用于产生l-赖氨酸的方法

专利名称：用于产生l-赖氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及通过培养微生物产生L-赖氨酸的方法，所述的微生物是通过借助基于基因工程的技术修饰用于发酵生产氨基酸的棒状杆菌等获得的。
作为饲料添加剂的赖氨酸通常通过利用属于棒状杆菌的L-赖氨酸-产生突变菌株用发酵法产生。现在已知各种L-赖氨酸-产生菌是从属于棒状杆菌的野生型菌株开始经人工突变产生的那些。
就棒状杆菌而言，公开了载体质粒，这种质粒是在细菌细胞中可自主复制的，并具有药物抗性标记基因(参见美国专利4,514,502)，并公开了用于把基因引入细菌细胞的方法(例如日本专利申请公开2207791)。也公开了通过利用以上所述的技术培养L-苏氨酸-或L-异亮氨酸-产生菌的可能性(参见美国专利4,452,890)。培养L-赖氨酸-产生菌的技术是已知的，在其中参与L-赖氨酸生物合成的基因掺入到载体质粒中，以便在细菌细胞中扩增该基因(例如，日本专利申请公开56-160997)。
L-赖氨酸生物合成的已知基因包括，例如，二氢二吡啶甲酸还原酶基因(日本专利申请公开7-75578)和二氨基庚二酸脱氢酶基因(Ishino，S.等，核酸研究，15，3917))(其中参与L-赖氨酸生物合成的基因被克隆)，以及磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因(日本专利申请公开60-87788)，二氢二吡啶甲酸合酶基因(日本专利出版物6-55149)和二氨基庚二酸脱羧酶基因(日本专利申请公开60-62994)(其中扩增基因影响L-赖氨酸产量)。
就参与L-赖氨酸生物合成的酶而言，在以野生型使用时，经历反馈抑制的酶的情况是已知的。在这种情况下，L-赖氨酸产量通过这样一种方法得到提高，即引入具有脱敏反馈抑制之突变的基因。具体地说，已知这样的基因包括天冬氨酸激酶基因(国际出版物WO 94/25605)。
如上所述，借助L-赖氨酸生物合成系统的基因扩增或突变基因的引入获得了成功的结果。例如，具有突变天冬氨酸激酶基因(脱敏了由赖氨酸和苏氨酸引起的固有抑制)的棒状杆菌产生大量的L-赖氨酸(大约25g/L)。然而，这种细菌与不具有突变天冬氨酸激酶基因的细菌比较生长速度降低。也报道了通过除了引入突变天冬氨酸激酶基因之外进一步引入二氢二吡啶甲酸合酶基因可提高L-赖氨酸产量(应用的和环境的微生物学，57(6)，1746-1752(1991))。然而，这种细菌生长速度进一步降低。
也没有报道通过增强L-赖氨酸生物合成基因改善生长的情况。目前，对棒状杆菌，没有出现任何人已成功地通过组合L-赖氨酸生物合成的多种基因明显改善L-赖氨酸产量而不抑制生长的情况。
本发明的目的是通过在棒状杆菌中同时增强L-赖氨酸生物合成的多种基因来提高L-赖氨酸的产率，而不障碍棒状杆菌的生长。
当目标产物经采用微生物发酵产生时，与引入的物质相关的目标产物的产生速度和产率是非常重要的因素。通过增加每单位发酵设备的产生速度，可以廉价地生产目标产物。因此，发酵产率和产生速度相互匹配是工业上非常重要的。为了通过采用棒状杆菌经发酵产生L-赖氨酸，本发明提出了以上所述问题的一种解决方案。
本发明的原理基于这样一种事实通过增强编码天冬氨酸激酶(其中实质上脱敏了L-苏氨酸L-赖氨酸的反馈抑制)的DNA序列和编码二氨基庚二酸脱羧酶的DNA序列两者，可以改善棒状杆菌的生长，并且因此可以改善L-赖氨酸产生速度(与单独增强这两种DNA序列之一比较)。
在本发明的第一方面，本发明提供了在棒状杆菌细胞中可自主复制的重组DNA，该DNA包含编码天冬氨酸激酶(其中实质上脱敏了L-苏氨酸L-赖氨酸的反馈抑制)的DNA序列和编码二氨基庚二酸脱羧酶的DNA序列。本发明也提供了还包含编码磷酸烯醇丙酮酸羧酶的重组DNA。
在第二方面，本发明提供了一种具有天冬氨酸激酶的棒状杆菌(其中L-苏氨酸和L-赖氨酸的反馈抑制实质上被脱敏)，该棒状杆菌包含编码二氨基庚二酸脱羧酶的增强DNA序列。本发明也提供了还包含编码磷酸烯醇丙酮酸羧酶的增强DNA序列的棒状杆菌。
在第三方面，本发明提供了一种用于产生L-赖氨酸的方法，该方法包括以下步骤在适当的培养基中培养以上所述的任何棒状杆菌使得在所说的细菌的培养物中产生并积累L-赖氨酸，并从培养物收集L-赖氨酸。
此后，需要时天冬氨酸激酶称为＂AK ＂，编码AK的基因称为＂lysC＂)，由L-赖氨酸和L-苏氨酸产生的反馈抑制被脱敏的AK称为“突变AK”。编码突变AK的基因称为＂突变lysC＂。同样，需要时二氨基庚二酸脱羧酶称为＂DDC＂，编码DDC的基因称为＂lysA＂)，磷酸烯醇丙酮酸羧酶称为“PEPC”，编码PEPC的基因称为“ppc”。
在本发明中所称的棒状杆菌是在Bergey’s细菌学手册(第8版p.599(1974))中限定的一组微生物，其是无孢子-形成能力的需氧革兰氏-阳性-非抗酸棒杆状菌。棒状杆菌包括属于棒杆菌属的细菌，属于短杆菌短的细菌(迄今为止分类为短杆菌属但现在与棒杆菌属细菌合并在一起)和与属于棒杆菌的细菌密切相关的短杆菌属的细菌。
按照本发明，棒状杆菌的L-赖氨酸产生量和产生速度可以得到提高。附图简要描述

图1说明包含突变lysC的质粒p399AK9B和p399AKYB的构建方法图2说明包含lys4的质粒p299LYSA的构建方法。
图3说明包含lys4和Brevi.-ori的质粒pLYSAB的构建方法。
图4说明包含PEPC结构基因的质粒pAKPFds的构建方法。
图5说明棒状杆菌的新克隆载体pVKG和pVK7的构建方法。
图6说明包含野生型高表达ppc的质粒pPwm的构建方法。
图7说明包含突变lysC，lysA和Brevi.-ori的质粒pCL的构建方法。
图8说明包含dapA和Brevi.-ori的质粒pDPSB的构建方法。
图9说明包含dapB和Brevi.-ori的质粒pDPRB的构建方法。
图10说明包含ddh和Brevi.-ori的质粒pPK4D的构建方法。
图11说明包含lysC，dapA和Brevi.-ori的质粒pCRCAB的构建方法。
图12说明包含突变lysC，dapB和Brevi.-ori的质粒pCB的构建方法图13说明包含法突变lysC和ddb的质粒pCD的构建方法。
发明的详尽描述1制备用于本发明的L-赖氨酸生物合成的基因用于本发明的L-赖氨酸生物合成的基因分别通过以下方法获得从DNA供体细菌染色体DNA用质粒载体或类似物构建染色体DNA文库，选择具有所需基因的菌株，和从所选择的菌株回收已插入了所述基因的重组DNA。对用于本发明的L-赖氨酸生物合成的基因的DNA供体没有特别的限制，只要L-赖氨酸生物合成的所需基因表达酶蛋白质(其在棒状杆菌细胞中起作用)。然而，DNA供体优选地是棒状杆菌。
来源于棒状杆菌的lysC，dapA和ppc的所有基因具有已知的序列。因此，可以通过按照聚合酶链反应方法(PGR；see White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))进行扩增来获得它们。
用于本发明的L-赖氨酸生物合成的各种基因可以按照以下例举的方法获得(1)突变lysC的制备包含突变lysC的DNA片段可以从突变菌株制备，在所述菌株中由L-苏氨酸和L-赖氨酸产生的AK活性的协同反馈抑制实质上被脱敏(国际出版物WO94/25605)。这样一种突变菌株可以通过例如用诱变剂如紫外光和N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)对来源于棒状杆菌野生型菌株的一组细胞进行常规突变处理获得。AK活性可以通过用由Miyajima，R.等在生物化学杂志(1968)，63(2)，139-148中描述的方法测量。最优选的这样的突变菌株由L-赖氨酸-产生菌AJ 3445(FERM 1944)代表，其来源于突变处理乳发酵短杆菌ATCC13869野生型菌株(现在其改变的名称是Corynebacterium alutamicum)。
另外，突变lysC也可由包含野生型lysC的质粒DNA体外突变处理获得。另一方面，突变脱敏L-赖氨酸和L-苏氨酸产生的对AK活性的协同反馈抑制的信息是十分清楚的(国际出版物WO 94/25605)。因此，在该信息的基础上按照定点突变方法也可以制备突变lysC。
可以按照例如Saito和Miura(H.Saito和K.Miura，生物化学生物物理学报，72，619(1963))的方法通过制备染色体DNA或按照聚合酶链反应方法(PCR；参见White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))扩增lysC从棒状杆菌分离包含lysC的片段。
以单链DNA例证性地说明DNA引物，所说单链DNA是具有SEQ ID NO1和2所示的核苷酸序列的23链节和21链节的，以便扩增例如基于谷氨酸棒杆菌已知序列(参见分子微生物学(1991)，5(5)，1197-1204；Mel.Gen.Genet.(1990)，224，317-324)的编码lysC的约1,643bp的区域。可以通过采用Applied Biosystems生产的DNA合成仪380B型和采用phosphoamidite法(参见Tetrahedron Letters (1981)，22，1859)按照常规方法合成DNA。可以通过用由Takara Shuzo生产的DNA热循环器PJ2000型按照供给者指定的方法和尾端DNA聚合酶进行PCR。
优选的是将经PCR扩增的lysC与在大肠杆菌和/和/或棒状杆菌细胞中可自主复制的载体DNA连接制备重组DNA，把重组DNA引入预先的大肠杆菌细胞中。这一过程使随后的操作容易进行。在大肠杆菌细胞中可自主复制的载体优选地是质粒载体，其是在宿主的细胞中优选的可自主复制的，包括例如，pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398和RSF1010。
当具有使得质粒可以在棒状杆菌中自主复制的能力的DNA片段插入到这些载体中时，它们可以用作在大肠杆菌和棒状杆菌中可自主复制的所谓的穿梭载体。
这样穿梭载体包括以下载体。含有各载体的微生物和其在国际保藏单位中的保藏号(在括号)显示如下pHC4 大肠杆菌AJ12617(FERM3532)pAJ655 大肠杆菌AJ11882(FERM136)谷氨酸棒杆菌SR8201(ATCC39135)pAJ1844大肠杆菌AJ11883(FERM137)谷氨酸棒杆菌SR8202(ATCC39136)pAJG11 大肠杆菌A511884(FERM138)pAJ3148谷氨酸棒杆菌SR8203(ATCC39137)pAJ440 枯草芽孢杆菌AJ11901(FERM140)这些载体可从其后的保藏的微生物获得。采用溶菌酶和SDS裂解在对数的生长期所收集的细胞，接着在30,000×g下从裂解物分离以获得上清液。将聚乙二醇添加到上清液中，借助氯化铯-溴化乙锭均衡密度梯度离心进行分级分离和纯化。
可以通过按照以下方法将质粒引入来转化大肠杆菌，所述方法例如D.M.Morrison(酶学方法，68，326(1979))的方法或其中用氯化钙处理受体细胞以增加DNA渗透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物学杂志，53，159(1970))。
当按照以上所述的方法从AK野型菌株分离lysC时，获得野生型lysC，而从AK突变菌株分离lysC时，获得突变lysC。
包含野生型lysC的DNA片段的核苷酸序列的例子在序列表中SEQ ID NO3中显示。野生型AK蛋白质的α亚单位的氨基酸序列是从核苷酸序列推定的，其与DNA序列一起在序列表SEQ ID NO4中显示。单独的氨基酸序列在SEQ IDNO5中显示。野生型AK蛋白质的β亚单位的氨基酸序列是从DNA的核苷酸序列推定的，其与DNA序列一起在序列表SEQ ID NO6中显示。单独的氨基酸序列在SEQ ID NO7中显示。在各亚单位中，GTG用作起始密码子，相应的氨基酸由甲硫氨酸代表。然而，这种代表涉及到甲硫氨酸、缬氨酸或甲酰甲硫氨酸。
对用于本发明的突变lysC没有特别的限制，只要其编码AK(其中由L-苏氨酸和L-赖氨酸产生的协同反馈抑制被脱敏)。然而，突变lysC的一个例证性例子包括这样的突变，其中与279位(从N-末端开始计算)丙氨酸残基相应的氨基酸残基改变成为非丙氨酸和非非野生型AK氨基酸序列中的β亚单位中的酸性氨基酸的氨基酸残基，与30位(从N-末端开始计数)丙氨酸残基相应的氨基酸残基改变成为非丙氨酸和非野生型AK氨基酸序列中的β亚单位中的酸性氨基酸的氨基酸残基。野生型AK的氨基酸序列具体来说包括作为α亚单位的在序列表中SEQ ID NO5所示的氨基酸序列，作为β亚单位的在序列表中SEQ ID NO7所示的氨基酸序列。
称为非丙氨酸和非酸性氨基酸的那些氨基酸残基优选的包括苏氨酸、精氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸和缬氨酸残基。
对相应于所要替代的氨基酸残基的密码子没有特别的限制，只要它编码所说的氨基酸残基。可以预计，依据细菌物种和细菌菌株的不同，野生型AK的氨基酸序列可以稍微不同。具有基于在一个或多个位置上取代，缺失或插入一个或多个氨基酸残基而不影响以上所述活性的突变的AK也可以用于本发明中。具有自发突变的编码AK的DNA可以通过分离这样一种DNA获得，该DNA在严格条件与例如具有SEQ ID NO3所示的一部分核苷酸序列的DNA杂交。本文所说的＂严格条件＂意指形成特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件。用数值难于清楚表达所述条件。然而，例举性的条件是这样一种条件，在该条件下，具有高同源性的核酸(例如具有不低于90％同源性的DNA)相互杂交或者是这样一种条件，其温度是从熔点温度Tm到(Tm-30)℃，优选地是从Tm到(Tm-20)℃，盐浓度相当于1x SSC，优选地相当于0.1x SSC。
基于例如，取代、缺失或插入一个或多个氨基酸残基进行过人工突变的其它AK也可以使用，只要对AK活性实质上没有影响和对L-赖氨酸和L-苏氨酸的协同反馈抑制的脱敏没有影响。可以通过例如定点突变修饰核苷酸序列，产生特定位点的缺失或插入，由此来获得编码具有人工突变的AK的DNA。也可以通过已知诱变处理方法获得具有突变的lysC。诱变处理包括用羟胺或类似物体外处理包含lysC的DNA，用诱变如紫外光或诱变剂(其是用于常规人工诱变的，如N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或硝酸)处理具有包含lysC之DNA的微生物的。诱变处理后，可以通过选择编码或产生AK(其具有AK活性，其氨基酸序列从经历诱变处理的DNA或者经历诱变处理的微生物突变)的DNA或微生物测定引入了突变或者发生了突变的位点。对所引入突变的位点没有特定的限制，只要对AK活性实质上没有影响和对反馈抑制的脱敏没有影响。所引入的突变的数目随在蛋白质的立体结构中的氨基酸的位置和种类变化，并且没有特定的限制，只要对AK活性实质上没有影响和对反馈抑制的脱敏没有影响。该数目通常是1至20，优选地是1至10。
通过将突变lysC质粒p399AK9B引入乳发酵短杆菌野生型菌株AJ12036菌株(FERM BP-734)获得的AJ12691菌株已于1992年4月10日以保藏号FERMP-12918保藏在国际贸易和工业部工业科学和技术机构的国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi L-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305，日本)，基于布达佩斯条约于1995年2月10日转变成国际保藏，以保藏号FERMBP-4999保藏。(2)lysA的制备可以借助PCR从棒状杆菌的染色体制备包含lysA的DNA片段。对DNA供体没有特别的限制，然而，由乳发酵短杆菌ATCC13869菌株所例证。
在棒状杆菌中，lysA与argS一道形成操纵子(精氨酰-tRNA合酶基因)，lysA存在于argS下游。lysA的表达由存在于argS上游的启动子调节(参见生物技术杂志，Nov.，7356-7362(1993))。谷氨酸棒杆菌的这些基因的DNA序列是已知的(参见分子微生物学，4(11)，1819-1830(1990)；分子和普通遗传学，212，112-119(1988))，基于该序列可以制备PCR的DNA引物。这样的DNA引物由分别具有序列表SEQ ID NO8(相应于在分子微生物学4(11)，1819-1830(1990)中描述的核苷酸序列中的11至33位核苷酸)和SEQ ID NO9(相应于在分子和普通遗传学，212，112-119(1988)中描述的核苷酸序列中的1370至1392位核苷酸)中所示的核苷酸序列的23-链节DNA所具体例证。可以以与以上所述的有关lysC的那些相同的方式进行DNA的合成、PCR和包含获得的lysA的质粒的制备。
在以下描述的实施例中，包含启动子、argS和lysA的DNA片段用来增强lysA。然而，argS对本发明不是必要的。其允许使用在其中lysA就连接在启动子下游的DNA片段。
包含argS和lysA以及由核苷酸序列编码的推断的氨基酸序列的DNA片段的核苷酸序列在SEQ ID NO18中例证。由argS编码的氨基酸序列的实例在SEQ ID NO19中显示，由lysA编码的氨基酸序列的实例在SEQ ID NO12中显示。除编码这些氨基酸序列的DNA片段之外，如果对DDC活性实质上没有影响，本发明可以等同地使用编码实质上与SEQ ID NO12所示的氨基酸序列相同的氨基酸序列(即具有基于例如取代、缺失或插入一个或多个氨基酸之突变的氨基酸序列)的DNA片段。可以用与编码具有突变(只要对AK活性实质上没有影响和对L-赖氨酸和L-苏氨酸的协同反馈抑制的脱敏没有影响)的AK的DNA的那些相同的方式获得具有自发和人工突变的lysA。(2)ppc的制备可以借助PCR从棒状杆菌的染色体制备包含ppc的DNA片段。对DNA供体没有特别的限制，然而，由乳发酵短杆菌ATCC13869菌株所例证。
对乳发酵短杆菌的ppc序列是已知的(参见O′Regan，M.等，基因，77，237-251(1989))，基于该序列可以制备PCR的DNA引物。这样的DNA引物由分别具有序列表SEQ ID NO13和14中所示的核苷酸序列的23-链节DNA所具体例证。可以以与以上所述的有关lysC的那些相同的方式进行DNA的合成、PCR和包含获得的ppc的质粒的制备。
包含ppc之DNA片段的核苷酸序列和由所述核苷酸序列编码的推断的氨基酸序列在SEQ ID NO15中显示。单独的氨基酸序列在SEQ ID NO16中显示。
除编码这种氨基酸序列的DNA片段之外，如果对PEPC活性实质上没有影响，本发明可以等同地使用编码实质上与SEQ ID NO16所示的氨基酸序列相同的氨基酸序列(即具有基于例如取代、缺失或插入一个或多个氨基酸之突变的氨基酸序列)的DNA片段。可以用与编码具有突变(只要对AK活性实质上没有影响和对L-赖氨酸和L-苏氨酸的协同反馈抑制的脱敏没有影响)的AK的DNA的那些相同的方式获得具有自发和人工突变的ppc。
棒状杆菌的ppc与gap(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)、pgk(磷酸甘油酸盐激酶基因)和tpi(丙糖磷酸异构酶基因)一道形成操纵子，并且ppc存在于tpi的下游。ppc的表达由存在于pgk上游的启动子调节(参见Schwinde，J.W.等，细菌学杂志，175(12)，3905-3908(1993))。因此，类似以上提到的lysA，ppc可以与pgk和tpi一道经PCR扩增，以使用包含pgk、tpi和ppc的DNA片段，如以下描述的实施例所示，允许使用在其中合适的启动子就连接在PEPC编码区上游的DNA片段。所述的启动子包括lysC启动子、来源于大肠杆菌的tac启动子和trc启动子。2.本发明的重组DNA和棒状杆菌所述重组DNA包含编码天冬氨酸激酶(其中实质上脱敏了L-苏氨酸L-赖氨酸的反馈抑制)的DNA序列和编码二氨基庚二酸脱羧酶的DNA序列，并且在棒状杆菌细胞中可自主复制。在一个优选的实施方案中，所述重组DNA除了包含以上所述的DNA序列外还包含编码磷酸烯醇丙酮酸羧酶的DNA序列。
本发明的棒状杆菌含有天冬氨酸激酶(突变AK)，在其中由L-赖氨酸和L-苏氨酸产生的反馈抑制实质上被脱敏，其中所说的编码二氨基庚二酸脱羧酶的DNA序列被增强。
术语＂增强＂本文指这一事实通过例如，增加基因的拷贝数，用强启动子，使用编码具有高比活性的酶的基因或者组合这些方法，由所说DNA编码的酶的胞内活性得到提高。
含有突变AK的棒状杆菌可以是作为突变的结果产生突变天冬氨酸激酶的那些或通过引入突变lysC转化的那些。
用以引入以上所述的DNA棒状杆菌的例子包括，例如，下列赖氨酸-产生野生型菌株Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870；Corynebacterium acetocrlutamicum ATCC 15806；美棒杆菌ATCC 15991；谷氨酸棒杆菌ATCC 13032；(Brevibacterim divaricatum)ATCC 14020；(乳发酵短杆菌)ATCC 13869；(Corynebacterium lilium)ATCC 15990；(Brevibacterium flavum)ATCC 14067；Corynebacterium melassecola ATCC 17965；Brevibacterium saccharolvticum ATCC 14066；Brevibacterium immariophilum ATCC 14068；Brevibacterium roseum ATCC 13825；Brevibacterium thioaenitalis ATCC 19240；Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354；Corynebacterium thermoaminoaenes AJ12340(FERM BP-1539)除了以上所述的细菌菌株外，其他可用的宿主包括，例如，来源于以上所述菌株的具有L-赖氨酸-产生能力的突变菌株。这样的的人工突变菌株包括如下菌株(2-氨乙基)-半胱氨酸(在下文中简称为＂AEC＂)抗性突变菌株，如乳发酵短杆菌AJ11082(NRRL B-1147)，日本专利出版物56-1914、56-1915、57-14157、57-14158、57-30474、58-10075、59-4993、61-35840、62-24074、62-36673、5-11958、7-112437和7-112438)；突变菌株，其生长需要氨基酸(如L-高丝氨酸)的突变菌株(日本专利出版物48-28078和56-6499)；显示出对AEC的抗性并需要氨基酸如L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸的突变菌株(美国专利3,708,395和3,825,472)；显示出对DL-α-氨基-ε-己内酰胺、α-氨基-月桂内酰胺、天冬氨酸-类似物、磺胺类药、醌型和N-月桂酰亮氨酸抗性的L-赖氨酸-产生突变菌株；显示出对oxyaloacetate脱羧酶抑制剂或呼吸系统酶抗性的L-赖氨酸-产生突变菌株(日本专利申请公开50-53588、50-31093、52-102498、53-9394、53-86089、55-9783、55-9759、56-32995和56-39778，以及日本专利出版物53-43591和53-1833)；需要肌醇或醋酸的L-赖氨酸-产生突变菌株(日本专利申请55-9784和56-8692)；对氟丙酮酸或不低于34℃的温度表现出敏感性的L-赖氨酸-产生突变菌株(日本专利申请公开55-9783和53-86090)；属于短杆菌属或棒杆菌属的表现出对乙二醇抗性并产生L-赖氨酸的产生突变菌株(美国专利4,411,997)。
在一个特定的实施方案中，为了如上所述在宿主中增强L-赖氨酸生物合成基因，通过采用质粒载体、转座子或噬菌体载体或类似物将所述基因引入到宿主中。一旦引入，就预期会有某种程度的增强，即使使用低拷贝型载体。然而，优选地是采用多拷贝型载体。这样载体包括，例如以上所述的质粒载体，pAJ655、pAJ1844、pAJG11、pAJ3148和pAJ440。此外，在以下文献中描述了来源于棒状杆菌的转座子国际出版物WO02/02627和WO93/18151，欧洲专利出版物445385，日本专利申请公开6-46867；Vertes，A.A.等，分子微生物学，11，739-746(1994)，；Bonamy，C.，等，分子微生物学，14，571-581(1994)；Vertes，A.A.等，Mel.Gen.Genet.，245，397-405(1994)；Jagar，W.等，FEMS微生物学通讯，126，1-6(1995)，日本专利申请公开7-107976；日本专利申请公开7-327680等。
在本发明中，不可缺少的是突变lysC必需被增强。允许使用在染色体DNA上的lysC的突变的那些或者其中突变lysC掺入到染色体DNA中从那些。另外，突变lysC可以通过用质粒载体引入。另一方面，为了有效地产生L-赖氨酸，优选地是增强lysA和ppc。
通过分别采用不同的载体，可以成功地将lysC、dspA和ppc各基因引入宿主中。另外，可以用单一载体将二或三种基因一起引入。当使用不同的载体时，基因可以以任何秩序引入，然而，优选地使用这样一些载体，它们具有在宿主细胞中的稳定参与和隐藏机制，并且能够相互共存。
通过例如向宿主棒状杆菌引入在棒状杆菌细胞中可自主复制的包含突变lysC、lysA和ppc的重组DNA，获得含有突变AK并包含增强的lysA的棒状杆菌。
除了含有突变lysC和lysA之外还含有增强的ppc的棒状杆菌可以通过将包含突变lysC、lysA和ppc的在棒状杆菌细胞中可自主复制的重组DNA引入到宿主棒状杆菌中获得。含有增强的突变lysC，lysA和ppc的棒状杆菌也可以通过将包含ppc的在棒状杆菌细胞中可自主复制的重组DNA引入到含有增强的突变lysC和lysA的宿主棒状杆菌中获得。
可以通过例如把以上所述的参与L-赖氨酸生物合成的各基因插入到载体(如质粒载体，转座子或噬菌体载体)中获得上述重组DNA。
在其中质粒用作载体情况下，按照电脉冲方法(Sugimoto等，日本专利申请公开2207791)可以将重组DNA引入宿主。用转座子的基因扩增可以通过引入质粒进行，该质粒把转座子携带至宿主细胞，并诱导转座子转座。3用于产生L-赖氨酸的方法通过在合适的培养基中培养棒状杆菌(包含如上所述的L-赖氨酸生物合成的增强的基因)，使得L-赖氨酸在细菌培养物中产生和积累，并从培养物收集L-赖氨酸，由此可以有效地产生L-赖氨酸。
所用的培养基的例举性例子是包含碳源、氮源、无机离子和可有可无的其它有机组分的普通培养基。
作为碳源，可以用食糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜和淀粉水解物；和有机酸，如富马酸、柠檬酸和琥珀酸。
作为氮源，可以用无机铵盐，如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵；有机氮，如大豆水解物；氨气和氨水。
作为有机微量营养源，以合适的量包含所需物质(如维生素B1和L-高丝氨酸或酵母提取物等)是合乎需要的。此外，如果需要，少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
培养优选地在需氧条件下进行大约30至90小时。在培养期间培养温度优选地控制在25℃到37℃，pH优选地控制在5至8。无机或有机，酸性或碱性物质或氨气等可以用于调节pH。可以用普通的离子交换树脂法、沉淀法和其它已知方法结合起来从培养物收集赖氨酸。
实施例以下参照实施例更详细地解释本发明。实施例1从乳发酵短杆菌制备野生型lysC基因和突变lysC基因1制备野生型和突变lysC和制备含有它们的质粒将乳发酵短杆菌ATCC 13869菌株和通过突变处理从ATCC 13869菌株获得的L-赖氨酸-产生突变菌株AJ3445(FERM P-1944)用作染色体DNA供体。AJ3445菌株已经历突变，使lysC改变得实质上脱敏了由赖氨酸和苏氨酸产生的协同抑制(生物化学杂志，68，701-710(1970))。
用PCR法(聚合酶链反应；参见White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))从染色体DNA扩增包含lysC的DNA片段，就用于扩增的DNA引物而言，为了扩增编码lysC的1,643bp的区，基于谷氨酸棒杆菌已知的序列(参见分子微生物学(1991)，5(5)，1197-1204；和Mel.Gen.Genet.(1990)，224，317-324)合成23链节和21链节(具有SEQ ID NO1和2所示的核苷酸序列)的单链DNA序列。经Applied Biosystems生产的DNA合成仪380B型用普通方法和用phosphoamidite法(参见Tetrahedron Letters(1981)，22，1859)合成DNA。
通过用Takara Shuzo生产的DNA热循环仪PJ2000型按照供给者指定的方法和用尾端DNA聚合酶经PCR扩增所说的基因。由琼脂糖凝胶电泳确认1,643bp的扩增的基因片段。之后，用普通的方法纯化从凝胶上切下的片段，用限制酶NruI(由Takara Shuzo生产)和EcoRI(由Takara Shuzo生产)消化该片段。
将pHSG399(参见，s.等，基因(1987)，6163-74)用作基因片段的克隆载体。用限制酶SmaI(由Takara Shuzo生产)和EcoRI消化pHSG399，将其与扩增的lysC片段连接。按照指定的方法用DNA连接试剂盒(由Takara Shuzo生产)连接DNA。由此制备质粒，其中从乳发酵短杆菌染色体扩增的lysC片段分别与pHSG399连接。包含ATCC 13869(野生型菌株)lysC的质粒命名为p399AKY，包含AJ 3463(L-赖氨酸-产生菌)lysC的质粒命名为p399AK9。
将具有使细菌在属于棒杆菌属的细菌中可自主复制能力的DNA片段(在下文中称为“Brevi.-ori”)分别引入到p399AKY和p399AK9中，以制备携带有lysC的在属于棒杆菌属的细菌中可自主复制的质粒。从包含Brevi.-ori并且在大肠杆菌和属于棒杆菌属的细菌两种细胞中可自主复制的质粒载体pHK4制备Brevi.-ori。pHK4通过以下方法构建pHK4用KpnI(由Takara Shuzo生产)和BamHI(由Takara Shuzo生产)消化pHC4，提取Brevi.-ori片段，与pHSG298(也已由KpnI和BamHI消化)连接(参见日本专利申请公开5-7491)。pHK4使宿主具有卡那霉素抗性。含有pHK4的大肠杆菌称命名为大肠杆菌AJ13136，该菌株已于1995年8月1日以保藏号FERM BP-5186保藏在国际贸易和工业部工业科学和技术机构的国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi L-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305，日本)。
用限制酶KpnI和BamHI消化pHK4，使切开的末端平端化。按照指定的方法用平端化试剂盒(由Takara Shuzo生产)进行平端的形成。形成平端后，连接上磷酸化BamHI接头(由Takara Shuzo生产)进行修饰，使相应于Brevi.-ori部分的DNA片段可以仅经BamHI消化从pHK4切下。用BamHI消化这一质粒，将所产生的Brevi.-ori DNA片段与p399AKY和p399AK9(也已分别用BamHI消化)连接，以制备各自含有在属于棒杆菌属的细菌中可自主复制的lysC基因的质粒。
包含源于p399AKY的野生型lysC基因的质粒命名为p399AKYB，包含源于p399AK9的突变lysC基因的质粒命名为p399AK9B。p399AK9B和p399AKYB的构建方法在图1中显示。通过把突变lysC质粒p399AK9B引入乳发酵短杆菌野生型菌株所获得的菌株AJ12691(AJ12036菌株，FERM 734)已于1992年4月10日以保藏号FERM P-12918保藏在国际贸易和工业部工业科学和技术机构的国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi L-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305，日本)，基于布达佩斯条约于1995年2月10日转变成国际保藏，以保藏号FERM BP-4999保藏。2测定乳发酵短杆菌野生型lysC和突变lysC的核苷酸序列从各自的转化体制备包含野生型lysC的质粒p399AKY和包含突变lysC的质粒p399AK9，以测定野生型与突变lysC的核苷酸序列。核苷酸序列测定按照Sanger等(例如F.Sanger等，美国科学院学报，74，5463(1977))的方法进行。
由p399AKY编码的野生型lysC的核苷酸序列在序列表SEQ ID NO3中显示。另一方面，由p399AK9编码的突变lysC的核苷酸序列仅具有一个核苷酸突变，这样与野生型lysC比较，在SEQ ID NO3中的1051位G改变成A。已知谷氨酸棒杆菌的lysC有两个在同一DNA链上的同一读框中编码的亚单位(α，β)(参见，Kalinowski，J.等，分子微生物学(1991)5(5)，1197-1204)。从同源性判断，假定此处测序的基因也具有两个在同一DNA链上的同一读框中编码的亚单位(α，β)。
从DNA的核苷酸序列推断的野生型AK蛋白质α-亚单位的氨基酸序列与DNA序列一起在SEQ ID NO4中显示。单独的氨基酸序列在SEQ ID NO5中显示。从DNA的核苷酸序列推断的野生型AK蛋白质β-亚单位的氨基酸序列与DNA序列一起在SEQ ID NO6中显示。单独的氨基酸序列在SEQ ID NO7中显示。在每一亚单位中，GTG用作起始密码子，相应的氨基酸由甲硫氨酸代表。然而，这种代表指甲硫氨酸、缬氨酸或甲酰甲硫氨酸。
另一方面，在突变lysC序列上的突变指出现氨基酸残基取代，以便在野生型AK蛋白质氨基酸序列中α-亚单位的279位丙氨酸残基改变成为苏氨酸残基，β-亚单位的30位丙氨酸残基改变成为苏氨酸残基(SEQ ID NO5、7)。实施例2从短杆菌属制备lysA1制备lysA和构建含有lysA的质粒乳发酵短杆菌野生型菌株ATCC13869用作染色体DNA供体。按照普通方法从ATCC13869菌株制备染色体DNA。按照PCR从染色体DNA扩增包含argS、lysA和操纵子的启动子的DNA片段。就用于扩增的DNA引物而言，为了扩增编码精氨酰-tRNA合酶和DDC的3.6kb的区，基于谷氨酸棒杆菌已知的序列(参见分子微生物学，4(11)，1819-1830(1990)；分子和普通遗传学，212，112-119(1988))，使用23链节(分别具有序列表中SEQ ID NO8和9所示的核苷酸序列)的合成DNA，DNA合成和PCR以与实施例1所描述的相同的方式进行。将pHSG399用作扩增3,579bp的基因片段的克隆载体，用限制酶SmaI(由Takara Shuzo生产)消化pHSG399，该质粒与包含扩增的lysA的DNA片段连接。具有源于ATCC13869的lysA的如上所述获得的质粒命名为p399LYSA。
通过以KpnI(由Takara Shuzo生产)和BamHI(由Takara Shuzo生产)消化p399LYSA提取包含lysA的DNA片段。将这一片段与pHSG299(已由KpnI和BamHI消化)。构建p399LYSA的方法在图2中显示。
将Brevi.-ori引入到制备的p399LYSA中以构建在棒状杆菌中可自主复制的携带lys4的质粒。用限制酶KpnI和BamHI消化pHK4，使切开的末端平端化。按照指定的方法用平端化试剂盒(由Takara Shuzo生产)进行平端的形成。形成平端后，连接上磷酸化KpnI接头(由Takara Shuzo生产)进行修饰，使相应于Brevi.-ori部分的DNA片段可以仅经KpnI消化从pHK4切下。用KpnI消化这一质粒，将所产生的Brevi.-ori DNA片段与p299LYSA(也已用KpnI消化)连接，以制备含有在棒状杆菌中可自主复制的lysA基因的质粒。所制备的质粒命名为pLYSAB。pLYSAB的构建方法在图3中显示。2测定乳发酵短杆菌lysA的核苷酸序列制备质粒p299LYSA的DNA，以与实施例1中描述的相同的方式测定其核苷酸序列。所测定的核苷酸序列和从该核苷酸序列推断的氨基酸序列在SEQ ID NO10中显示，有关核苷酸序列，由lysA编码的氨基酸序列和由argS编码的氨基酸序列分别在SEQ ID NO11和12中显示。实施例3从短杆菌属制备ppc1制备ppc乳发酵短杆菌野生型菌株ATCC13869用作染色体DNA供体。按照普通方法从ATCC13869菌株制备染色体DNA。按照PCR从染色体DNA扩增包含ppc的DNA片段。就用于扩增的DNA引物而言，为了扩增编码PEPC的3.3kb的区，基于谷氨酸棒杆菌已知的序列(参见O′Regan，M.等，基因，77，237-251(1989))，使用23链节的分别具有序列表中SEQ ID NO13和14所示的核苷酸序列的合成DNA，DNA合成和PCR以与实施例1所描述的相同的方式进行。
由琼脂糖凝胶电泳确认3,300bp的扩增的基因片段。之后，用普通的方法纯化从凝胶上抽提的片段，用限制酶SalI(由Takara Shuzo生产)消化该片段。将pHSG399用作ppc的克隆载体。以限制酶SalI(由Takara Shuzo生产)消化pHSG399，将其与包含扩增的DNA片段的质粒连接，具有来源于ATCC13869的ppc的如上所述的获得的质粒命名为ppcF。2将ppc与具有lysC启动子的基因连接用限制酶DraI(由Takara Shuzo生产)消化如上所述的所获得的ppcF。在除去PEPC结构基因上游的约150bp的DNA片段后，进行自连接，以获得质粒ppcFds。以限制酶SalI(由Takara Shuzo生产)消化ppcFds，使切开的末端平端化。按照指定的方法经采用DNA平端化试剂盒(由Takara Shuzo生产)完成平端形成。
用限制酶ApaLI和PstI(两者都由Takara Shuzo生产)消化实施例1中所获得的含有野生型lysC的p399AKYB，以与以上类似的方式使切开的末端平端化。在所获得的两个DNA片段中的较小的一个含有Brevi.-ori和lysC启动子。将这一片段与以上提到的片段(通过用SalI消化ppcFds并经采用DNA连接试剂盒(由Takara Shuzo生产)平端化获得)连接。
用电脉冲法(Sugimoto等，日本专利申请公开2-207791)将在连接溶液中的DNA引入到乳发酵短杆菌ATCC13969中。在含有5μg/ml氯霉素的完全培养基上选择转化体。从转化体收集质粒DNA，用EcoRI消化以获得其中lysC启动子以正常的方向与ppc的结构基因连接的质粒。所获得的质粒命名为pAKPFds。pAKPFds的构建方法在图4中显示。与lysC启动子连接的ppc此后称为＂野生型高表达ppc＂。3将野生型高表达ppc插入到载体中以上获得的野生型高表达ppc经PCR扩增，以便将其插入到具有在棒状杆菌中可自主复制的复制起点而不是Brevi.-ori的载体中。就DNA引物而言，其是相应于在谷氨酸棒杆菌已知的lysC序列(参见分子微生物学，5(5)，1197-1204(1991)；Mel.Gen.Genet.，224，317-324(1990))基础上合成的lysC启动子部分的寡核苷酸(SEQ ID NO7)，和相应于在谷氨酸棒杆菌已知的ppc序列(参见O’Regan，M.等，基因，77，237-251(1989))基础上合成的ppc部分的寡核苷酸(SEQ ID NO8)。设计这些引物，以便可以扩增含有野生型高表达ppc的约3,150bp的片段，并且可以用限制酶KpnI消化最终的扩增DNA片段。DNA合成和PCR可以以与实施例1所描述的相同的方式进行。
作为用于把野生型高表达ppc引入棒状杆菌的载体，使用新构建的棒状杆菌的克隆载体pVK7。如以下描述通过将大肠杆菌的载体pHSG299(Kmr；Takeshita，S.等，基因，61，63-74(1987))与乳发酵短杆菌的隐蔽性质粒pAM330构建pVK7。以形成一个切割位点的限制酶AvaII(由Takara Shuzo生产)消化pHSG299，用T4 DNA聚合酶平端化，并与已用HindIII(由Takara Shuzo生产)消化和用T4 DNA聚合酶平端化的pAM330连接。根据在pHSG299中所插入的pAM330的方向，两个获得的质粒命名为pVK6和pVK7，pVK7用于下列实验中。pVK7是在大肠杆菌和乳发酵短杆菌两者中可自主复制的，并且具有来源于pHSG299和lacZ’的多克隆位点。pVKG和pVK7的构建方法在图5中显示。
由琼脂糖凝胶电泳确认3,150bp的扩增的基因片段。之后，用普通的方法纯化从凝胶上切下的片段，用限制酶KpnI(由Takara Shuzo生产)消化该片段。将该DNA片段与已由限制酶KPnI消化的pVK7连接。所制备的质粒命名为pPwm。pPwm的构建方法在图6中显示。实施例4制备包含组合突变的lysC和lysA的质粒从含有突变lysC和Brevi.-ori的质粒p399AK9B和含有lysA的质粒p299LYSA制备含有lysC、lysA和棒状杆菌的复制起点的质粒。以限制酶BamHI和KpnI(两者都由Takara Shuzo生产)消化p299LYSA，并平端化。按照指定的方法用DNA平端化试剂盒(由Takara Shuzo生产)进行平端形成。将所获得的DNA片段与p399AK9B(已由SalI消化并平端化)连接。由此制备在棒状杆菌中可自主复制的含有突变lysC和lysA的质粒。该质粒命名为pCL。pCL的构建方法在图7中显示。比较实施例1从乳发酵短杆菌制备dapA、dapB和ddh按如下方法获得L-赖氨酸生物合成相关的非lysC，lysA和ppc的基因dapA(二氢二吡啶甲酸合酶基因)、dapB(二氢二吡啶甲酸还原酶基因)和ddh(二氨基庚二酸脱氢酶基因)。1制备dapA和构建含有dapA的质粒乳发酵短杆菌野生型菌株ATCC13869用作染色体DNA供体。按照普通方法从ATCC13869菌株制备染色体DNA。按照PCR从染色体DNA扩增包含dapA的DNA片段。就用于扩增的DNA引物而言，为了扩增编码DDPS的1.5kb的区，基于谷氨酸棒杆菌已知的序列(核酸研究，18(21)，6421(1990)；EMBL保藏号X53993)合成23链节的分别具有序列表中SEQ ID NO19和20所示的核苷酸序列的DNA，DNA合成和PCR以与实施例1所描述的相同的方式进行。将pCR-1000(由Invitrogen生产，参见生物技术，9，657-663(1991))用作扩增1,411bp的基因片段的克隆载体，将其与扩增的dapA片段连接。DNA的连接按照指定的方法用DNA连接试剂盒进行。由此构建质粒，其中从乳发酵短杆菌染色体扩增的1,411bp dapA片段与pCR-1000连接。具有源于ATCC13869的dapA的如上所述获得的质粒命名为pCRDAPA。
基于布达佩斯条约，通过把pCRDAPA引入大肠杆菌JM109菌株获得的转化菌株AJ13106已从1995年5月26日以保藏号FERM BP-5113国际保藏在国际贸易和工业部工业科学和技术机构的国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi L-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305，日本)。
将Brevi.-ori引入到制备的pCRDAPA中以构建在棒状杆菌中可自主复制的携带dapA的质粒。用限制酶KpnI和BamHI(由Takara Shuzo生产)消化pHK4，使切开的末端平端化。按照指定的方法用平端化试剂盒(由Takara Shuzo生产)进行平端的形成。形成平端后，连接上磷酸化SmaI接头(由Takara Shuzo生产)进行修饰，使相应于Brevi.-ori部分的DNA片段可以仅经SmaI消化从pHK4切下。用SmaI消化这一质粒，将所产生的Brevi.-ori DNA片段与pCRDAPA(也已用SmaI消化)连接，以制备含有在棒状杆菌中可自主复制的dapA基因的质粒。所制备的质粒命名为pDPSB。pDPSB(Kmr)的构建方法在图8中显示。2制备dapB和构建含有dapB的质粒乳发酵短杆菌野生型菌株ATCC13869用作染色体DNA供体。按照普通方法从ATCC13869菌株制备染色体DNA。按照PCR从染色体DNA扩增包含dapB的DNA片段。就用于扩增的DNA引物而言，为了扩增编码DDPR的2.0kb的区，基于乳发酵短杆菌已知的序列(参见细菌学杂志，175(9)，2743-2749(1993))分别合成23链节(分别具有序列表中SEQ ID NO21和22所示的核苷酸序列)的DNA，DNA合成和PCR以与实施例1所描述的相同的方式进行。将pCR-Script(由Invitrogen生产)用作扩增2,001bp的基因片段的克隆载体，将其与扩增的dapB片段连接。由此构建质粒，其中从乳发酵短杆菌染色体扩增的2,001bp dapB片段与pCR-Script连接。具有源于ATCC13869的dapB的如上所述获得的质粒命名为pCRDAPB。基于布达佩斯条约，通过把pCRDAPB引入大肠杆菌JM109菌株获得的转化菌株AJ13107已从1995年5月26日以保藏号FERM BP-5114国际保藏在国际贸易和工业部工业科学和技术机构的国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi L-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305，日本)。
通过以EcoRV和SphI消化pCRDAPB提取包含DDPR结构基因的1,101bp片段。将这一片段与pHSG399(已由HincII和SghI消化)以制备质粒。该制备的质粒命名为p399DPR。
将Brevi.-ori引入到制备的p399DPR中以构建在棒状杆菌中可自主复制的携带dapB的质粒。用限制酶KpnI(由Takara Shuzo生产)消化pHK4，使切开的末端平端化。按照指定的方法用平端化试剂盒(由Takara Shuzo生产)进行平端的形成。形成平端后，连接上磷酸化BamHI接头(由Takara Shuzo生产)进行修饰，使相应于Brevi.-ori部分的DNA片段可以仅经BamHI消化从pHK4切下。用BamHI消化这一质粒，将所产生的Brevi.-ori DNA片段与p399DPR(也已用BamHI消化)连接，以制备含有在棒状杆菌中可自主复制的dapB基因的质粒。所制备的质粒命名为pDPRB。pDPRB的构建方法在图9中显示。3制备ddh和构建包含ddh的质粒按照PCR方法采用两种寡核苷酸引物(SEQ ID NO23，24)从乳发酵短杆菌ATCC13869染色体DNA ddh基因扩增来获得ddh基因，所述引物是基于谷氨酸棒杆菌ddh基因的已知核苷酸序列(Ishino，S.等，核酸研究，15，3917(1987))制备的。将所获得的扩增DNA片段用EcoT22I和AvaI消化，使切开末端平端化。之后，将该片段插入到pMW119的SmaI位点中以便获得质粒pDDH。
接着，用SalI和EcoRI消化pDDH，并形成平端。之后，将所获得的片段与已由SmaI消化的pUC18连接。这样获得的质粒命名为pUC18DDH。
将Brevi.-ori引入pUC18DDH，以构建在棒状杆菌中可自主复制的携带ddh的质粒。以限制酶KpnI和BamHI消化pHK4。使切开的末端平端化。按照指定的方法用平端化试剂盒(由Takara Shuzo生产)进行平端的形成。形成平端后，连接上磷酸化PstI接头(由Takara Shuzo生产)，以便将其插入到pHSG299的PstI位点中。如以上所述构建的质粒命名为pP4。接着，以XbaI和KpnI消化pUC18DDH，将所产生的片段与已由KpnI和XbaI消化的pPK4连接。这样，构建了在棒状杆菌中可自主复制的包含ddh的质粒。这一质粒命名为pPK4D。pPK4D的构建方法在图10中显示。比较实施例2构建含有组合的突变lysC和dapA、dapB或ddh的质粒1构建含有突变lysC和dapA的质粒从包含dapA的质粒pCRDAPA和包含突变lysC和Brevi.-ori的质粒p399AK9B构建包含突变lysC、dapA和棒状杆菌复制源的质粒。以SalI完全消化p399AK9B，然后平端化，并与EcoRI接头连接，以构建其中SalI位点修饰成EcoRI位点的质粒。所获得的质粒命名为p399AK9BSE。通过以EcoRI部分消化p399AK9BSE作为一个片段切下突变lysC和Brevi.-ori。将这一片段与已用EcoRI消化的pCRDAPA连接。所获得的质粒命名为pCRCAB。这一质粒在大肠杆菌和棒状杆菌中可自主复制，其使宿主具有对卡那霉素的抗性，该质粒包含组合的突变lysC和dapA。pCRCAB的构建方法在图11中显示。2构建包含组合的突变lysC和dapB的质粒从具有突变lysC的质粒p399AK9和具有dapB的质粒p399DPR构建包含突变lysC和dapB的质粒。通过以EcoRV和SphI消化p399DPR提取包含DDPR结构基因的1,101bp的片段。将这一片段与已用SalI消化，然后平端化，并进一步由SphI消化的p399AK9连接，以构建包含组合的突变lysC和dapB的质粒。这一质粒命名为p399AKDDPR。
其次，将Brevi.-ori引入所获得的p399AKDDPR。以限制酶KpnI(由Takara Shuzo生产)消化包含Brevi.-ori的质粒pHK4，使切下的边缘平端化。按照指定的方法用平端化试剂盒(由Takara Shuzo生产)进行平端的形成。形成平端后，连接上磷酸化BamHI接头(由Takara Shuzo生产)进行修饰，使相应于Brevi.-ori部分的DNA片段可以仅经BamHI消化从pHK4切下。用BamHI消化这一质粒，将所产生的Brevi.-ori DNA片段与p399AKDDPR(也已用BamHI消化)连接，以构建在棒状杆菌中可自主复制的含有突变lysC和dapB的质粒。构建的质粒命名为pCB。pCB的构建方法在图12中显示。3构建含有组合突变lysC和ddh的质粒自包含ddh的质粒pUC18DDH和包含突变lysC和Brevi.-ori的质粒p399AK9B制备包含突变lysC、ddh的和棒状杆菌的复制起点的质粒。以限制酶EcoRI(由Takara Shuzo生产)消化pUC18DDH，并平端化，将其在末端与SalI多接头连接，以便将EcoRIJ位点改变成SalI位点。用SalI消化所获得的质粒，以获得含有ddh的DNA片段。
然后，用限制酶SalI消化p399AK9B，将其与包含ddh的DNA片段连接。这样，由此制备在棒状杆菌中可自主复制的包含突变lysC、ddh和Brevi.-ori的质粒，该质粒命名为pCD。pCD的构建方法在图13中显示。实施例5将包含L-赖氨酸生物合成基因的质粒引入到乳发酵短杆菌L-赖氨酸-产生菌中将如上所述构建的质粒分别引入乳发酵短杆菌L-赖氨酸-产生菌AJ11082(NRRL B-11470)中，所述质粒即p399AK9B(Cmr)、pLYSAB(Cmr)、pPwm(Kmr)、pCRCAB(Kmr)、pCB(Cmr)、pCD(Cmr)和pCL(Cmr)。AJ11082菌株具有AEC抗性。按照电脉冲方法引入质粒(Sugimoto等，日本专利申请公开2-207791)，基于质粒具有的药物抗性标记选择转化体，当包含氯霉素抗性基因的质粒被引入时，在包含5μg/ml氯霉素完全培养基上选择转化体，当包含卡那霉素抗性基因的质粒被引入时，在包含25μg/ml卡那霉素完全培养基上选择转化体。
向所获得的转化体中的突变lysC和lysA被增强的菌株中引入pPwm(Kmr)，以获得其中三种突变lysC、lysA和ppc被增强的菌株(AJ11082/pCL/pPwm)。在含有5μg/ml氯霉素和25μg/ml卡那霉素的完全培养基上选择转化体。实施例6L-赖氨酸的产生在L-赖氨酸-产生培养基中培养实施例5中所获得的各种转化体，以估价L-赖氨酸产量。L-赖氨酸-产生培养基具有下列组成。[L-赖氨酸-产生培养基]除了碳酸钙外，溶解下列组分(在1升中)，用KOH调节pH为8.0。于115℃灭菌15分钟，将已经以干燥状态在热气流中分别灭菌过的碳酸钙(50g)加入其中。
葡萄糖 130g(NH4)2SO455gKH2PO41gMgSO4·7H2O1g生物素 500μg硫胺 2000μgFeSO4·7H2O0.01gMnSO4·7H2O0.01g烟酰胺 5mg蛋白质水解物(Mamenou)30ml碳酸钙 50g将各种类型的转化体和亲本菌株接种到具有以上组成的培养基中，以进行在31.5℃下的往复振荡培养。在培养40或72小时和生长72小时(OD562)后产生的L-赖氨酸的量在表1中显示。在表中，lysC*代表突变lysC。
表1在40或72小时培养后积累的L-赖氨酸细菌菌株/质粒 引入的基因 产生的L-赖氨酸量(g/l)40h后72h后AJ 11082 22.0 29.8AJ 11082/p399AK9B lysC* 16.8 34.5AJ 11082/pLYSABlysA19.8 32.5AJ 11082/pPwm ppc 20.7 28.9AJ 11082/pCRCABlysC*，dapA 19.7 36.5AJ 11082/pCB lysC*，dapB 23.3 35.0AJ 11082/pCD lysC*，ddh 15.0 27.0AJ 11082/pCL lysC*，lysA 24.0 44.0AJ 11082/pCL/pPwm lysC*，lysA，ppc25.0 45.2如上所示，当突变lysC、lysA或ppc单独增强时或者当突变lysC和dapA或ddh一起增强时，培养72小时后产生的L-赖氨酸的量大于由亲本菌株产生的量，然而，培养40小时后产生的L一赖氨酸的量小于由亲本菌株产生的量。即，在短的培养时间内，L-赖氨酸-产生速度降低。同样地，当突变lysC和ddh一起增强时，培养40和72小时后产生的L-赖氨酸的量大于由亲本菌株产生的量。相反，在其中dapB与突变lysC一道增强的菌株的情况下，在短的培养时间内L-赖氨酸产生速度成功地恢复，在长的培养时间内所积累的L-赖氨酸的量也得到提高。
在其中三种突变lysC、lysA和ppc同时增强的情况下，L-赖氨酸的产量得到进一步的提高。
序列表(1)一般信息(i)申请人AJINOMOTO有限公司(ii)发明名称用于产生L-赖氨酸的方法(iii)序列数24个(iv)通讯地址(A)收信人(B)街道(C)城市(E)国家(F)ZIP(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patentln Release#，版本#1.30(vi)当前申请的数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(vii)在先申请的数据(A)申请号JP 8-325659(B)申请日1996年12月5日(viii)律师/代理人信息(A)姓名(B)登记号(ix)电信信息(A)电话(B)传真(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝＂合成的DNA＂(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO1TCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度21个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO2ACGGAATTCA ATCTTACGGC C21(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度1643个碱基(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型基因组DNA(vi)原始来源(A)有机体乳发酵短杆菌(B)菌株ATCC 13869(xi)序列描述SEQ ID NO3TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT240GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC300ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT360GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG420CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT480GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC540GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC600AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG660TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT720GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT780AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC840TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC900GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT960CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG 1320CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度1643个碱基(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型基因组DNA(vi)原始来源(A)有机体乳发酵短杆菌(B)菌株ATCC 13869(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置217..1482(xi)序列描述SEQ ID NO4TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234Met Ala Leu Val Val Gln1 5AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC282Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val10 15 20GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT330Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val25 30 35GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA378Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala40 45 50GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG426Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu55 60 65 70ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG474Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu75 80 85TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG522Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val90 95 100CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG570Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro105 110 115GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT618Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala120 125 130GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT666Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly135 140 145 150CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC714Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn155 160 165GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT762Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala170 175 180GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC810Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe185 190 195GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG858Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu200 205 210CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC906Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg215 220 225 230TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG954Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu235 240 245GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys250 255 260TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu265 270 275GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp280 285 290ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile295 300 305 310ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu315 320 325AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp330 335 340CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro345 350 355GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn360 365 370ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg375 380 385 390GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln395 400 405CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg410 415 420AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG1542TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT1602TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C1643(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度421个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg50 55 60Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130 135 140Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155160Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val165 170 175Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200 205Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn210 215 220Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225 230 235 240Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr245 250 255Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile260 265 270Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp275 280 285Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290 295 300Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg305 310 315 320Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330 335Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg370 375 380Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415Ala Gly Thr Gly Arg420(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度1643个碱基(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型基因组DNA(vi)原始来源(A)有机体乳发酵短杆菌(B)菌株ATCC13869(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置964..1482(xi)序列描述SEQ ID NO6TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu1 5 10 15GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala20 25 30AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val35 40 45CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe50 55 60ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys65 70 75CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val80 85 90 95GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val100 105 110ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu115 120 125TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp130 135 140GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly145 150 155GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg160 165 170AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度172个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO7Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala1 5 10 15Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys20 25 30Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu.
35 40 45Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr50 55 60Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu65 70 75 80Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly85 90 95Lys Val Set Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Set His Pro Gly val Thr100 105 110Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp val Asn Val Asn Ile Glu Leu115 120 125Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glo Asp Asp130 135 140Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly145 150 155 160Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg165 170(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基(B)类型核酸(c)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述dcsc=＂合成的DNA＂(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO8GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG 23(2)SEQ ID NO的信息9(i)序列特征(A)长度23个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO9CCAAACCGC CCTCCACGGC GAA(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度3579个碱基(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型基因组DNA(vi)原始来源(A)有机体乳发酵短杆菌(B)菌株ATCC 13869(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置533..2182(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置2188..3522(xi)序列描述SEQ ID NO10GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGTTTTG GTACATGGCT 60TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA120GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT180GATATCGCCA AGTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TGGATGCTGC CACATTGAGC240GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGTTTTCTT GCGCTGCTGC300AGTGGGCATT GATACCAAAA AGGGGCTAAG CGCAGTCGAG GCGGCAAGAA CTGCTACTAC 360CCTTTTTATT GTCGAACGGG GCATTACGGC TCCAAGGACG TTTGTTTTCT GGGTCAGTTA 420CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATGAT TTTTCATTAA AAAGGCAGGG ATTTGTTATA 480AGTATGGGTC GTATTCTGTG CGACGGGTGT ACCTCGGCTA GAATTTCTCC CC ATG 535Met1ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GCG GTA GAG GTT 583Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu Val5 10 15TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT 631Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val Val20 25 30GTG GAG CGT CCG CGT AAC CCA GAG CAC GGC GAT TAC GCC ACC AAC ATT 679Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn Ile35 40 45GCA TTG CAG GTG GCT AAA AAG GTC GGT CAG AAC CCT CGG GAT TTG GCT 727Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu Ala50 55 60 65ACC TGG CTG GCA GAG GCA TTG GCT GCA GAT GAC GCC ATT GAT TCT GCT 775Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser Ala70 75 80GAA ATT GCT GGC CCA GGC TTT TTG AAC ATT CGC CTT GCT GCA GCA GCA 823Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala Ala85 90 95CAG GGT GAA ATT GTG GCC AAG ATT CTG GCA CAG GGC GAG ACT TTC GGA 871Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe Gly100 105 110AAC TCC GAT CAC CTT TCC CAC TTG GAC GTG AAC CTC GAG TTC GTT TCT 919Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val Ser115 120 125GCA AAC CCA ACC GGA CCT ATT CAC CTT GGC GGA ACC CGC TGG GCT GCC 967Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala Ala130 135 140 145GTG GGT GAC TCT TTG GGT CGT GTG CTG GAG GCT TCC GGC GCG AAA GTG 1015Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys Val150 155 160ACC CGC GAA TAC TAC TTC AAC GAT CAC GGT CGC CAG ATC GAT CGT TTC 1063Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg Phe165 170 175GCT TTG TCC CTT CTT GCA GCG GCG AAG GGC GAG CCA ACG CCA GAA GAC 1111Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu Asp180 185 190GGT TAT GGC GGC GAA TAC ATT AAG GAA ATT GCG GAG GCA ATC GTC GAA 1159Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val Glu195 200 205AAG CAT CCT GAA GCG TTG GCT TTG GAG CCT GCC GCA ACC CAG GAG CTT 1207Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu Leu210 215 220 225TTC CGC GCT GAA GGC GTG GAG ATG ATG TTC GAG CAC ATC AAA TCT TCC 1255Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser Ser230 235 240CTG CAT GAG TTC GGC ACC GAT TTC GAT GTC TAC TAC CAC GAG AAC TCC 1303Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn Ser245 250 255CTG TTC GAG TCC GGT GCG GTG GAC AAG GCC GTG CAG GTG CTG AAG GAC 1351Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys Asp260 265 270AAC GGC AAC CTG TAC GAA AAC GAG GGC GCT TGG TGG CTG CGT TCC ACC 1399Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser Thr275 280 285GAA TTC GGC GAT GAC AAA GAC CGC GTG GTG ATC AAG TCT GAC GGC GAC 1447Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly Asp290 295 300 305GCA GCC TAC ATC GCT GGC GAT ATC GCG TAC GTG GCT GAT AAG TTC TCC 1495Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe Ser310 315 320CGC GGA CAC AAC CTA AAC ATC TAC ATG TTG GGT GCT GAC CAC CAT GGT 1543Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His Gly325 330 335TAC ATC GCG CGC CTG AAG GCA GCG GCG GCG GCA CTT GGC TAC AAG CCA 1591Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Pro340 345 350GAA GGC GTT GAA GTC CTG ATT GGC CAG ATG GTG AAC CTG CTT CGC GAC 1639Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg Asp355 360 365GGC AAG GCA GTG CGT ATG TCC AAG CGT GCA GGC ACC GTG GTC ACC CTA 1687Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr Leu370 375 380 385GAT GAC CTC GTT GAA GCA ATC GGC ATC GAT GCG GCG CGT TAC TCC CTG 1735Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser Leu390 395 400ATC CGT TCC TCC GTG GAT TCT TCC CTG GAT ATC GAT CTC GGC CTG TGG 1783Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu Trp405 410 415GAA TCC CAG TCC TCC GAC AAC CCT GTG TAC TAC GTG CAG TAC GGA CAC 1831Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly His420 425 430GCT CGT CTG TGC TCC ATC GCG CGC AAG GCA GAG ACG TTG GGT GTC ACC 1879Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val Thr435 440 445GAG GAA GGC GCA GAC CTA TCT CTA CTG ACC CAC GAC CGC GAA GGC GAT 1927Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly Asp450 455 460 465CTC ATC CGC ACA CTC GGA GAG TTC CCA GCA GTG GTG AAG GCT GCC GCT 1975Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala Ala470 475 480GAC CTA CGT GAA CCA CAC CGC ATT GCC CGC TAT GCT GAG GAA TTA GCT 2023Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu Ala485 490 495GGA ACT TTC CAC CGC TTC TAC GAT TCC TGC CAC ATC CTT CCA AAG GTT 2071Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys Val500 505 510GAT GAG GAT ACG GCA CCA ATC CAC ACA GCA CGT CTG GCA CTT GCA GCA 2119Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala515 520 525GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC GTT TCC 2167Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val Ser530 535 540 545GCA CCG GAG AAG ATG TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA2214Ala Pro Glu Lys Met Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu550 1 5CTT CCC GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCC GTG CGC CAA GAA GAC GGC 2262Leu Pro Ala His Val Trp Pro Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly10 15 20 25GTT GTC ACC GTC GCT GGT GTG CCT CTG CCT GAC CTC GCT GAA GAA TAC 2310Val Val Thr Val Ala Gly Val Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr30 35 40GGA ACC CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TGT 2358Gly Thr Pro Leu Phe Val Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys45 50 55CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA 2406Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala60 65 70TCT AAA GCG TTC CTG ACC AAG ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG 2454Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu75 80 85GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCC ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCC CTG 2502Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu90 95 100 105GCC GCT GGT TTC CCC GCC AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA 2550Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys110 115 120GGC GTA GAG TTC CTG CGC GCG TTG GTT CAA AAC GGT GTG GGA CAC GTG 2598Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val125 130 135GTG CTG GAC TCC GCA CAG GAA CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCC GCT 2646Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala140 145 150GGT GAA GGC AAG ATT CAG GAC GTG TTG ATC CGC GTA AAG CCA GGC ATC 2694Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile155 160 165GAA GCA CAC ACC CAC GAG TTC ATC GCC ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG 2742Glu Ala His Thr His Glu Phe Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys170 175 180185TTC GGA TTC TCC CTG GCA TCC GGT TCC GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCC 2790Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala190 195 200GCC AAC AAC GCA GAA AAC CTG AAC CTG GTT GGC CTG CAC TGC CAC GTT 2838Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val205 210 215GGT TCC CAG GTG TTC GAC GCC GAA GGC TTC AAG CTG GCA GCA GAA CGC 2886Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg220 225 230GTG TTG GGC CTG TAC TCA CAG ATC CAC AGC GAA CTG GGC GTT GCC CTT 2934Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu235 240 245CCT GAA CTG GAT CTC GGT GGC GGA TAC GGC ATT GCC TAT ACC GCA GCT 2982Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala250 255 260 265GAA GAA CCA CTC AAC GTC GCA GAA GTT GCC TCC GAC CTG CTC ACC GCA 3030Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala270 275 280GTC GGA AAA ATG GCA GCG GAA CTA GGC ATC GAC GCA CCA ACC GTG CTT 3078Val Gly Lys Met Ala Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu285 290 295GTT GAG CCC GGC CGC GCT ATC GCA GGC CCC TCC ACC GTG ACC ATC TAC 3126Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr300 305 310GAA GTC GGC ACC ACC AAA GAC GTC CAC GTA GAC GAC GAC AAA ACC CGC 3174Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg315 320 325CGT TAC ATC GCC GTG GAC GGA GGC ATG TCC GAC AAC ATC CGC CCA GCA 3222Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala330 335 340 345CTC TAC GGC TCC GAA TAC GAC GCC CGC GTA GTA TCC CGC TTC GCC GAA 3270Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp Ala Arg Val Val ser Arg Phe Ala Glu350 355 360GGA GAC CCA GTA AGC ACC CGC ATC GTG GGC TCC CAC TGC GAA TCC GGC 3318Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly365 370 375GAT ATC CTG ATC AAC GAT GAA ATC TAC CCA TCT GAC ATC ACC AGC GGC 3366Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly380 385 390GAC TTC CTT GCA CTC GCA GCC ACC GGC GCA TAC TGC TAC GCC ATG AGC 3414Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser395 400 405TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT 3462Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala410 415 420 425GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC 3510Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu430 435 440TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC 3562Ser Leu Glu Ala445GTGGAGGGCG GTTTTGG 3579(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度550个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO11Met Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu1 5 10 15Val Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val20 25 30Val Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn35 40 45Ile Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu50 55 60Ala Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser65 70 75 80Ala Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala85 90 95Ala Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe100 105 110Gly Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val115 120 125Ser Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala130 135 140Ala Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys145 150 155 160Val Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg165 170 175Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu180 185 190Asp Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val195 200 205Glu Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu210 215 220Leu Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser225 230 235 240Ser Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn245 250 255Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys260 265 270Asp Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser275 280 285Thr Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly290 295 300Asp Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe305 310 315 320Ser Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His325 330 335Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys340 345 350Pro Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg355 360 365Asp Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr370 375 380Leu Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser385 390 395 400Leu Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu405 410 415Trp Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly420 425 430His Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val435 440 445Thr Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly450 455 460Asp Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala465 470 475 480Ala Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu485 490 495Ala Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys500 505 510Val Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala515 520 525Ala Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val530 535 540Ser Ala Pro Glu Lys Met545 550(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度445个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro1 5 10 15Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val20 25 30Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val35 40 45Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe50 55 60Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys65 70 75 80Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala85 90 95Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser100 105 110Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala115 120 125Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu130 135 140Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp145 150 155 160Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe165 170 175Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser180 185 190Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu195 200 205Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala210 215 220Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln225 230 235 240Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly245 250 255Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala260 265 270Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu275 280 285Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile290 295 300Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp305 310 315 320Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly325 330 335Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp340 345 350Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg355 360 365Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu370 375 380Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala385 390 395 400Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr405 410 415Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu420425 430Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala435 440 445(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO13TCGTCGGTCA GCCTGACGTC GAC 20(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO14TCTTGGTGTCGAAAGTGCACACC20(2)SEQ ID NO的信息15(i)序列特征(A)长度3533个碱基(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型基因组DNA(vi)原始来源(A)有机体乳发酵短杆菌(B)菌株ATCC 13869(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置321..3077(xi)序列描述SEQ ID NO15GGTGGTTCTG TTAAGGCAGA AACCGTCGCT GAGATCGTCG GTCAGCCTGA CGTCGACGGC 60GGACTTGTCG GTGGCGCTTC CCTCGACGGT GAAGCATTCG CCAAGCTGGC TGCCAACGCT 120GCGAGCGTTG CTTAAAGTAC AGAGCTTTAA AGCACAGCCT TAAAGCACAG CCTTAAAGCA 180CAAGCACTGT AGAAGTGCGG TTTTGATGAG CCCATGAAAG CCATCGAAAT CAATCGCCCA 240GCTAAACACC TGTTTTGCTG GGTGATTTTT TATCTCATGC ACGCCAACAC CCTCAATGTG 300AAAGAGTGTT TAAAGTAGTT ATG ACT GAT TTT TTA CGC GAT GAC ATC AGG 350Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg1 5 10TTC CTC GGT CAA ATC CTC GGT GAG GTA ATT GCG GAA CAA GAA GGC CAG 398Phe Leu Gly Gln Ile Leu Gly Glu Val Ile Ala Glu Gln Glu Gly Gln15 20 25GAG GTT TAT GAA CTG GTC GAA CAA GCG CGC CTG ACT TCT TTT GAT ATC 446Glu Val Tyr Glu Leu Val Glu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile30 35 40GCC AAG GGC AAC GCC GAA ATG GAT AGC CTG GTT CAG GTT TTC GAC GGC 494Ala Lys Gly Asn Ala Glu Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly45 50 55ATT ACT CCA GCC AAG GCA ACA CCG ATT GCT CGC GCA TTT TCC CAC TTC 542Ile Thr Pro Ala Lys Ala Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe60 65 70GCT CTG CTG GCT AAC CTG GCG GAA GAC CTC TAC GAT GAA GAG CTT CGT 590Ala Leu Leu Ala Asn Leu Ala Glu Asp Leu Tyr Asp Glu Glu Leu Arg75 80 85 90GAA CAG GCT CTC GAT GCA GGC GAC ACC CCT CCG GAC AGC ACT CTT GAT 638Glu Gln Ala Leu Asp Ala Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp95 100 105GCC ACC TGG CTG AAA CTC AAT GAG GGC AAT GTT GGC GCA GAA GCT GTG 686Ala Thr Trp Leu Lys Leu Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val110 115 120GCC GAT GTG CTG CGC AAT GCT GAG GTG GCG CCG GTT CTG ACT GcG CAC 734Ala Asp Val Leu Arg Asn Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His125 130 135CCA ACT GAG ACT CGC CGC CGC ACT GTT TTT GAT GCG CAA AAG TGG ATC 782Pro Thr Glu Thr Arg Arg Arg Thr Val Phe Asp Ala Gln Lys Trp Ile140145 I50ACC ACC CAC ATG CGT GAA CGC CAC GCT TTG CAG TCT GCG GAG CCT ACC 830Thr Thr His Met Arg Glu Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr155 160 165 170GCT CGT ACG CAA AGC AAG TTG GAT GAG ATC GAG AAG AAC ATC CGC CGT 878Ala Arg Thr Gln Ser Lys Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Arg175 180 185CGC ATC ACC ATT TTG TGG CAG ACC GCG TTG ATT CGT GTG GCC CGC CCA 926Arg Ile Thr Ile Leu Trp Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro190 195 200CGT ATC GAG GAC GAG ATC GAA GTA GGG CTG CGC TAC TAC AAG CTG AGC 974Arg Ile Glu Asp Glu Ile Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser205 210 215CTT TTG GAA GAG ATT CCA CGT ATC AAC CGT GAT GTG GCT GTT GAG CTT 1022Leu Leu Glu Glu Ile Pro Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu220 225 230CGT GAG CGT TTC GGC GAG GAT GTT CCT TTG AAG CCC GTG GTC AAG CCA 1070Arg Glu Arg Phe Gly Glu Asp Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro235 240 245 250GGT TCC TGG ATT GGT GGA GAC CAC GAC GGT AAC CCT TAT GTC ACC GCG 1118Gly Ser Trp Ile Gly Gly Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala255 260 265GAA ACA GTT GAG TAT TCC ACT CAC CGC GCT GCG GAA ACC GTG CTC AAG 1166Glu Thr Val Glu Tyr Ser Thr His Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys270 275 280TAC TAT GCA CGC CAG CTG CAT TCC CTC GAG CAT GAG CTC AGC CTG TCG 1214Tyr Tyr Ala Arg Gln Leu His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser285 290 295GAC CGC ATG AAT AAG GTC ACC CCG CAG CTG CTT GCG CTG GCA GAT GCC 1262Asp Arg Met Asn Lys Val Thr Pro Gln Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala300 305 310GGG CAC AAC GAC GTG CCA AGC CGC GTG GAT GAG CCT TAT CGA CGC GCC 1310Gly His Asn Asp Val Pro Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala315 320 325 330GTC CAT GGC GTT CGC GGA CGT ATC CTC GCG ACG ACG GCC GAG CTG ATC 1358Val His Gly Val Arg Gly Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile335 340 345GGC GAG GAC GCC GTT GAG GGC GTG TGG TTC AAG GTC TTT ACT CCA TAC 1406Gly Glu Asp Ala Val Glu Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyr350 355 360GCA TCT CCG GAA GAA TTC TTA AAC GAT GCG TTG ACC ATT GAT CAT TCT 1454Ala Ser Pro Glu Glu Phe Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser365 370 375CTG CGT GAA TCC AAT GAC GTT CTC ATT GCC GAT GAT CGT TTG TCT GTG 1502Leu Arg Glu Ser Asn Asp Val Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val380 385 390CTG ATT TCT GCC ATC GAG AGC TTT GGA TTC AAC CTT TAC GCA CTG GAT 1550Leu Ile Ser Ala Ile Glu Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ala Leu Asp395 400 405 410CTG CGC CAA AAC TCC GAA AGC TAC GAG GAC GTC CTC ACC GAG CTT TTC 1598Leu Arg Gln Asn Ser Glu Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe415 420 425GAA CGC GCC CAA GTC ACC GCA AAC TAC CGC GAG CTG TCT GAA GCA GAG 1646Glu Arg Ala Gln Val Thr Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu430 435 440AAG CTT GAG GTG CTG CTG AAG GAA cTG CGC AGC CCT CGT CCG CTG ATC 1694Lys Leu Glu Val Leu Leu Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile445 450 455CCG CAC GGT TCA GAT GAA TAC AGC GAG GTC ACC GAC CGC GAG CTC GGC 1742Pro His Gly Ser Asp Glu Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly460 465 470ATC TTC CGC ACC GCG TCG GAG GCT GTT AAG AAA TTC GGG CCA CGG ATG 1790Ile Phe Arg Thr Ala Ser Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met475 480485 490GTG CCT CAC TGC ATC ATC TCC ATG GCA TCA TCG GTC ACC GAT GTG CTC 1838Val Pro His Cys Ile Ile Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu495 500 505GAG CCG ATG GTA TTG CTC AAG GAA TTC GGC CTC ATT GCA GCC AAC GGC 1886Glu Pro Met Val Leu Leu Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly510 515 520GAC AAC CCA CGC GGC ACC GTC GAT GTC ATC CCA CTG TTC GAA ACC ATC 1934Asp Asn Pro Arg Gly Thr Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile525 530 535GAA GAT CTC CAG GCC GGC GCC GGA ATC CTC GAC GAA CTG TGG AAA ATT 1982Glu Asp Leu Gln Ala Gly Ala Gly Ile Leu Asp Glu Leu Trp Lys Ile540 545 550GAT CTT TAC CGC AAC TAC CTC CTG CAG CGC GAC AAC GTC CAG GAA GTC 2030Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val555 560 565 570ATG CTC GGT TAC TCC GAT TCC AAC AAG GAT GGC GGA TAT TTC TCC GCA 2078Met Leu Gly Tyr Ser Asp Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala575 580 585AAC TGG GCG CTT TAC GAC GCG GAA CTG CAG CTC GTC GAA CTA TGC CGA 2126Asn Trp Ala Leu Tyr Asp Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg590 595 600TCA GCC GGG GTC AAG CTT CGC CTG TTC CAC GGC CGT GGT GGC ACC GTC 2174Ser Ala Gly Val Lys Leu Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val605 610 615GGC CGC GGT GGC GGA CCT TCC TAC GAC GCG ATT CTT GCC CAG CCC AGG 2222Gly Arg Gly Gly Gly Pro Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Arg620 625 630GGG GCT GTC CAA GGT TCC GTG CGC ATC ACC GAG CAG GGC GAG ATC ATC 2270Gly Ala Val Gln Gly Ser Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile635 640 645 650TCC GCT AAG TAC GGC AAC CCC GAA ACC GCG CGC CGA AAC CTC GAA GCT 2318Ser Ala Lys Tyr Gly Asn Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala655 660 665CTG GTC TCA GCA ACG CTT GAG GCA TCG CTT CTC GAC GTC TCC GAA CTC 2366Leu Val Ser Ala Thr Leu Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu670 675 680ACC GAT CAC CAA CGC GCG TAC GAC ATC ATG AGT GAG ATC TCT GAG CTC 2414Thr Asp His Gln Arg Ala Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu685 690 695AGC TTG AAG AAG TAC GCC TCC TTG GTG CAC GAG GAT CAA GGC TTC ATC 2462Ser Leu Lys Lys Tyr Ala Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile700 705 710GAT TAC TTC ACC CAG TCC ACG CCG CTG CAG GAG ATT GGA TCC CTC AAC 2510Asp Tyr Phe Thr Gln Ser Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn715 720 725 730ATC GGA TCC AGG CCT TCC TCA CGC AAG CAG ACC TCC TCG GTG GAA GAT 2558Ile Gly Ser Arg Pro Ser Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp735 740 745TTG CGA GCA ATC CCG TGG GTG CTC AGT TGG TCC CAG TCT CGT GTC ATG 2606Leu Arg Ala Ile Pro Trp Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met750 755 760CTG CCG GGC TGG TTT GGT GTC GGC ACC GCA CTT GAG CAA TGG ATT GGC 2654Leu Pro Gly Trp Phe Gly Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly765 770 775GAA GGG GAG CAG GCC ACC CAG CGC ATT GCC GAG CTA CAA ACA CTC AAC 2702Glu Gly Glu Gln Ala Thr Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn780 785 790GAG TCC TGG CCA TTT TTC ACC TCA GTG TTG GAT AAC ATG GCT CAG GTG 2750Glu Ser Trp Pro Phe Phe Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val795 800 805 810ATG TCC AAG GCA GAG CTG CGT TTG GCA AAG CTC TAC GCA GAC CTG ATC 2798Met Ser Lys Ala Glu Leu Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile815 820 825CCA GAT AGG GAA GTA GCT GAG CGC GTT TAT GCC GTC ATC CGC GAG GAA 2846Pro Asp Arg Glu Val Ala Glu Arg Val Tyr Ala Val Ile Arg Glu Glu830 835 840TAC TTC CTG ACC AAG AAG ATG TTC TGC GTA ATC ACC GGT TCT GAT GAT 2894Tyr Phe Leu Thr Lys Lys Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp845 850 855CTG CTT GAT GAC AAC CCG CTT CTC GCA CGA TCC GTC CAG CGC CGA TAC 2942Leu Leu Asp Asp Asn Pro Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr860 865 870CCC TAC CTG CTT CCA CTC AAC GTG ATC CAG GTA GAG ATG ATG CGA CGC 2990Pro Tyr Leu Leu Pro Leu Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg875 880 885 890TAC CGA AAA GGC GAC CAAAGC GAG CAA GTA TCC CGC AAC ATC CAG CTG 3038Tyr Arg Lys Gly Asp Gln Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu895 900 905ACC ATG AAC GGT CTT TCC ACT GCA CTG CGC AAC TCT GGC TAGTCCTGCT 3087Thr Met Asn Gly Leu Ser Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly910 915GGGTAGGTAG TACTCGTGTA TACTGTCTAA AGTTATTCGA AATCAGGTGG GAATAAGGTT3147CACCTGGGTT CTCAAACGGC AAAGGAACAT TTTCCACATG GCATTGACGC TTCAAATCAT3207CCTCGTCGTC GCCAGCCTGC TCATGACGGT TTTCGTCTTG CTGCACAAGG GCAAAGGCGG3267CGGACTCTCC AGCCTCTTCG GTGGCGGTGT GCAGTCCAAT CTTTCGGGCT CCACTGTTGT3327TGAAAAGAAC CTGGATCGCG TCACCATTTT GGTTGCCGTT ATCTGGATTG TGTGCATTGT3387CGCACTCAAC CTCATCCAGA CTTATTCATA AGACACGAGC TTAAAAAGAG CGGTTCCCTT3447TTCATAGGGG AGCCGCTTTT TTGGGTTTTG TCGACCTGTT GTCTCCCCAC TGTTCCTCGG3507TGTGCACTTT CGACACCAAG ATTTCG 3533(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度919个氨基酸(B)类型氨基酸
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO16Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg Phe Leu Gly Gln Ile Leu1 5 10 15Gly Glu Val Ile Ala Glu Gln Glu Gly Gln Glu Val Tyr Glu Leu Val20 25 30Glu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ala Lys Gly Asn Ala Glu35 40 45Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly Ile Thr Pro Ala Lys Ala50 55 60Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asn Leu65 70 75 80Ala Glu Asp leu Tyr Asp Glu Glu Leu Arg Glu Gln Ala Leu Asp Ala85 90 95Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp Ala Thr Trp Leu Lys Leu100 105 110Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val Ala Asp Val Leu Arg Asn115 120 125Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Thr Arg Arg130 135 140Arg Thr Val Phe Asp Ala Gln Lys Trp Ile Thr Thr His Met Arg Glu145150 155 160Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gln Ser Lys165 170 175Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Ile Thr Ile Leu Trp180185 190Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro Arg Ile Glu Asp Glu Ile195 200 205Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu Glu Glu Ile Pro210 215 220Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu Arg Glu Arg Phe Gly Glu225 230 235 240Asp Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro Gly Ser Trp Ile Gly Gly245 250 255Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala Glu Thr Val Glu Tyr Ser260 265 270Thr His Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Tyr Tyr Ala Arg Gln Leu275 280 285His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser Asp Arg Met Asn Lys Val290 295 300Thr Pro Gln Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala Gly His Asn Asp Val Pro305310 315 320Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala Val His Gly Val Arg Gly325 330 335Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile Gly Glu Asp Ala Val Glu340 345 350Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe355 360 365Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser Leu Arg Glu Ser Asn Asp370 375 380Val Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val Leu Ile Ser Ala Ile Glu385 390 395 400Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ala Leu Asp Leu Arg Gln Asn Ser Glu405 410 415Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe Glu Arg Ala Gln Val Thr420 425 430Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Lys Leu Glu Val Leu Leu435 440 445Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile Pro His Gly Ser Asp Glu450 455 460Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly Ile Phe Arg Thr Ala Ser465 470 475 480Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met Val Pro His Cys Ile Ile485 490 495Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu Glu Pro Met Val Leu Leu500 505 510Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly Asp Asn Pro Arg Gly Thr515 520 525Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile Glu Asp Leu Gln Ala Gly530 535 540Ala Gly Ile Leu Asp Glu Leu Trp Lys Ile Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr545 550 555 560Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp565 570 575Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala Asn Trp Ala Leu Tyr Asp580 585 590Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg Ser Ala Gly Val Lys Leu595 600 605Arg Leu Phe His GlyArg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro610615 620Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Arg Gly Ala Val Gln Gly Ser625 630 635 640Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ala Lys Tyr Gly Asn645 650 655Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala Leu Val Ser Ala Thr Leu660 665 670Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu Thr Asp His Gln Arg Ala675 680 685Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Ala690 695 700Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile Asp Tyr Phe Thr Gln Ser705 710 715 720Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ser725 730 735Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp Leu Arg Ala Ile Pro Trp740 745 750Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly755 760 765Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly Glu Gly Glu Gln Ala Thr770 775 780Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro Phe Phe785 790 795 800Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val Met Ser Lys Ala Glu Leu805 810 815Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile Pro Asp Arg Glu Val Ala820 825 830Glu Arg Val Tyr Ala Val Ile Arg Glu Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Lys835 840 845Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro850 855 860Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Leu865 870 875 880Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Lys Gly Asp Gln885 890 895Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser900 905 910Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly915SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO17CGCGAGGTAC CACCTGTCAC 20(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO18CAATCCAGGT ACCGGCAACC(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO19GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA 23(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO20CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述desc＝＂合成的DNA＂(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO21GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述dese＝＂合成的DNA＂(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO22GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG23(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述dese＝＂合成的DNA＂(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO23CATCTAAGTA TGCATCTCGG20(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述desc＝，＂合成的DNA＂(iv)反义是(xi)序列描述SEQID.NO24TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20
权利要求
1.一种在棒状杆菌细胞中可自主复制的重组DNA，该DNA包含编码天冬氨酸激酶(其中L-苏氨酸和L-赖氨酸的反馈抑制实质上被脱敏)的DNA序列和编码二氨基庚二酸脱羧酶的DNA序列。
2.按照权利要求1的重组DNA，其中所说的天冬氨酸激酶(其中L-苏氨酸和L-赖氨酸的反馈抑制实质上被脱敏)是来源于棒状杆菌的天冬氨酸激酶，并且其中所说的天冬氨酸激酶是突变天冬氨酸激酶，在该突变天冬氨酸激酶中，相应于279位(在SEQ ID NO5所示的氨基酸序列中从N-末端开始计数)丙氨酸残基的氨基酸残基改变成非丙氨酸和非其α-亚单位中的酸性氨基酸的氨基酸残基，相应于30位(在SEQ ID NO7所示的氨基酸序列中从N-末端开始计数)丙氨酸残基的氨基酸残基改变成非丙氨酸和非其β-亚单位中的酸性氨基酸的氨基酸残基。
3.按照权利要求1的重组DNA，其中所说的编码二氨基庚二酸脱羧酶的DNA序列编码SEQ ID NO12所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO12所示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列。
4.按照权利要求1的重组DNA，该DNA还包含编码磷酸烯醇丙酮酸羧酶的DNA序列。
5.一种具有天冬氨酸激酶(其中L-苏氨酸和L-赖氨酸的反馈抑制实质上被脱敏)的棒状杆菌，该棒状杆菌包含编码二氨基庚二酸脱羧酶的增强DNA序列。
6.按照权利要求5的棒状杆菌，该棒状杆菌是通过引入如权利要求1所限定的重组DNA转化过的。
7.按照权利要求5的棒状杆菌，该棒状杆菌还包含编码磷酸烯醇丙酮酸羧酶的增强DNA序列。
8.按照权利要求7的棒状杆菌，该棒状杆菌是通过引入如权利要求4所限定的重组DNA转化过的。
9.一种用于产生L-赖氨酸的方法，该方法包括以下步骤在适当的培养基中培养如权利要求5所限定的棒状杆菌，使得在所说的细菌的培养物中产生并积累L-赖氨酸，并从培养物收集L-赖氨酸。
全文摘要
一种在棒状杆菌细胞中可自主复制的重组DNA,该DNA包含编码天冬氨酸激酶(其中L－苏氨酸和L－赖氨酸的反馈抑制实质上被脱敏)的DNA序列和编码二氨基庚二酸脱羧酶的DNA序列。一种具有天冬氨酸激酶的棒状杆菌(其中L－苏氨酸和L－赖氨酸的反馈抑制实质上被脱敏),其包含编码二氨基庚二酸脱羧酶的增强DNA序列;一种用于产生L－赖氨酸的方法,该方法包括以下步骤:在适当的培养基中培养棒状杆菌使得在所说的细菌的培养物中产生并积累L－赖氨酸,并从培养物收集L－赖氨酸。
文档编号C12N15/60GK1187539SQ97120819
公开日1998年7月15日 申请日期1997年12月5日 优先权日1996年12月5日
发明者早川敦, 杉本雅一, 吉原康彦, 中松亘 申请人:味之素株式会社