝此重复片段时)中，而不存在于i中，这就提供了一个I的标记。寡核苷酸引物能被设计成能与被发现此缺失位置的基因组DNA的任何一边杂交，完成PCR，结果是出现两种可能大小的产物。当存在四个碱基对缺失时获得的将比从同一个片段不存在此缺失时获得的短四个碱基对。这两种产物的相对量能用以前讨论的任何一种方法来确定，但一个优选的方法包括寡核苷酸引物的其中一条用荧光染料标记并与带有合适的检测设备的仪器或TaqMan仪器(Perkin-Elmer)中的电泳结合。关于PCR成分的这一测试策略的一个特殊的优点是它不易随着PCR离开指数期而丧失判别力。引物、其结合位点及产物对缺失和非缺失模板片段是相同的或相似的，因此，一种产物相对于另一种产物的产率在反应的不同时期不太可能变化。由于模板/模板杂交的形成开始与模板/引物复合物的形成竞争，它同时影响两个亚反应，综合的结果是每个产品生产的动力学之间的高度相似性。在一种只带有I或i而不带有IP的猪家系中，获得的这两个产物的比率能与下面所示的基因型相关，这是基于每个I等位基因的拷贝都同等量地增加非缺失的和缺失的产物，而i只给出非缺失的产物这一事实。</tables>因此，第五个方面，本发明提供了一种确定猪的皮毛颜色基因型的方法，包括，(i)获得猪的核酸样品；及(ii)分析从(i)获得的核酸以确定KIT基因序列中的缺失存在或不存在。简单地通过确定此缺失的存在或不存在，能够区分I和i。当然，由于在IP重复的一个拷贝中这个缺失的不存在在这种试验中有效地模仿了i，这就使得IP的存在使结果复杂化。因此，将此方法应用于带有IP的家系可能会导致对带有等位基因ii的动物的错误鉴定。但是，这样的方法仍然可能发现用途，例如在特定的动物繁殖方面，当所要求的只是对那些I的杂合子动物的阳性鉴定时。当然，还会体会到每个单独的基因型或者产生一个两种产物的不同比率，或者产生不同数量的单一产物类型。因此，这样的一个试验也将提供确定一个动物个体的确实的基因型的方法，这是通过对所产生的产物定量实现的。在这样一种情况下，在每个试验中使用的DNA的量应该是被控制的以保证产物的量的区别能被精确地确定出来。优选地，确定步骤(ii)包括PCR扩增，通常是在一个猪的基因组DNA样品上。能够用于这种PCR方法的合适的引物对包括TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGGKIT缺失1-正向CCAGCAGGACAATGGGAACATCTKIT缺失1-反向及GAAAGTGA(C/T)GTCTGGTCCTAT(C/G)GGATKIT缺失2-正向AGCCTTCCTTGATCATCTTGTAGKIT缺失2-反向实施这一步骤的众多可选择的方法之一是在PCR反应中使用与唯一的核苷酸序列结合的引物，这个唯一的核苷酸片段是通过缺失的存在或不存在而在KIT基因片段的每种形式中产生的。这种引物可通过这样来设计，就是它们仅在相应的序列的存在下产生产物。因此，如果所选择的两条引物中的每一条都用一个不同的荧光标记，就没有必要通过凝胶电泳进行分离，可按照它们的荧光来鉴别每个产物。已有初步的证据表明含有两个以上重复片段拷贝的I等位基因存在于某些种类的猪中，该证据是基于检测重复的存在及缺失的拷贝数时得到的比率的特异值的遗传特征。I的多种形式在动物间的判别能利用两种比率的结合而增强，即重复片段拷贝数的确定中和缺失存在的确定中产生的比率。可能存在的等位基因中的KIT基因的结构存在两个以上重复型拷贝的，列于下表</tables>由于这些等位基因的存在引起的可能的基因型以及从对重复片段的拷贝数和含有缺失的拷贝数的测定试验中获得的各自的比率列于下面</tables>可能将两种检测组合起来的一种方法包含TaqManTM系统(PerkinElmer公司)的应用。在这个TaqMan具体应用中，利用三个探针带两组PCR引物。一个探针允许产生于一组引物的对照产物的测量。另一组PCR引物允许可能含有或不含有缺失的重复片段的扩增。剩下的探针检测这个扩增中的缺失的或不缺失的产物。从获得的数据能进行如下两个计算，提供了如前面所描述的两个不同的测试中获得的值。AKIT基因片段的拷贝数∶对照片段的拷贝数B非缺失的KIT基因∶缺失的KIT基因适当时，本发明的每个方面的优选特征对其他每方面都适用，反之亦然。现在将参照下面的实例描述本发明，这些实例不应以任何形式解释为对本发明的限制。实施例3涉及图1，其中图1显示SSCP分析的结果。实施例1(i)DNA的准备DNA能从任何来源的含有细胞核的组织准备，例如白细胞，发囊，耳切口及肌肉。这里略述的步骤是有关血细胞的准备；其他组织能进行相似处理，通过直接将材料悬浮于K缓冲液中，然后以血样的步骤相同的步骤进行处理。这里概述的方法产生含有粗制DNA的细胞裂解物，适合用于PCR扩增。然而任何用于准备纯化的或粗制DNA的方法都应是同等有效的。血液收集于50mMpH8.0EDTA中以防止凝集。将50μl血分散于一个小的微离心管中(0.5mlEppendorf管或相当的)。加入450μlTE缓冲液以溶解红细胞(血红素团抑制PCR)并将混合物混旋2秒。然后将完整的白细胞和残留的红细胞在一个微量离心机中以13,000g离心12秒。用一个低压真空泵系统将上清轻轻地吸弃。然后加入另外450μlTE缓冲液以溶解剩余的红细胞，白细胞通过上述的离心收集。如果沉淀中留有任何红色，则重复此步骤直到没有红色为止。当从沉淀的白细胞除去最后一滴上清后，加入100μl含有蛋白酶K的K缓冲液并将此混合物在55℃孵育2小时。然后将混合物加热到90-100℃计8分钟，并将DNA裂解液贮存在-20℃直到需要的时候。试剂TE缓冲液10mMTRIS-HClpH8.01mMEDTAK缓冲液50mMKCl10mMTRIS-HClpH8.32.5mMMgCl20.5％吐温20在用于裂解之前，每1.0ml的K缓冲液中加入10μl20mg/ml的蛋白酶K(MolecularProbes公司)。(ii)PCR反应在薄壁的0.25ml管子(PerkinElmer)中按如下建立4.0μl5μMCRC正向引物；4.0μl5μMCRC反向引物；4.0μl5μMKIT1-反向引物；4.0μl5μMKIT1-正向引物；4.0μl2mMdNTP(Pharmacia)；4.0μl35mMMgCl2。加入一滴蜡珠(PCRGem50，PerkinElmer)并将此管放入一台PerkinElmer9600热循环仪中，然后将试管升温至80℃放15秒，然后冷却至4℃。然后将如下的第二组试剂加到每个试管中4.0μl10倍缓冲液；9.6μl灭菌去离子水；0.4μl(0.5单位)AmpliTaqDNA聚合酶(PerkinElmer)；2μlDNA裂解液。然后将反应试管放到一台PerkinElmer9600热循环仪中预热至94℃并按照下面指出的方法进行PCR反应94℃4分钟；94℃30秒，62℃30秒，72℃30秒20个循环；0℃直到需要时。循环数目可根据所用的DNA来源的组织而变化。KIT引物正向GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCCKIT1-正向反向CCGCTTCTGCGTGATCTTCCTGKIT1-反向CRC引物正向CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGTCRC-正向反向AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTCCRC反向反向的KIT引物和正向的CRC引物用ABI荧光染料FAM在5’末端进行了标记。(iii)DNA片段的电泳及定量1μlPCR反应液与2.5μl去离子甲酰胺、0.5μlGS350DNA标准，0.4μl蓝葡聚糖溶液混合，在90℃加热2分钟，之后在冰上快速冷却。之后将3μl的此混合液载到AB1373DNA测序仪上，DNA片段在6％的聚丙烯酰胺凝胶(1倍的TBE缓冲液中)中，在700V、40mA、32W电泳2小时而得到分离。与KIT基因及CRC基因的产物相应的片段用GeneScan软件进行定量，测定每条带的峰面积。(iv)结果表1给出的数据代表从一个实验获得的结果，在这个实验中，从23个动物的每个个体产生DNA裂解液，及对每个裂解液进行两个PCR检测。每个PCR的KIT峰面积对CRC峰面积的比率计算出来并得出从同一动物得到的那些样品的均值。表1</tables>在本实验中从不同基因型II、Ii及ii的动物中得到的比值的上限及下限如下基因型上限下限I/I3.252.80I/i2.451.84i/i1.500.99这些结果说明利用这个试验产生的基因型的区别。实施例2第二个试验利用存在于此重复(片段)的一个末端(或在两个末端，如果此重复片段与此基因的剩余部分是反向的或重复片段不是以与非重复的片段直接串联的形式出现)的DNA独特序列。用于PCR的寡核苷酸引物是这样设计的在用于PCR过程的退火温度下，它们将只在此重复片段的末端的连接片段退火。这样就利用两对寡核苷酸进行一个PCR反应。一对用于扩增连接片段的前述引物及在一段合适距离外的第二个引物，它只允许扩增仅仅发生在含有重复片段的I等位基因。第二对引物允许仅以单拷贝形式存在于单倍体基因组的一个片段的扩增。在同一试管内进行的这一反应的产物，其功能是作为前述检测的一个内标准。测量连接片段特异反应的产物与从单拷贝对照序列所得产物的比值。在这个试验中，不同的基因型产物的预测比值之间有较大的差异。产物的相对水平及它们的比值说明如下基因型连接处产物对照产物比值II221∶1Ii121∶2ii020∶2这些较大的比值允许从不同的基因型所获结果的范围之间有较大的差别，减少了错估动物的风险。实施例3(i)DNA制备DNA可按实施例1中所描述的方法制备。(ii)PCR反应在薄壁的0.25ml管子(PerkinElmer)中按如下建立2.0μl5mMKIT缺失2正向引物；2.0μl5mMKIT缺失2反向引物；1.0μl2mMdNTP(Pharmacia)；1.2μl25mMMgCl2；2.0μl10倍缓冲液(不含MgCl2)；0.1μl(0.5单位)AmpliTaqDNA聚合酶(PerkinElmer)；2.0μlDNA裂解物；9.7μl灭菌去离子水。将反应管放入一台PerkinElmer9600热循环仪中，并按照下面所示的方法进行PCR反应95℃1分钟；95℃15秒，50℃20秒，72℃40秒3个循环；94℃15秒，50℃20秒，72℃50秒27个循环；72℃5分钟4℃直到需要时。循环数目可根据所用的DNA来源组织而变化。KIT引物正向GAAAGTGA(C/T)GTCTGGTCCTAT(C/G)GGATKIT缺失2-正向反向AGCCTTCCTTGATCATCTTGTAGKIT缺失2-反向(iii)电泳1μlPCR反应液与3μl装载缓冲液(95％去离子甲酰胺，10mMNaOH，20mMEDTA，0.05％溴酚蓝，0.05％二甲苯腈蓝)混合，在95℃加热3分钟，之后在冰上快速冷却。之后将样品加到在1倍的TBE缓冲液中(89mMTris，89mM硼酸，2mMEDTA.Na2)的8％非变性的聚丙烯酰胺凝胶(Protogel，37.5∶1丙烯酰胺∶双丙烯酰胺NationalDiagnostics，Atlanta)。DNA片段通过在20℃恒温、6W4.5个小时的电泳进行分离，在一个垂直平板单元(SE600HoeferScientificInstruments，圣弗兰西斯科)内用0.6倍的TBE作为跑胶缓冲液。(iv)通过银染进行DNA片段显像电泳后，将胶在固定溶液中轻轻振荡孵育20分钟或直到不再能看到电泳示踪染料。将胶在去离子水中漂洗3次(每次2分钟并振荡)。然后将胶在染色溶液中轻微振荡孵育40分钟，之后在去离子水中进行简单的冲洗并直接转移到展开溶液中，把胶在展开溶液中孵育直到带能被清晰地看到，然后加入相同体积的固定溶液以终止展开。最后，在去离子水中将胶漂洗2分钟。试剂固定溶液10％在去离子水中的冰醋酸染色溶液2g硝酸银(AgNO3)3ml37％甲醛2升去离子水展开溶液60g碳酸钠(Na2CO3)溶解于2升去离子水。使用之前马上加入3ml37％甲醛及400ml硫代硫酸钠(10mg/ml)。在使用时，此溶液应在10-12℃。(v)结果此SSCP分析揭示了到现在为止仅仅在显性白色基因型的动物中发现的一个提供信息的多态性(图1)。带1～8是对取自带有显性白色的SwidishLandrace猪的DNA的分析，带9和10是取自野生型颜色的野猪的DNA。显示了多态的带。此多态性突出地表现为仅仅存在于带有I型等位基因的一个重复的KIT基因的动物中的两个独特的片段。此片段代表来源于不等长度的PCR产物的DNA链的异源双链，不等的长度表示KIT基因的重复拷贝和非重复拷贝。利用40个代表5个品种和190个LargeWhite/野猪杂交的子2代(F2)的无关动物进行的带有此标记的筛选试验的结果列于表2。此结果表明这个特殊的多态性与KIT重复(片段)的存在非常紧密相关。它不是完全地与此重复(片段)相关，因为一些白色的动物不显示异源双链的模式。因此，这个多态性是一个紧密连锁的遗传标志的例子，此遗传标志通过它自己或与其他连锁标记组合能用于区分这个关于显性白皮毛颜色的基因型。表2</tables>实施例4i)DNA的提取DNA按实施例1中的方法准备。ii)PCR反应在薄壁的0.25ml的反应试管(PerkinElmer)中按如下建立0.5ml5μMKIT缺失1正向引物；0.5ml5μMKIT缺失1反向引物；1.0ml2mMdNTP(Pharmacia)；1.0ml15mMMgCl2；1.0ml10倍缓冲液4.9ml灭菌蒸馏水0.1mlAmpliTaqDNA聚合酶1.0mlDNA裂解液将反应管放入一台PerkinElmer9600热循环仪中，并按照下面所示的方法进行PCR反应94℃4分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒21个循环；72℃4分钟4℃直到需要时。循环数目可根据所用的DNA来源组织而变化。引物正向TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGGKIT缺失1-正向反向CCAGCAGGACAATGGGAACATCTKIT缺失1-反向反向引物在5’端用ABI荧光染料FAM标记。iii)DNA片段的电泳及定量1μlPCR反应液与1.5μl去离子甲酰胺、0.25μlGS350DNA标准、0.25μl装载缓冲液(50mg/ml蓝葡聚糖，25mMEDTA)混合，在90℃加热2分钟，之后在冰上快速冷却。之后将1.75μl的此混合液载到ABI377DNA测序仪上，DNA片段在4.12％的聚丙烯酰胺凝胶(1倍的TBE缓冲液中)中，在3000V、60mA、200W及48℃电泳2小时而进行分离。分别相应于无缺失和含有缺失KIT基因模板产物的97bp及93bp的片段用GeneScan软件进行定量，测定每条带的峰面积。结果下表中给出的数据表示从一个实验获得的结果，在这个实验中，从20个已知基因型的动物的每个个体中获得DNA裂解液并对每个裂解液进行一个PCR检测。计算出从不含有4个碱基对的缺失的DNA模板获得的产物的峰面积对从含有缺失的DNA模板获得的产物的峰面积的比值。表3</tables>对这个小样本，每个基因型的预测比值(对于Ii期望值＝2，对于II是1)中的中点值1.5也许能用作划分动物为各个基因型的分界线。从这个表中可确定，7/10II及9/10Ii被鉴定为正确的基因型。权利要求1.确定猪的皮毛颜色基因型的一种方法，包括(i)获得猪核酸的样品；及(ii)分析从(i)获得的核酸以确定KIT基因的全部或部分的重复是否存在。2.权利要求1中要求的方法，其中猪核酸是基因组DNA。3.权利要求2中要求的方法，其中步骤(ii)包括利用一个或多个PCR循环及一对适合的引物对至少KIT基因的一部分扩增。4.权利要求3中要求的方法，其中对PCR产物的量定量。5.权利要求3或4中要求的方法，其中引物对是GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCCCCGCTTCTGCGTGATCTTCCTG；GG(C/T)AATCACATGAATATTGTGAATCACCATAGCAACAATATTCTGT；TC(A/G)TACATAGAAAGAGA(C/T)GTGACTCCCTTT(A/G)ACCAC(A/G)TAATT(A/C)GAATC；或GTGATG(A/G)T(T/G)CT(C/G)ACCTACAAATAGTCTATGTAAACATAATTGTTTCC。6.权利要求3或4中要求的方法，其中引物对与位于KIT基因和重复片段的边界的一段独特片段杂交。7.权利要求3-6中任一项要求的方法，其中确定方法包括与一个内标准进行比较。8.权利要求7中要求的方法，其中内标准是通过对另一个核苷酸序列的至少一部分通过利用一对合适的引物的一个或多个PCR循环扩增产生的。9.权利要求8中要求的方法，其中对内标准PCR产物的量定量。10.权利要求8或9中要求的方法，其中这个内标准PCR产物是对肌肉钙释放通道(CRC)基因的至少一部分扩增产生的。11.权利要求10中要求的方法，其中下面的这对引物用于内标准PCR反应CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGT及AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTC。12.权利要求10中要求的方法，其中下面的这对引物用于内标准PCR反应GATGAACTTTGAGGTCCCTGAGGAG及TTTCTTCTGAGAATGCCGAAGATCTG。13.权利要求8-12中任一项要求的方法，其中内标准PCR反应与KIT序列的扩增同时进行。14.权利要求8-13中任一项要求的方法，其中测定KIT片段的拷贝数∶内标准片段的拷贝数的比值。15.权利要求1-14中任一项要求的方法，还包括下步(iii)确定存在的重复是由于I还是IP的存在造成的。16.权利要求14中要求的方法，其中确定在至少一个重复片段中存在或不存在缺失。17.权利要求16中要求的方法，其中确定非缺失片段的拷贝数∶缺失片段的拷贝数的比值。18.确定猪的皮毛颜色基因型的一种方法，包括(i)获得猪基因组DNA的样品；(ii)用从(i)获得的基因组DNA与一个或多个适合的引物杂交；(iii)利用(ii)中的杂交的核酸进行一个或多个PCR循环；及(iv)测定PCR反应产物的量。19.权利要求18中要求的方法，还包括下步(v)确定存在的任何重复是由于I还是IP的存在造成的。20.权利要求19中要求的方法，其中确定在至少一个重复片段中存在或不存在缺失。21.权利要求18-20任一项要求的方法，其中用权利要求6-14中的一个或多个特征限定。22.确定猪的皮毛颜色基因型的一种方法，包括(i)获得猪KIT蛋白质的样品；及(ii)分析从(i)获得的蛋白质以确定KIT基因的全部或部分的重复是否存在。23.权利要求22中要求的方法，其中步骤(ii)是通过这种蛋白质与一个或多个抗体反应实现的。24.权利要求23中要求的方法，其中此方法是ELISA。25.确定猪的皮毛颜色基因型的试剂盒，包含一种或多种能指示KIT序列全部或部分的重复存在的试剂。26.权利要求25中要求的试剂盒，其中此试剂盒适合用于猪基因组DNA样品。27.权利要求25或26中要求的试剂盒，包括用于进行PCR的试剂连同至少一对引物。28.权利要求27中要求的试剂盒，其中引物对是GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCCCCGCTTCTGCGTGATCTTCCTG；GG(C/T)AATCACATGAATATTGTGAATCACCATAGCAACAATATTCTGT；TC(A/G)TACATAGAAAGAGA(C/T)GTGACTCCCTTT(A/G)ACCAC(A/G)TAATT(A/C)GAATC；或GTGATG(A/G)T(G/T)CT(C/G)ACCTACAAATAGTCTATGTAAACATAATTGTTTCC。29.权利要求27中要求的试剂盒，其中引物对与位于KIT基因和重复片段的边界的一段独特片段杂交。30.权利要求26-29中任一项要求的试剂盒，其中还包括第二对引物，它允许另一个核苷酸序列的至少一部分通过一个或多个PCR循环来扩增。31.权利要求30中要求的试剂盒，其中此第二对引物与肌肉钙释放通道(CRC)基因序列的至少一部分杂交。32.权利要求31中要求的试剂盒，其中此第二对引物的序列为CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGT及AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTC。33.权利要求30中要求的试剂盒，其中此第二对引物与猪干扰素-β基因序列的至少一部分杂交。34.权利要求33中要求的试剂盒，其中此第二对引物的序列为GATGAACTTTGAGGTCCCTGAGGAG及TTTCTTCTGAGAATGCCCGAAGATCTG。35.权利要求25中要求的试剂盒，其含有能与KIT蛋白反应的一种或多种抗体。36.确定猪的皮毛颜色基因型的一种方法，包括(i)获得猪核酸的样品；及(ii)分析从(i)获得的核酸以鉴别KIT基因序列中的缺失存在或不存在。37.权利要求36中要求的方法，其中猪核酸是基因组DNA。38.权利要求36或37中要求的方法，其中步骤(ii)包括利用一个或多个PCR循环及一对适合的引物对至少KIT基因的一部分扩增。39.权利要求38中要求的方法，其中引物对是TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGGCCAGCAGGACAATGGGAACATCT；或GAAAGTGA(C/T)GTCTGGTCCTAT(C/G)GGATAGCCTTCCTTGATCATCTTGTAG。40.权利要求36-39中任一项要求的方法，其中此方法用于区分I和i。41.确定猪的皮毛颜色基因型的试剂盒，包含一种或多种能指示KIT序列中的一段缺失的存在或不存在的试剂。42.权利要求41中要求的试剂盒，其中此试剂盒适合用于猪基因组DNA样品。43.权利要求41或42中要求的试剂盒，其包括用于进行PCR的试剂连同至少一对引物。44.权利要求43中要求的试剂盒，其中引物对是TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGGCCAGCAGGACAATGGGAACATCT；或GAAAGTGA(C/T)GTCTGGTCCTAT(C/G)GGATAGCCTTCCTTGATCATCTTGTAG。全文摘要提供了确定猪皮毛颜色的方法。此外,还提供了含有用于此方法的适合试剂的试剂盒及用于基于PCR方法的特异性引物。文档编号C12Q1/68GK1196755SQ96197048公开日1998年10月21日申请日期1996年7月24日优先权日1995年7月27日发明者L·安德桑,M·J·莫勒,R·瓦利斯,K·W·希根斯,G·S·普拉斯托申请人:达尔吉蒂公共有限公司