专利名称：双尾菌增殖促进组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及可口服的、能够使肠内菌丛改善为处于良好状态、有效地表现出整肠效果的组合物及其用途。详细地讲，本发明是涉及含有从乳果糖、低聚半乳糖、低聚果糖中选择出的1种或2种以上的低聚糖以及棉子糖为有效成分的促进双尾菌增殖的组合物，本发明还涉及由该组合物以及其它的食用成分组成的配合物。
人的肠道内生息着大约100种，100兆个以上的微生物，它们形成肠内细菌菌从。肠内细菌中，既有象双尾菌那样对人的健康有密切关系的，认为能给予机体好的影响的细菌，也有能生成腐败产物，致癌物质等对机体产生不好影响的细菌，这些菌从的分布状况因年龄，人种，生活环境，食物成分等各种因素而变化。特别是肠内菌从因日常的食物不同而受到显著的影响。为了提高整肠的效果，一直有在酸奶等乳制品中加有双尾菌的商品被广泛地利用，为的是摄取活的乳酸菌后获得整肠的效果。
另外，为了使肠内双尾菌增殖，人们已知糖源是最重要的，作为双尾菌生育促进物质的已知的各种低聚糖的利用正积极地进行着。在这些低聚糖中，已知有具有人的消化酶不能分解的，肠道不能吸收的，而能被双尾菌有选择资化等共同性质的乳果糖，各种低聚半乳糖，各种低聚果糖，低聚异麦芽糖，低聚木糖等多种低聚糖。
以前，这些低聚糖以双尾菌占优势的肠内菌从的形成等为目的，虽然也在各种食品，药品等中利用，但都是分别单独(含有来自原料，合成反应物的粗提取物的混合物的情形)添加，或只是配合使用(例如，双尾菌，第6卷，第143～150页，1993年，双尾菌，第8卷，第1～5页，1994年，特许第2549638号公报，特开平8-256730号公报等)。另外，这些低聚糖其功能因种类而异，在被双尾菌，腐败菌(例如，梭菌等)利用的程度方面存在着很大的差异，而且分别单独在制品中利用时只限于发挥出各个低聚糖的特长，未必能获得满意的双尾菌的增殖效果。因此，目前的实际情况是尚未确立能够发挥高效整肠作用的方法。
就是说，为了使作为促进双尾菌增殖的糖源表现有效的整肠效果，以下两点很重要。①应当对于生存在肠道内的主要的双尾菌具有范围广泛的，很高的利用性。②应当是肠内腐败菌不能利用的，或利用的糖源的量少，而双尾菌的增殖(消费)速度尽可能大。
以前，人们还不知道低聚糖相互组合比起单独利用低聚糖能获得良好的促进双尾菌增殖效果，所以能发挥有效的整肠效果的双尾菌增殖促进糖源一直是人们期盼的。
本发明人借鉴上述的先有技术，经锐意研究，结果发现将棉子糖与特定的低聚糖分别以一定的比例组合成的组合物，以及含有该组合物与其它食品成分的配合物比单独使用以前众所周知的低聚糖时能对双尾菌的增殖效果产生显著的影响，整肠作用能有效地表现出来，从而完成了本发明。
本发明的目的在于提供能显著使双尾菌增殖，没有腹泻等副作用的促进双尾菌增殖的组合物。
本发明的另外的目的是提供含有上述促进双尾菌增殖的组合物以及其它的食用成分的配合物。
解决上述课题的本发明第一项发明是含有从乳果糖，低聚果糖以及低聚半乳糖中选择出的1种或2种以上的低聚糖，以及棉子糖为有效成分的双尾菌增殖促进组合物，其中低聚糖的比例优选为相对于9份(重量)棉子糖至少配有1份低聚糖。
解决上述课题的本发明第二项发明是由从乳果糖，低聚果糖以及低聚半乳糖中选择出1种或2种以上的低聚糖，棉子糖，以及其它食用成分构成的配合物，其中其它食用成分可以是一般的食品用成分，婴幼儿食用的奶粉用的成分，以及营养剂用成分，将配合物作成所希望的样式。
以下记载了本发明，但最初记载的是作为本发明的第一项发明的双尾菌增殖促进组合物。
作为本发明中使用的棉子糖可以使用例如从甜菜根中按照众所周知的方法制造的产物，也可以将作为大豆低聚糖(日本食品科学(Japan foodscience)第26卷，第10号，第56～64页，1987年)制造，市场销售的粗制品作为“含有棉子糖”的低聚糖使用。另外，即使是利用众所周知的方法(例如，特开昭59-179064号公报)从大豆乳清中直接提取的棉子糖也可以。
另外，作为本发明中使用的乳果糖是利用众所周知的方法将乳糖碱异构化后制造的，糖浆状，粉末状，颗粒状等任一种剂型都可以使用，但从副产物少方面来看，希望例如利用特公昭52-21063号公报记载的方法制造的产品。
而作为本发明使用的低聚果糖，例如蔗果三糖，霉菌赤藓醛糖可利用众所周知的方法(例如，特开平8-173109，特公昭59-53834号公报)从蔗糖溶液中制造。
另外，作为低聚半乳糖，例如可以是用以下通式(1)表示的化合物，可以利用众所周知的方法(例如，特公昭58-20266号公报)由乳糖溶液制造。
Gal-(Gal)n-Glc…(1)(式中的Gal代表半乳糖基，Glc代表葡萄糖基，n为1～4的整数)在本发明中，对于9份(重量。以下同)作为上述必需成分的棉子糖，至少与一份从乳果糖，低聚果糖以及低聚半乳糖中选择成的1种或2种以上的低聚糖混合，理想的是从4份棉子糖与1份低聚糖到3份棉子糖与2份低聚糖的范围内混合。而将这些低聚糖组合物让人摄取时，希望每1kg体重按0.01～0.5g/日范围服用，希望在最终的组合物中含有0.05％(重量。以下只要没有特别指明都是相同的)以上的低聚糖。
本发明的促进双尾菌增殖组合物虽然是以棉子糖和其它所希望的低聚糖作为必需成分，但为了提高保存性，或为了调整剂型，也可以利用常规方法添加保形剂，赋形剂等。
以下记载作为本发明的第二项发明的配合物。作为本发明的第二项发明的配合物是由作为上述本发明的第一项发明的促进双尾菌增殖组合物以及其它食用成分组成的。作为其它的食用成分有蛋白质，脂类，糖，维生素以及矿物质等，将这些其它食用成分与作为上述本发明的第一项发明的促进双尾菌增殖组合物一起按照所希望的比例进行适当的配合，利用众所周知的方法可以作成各种食品，婴幼儿用奶粉，各种营养剂等配合物。本发明的配合物可以以液体，粉末状，颗粒状等通常的状态制造。
作为其它食用成分的具体例子如下所示。作为蛋白质，有乳蛋白，大豆蛋白，小麦粉，玉米蛋白等，还有蛋白质的分解物，肽，氨基酸等。而作为脂类可以使用众所周知的各种调制油脂，油脂组合物，脂肪酸组合物等，而作为糖除了上述各种低聚糖以外，可以使用葡萄糖，砂糖，葡聚糖，淀粉等众所周知的各种糖。
而作为配合使用的矿物质类例如有氯化钠，氯化钾，氯化钙，硫酸镁，甘油磷酸钙，柠檬酸铁等，而作为配合使用的维生素类有维生素A，维生素B1，维生素B2，维生素B6，维生素B12，烟酸，叶酸，维生素C，维生素D，维生素E，维生素K，泛酸钙，尼克酰胺，氯化胆碱等。
此外，作为各种添加剂，例如作为稳定剂，可以添加胍儿豆酸，果胶，刺槐豆胶，鹿角菜胶等，作为防腐剂可以添加苯甲酸及其盐，山梨酸及其盐等，作为甜味剂可以添加ン-マチン，ステビァ，糖精，氨基酸衍生物，ラクチト-ル等，作为抗氧化剂可以添加多酚类化合物，β-胡萝卜素，抗坏血酸衍生物等。另外根据需要也可以添加菌体，众所周知的赋形剂，增量剂，乳化剂，香料，着色剂，防腐剂等。
如上所述制造的本发明的促进双尾菌增殖组合物，以及含有该组合物的配合物与单独利用以前众所周知的各种低聚糖相比，就象下面记述的那样，能有效地促进双尾菌的增殖，改善肠内环境，通便，表现出整肠的效果。
以下给出试验例详细说明本发明。
如上所述，作为促进双尾菌增殖的糖源其必需条件是能加速双尾菌利用该糖源的消费速度。因此为了测定双尾菌的糖利用性，作为获得糖与培养时间再现性比较好的方法，是测定由菌体的增殖引起培养基浊度的上升。预备试验1进行该试验是为了研究培养基的浊度随时间的变化，确定培养几小时后测定的浊度是否是双尾菌的糖消费速度判定中所希望的测定值。(1)供试菌体使用从健康成年人的粪便中按照常规方法[光冈知足编，「双尾菌的研究」，第40～60页，财团法人日本双尾菌中心，1994年]分离鉴定的来自人的属于双歧杆菌属的微生物Bifidobacterium longum BB-536。而该菌体由本发明人保藏，必要的时候可以分享。(2)试验方法1)基础培养基和预培养液的制备将由酵母提取液0.5％，肉提取液0.5％，葡萄糖2％，磷酸钾0.1％，磷酸二钾0.1％，无水醋酸钠0.2％，胱氨酸0.05％，吐温80(Tween80)0.05％精制水(离子交换水)96.5％组成的液体培养基于115℃高压灭菌15分钟后，用作基础培养基。
将上述基础培养基按每管10ml分装在试管中，从前述的双尾菌的保存斜面取出一铂匙接种于灭了菌的试管培养基中，再覆盖一层2ml灭菌液体石蜡，在设定了厌氧条件的基础上，于37℃厌氧培养24小时，作为预培养液。2)试验培养基的制备取代基础培养基中的葡萄糖，作成分别使用了作为各种低聚糖代表例的乳果糖(森永乳业公司制)，棉子糖(日本甜菜制糖公司制)，以及低聚异麦芽糖(林原商事社制)的培养基，分别按照每管10ml分装在试管中，灭菌之后作为试验用培养基。3)培养与浊度的测定向每2只装有上述各个试验用培养基的试管中分别接种双尾菌的预培养液各0.5ml，然后立即使用分光光度计(日立制作所制)，在波长660nm，石英皿，光路长10mm条件下测定浊度。测定后覆盖一层灭菌液体石蜡2ml，于37℃在通常的温育器中培养24小时，每隔2小时于上述同一条件下测定浊度，算出两只管的浊度的平均值作为测定值。同时，作为对照使用含有葡萄糖的基础培养基同样测定浊度。(3)试验结果该试验结果如
图1所表示的那样。图1给出了培养时间与培养基的浊度增加之间的关系，横轴和纵轴分别代表培养时间和菌体增殖引起的浊度增加。给出了于37℃直至培养24小时后的Bifidobacterium longum在4种不同糖源的增殖曲线。图中—表示使用葡萄糖的培养基，
代表使用棉子糖的培养基，
代表使用乳果糖的培养基，-----代表使用低聚异麦芽糖的培养基。
就象图1所表明的那样，使用棉子糖的培养基超过使用作为基准糖源的葡萄糖的培养基的消费速度，使用乳果糖的培养基大致与使用葡萄糖培养基的消费速度相当，使用低聚异麦芽糖的培养基低于使用葡萄糖培养基的消费速度。而作为测定时间点，因为在尽可能短时间的场合能反映出以使用葡萄糖培养基为基准的菌体的增殖速度，因此是理想的，但培养8小时后，就能清楚了解到能够明确测定因双尾菌引起的糖消费速度。预备试验2以前虽然知道各种低聚糖可作为双尾菌增殖因子，但由于通过同一培养条件，同一尺度研究主要的总低聚糖经双尾菌的消费速度的例子还没有，所以本发明人进行了这方面的比较评价。(1)供试菌株来自人的属于Bifidobacterium属的微生物，所谓的双尾菌虽然现在已经知道有10种，但作为尽可能反映肠内的双尾菌的菌株，在我国从婴幼儿到大人普遍地广泛分离的菌种已知有以下4个菌种可供实验用。
Bifidobacterium bifidum BB-225，Bifidobacterium adolescentisBB-102，Bifidobacterium longum breve BB-308，Bifidobacteriumlongum BB-536。
供预备试验1用的Bifidobacterium longum BB-536以外的3个菌种用的是本发明人从婴幼儿以及健康成年人的肠内的粪便通过与前述同一方法分离，并根据常规方法在进行了包括DNA同源性，糖消化性等在内的菌种鉴定试验的基础上确定菌种的保存菌株。另外，这些菌株由本发明人保藏，根据需要可以分享。(2)试验方法基础培养基以及预培养液的制备与前述预备试验1同样进行，试验培养基使用作为一般双尾菌增殖因子而广泛利用的以下7种低聚糖取代葡萄糖来制备。
棉子糖(日本甜菜制糖公司制)，乳果糖(森永乳业公司制)，低聚半乳糖(日新制糖公司制)，乳蔗糖(林原商事公司制)，低聚果糖(明治制果公司制)，低聚异麦芽糖(林原商事公司制)，低聚木糖(三得利公司制)培养与前述预备试验1同样进行，以培养8小时后的各个培养基的浊度的增值作为指标通过下式算出，进行比较研究。
消费速度促进效果(倍)＝(于试验培养基中培养8小时后的浊度的增值)/(于基础培养基中培养8小时后的浊度的增值)(3)试验结果该试验结果如表1所示。如果将糖的消费速度促进效果1.0以上作为具有与葡萄糖同等以上的双尾菌增殖促进效果，获得可利用性的话，可以看出对于供试的全部4个菌种超过该基准值的低聚糖是不存在的。表中有特征的地方在于乳果糖对于所有四种菌种都表现出比较高的消费速度促进效果，棉子糖虽然Bifidobacterium bifidum的棉子糖可利用性完全没有，但对其它3种双尾菌消费速度促进效果表现出了最高的结果。
从这些结果虽然可以看出几个低聚糖中的突出的优点，但充分满足作为前述的双尾菌的增殖糖源表现的有效的整肠效果的条件，而且实用上接近理想的单一的低聚糖还不存在。表1
试验例1以下，本发明人以调查各种低聚糖的组合对双尾菌的增殖促进效果为目的进行试验。即，对在前述预备试验2中，从双尾菌的可利用性以及消费速度方面认为最实用的低聚糖棉子糖作为基本，通过与其它的低聚糖组合引起的4种双尾菌的消费速度促进效果进行研究。(1)供试菌株使用与前述预备试验2用的同一的4种双尾菌。(2)试验方法基础培养基以及预培养液的制备与前述预备试验1同样进行。试验培养基的制备是用合计总量为2.0％的所希望的棉子糖与各个低聚糖取代基础培养基中的2.0％葡萄糖，在13阶段中变更添加比例进行制备的。使用的低聚糖与前述预备试验2相同，培养方法，浊度测定以及消费速度促进效果的评价也与前述预备试验2同样进行。(3)试验结果由棉子糖和乳果糖组合后使用的培养基在4种供试双尾菌中引起的消费速度促进效果，以及4种供试菌种中的平均的消费速度促进效果的结果就象表2中给出的那样，而使用棉子糖和乳果糖培养基以外的各个试验培养基引起的4种供试菌种中的平均的消费速度促进效果的结果就象表3中给出的那样。
如表2所示，将棉子糖和乳果糖组合后使用的培养基，棉子糖对乳果糖的比率在0.6∶1.4(3∶7)到1.8∶0.2(9∶1)的范围能看出良好的双尾菌引起的消费速度促进效果，特别是在1.2∶0.8(3∶2)到1.6∶0.4(4∶1)的范围内，其效果更显著。
另外就象从表3所表明的那样，棉子糖与低聚半乳糖，低聚果糖中的任一个组合使用的培养基中，能够看出与乳果糖组合使用的培养基同样可获得与葡萄糖同等以上的显著的消费速度促进效果。棉子糖与这些果糖的比率也与乳果糖的情形大致一样，清楚了解到9份棉子糖与各1份以上的低聚半乳糖，低聚果糖的组合是理想的组合。
通常，据说人的肠内生存着2～3种双尾菌，所以希望在本试验例1中供试验用的来自人的主要的4种双尾菌种中的消费速度促进效果平均值高的状态作为反映人肠内的实际状态的指标。
另外在使用了其它的低聚糖，乳蔗糖，低聚异麦芽糖，以及低聚木糖的培养基中，使用与棉子糖组合的培养基，与单独使用这些低聚糖的培养基相比，虽然可以看出消费速度促进效果，但与葡萄糖同等或以上的显著的效果还不能确认。
对棉子糖，通过将乳果糖，低聚半乳糖，低聚果糖中的2种以上混合后，对合计3种以上的低聚糖组合物进行相同的试验，得到大致同样的效果。表2
表3
试验例2该试验的进行是为了研究利用与实施例3同一方法制造的育儿用调制奶粉对婴儿的通便性的效果。(1)样品和试验方法将利用与实施例3同一方法制造的育儿用调制奶粉对平均月龄4个月的10个婴儿喂奶粉一个月，然后收集这些婴儿的粪便，调查它们的通便性，菌从。而作为对照收集饮用市场销售的育儿调制奶粉(A公司制。低聚半乳糖1.2g/100g)的大致在同一条件下的10个婴儿的粪便，调查同样的项目。另外菌从的调查按照从粪便中分离，培养的方法、光冈的方法等(光冈知足著，「肠内菌的世界」，丛文社，1980年)进行。(2)试验结果该试验结果如表4所示。就象从表4所看到的那样，用含有棉子糖和低聚半乳糖的调制奶粉哺育的婴儿的通便性(性状水分含量，色调，味道，pH)与用市场销售的调制奶粉哺育的婴儿的粪便相比能保持良好的性状，而前者的肠内菌从随着双尾菌的增加腐败菌减少，双尾菌的总量和双尾菌对所有肠内菌的占有比例也看出有显著的增加。人们认为这是由于由以前产品所期望的糖源被肠内的双尾菌大幅度地迅速地消费，早期形成双尾菌菌从引起的。
从这些结果可以清楚了解到含有一定比例的棉子糖和低聚半乳糖的调制奶粉在婴儿的通便性的改善，肠内菌从的改善中发挥着作用。而在实施例3中的育儿用调制奶粉中，完全看不到腹泻等副作用。另外就通过其它方法制造的育儿用调制奶粉也进行了试验，得到大致相同的结果。表4
注)菌数为每1g粪便，10例的平均常用对数值，()内表示占有率(％)。试验例3该试验使用的是与实施例4同一方法制造的术后患者用营养剂，就该营养剂对健康正常的成年人肠内腐败产物的效果进行了研究。(1)试验方法以20位健康正常的成年人(年龄25～58岁，平均48岁)为对象，使他们摄取实施例记载的术后患者用营养剂，每日10g，摄取10天，分别于摄取前，摄取第5天，第10天，以及摄取结束后的第10天收集各个试验对象的粪便，测定粪便中的粪便产物量。而氨的测定通过使用了氨测定试剂盒(和光纯药工业公司制)的比色法，其它的腐败产物的定量通过Yoshihara的方法[农业和生物化学(Agricultural andBiological Chemistry)，第45卷，第1873～1875页，1981年]定量。(2)试验结果20个试验对象的便中的腐败产物量的平均值如表5所示。就象表5所表明的那样，可以看出作为测定的腐败产物的苯酚，吲哚，3-甲基吲哚，氨等表5中给出的所有测定项目在摄取到第10天的粪便中的含量都降低了。这表明肠内菌从变化为双尾菌占优势的菌从，梭状芽孢杆菌等腐败菌减少了，以及与氨的生成有关的消化球菌，拟杆菌等厌氧性菌的生长发育受到了抑制。
因此，很清楚通过摄取实施例4营养剂，便中腐败产物显著减少，对术后患者的营养具有很大的效果。另外，就通过其它方法制造的营养剂也进行了试验，得到大致同样的结果。表5
(注)单位μg/g粪便附图的简单说明图1是表示双尾菌的培养时间与培养基浊度增加之间的关系的说明图。
实施发明的最好的形态以下给出实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。实施例1将棉子糖(日本甜菜制糖公司制)8kg，以及乳果糖粉末(森永乳业公司制)5kg，其它市场销售的赋形剂，粘合剂等3kg混合均匀，装入铝箔制的袋中，每袋10g，密封，得到促进双尾菌增殖组合物5000袋。实施例2将大豆低聚糖(カルピス食品工业公司制。棉子糖含量7％)20kg，乳果糖粉末(森永乳业公司制)0.5kg，低聚果糖(明治制果公司制)，以及双尾菌粉末(森永乳业公司制，双尾菌数目1010个/g)10g，其它糊精等市场销售的赋形剂，粘合剂共计80kg混合均匀，然后作成药片，得到每一片大约1g的双尾菌增殖促进片10万片。实施例3通过常规方法制造具有以下组成的育儿用调制奶粉。蛋白质 酪蛋白 4.2(g/100g)乳清蛋白质 6.2蛋白质分解物2.6氨基酸 0.3脂类 调制脂肪24.3糖 乳糖51.4糊精3.0棉子糖 0.8低聚半乳糖 0.4维生素 2.0矿物质 2.0另外，使用了棉子糖(日本甜菜制糖公司制)，低聚半乳糖(日新制糖公司制)，其它都是市场销售产品。实施例4将棉子糖(日本甜菜制糖公司制)20kg，以及乳果糖粉末(森永乳业公司制)5kg，DHA粉末(日本油脂公司制)50g，卵黄油脂(キュ-ピ-公司制)100g，以及维生素(市场销售品，维生素A，D，E，C)共计20g混合，装入铝箔制的袋中，每袋15g，密封，制造出术后患者用营养剂1600袋。
将上述营养剂15g通常一日2次给患者服用。实施例5通过常规方法制造具有以下组成的液体营养剂。蛋白质 酪蛋白4.0(g/100ml)蛋白质分解物 0.5氨基酸0.5脂类 调制脂肪 2.2糖 糊精 13.5棉子糖1.0低聚果糖 0.5维生素 0.3矿物质 0.7另外，使用了棉子糖(日本甜菜制糖公司制)，低聚果糖(明治制果公司制)，其它都是市场销售产品。
产业上利用的可能性如上所述，本发明涉及含有从乳果糖，低聚半乳糖，低聚果糖中选择出的1种或2种以上的低聚糖，以及棉子糖为有效成分的双尾菌增殖促进组合物，配合有该组合物以及其它的食用成分的配合物，通过本发明可给出的效果如下所示。
1)本发明的促进双尾菌增殖的组合物由于被双尾菌利用的速度非常快，而且可以广泛地被肠内主要的双尾菌种利用，所以尽管应摄取的低聚糖的总量是少量的，但表现出促进双尾菌增殖效果，并且没有腹泻等副作用。
2)本发明的促进双尾菌增殖的组合物可以有效地促进肠内的双尾菌有选择地增殖，抑制腐败菌的增殖。
3)本发明的促进双尾菌增殖的组合物在维持便的性状处于良好的状态的同时，还能抑制各种腐败产物的发生，维持人体健康。
4)本发明的配合物由于从效果上看可以获得从婴幼儿到高龄人的广泛年龄层中的整肠改善效果，所以在调制奶粉，各种营养剂，其它各种食品中都可以利用。
权利要求
1.含有从乳果糖、低聚果糖、低聚半乳糖中选择出的1种或2种以上的低聚糖以及棉子糖为有效成分的双尾菌增殖促进组合物。
2.权利要求1记载的双尾菌增殖促进组合物，其中相对于9份(重量)棉子糖至少含有1份(重量)低聚糖。
3.由从乳果糖、低聚果糖、低聚半乳糖中选择出的1种或2种以上的低聚糖和棉子糖以及其它食用成分组成的配合物。
4.权利要求3记载的配合物，其中其它食用成分是一般的食品用成分。
5.权利要求3记载的配合物，其中其它食用成分是婴幼儿奶粉用的成分。
6.权利要求3记载的配合物，其中其它食用成分是营养剂用的成分。
全文摘要
本发明提供能使双尾菌显著增殖，无腹泻等副作用的双尾菌增殖促进组合物，以及含有上述双尾菌增殖促进组合物和其它食用成分的配合物。本发明涉及含有从乳果糖，低聚半乳糖，低聚果糖中选择出的1种或2种以上的低聚糖以及棉子糖为有效成分的促进双尾菌增殖的组合物，以及由该组合物以及其它的食用成分组成的配合物。
文档编号C12N1/26GK1239998SQ97180524
公开日1999年12月29日 申请日期1997年10月28日 优先权日1996年12月12日
发明者富田守, 大桥俊夫, 早泽宏纪, 高濑光德, 中村浩彦, 佐山晃司 申请人:森永乳业株式会社