专利名称：淀粉分支酶表达的反义内含子的抑制作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制基因表达的方法，特别是抑制植物中基因表达的方法。本发明还涉及所述方法中使用的核苷酸序列。此外，本发明涉及对表达所述核苷酸序列有用的启动子。
淀粉是植物，特别是高等植物中主要的存储碳水化合物。淀粉的结构包括直链淀粉与支链淀粉。直链淀粉基本上由的α-1-4-连接糖基的直链组成。支链淀粉包含一些α-1-6分支的α-1-4-连接糖基链。支链淀粉的分支特性是通过一种通常所熟知的酶如淀粉分支酶(“SBE”)的特别作用而建立的。SBE通过α-1，6-葡萄糖苷分支键加入α-1，4葡萄糖苷，催化支链淀粉的分支点形成。直链淀粉与支链淀粉的生物合成以图解方式在
图1中给出，而α-1，4-键与α-1，6键在图2中给出。
在马铃薯中，已知存在两类SBE。在我们的共同未决国际专利申请PCT/EP96/03052和PCT/EP96/03053中，讨论了B类马铃薯SBE及其编码基因。在国际专利申请WO96/34968中，公开了A类马铃薯SBE及其cDNA编码基因。
已知淀粉是重要的原料。淀粉广泛应用在食品，造纸和化学工业。然而，在这些工业应用中使用的大部分淀粉要通过化学，物理或酶学方法的收获后修饰，以获得具有某种所需功能性质的淀粉。
在过去的数年中，已经达到如愿的产生遗传性修饰植物，这些植物能产生与收获后修饰淀粉相同的修饰淀粉。还知道通过表达反义核苷酸编码序列，可以制备这种遗传性修饰的植物。在这方面，JuneBourque提供了在植物中进行基因操作的反义策略的详细总结(Bourque 1995植物科学105第125-129页)。在此阶段，可参考图3，这是一种推测的反义-RNA抑制机制的策略图解。
特别是，WO92/11375报道了有关遗传性修饰马铃薯以形成直链型淀粉的方法。该方法包括使用能(在不同程度上)明显抑制编码在马铃薯中形成分支酶的基因之表达的反义构建体。WO/92/11375的反义构建体包括一个块茎特异性启动子，一个转录起始序列和反义方向的分支酶的第一个外显子。然而，WO92/11375不提供任何反义序列数据。此外，WO92/11375仅公开了所述马铃薯GBSS启动子的用途。
WO92/14827报道了一种质粒，该质粒插入到植物基因组后能明显引起再生植物中碳水化合物浓度和碳水化合物组成如直链淀粉与支链淀粉的浓度和组成上的变化。该质粒含反义方向的部分分支酶编码序列。
EP-A-0647715报道了有关使用编码反义内源性mRNA编码DNA以改变观赏植物的特征和代谢途径。
EP-A-0467349报道了关于控制基因表达的启动子上游序列之反义序列的表达。
EP-A-0458367和US-A-5107065报道了有关植物中调节基因表达的核苷酸序列的表达。所述核苷酸序列与一种基因的mRNA序列互补并可包括全部或部分该基因的非编码区。换言之，EP-A-0458367和US-A-5107065的序列应该至少包括与一个编码区互补的序列。EP-A-0458367和US-A-5107065含最少的序列信息。
WO96/34968讨论了使用与编码在马铃薯植物的下调SBE表达的A类和B类马铃薯SBE序列互补的反义序列。所使用的序列与SBE编码序列互补。
Kuipers等在分子基因遗传学246 745-755中报道了关于一系列核苷酸的表达，所述核苷酸对马铃薯颗粒结合淀粉合成酶的部分基因组内含子序列是反义的。此处，所述反义内含子序列与部分反义外显子序列连接-其中内含子序列与外显子序列之间相互自然结合。此外，所表达的反义内含子序列长度最多有231bp。
类似的，Kull等在遗传和育种杂志49 69-76报道了对马铃薯颗粒结合淀粉合成酶部分基因组内含子序列是反义的一系列核苷酸的表达。同样，此处所述反义内含子序列与部分反义外显子序列连接-其中所述内含子序列与外显子序列相互自然结合。此外，所表达的反义内含子序列同样是至多231bp长。
Shimada等在理论应用遗传86 665-672报道了对水稻颗粒结合淀粉合成酶部分基因组内含子序列反义的一系列核苷酸的表达。此处，所述反义内含子序列与部分反义外显子序列连接-其中所述内含子序列与外显子序列相互自然结合。此外，所表达的反义内含子序列不足350bp长。
关于酶活性可能如何受具体核苷酸序列表达的影响的综述可在Finnegan and Mcroy生物技术12 883-888的论述中以及Matzkeand MatzkeTIG 11 1-3的论述中找到。
即使已知酶活性可受到具体核苷酸序列表达的影响，仍需要一种更可靠和(或)更有效和(或)更专一的影响酶活性的方法。
本发明的第一方面提供了一种影响植物(或其细胞，组织或器官)中酶活性的方法，其中包括在植物(或其细胞，组织或器官)中表达一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列部分或完全编码(是)马铃薯A类SBE基因的内含子，任选的，以及一种以反义或正义方向部分或完全编码B类淀粉分支酶的内含子的核苷酸序列；而其中核苷酸序列不含正常地与所述内含子相连的外显子序列的反义序列。
本发明的第二方面提供了影响产生淀粉的有机体(或其细胞，组织或器官)中酶活性的方法，包括在产淀粉有机体(或其细胞，组织或器官)中表达以反义方向部分或全部编码马铃薯A类SBE基因的内含子的核苷酸序列，任选的，以及以反义或正义方向部分或全部编码B类淀粉分支酶的内含子的核苷酸序列；而其中淀粉分支酶活性受到影响和(或)支链淀粉的水平受影响和(或)淀粉组成被改变。
优选A类SBE基因反义内含子构建体与PCT/EP96/03052中定义的马铃薯B类SBE基因反义内含子构建体结合使用。然而，也可独立使用以只靶A类SBE基因，或与其他转基因结合使用以进一步改良马铃薯植物中的淀粉质量。
因此，本发明的第三方面提供一种反义序列，包括SEQ.I.D.NO.15到SEQ.I.D.No.27任何之一给出的序列以及SEQ.ID.No.38的互补序列，或其变体，衍生物或同系物。
本发明的第四方面提供一种启动子，包括在SEQ.I.D.NO.14显示的序列或变体、衍生物或其同系物。
本发明的第五方面提供能包含或表达本发明的构建体。
本发明的第六方面提供包含或表达本发明的载体。
本发明的第七方面提供包含或表达本发明的细胞，组织或器官。
本发明的第八方面提供包含或表达本发明的产转基因淀粉的有机体，本发明的第九方面提供从本发明获得的淀粉。
本发明的第十方面提供pSS17和pSS18。
本发明的第十一方面提供一种核酸序列，该核酸序列对可从A类SBE获得的内含子序列的任何之一或多个序列是反义的，并特别对从SEQ.ID.No.38中给出的A类SBE之内含子1获得的序列是反义的。
本发明的一个关键优点是它提供了制备修饰的淀粉的一种方法，而该方法不必须进行淀粉的收获后修饰。因此，本发明的方法排除了使用有害化学品的需要，所述化学品通常在淀粉的收获后修饰中使用。
此外，本发明提供特别遗传修饰的植物，这些植物能产生修饰和/或新型和/或改善的淀粉，这些淀粉将适于各种工业需要。
因此，本发明提供制备植物中特制淀粉的方法，该方法可代替淀粉的收获后修饰。
本发明还提供一种使由该法制备的被修饰的淀粉能比已知收获后修饰方法对环境更有益的方法，而收获后修饰的方法是依赖于使用有害化学品和大量能量的。
本发明的其他关键性优点是与已知对酶活性有作用的方法相比，它提供对酶活性有更可靠和(或)更有效和(或)更专一的影响。就本发明的这个优点而言，应注意到SBEs编码区之间存在某些程度的同源性。然而，与SBEs内含子序列少有或没有同源性。
因此，反义内含子的表达提供了选择性影响具体A类SBE表达的一种机制。这些有利的方面可被用于例如减少或消除具体的SBE酶，特别是A类SBE酶，并用另一种酶代替之，所用的酶可以是另一种分支酶或甚至是受影响的酶的重组体或甚至一种杂种酶，例如所述杂种酶可包括从一个来源的部分SBE酶和至少一部分另一来源的另一SBE酶。本发明的这种具体特征被包括在后文本发明对复合物方面更详细的讨论中。
因此，本发明提供选择性影响A类SBE活性的机制。这与先前依赖于使用例如不可能引入新的SBE活性而又对该活性没有影响的反义外显子表达的专业方法形成对照。
在本发明的上下文中，B类SBE与SBE I是同义词而A类SBE与SBE II是同义词。A类SBE在WO96/34968中有定义，本文引用为参考。优选使用的反义内含子构建体包括A类的内含子1，它有2.0kb长并位于以A类SBE编码序列的第45个残基处开始的位置。所述内含子的边界可通过查询共有内含子边界序列进行计算，并在附图13中给出。B类SBE基本上如本文和在PCT/EP96/03052中给出的序列所定义的。
就本发明的第一方面而言，优选分支酶活性受影响和(或)支链淀粉的水平受影响和(或)淀粉组成被改变。
就本发明的第二方面而言，优选所述核苷酸序到不含正常地与所述内含子相连的外显子的反义序列。
就本发明的第四方面而言，优选所述启动子与目的基因(“GOI”)结合。
优选酶活性被降低或消除。
优选所述核苷酸序列至少编码反义方向的至少一个内含子的基本上全部序列。
优选所述核苷酸序列部分或全部地编码两个或更多个内含子，其中每一内含子以反义方向。
所述核苷酸序列优选包括至少350核苷酸(例如至少350bp)，更优选至少500核苷酸(例如至少500bp)。
所述核苷酸序列优选包含SEQ.ID.No.38中给出序列的互补序列或其片段。
所述核苷酸优选通过一个具有SEQ.ID.No14给出的序列或其变体，衍生物或同系物的启动子进行表达。
产生转基因淀粉的有机体优选的是植物。
因此，本发明的一个优选方面涉及影响植物(或其细胞，组织或器官)的酶活性的方法，包括在所述植物(或其细胞，组织或器官)中表达一个核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(部分或完全)编码反义方向的内含子；其中所述核苷酸序列不含与该内含子正常地相连的外显子序列的反义序列；并且其中淀粉分支酶活性受影响和(或)支链淀粉的水平受影响和(或)淀粉组成被改变。
因此，本发明的优选方面涉及影响植物(或其细胞，组织或器官)中的酶活性的方法，包括在所述植物(或其细胞，组织或器官)中表达一个核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(部分或完全)编码一个反义方向的内含子；其中所述内含子序列不含与该内含子正常地相连的外显子的反义序列；其中淀粉分支酶受到影响和(或)支链淀粉水平受到影响和(或)淀粉组成被改变；并且其中所述核苷酸序列包含SEQ.ID.No.15到SEQ.ID.No.27任何之一给出的序列或其变体，衍生物或同系物，包括其组合。
本发明涉及的术语“核苷酸”包括DNA和RNA。该术语优选意指DNA，更优选通过使用重组DNA技术制备的DNA。
术语“内含子”以其正常意义被用做意指核苷酸片段，通常指被转录但不编码部分或全部表达的蛋白质或酶之DNA。
术语“外显子”正常意义上被用做意指核苷酸片段，通常指编码部分或全部表达的蛋白质或酶的DNA。
因此，术语“内含子”指能转录成RNA分子的基因区域，但该区域在RNA被翻译成蛋白质前从所述RNA中被切除。相比之下，术语“外显子”指被转录成RNA并随后翻译成蛋白质的基因区域。
如果所产生的核苷酸序列能影响植物，或其细胞或组织中的酶活性，则本发明核苷酸序列所涉及的术语“变体”或“同系物”或“片段”包括从或向各自核苷酸序列进行任何替代，变异，修饰，取代，缺失或添加一个(或多个)核酸，其中优选的所产生的核苷酸序列含至少与SEQ.ID.No.38给出的序列之互补序列相同的效应。特别是，如果所产生的核苷酸序列具有影响符合本发明酶活性的能力，则术语“同系物”包含与结构类似性和(或)功能类似性相关的同源性。就序列同源性(即类似性)而言，优选含80％以上的同源性，更优选至少85％同源性，更优选至少90％同源性，甚至更优选至少95％同源性，更优选至少98％同源性。上述术语亦是所述序列的等位基因变异的同义词。
同样，如果所产生的启动子序列容许GOI表达，其中优选所产生的启动子序列有至少与SEQ.ID.No.14相同的效应，则本发明启动子所涉及的术语“变体”或“同系物”或“片段”包括从或向各个启动子序列进行一个(或多个)核酸的任何替代，变异，修饰，取代，缺失或添加。特别是，如果所产生的启动子序列有能力容许表达GOI，则术语“同系物”包括了结构类似性和(或)功能类似性方面的同源性，如本发明的核苷酸序列。就序列同源性(即类似性)而言，优选含80％以上的同源性，更优选至少85％同源性，更优选至少90％同源性，甚至更优选至少95％同源性，更优选至少98％同源性。上述术语亦是所述序列的等位基因变异的同义词。
术语“反义”指与任何一种或全部本发明内含子序列(包括其部分序列)互补并因此能杂交的一种核苷酸序列。
就本发明而言，反义内含子可与被抑制基因的完整内含子互补。然而，在某些情况下，假如部分序列影响酶活性，则可使用部分反义序列(即不是或不包含完全互补序列的序列)。适当的部分序列的实例包括比SEQ.ID.No.38的完全互补序列短但包含至少与各个的外显子相邻的有义内含子序列或外显子反义的核苷酸序列。
就本发明的第二方面内容而言(即专一影响SBE活性)，如果所述核苷酸序列可影响SBE活性(优选所述核苷酸降低或消除SBE活性)，则本发明的核酸序列可包含SBE基因的一个或多个有义或反义外显子序列，包括其完全或部分序列。本发明的第二方面的核苷酸序列优选不包括反义外显子序列。
术语“载体”包括表达载体和转化载体。术语“表达载体”意指能在体内或体外表达的构建体。术语“转化载体”意指能从一个物种转移到另一物种-如从E.coli质粒到真菌或植物细胞，或从土壤杆菌到植物细胞的一种构建体。
术语“构建体”与术语“共轭体”，“盒”及“杂合体”是同义词，它与本发明的反义核苷酸序列方面有关，它包括与启动子直接或间接相连的本发明核苷酸序列。间接相连的实例是提供适当的间隔群，如内含子序列如Sh1-内含子或ADH内含子，这该内含子序列位于本发明的启动子和核苷酸序列之间。与本发明有关的术语“融合的”也同样包括直接或间接相连。所述术语不包括在其自然环境中与野生型SBE基因启动子相连的野生型SBE基因天然组合。
所述构建体甚至包含或表达一种标记，该标记容许选择例如植物细胞中的遗传构建体，这种构建体已被转移进入所述细胞中。例如现有各种用于植物的标记，如甘露糖。标记的其他实例包括提供例如G418，湿霉素，博菜霉素，卡那霉素和庆大霉素抗生素抗性的标记。
本发明的构建体优选包括启动子。所述术语“启动子”以本专业的正常意义使用，例如Jacob-Monod基因表达理论中的RNA聚合酶结合部位。适当的启动子实例是那些能指导本发明核苷酸序列有效表达和(或)在具体类型的细胞中有效表达。的启动子。组织特异性启动子的某些实例在WO92/11375中有描述。
此外，所述启动子可包括保守区如Pribnow盒或TATA盒。所述启动子甚至可包括影响(如维持，增强，降低)本发明核苷酸序列表达水平的其他序列。此类序列的适当实例包括Sh1-内含子或ADH内含子。其他序列包括可诱导元件-如温度，化学试剂，光或应激诱导的元件。也可存在适合于增强转录或翻译的元件。后述元件的一个实例是TMV5’前导序列(参见Sleat基因217217-225；和Dawson植物分子生物学2397)。
正如所描述的，本发明的构建体与(或)载体可包括转录起始区，它可提供调节型或组成型表达。任何适当的启动子可被用于所述转录起始区，如组织特异性启动子。一方面，所述启动子优选是patatin启动子或E35S启动子。另一方面，所述启动子优选是SBE启动子。
例如，如果所述有机体是植物，则所述启动子可以是影响任何一种或多种种子，块茎，茎，新芽，根以及叶组织(优选块茎)中核苷酸序列的表达的启动子。作为实施例，本发明核苷酸序列的启动子可以是如1994年10月21日提交的我们的共同未决UK专利申请号9421292.5中描述的α-Amy1启动子(另外称为Amy1启动子，Amy637启动子或α-Amy637启动子)。或者本发明的核苷酸序列的启动子可以是如1994年10月21日提交的我们的共同未决UK专利申请号9421286.7中描述的α-Amy3启动子(另外称为Amy3启动子，Amy351启动子或α-Amy351启动子)。
本发明还包括使用启动子表达本发明核苷酸序列。其中所述启动子的一部分被失活，但其中所述启动子仍行使启动子功能。在某些情况下，启动子的部分失活是有利的。特别是对早些时候提及的Amy351启动子，有可能失活其一部分以致所述部分失活的启动子以更专一的方式如仅在一种特异组织型或器官中表达本发明的核苷酸序列。术语“失活”指部分失活，其意义在于所述启动子的表达方式被修饰但其中部分失活的启动子仍行使启动子功能。然而，如上所述，经过修饰的启动子能至少在一种(但非全部)原始启动子特异组织中表达编码本发明的酶的基因。部分失活的实施例包括改变启动子序列的折叠形式，或与部分核苷酸序列的结合种类，以使部分所述核苷酸序列不被例如RNA聚合酶识别。另一个(并且是优选的)部分灭活启动子的方法是将其截成片段。另一种方法是使一部分所述序列突变，以使RNA聚合酶不能与那个部分或另一部分结合。另一种修饰是使调节蛋白的结合部位发生突变，例如已知丝状真菌以进行碳代谢产物抑制，的CreA蛋白质，因而废除了天然启动子的代谢产物抑制作用。
本发明的构建体与(或)载体可包括转录终止区。
本发明的核苷酸可以与另外构建体结合的形式(但并不必须在同时进行)进行表达。因此，本发明还提供含第一构建体和第二构建体的构建体组合，所述第一种构建体包含根据本发明有效连接到第一启动子的核苷酸序列；而第二种结构包含一个有效连接到第二启动子(它不必与第一启动子相同)的GOI。就本发明的此方面而言，构建体组合复合物可在相同的载体，质粒，细胞，组织，器官或有机体中存在。本发明的这方面还包括表达同样机体(优选在特异细胞或组织)，如恰在一个有机体(一般是一株植物)的一个特异性细胞或组织中表达。就本发明的这方面内容而言，第二种构建体不包括编码与所述野生型基因启动子相关的酶基因的天然组合物(当两者均存在于其自然环境中时)。
适当的组合物的一个实施例是含本发明核苷酸序列和启动子(如本发明的启动子)的第一种构建体，以及含一个启动子(如本发明启动子)和一个GOI的第二种构建体，其中GOI编码有义或反义方向的另一种淀粉分支酶。
有关本发明反义核苷酸方面的术语“构建体”和本发明的启动子方面的术语“构建体”在使用上是等价的。在这方面，所述术语包括直接或间接与GOI连接的本发明启动子。
就本发明的启动子方面或本发明的组合物方面而言，术语“GOI”指任何目的基因，这些基因并非必须编码蛋白质或酶-如后文所解释的。GOI可以是任何核苷酸序列，对正在研究的有机体而言(例如植物)它既可以是外来的也可以是天然的。
GOI的典型实例包括编码修饰代谢或分解代谢过程的其他蛋白质或酶的基因。所述GOI可编码引入或增强病原抵抗力的分子。
所述GOI甚至可以是一种修饰相关组织中存在的天然转录物表达的反义构建体。这种GOI的一个实例是本发明的核苷酸序列。
所述GOI甚至可编码对宿主有机体-例如植物而言是非天然的蛋白质。所述GOI可编码一种对动物或人类有益的化合物。例如，所述GOI可编码有药物活性的蛋白质或酶如治疗用化合物胰岛素，干扰素，人血清白蛋白，人生长因子和血液凝集因子中的任何之一。所述GOI甚至可编码给食品，饲料或作物以附加营养价值的蛋白质。典型实例包括能抑制抗营养性因子形成的植物蛋白质和有较多必需氨基酸组成(例如比非转基因植物更高的赖氨酸含量)的植物蛋白质。所述的GOI甚至编码用于食物加工的酶如木聚糖酶和半乳糖苷酶。所述GOI甚至可以是编码害虫毒素，如α淀粉酶，蛋白酶或葡聚糖酶的反义转录物。或者，所述GOI可以是本发明的核苷酸序列。
所述GOI可以是编码阿拉伯呋喃糖苷酶的核苷酸序列，它是我们的共同未决UK专利申请9505479.7的主题。所述GOI可以是编码葡聚糖酶的核苷酸序列，它是我们的共同未决UK专利申请9505475.5的主题。所述GOI可以是编码α淀粉酶的核苷酸序列，它是我们的共同未决UK专利申请9413439.2的主题。所述GOI可以是编码α淀粉酶的核苷酸序列，它是我们的共同未决UK专利申请9421290.9的主题。所述GOI可以是编码葡聚糖裂解酶的核苷酸序列，它在我们的共同未决PCT专利申请PCT/EP94/03397中被描述。
另一方面，所述GOI甚至可以是与一个不同的启动子有效连接的本发明核苷酸序列。
所述GOI可包括编码一个或多个木聚糖酶，阿拉伯糖酶，乙酰酯酶，鼠李半乳糖醛酸酶，葡聚糖酶，果胶酶，分支酶或另一种碳水化合物修饰酶或蛋白酶的序列。或者，所述GOI可以是任何这些序列的反义序列。
如上所述，本发明提供一种选择性影响具体酶活性的机制。在本发明的一个重要应用中，目前有可能通过表达所述具体基因组蛋白质或酶的反义内含子构建体和通过(例如在同时)表达所述酶或蛋白质的重组体来减少或消除编码基因组蛋白质或酶的基因组核苷酸序列的表达-换言之所述GOI是编码所述基因组酶或蛋白质的重组核苷酸序列。这种应用容许在缺乏(或降低了水平的)各自的基因组酶和蛋白质时表达所需要的重组酶或蛋白质。因此，可容易并从所述宿主有机体制备和纯化所需要的重组酶和蛋白质。本发明这个具体方面比先前的专业方法优越的多，例如先前的方法依赖于使用反义外显子表达，其方法也影响重组酶的表达。
因此，本发明的进一步内容涉及在宿主有机体中表达重组蛋白质或酶的方法，包括表达编码重组蛋白质或酶的核苷酸序列；和表达进一步的核苷酸序列，其中所述进一步核苷酸序列编码(部分或完全的)反义方向的内含子；其中所述内含子是与重组蛋白或酶相应的编码所述重组蛋白质或酶的基因组基因正常结合的内含子；而其中所述进一步核苷酸序列不含正常时与内含子结合的外显子序列的反义序列。其他方面包括这些核苷酸序列的组合物，包括其在构建体，载体，细胞，组织和转基因有机体中的结合。
因此，本发明还涉及核苷酸序列组合物，包括编码重组酶的第一个核苷酸序列和与反义方向内含子对应的第二个核苷酸序列；其中所述内含子是与编码与所述重组酶对应的酶基因组基因相连的内含子；而其中第二个核苷酸序列不含正常时与所述内含子连接的外显子序列的反义序列。
所述GOI甚至可编码一个或多个内含子，如任何一个或多个在所附序列表中给出的内含子序列。例如，本发明还包括表达例如一种与一个有义内含子结合的反义内含子(例如SEQ.ID.No.38的互补序列)，所述有义内含子优选不与所述反义内含子序列互补(例如SEQ.ID.No.2或另外的A类SBE内含子)。
术语“细胞”，“组织”与“器官”包括细胞，组织与器官本身以及存在于有机体的相应部分。
与本发明有关的术语“有机体”包括包含本发明核苷酸序列的任何有机体和(或)其中本发明核苷酸序列在所述有机体中存在时能被表达。所述有机体优选是产淀粉有机体如植物，藻类，真菌，酵母和细菌以及它们的细胞系。所述有机体优选植物。
术语“产淀粉有机体”包括能生物合成淀粉的任何有机体。产淀粉有机体优选是植物。
如本文所使用的术语“植物”包括任何适当的被子植物，裸子植物，单子叶植物和双子叶植物。适当植物的典型实例包括蔬菜如马铃薯；谷物如小麦，玉米和大麦；水果；树木；花；和其他植物作物。所述术语优选指马铃薯。
本发明有关的术语“转基因有机体”包括含本发明核苷酸序列与(或)从中获得产物的任何有机体，并且(或)本发明核苷酸序列可在所述有机体中表达。本发明核苷酸序列优选掺入所述有机体的基因组中。所述转基因有机体优选植物，更优选马铃薯。
为制备宿主有机体，可使用原核或真核有机体。适当的原核宿主实例包括大肠杆菌和枯草杆菌。本领域有关原核宿主的转化的论述已有充分的资料，例如参见Sambrook等(Sambrook等分子克隆实验室手册，第二版，1989，冷泉港实验室出版)。
即使本发明的酶和编码同样物质的核苷酸序列在EP-B-0470145和CA-A-2006454中没有公开，这两个文献提供了一些有用的有关技术种类的背景评论，所述技术可用于制备本发明的转基因植物。某些背景论述目前被包括在下面评论中。
构建遗传修饰的植物的基本原理是在所述植物基因组中插入遗传信息以便获得一种稳定保持的插入遗传物质。
有一些用于插入所述遗传信息的技术。两个主要的方法是直接引入遗传信息和通过使用载体系统引入遗传信息。一般性技术综述可在Potrykus(植物生理学植物分子生物学年评42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章中找到。
因此，一方面，本发明涉及携带核苷酸序列或本发明构建体的载体系统，并且它能引入所述核苷酸序列和构建体到有机体，如植物的基因组中。
所述载体系统可包含一个载体，但它能够包含两个载体。在两个载体的情况，所述载体系统通常指双载体系统。双载体系统在Gynheung An等(1980)，双载体系统，植物分子生物学手册A3，1-19中有描述。
用给定的启动子或核苷酸序列或结构转化植物细胞的一种广泛使用的系统是以使用根癌土壤杆菌的Ti质粒或发根土壤杆菌的质粒Ri为基础的，An等，(1986)，植物生理学81，301-305和Butcher D.N.等(1980)，植物病理学家的组织培养法D.S.Ingrams和J.P.Helgeson编辑，203-208。已建立了几种不同的Ti和Ri质粒，它们适合于构建上述的植物或植物细胞构建体。此类Ti质粒的一个非限制性实例是pGV3850。
本发明的核苷酸序列与结构应优选被插入到Ti质粒的T-DNA末端序列之间或与T-DNA相邻以避免破坏与T-DNA边界紧邻的序列，因为至少这些区域之一似乎是修饰过的T-DNA插入到所述植物基因组中所必须的。
从上述解释中应能理解，如果所述有机体是植物，本发明的载体系统优选包含感染植物(例如vir区)所必须的序列和至少一个T-DNA序列边界部分，所述边界部分位于与所述遗传构建体相同的载体上。
而且，所述载体系统优选根癌土壤杆菌Ti质粒或发根土壤杆菌Ri质粒或其衍生物。由于这些质粒是众所周知的并且在构建转基因植物中广泛使用，许多载体系统基于这些质粒或其衍生物而存在。
在构建转基因植物中，本发明的核苷酸序列或构建体首先在所述载体能在其中复制的微生物中构建，并且所述微生物易于在插入植物前进行处理。有用的微生物的一个实例是大肠杆菌，但有上述性质的其他微生物也可使用。当一个如上定义的载体系统的载体在大肠杆菌中构建时，如有必要，将其转移进入适当的土壤杆菌菌株，例如根癌土壤杆菌。因此，携带本发明核苷酸序列或构建体的Ti质粒优选被转移到适当的土壤杆菌菌株中，例如根癌土壤杆菌，以便获得一种携带本发明启动子或核苷酸序列或构建体的土壤杆菌细胞，其DNA随后被转移到要被修饰的植物细胞中。
例如，如果使用Ti或Ri质粒转化植物细胞，至少Ti与Ri质粒T-DNA的右边界然而通常所述T-DNA的右边界和左边界可与引入的基因序列侧翼连接。使用T-DNA转化植物细胞已被广泛研究，并在EP-A-120516；Hoekema，in双元植物载体系统OffsetdrukkerijKanters B.B.，Alblasserdam，1985，第V章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.，41-46；和An等.，EMBO J.(1985)4277-284中被描述。
通过土壤杆菌直接感染植物组织是一种广泛使用的简单技术，并在Butcher D.N.等(1981)，植物病理学家的组织培养法，D.S.Ingrams和J.P.Helgeson编辑203-208页中有描述。这方面的进一步论述参见Potrykus(植物生理学植物分子生物学年评42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)。用这种技术，植物感染可在所述植物的某些部位或组织中或其上进行，即在叶片，根，茎部位或植物的其他部位上进行。
一般而言，通过携带GOI(如本发明的核苷酸序列)和任意启动子的土壤杆菌直接感染植物组织，被感染植物的创伤方法例如通过用剪刀给所述植物切口或用针给所述植物穿刺或用砂纸摩擦植物。然后用土壤杆菌接种伤口。然后使被接种的植物或植物部分在适当的培养基上生长并使之发育成为成熟植株。
当植物细胞被构建时，这些细胞可按照众所周知的组织培养方法进行培养或维持，如通过在以必需生长因子如氨基酸，植物激素，维生素等补充的适当培养基中培养细胞。
可通过从细胞或组织再生植物的已知方法例如通过用抗生素筛选转化的幼苗并通过在含适当营养成分，植物激素等的培养基上进行再培养使转化细胞再生成为遗传修饰的植株。
有关植物转化的进一步论述可在EP-A-0449375中找到。
如CA-A-2006454中所报道的，有大量的克隆载体可供使用，它们含大肠杆菌复制系统和容许筛选转化细胞的标记。例如，所述载体包含pBR322，pUC系列，M13 mp系列，pACYC184等。在此方面，本发明的核苷酸或构建体可被引入到所述载体的适当限制位点。然后使用所含的质粒进行大肠杆菌转化。大肠杆菌细胞被培养在适当营养成分的培养基中，然后收获并裂解。然后回收所述质粒。就分析方法而言，一般被使用的有序列分析，限制性分析，电泳和进一步的生化-分子生物学方法。每次操作后，所使用的DNA序列被限制性酶解并与下一个DNA序列连接。每个序列可被克隆在相同或不同的质粒中。
向植物中引入本发明的核苷酸序列或构建体后，进一步的DNA序列的存在与插入是必须的-如创建如上概述的组合系统(例如含构建体的组合物的有机体)。
上述用本发明的核苷酸序列评价转化原核有机体和植物，与用本发明的启动子转化这些有机体在使用上是等值的。
总之，本发明涉及通过表达反义内含子序列影响酶活性。
本发明还涉及用于表达那些反义内含子序列的启动子。
按照布达佩斯条约，下述样品已于1995年7月13日被存放在公认的保藏所The National Collection of Industrial and MarineBacteria Limited(NCIMB)，23 S+ Machar Drive，Aberdeen，苏格兰，AB2 1RY联合王国
NCIMB 40753(本文称之为pBEA8)；NCIMB 40751(本文称之为λ-SBE3.2)，和NCIMB 40752(本文称之为λ-SBE3.4)。
按照布达佩斯条约，下述样品已于1996年7月9日被存放在公认的保藏所The National Collection of Industrial and MarineBacteria Limited(NCIMB)，23 Machar Drive，Aberdeen，苏格兰，AB2 1RY联合王国NCIMB 40815(本文称之为pBEA9)；因此本发明的一个十分优选的实施方案涉及影响植物(或其细胞，组织或器官)中的酶活性的方法，包括在所述植物中(或其细胞，组织或器官)表达核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码(部分或完全)反义方向的内含子；其中所述核苷酸序列不含正常时与所述内含子结合的外显子序列的反义序列；其中淀粉分支酶活性受到影响和(或)支链淀粉的水平受到影响和(或)淀粉的组成被改变；并且其中所述核苷酸序列对SEQ.ID.No.38中给出的A类的内含子1，或A类SBE的任何其他内含子是反义的，并包括A类反义内含子序列与B类反义内含子序列的组合物。除内含子1以外的A类SBE内含子序列可通过例如对马铃薯A类SBE基因组DNA测序获得，所述DNA可通过用WO96/34968获得的A类SBE cDNA，按照本领域众所周知的方法例如Sambrook等的分子克隆实验室手册，冷泉港，1989中给出的方法进行杂交筛选基因组DNA文库而分离。
本发明现在将仅通过实施例的方式进行描述，其中，参考如下附图图1，图解表示直链淀粉与支链淀粉的生物合成；图2，图解表示支链淀粉的α-1-4-键和α-1-6键；图3，图解表示可能的反义RNA抑制机制；图4，图解表示基因组SBE克隆的外显子-内含子结构；图5，pPATA1质粒图，该质粒大小是3936bp；图6，pABE6质粒图，该质粒大小是5106bp；图7，pVctorIV Man质粒图，其大小是7080bp；图8，pBEA8质粒图，其大小是9.54kb；图9，pBEA9质粒图，其大小是9.54kb；
图10，pBEP2质粒图，其是10.32kb大小；图11，pVictor5a质粒图，其大小是9.12kb；图12，其显示SBE的全基因组核苷酸序列，包括启动子，外显子与内含子；图13，其显示在A类与B类SBE基因中内含子1的位置；图14，显示马铃薯A类SBE内含子1的序列；图15，显示pSS17的结构；和图16，显示pSS18的结构。
上述图1和2属于有关淀粉的一般性引言描述。上述图3属于有关反义表达的引言描述。
如所提到的，图4是图解描述基因组SBE克隆的外显子-内含子结构，其序列在图12中给出。该克隆有约11.5k碱基对，包含14个外显子与13个内含子。所述内含子按从5’到3’端增序编号，并分别与SEQ.ID.No.s1-13相对应。它们各自的反义内含子序列在SEQ.ID.No.s 15-27中给出。
更详细而言，图4和12表示马铃薯SBE基因的11478碱基对的信息。从核苷酸1到2082的5’区含所述SBE基因的启动子区。一个位于核苷酸2048到2051的侯选TATA盒被框起。马铃薯SBE cDNA克隆(Poulsen & Kreiberg(1993)植物生理学1021053-1054)与外显子DNAs之间的同源性开始于2083bp并终止于9666bp。
所述cDNA与外显子之间的同源性由上标符号表示，而翻译的氨基酸序列以外显子DNA下的单符号编码表示。内含子序列由下标符号表示。
图5至7在下面讨论。如所述及的，图8是pBEA8的质粒图，它有9.54k碱基对大小；图9是pBEA9质粒图，它有9.54k碱基对大小。pBEA8与pBEA9的每个包含针对马铃薯SBE基因第一内含子序列的反义序列。该第一内含子序列有1177碱基对(在图4中给出)并位于第一外显子与第二外显子之间。
本发明的这些实验和方面现做更详细的讨论。
实验方法基因组B类SBE克隆的分离，亚克隆到质粒中及测序含马铃薯B类SBE基因的各种克隆从Desiree马铃薯基因组库(Clontech Laboratories Inc.，Palo Alto CA，USA) 用放射标记的马铃薯SBE cDNA(Poulsen & Keiberg(1993)植物生理学1021053-1054)为探针进行分离。分离的含SBE DNA的λ噬菌体片段(λSBE3.2-NCIMB40751-和λSBE-3.4-NCIMB40752)通过Southern分析进行鉴定，然后被亚克隆到pBluescript II载体中(ClontechLaboratories Inc.，Palo Alto CA，USA)。λSBE3.2含15kb马铃薯DNA插入片段，而λSBE-3.4含一个13kb马铃薯DNA插入片段。所得质粒被称为pGB3，pGB11，pGB15，pGB16和pGB25(参见如下讨论)。然后将各自的插入片段用Pharmacia Autoread测序试剂盒(Pharmacia，Uppsala)和A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia，Uppsala)进行测序。
总共，一段11.5kb的B类SBE基因被测序。从上述质粒推导出所述序列，其中pGB25含从1bp到836bp的序列，pGB15含从735到2586bp的序列，而pGB16含从2580bp到5093bp的序列，pGB11含从3348bp到7975bp的序列，而pGB3含从7533bp到11468bp的序列。
更详细而言，pGB3通过从λSBE3.2分离的4kb EcoRI片段插入到pBluescript II SK(+)的EcoRI位点而构建。pGB11通过插入从λSBE3.4分离的4.7kb XhoI片段插入到pBluescript II SK(+)的XhoI位点而构建。pGB15通过从λSBE3.4分离的1.7kb SpeI片段插入到pBluescript II SK(+)的SpeI位点而构建。pGB16通过插入从λSBE3.4分离的2.5kb SpeI片段插入到pBluescript II SK(+)的SpeI位点而构建。为构建pGB25，用引物5’GGA ATT CCA GTC GCA GTC TACATT AC3’(SEQ.ID.No.30)和5’CGG GAT CCA GAG GCA TTA AGA TTTCTG G3’(SEQ.ID.No31)和λSBE3.4作为模板产生一个PCR片段。
所述PCR片段用BamHI和EcoRI进行消化，并插入在用同样限制酶消化的pBluescript II SK(+)中。
一个A类SBE克隆通过类似方法获得。
构建B类SBE反义内含子质粒pBEA8与pBEA9
通过PCR用寡核苷酸5’CGG GAT CCA AAG AAA TTC TCG AGG TTACAT GG3’(SEQ.ID.No.32)和5’CGG GAT CCG GGG TAA TTT TTA CTAATT TCA TG3’(SEQ.ID.No.33)并以含所述SBE基因的λSBE3.4噬菌体为模板扩增SBE内含子1。
用BamHI消化所述PCR产物并以反义方向插入到patatin启动子和35S终止子之间的质粒pPATA1(在WO94/24292)中有描述)的BamHI位点中。这种构建体(pABE6)用KpnI进行消化，2.4Kb“patatin启动子-SBE内含子-1-35S终止子”KpnI片段被分离到，并插入到植物转化载体pVictorIV Man的KpnI位点。所述KpnI片段的两个方向被插入以产生pBEA8与pBEA9质粒。pVictorIV Man在图7中给出并通过把入含从pVictorIV SGiN Man(WO94/24292)分离的E35S启动子-manA-35S终止子盒的一个填充的XbaI片段插入到含一个填充的pVictor IV的XhoI位点而形成。pVictor IV Man的pVitor区包含在坐标位置2.52bp到0.32bp之间(参见图7)。
构建A类SBE反义内含子质粒pSS17与pSS18构建质粒pSS17通过PCR从基因组SBEII亚克隆用引物5’-CGG GAT CCC GTA TGTCTC ACT GTG TTT GTG GC-3’(SEQ.ID.No.34)和5’-CGG GAT CCCCCT ACA TAC ATA TAT CAG ATT AG-3’(SEQ.ID.No.35)扩增到马铃薯SBEII基因的2122bp内含子1序列。所述PCR产物用BamHI消化并以反义方向插入在植物转化载体的BamHI位点patatin启动子之后，其中NPTII基因用做选择性标记(参见图15)。
构建质粒pSS18通过PCR从基因组SBEII亚克隆用引物5’-CGG GAT CCC GTA TGTCTC ACT GTG TTT GTG GC-3’(SEQ.ID.No.34)和5’-CGG GAT CCCCCT ACA TAC ATA TAT CAG ATT AG-3’(SEQ.ID.No.35)扩增到马铃薯SBEII基因的2122bp内含子1序列。所述PCR产物用BamHI消化并以反义方向插入在植物转化载体的BamHI位点patatin启动子之后，其中manA基因用做选择性标记(参见图16)。产生转基因马铃薯植株纯性储用培养物Solanum tuberosum’Bintje’与’Dianella″的幼苗培养物被保持在按照Linsmaier，E.U.和Skoog，F.(1965)，植物生理学18100-127配方并另外含2μM硫代硫酸银的基质(LS)中，25℃，16小时光照/8小时黑暗。
约40天后，述培养物被再培养。然后剪下所述幼苗的叶片并切成结节片段(约0.8厘米)每段含一个结节。接种马铃薯组织从约40天龄幼苗培养的幼苗(高约5-6厘米)被切成结节内片段(约0.8厘米)。所述片段被放入含转化的根癌土壤杆菌的液体LS基质中，所述根癌土壤杆菌含目的双元载体。所述土壤杆菌在YMB-基质(磷酸氢二钾，三水(0.66克/升)；硫酸镁，七水(0.20克/升)；氯化钠(0.10克/升)；甘露糖醇(10.0克/升)；和酵母提取物(0.40克/升))含适当的抗生素(与土壤杆菌菌株的抗性基因相对应)中培养过夜，达到在660nm(OD-660)光密度值约为0.8，离心并重悬浮于LS基质中达到OD-660值为0.5。
所述片段被留在土壤杆菌悬液中30分钟，然后将所述片段在无菌滤纸上吸除多余的细菌。共培养所述幼苗截段与细菌一起直接在含琼脂(8.0克/升)，2，4-二氯苯氧基乙酸(2.0毫克/升)和反式玉米素(0.5毫克/升)的LS基质上共培养48小时。用无菌滤纸覆盖所述基质与外植块，并将培养皿放置在25℃，16小时光照/8小时黑暗。“洗涤方法”在共培养基质上48小时后，所述截段被转移到装有含800毫克/升羧苄青霉素的液体LS基质的容器中。轻微震摇所述容器并通过此方法将大部分土壤杆菌洗涤出所述截段和(或)杀死。筛选经过洗涤后，所述截段被转移到平板上，所述平板含LS基质，琼脂(8克/升)，反式玉米素(1-5毫克/升)，赤霉酸(0.1毫克/升)，羧苄青霉素(800毫克/升)，并依照所使用的载体构建方法而含硫酸卡那霉素(50-100毫克/升)或膦基麦黄酮(1-5毫克/升)或甘露糖(5克/升)。所述截段到新鲜基质中进行次级培养，每个培养3-4周。
在3到4周中，从所述截段发育出幼苗并在3-4个月期间不断形成新的幼苗。再生幼苗的生根再生幼苗被转移到含LS-基质，琼脂(8克/升)和羧苄青霉素(800毫克/升)的生根基质中。
再生幼苗的转基因基因型通过检测在含硫酸卡那霉素(200毫克/升)的上述底物上的生根能力，通过进行NPTII检测(Radke，S.E.等，理论应用遗传学(1988)，75685-694)或通过进行Wang等(1993，NAR 21 4153-4154页)的PCR分析来证实。在任何这些检测中为非阳性的植株被丢弃或被用做对照。或者，通过按照Hodal，L.等(P1.Sci.(1992)，87115-122)共引入的β葡萄糖醛酸酶基因进行GUS测试可证实所述转基因植株。转移到土壤将新生根的植株(高度约2-3厘米)从生根基质转移到土壤并放在生长室中(21℃，16小时光照200-400uE/m2/秒)。当这些植株完全长成时将其转移到温室，在那里这些植株继续生长直到发育出块茎并且植株的上部正在开始衰老。
大约三个月后收获马铃薯并进行分析收获分枝酶分析在转基因马铃薯品系中A类与B类SBE的表达用Blennow和Johansson(植物化学(1991)30437-444)描述的SBE检测法和使用直接抗马铃薯SBE抗体的标准Western方法进行测量。淀粉分析从马铃薯块茎分离淀粉并分析直链淀粉支链淀粉比例(Hovenkamp-Hermelink等(1988)马铃薯研究31241-246)。此外，支链淀粉链长的分布通过在Dionex HPAEC上分析异淀粉酶消化的淀粉进行测定。
异淀粉酶消化的淀粉中还原末端的数目通过N.Nelson(1944)生物化学杂志153375-380描述的方法进行测定。
结果显示为所述转基因植株中SBE合成水平和(或)SBE活性水平和(或)淀粉SBE成分的降低。建SBE启动子构建体从λ-SBE3.4使用引物5’CCA TCG ATA CTT TAA GTG ATT TGATGG C3’(SEQ.ID.No.36)和5’CGG GAT CCT GTT CTG ATT CTT GATTTC C3’(SEQ.ID.No.37)扩增SBE启动子片段。PCR产物用ClaI和BamHI消化。然后将产生的1.2kb片段插入到用ClaI和BglII线性化的pVictor5a(参见图11)，产生pBEP2(参见图10)。马铃薯块茎的淀粉分支酶的测定用来自pBEA8，pBEA9，pSS17或pSS18转化马铃薯植株的马铃薯切成小片并用Ultra-Turax匀浆器在提取缓冲液中(50mM Tris-HCIpH7.5，连二硫酸钠(0.1克/升)，和2mMDTT)匀浆；每10克块茎加入1克Dowex xl.。粗匀浆物通过miracloth滤器过滤并在4℃，24.700g离心10分钟。上清液用于淀粉分支酶检测。
在25℃，400微升含0.1M柠檬酸钠pH7.0缓冲液，0.75毫克/毫升直链淀粉，5毫克/毫升小牛血清白蛋白和马铃薯提取物的体积中进行淀粉分支酶检测。50微升一份在0，15，30和60分钟时移出反应物到20微升3N HCI中。加入1毫升碘液并在620nm用ELISA分光光度计检测吸收值的降低。
在来自用pBEA8，pSS17和pSS18质粒转化的34只转基因Dianella马铃薯植株的块茎提取物中检测淀粉分支酶(SBE)水平。
所述转基因品系产生的块茎含有的SBE水平是非转化Dianella植株中所述发现的适当A类或B类SBE水平的10％到15％。
在进一步的实验中，质粒pSS17与pSS18被共转移到如上所述的马铃薯植株中。在共转移子中，当如上述进行分析时，观察到A类和B类SBE水平的同时降低。总结上述实施例涉及分离，测序和利用衍生于马铃薯A类和B类SBE基因的反义内含子构建体。这些SBE内含子反义构建体可被引入到植物，如马铃薯植物中。在引入后，可达到植物中SBE合成水平和(或)SBE活性水平和(或)淀粉成分的降低。
不希望受到理论的限制，人们认为本发明表达的反义核苷酸序列结合到前mRNA的有义内含子并由此防止前mRNA剪接和(或)随后的mRNA翻译。因此，这种结合被认为降低植物酶活性(特别是A类和B类SBE的活性)的水平，从而认为SBE活性又影响直链淀粉支链淀粉比例并因此影响支链淀粉的分枝形式。
因此，本发明提供一种方法，其中通过使用反义RNA技术用反义内含子序列降低SBE活性水平，从而有可能处理植物，或其组织或细胞(如马铃薯块茎)中的淀粉成分。
而且，同时减少或消除双重转化的马铃薯植株的A类B类SBE序列提供了用任意不同的SBE基因转化这类植物的可能性，因此容许按照期望的结果对淀粉中的分枝进行处理。
本发明的其他修改方法将对本领域技术人员是显而易见，因此并不偏离本发明的范围。
下文给出一些序列列表，它们从SEQ.ID.No.1-SEQ.ID.No.38序贯编号。简言之，SEQ.ID.No.1-SEQ.ID.No13代表有义内含子序列(基因组DNA)；SEQ.ID.No.14代表SBE启动子序列(基因组序列)；SEQ.ID.No.15-SEQ.ID.No.27代表反义内含子序列；而SEQ.ID.No.28代表与SBE启动子序列互补的序列-即反义方向的SBE启动子序列。包括启动子，外显子和内含子的B类SBE全基因组核苷酸序列在SEQ.ID.No.29中给出并通过图4和12的方式进行解释，其中十分特殊的基因特征。SEQ.ID.No.30到37显示上述方法中使用的启动子。SEQ.ID.No.38显示A类SBE内含子1的序列。
序列表(1)一般资料(i)申请人(A)名称DANISCO A/S(B)街LANGEBROGADE 1(C)城市COPENHAGEN K(E)国家丹麦(F)邮编DK-1001(ii)发明题目基因表达的抑制(iii)序列数目38(iv)计算机可读形式(A)介质类型Floppy软盘(B)计算机IBM兼容个人计算机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1资料(i)序列特征(A)长度1165碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否(xi)序列描述SEQ ID NO1GTAATTTTTA CTAATTTCAT GTTAATTTCA ATTATTTTTA GCCTTTGCAT TTCATTTTCC 60AATATATCTG GATCATCTCC TTAGTTTTTT ATTTTATTTT TTATAATATC AAATATGGAA120GAAAAATGAC ACTTGTAGAG CCATATGTAA GTATCATGTG ACAAATTTGC AAGGTGGTTG180AGTGTATAAA ATTCAAAAAT TGAGAGATGG AGGGGGGGTG GGGGAAGACA ATATTTAGAA240AGAGTGTTCT AGGAGGTTAT GGAGGACACG GATGAGGGGT AGAAGGTTAG TTAGGTATTT300GAGTGTTGTC TGGCTTATCC TTTCATACTA GTAGTCGTGG AATTATTTGG GTAGTTTCTT360GTTTTGTTAT TTGATCTTTG TTATTCTATT TTCTGTTTCT TGTACTTCGA TTATTGTATT420ATATATCTTG TCGTAGTTAT TGTTCCTCGG TAAGAATGCT CTAGCATGCT TCCTTTAGTG480TTTTATCATG CCTTCTTTAT ATTCGCGTTG CTTTGAAATG CTTTTACTTT AGCCGAGGGT540CTATTAGAAA CAATCTCTCT ATCTCGTAAG GTAGGGGTAA AGTCCTCACC ACACTCCACT600TGTGGGATTA CATTGTGTTT GTTGTTGTAA ATCAATTATG TATACATAAT AAGTGGATTT660TTTACAACAC AAATACATGG TCAAGGGCAA AGTTCTGAAC ACATAAAGGG TTCATTATAT720GTCCAGGGAT ATGATAAAAA TTGTTTCTTT GTGAAAGTTA TATAAGATTT GTTATGGCTT780TTGCTGGAAA CATAATAAGT TATAATGCTG AGATAGCTAC TGAAGTTTGT TTTTTCTAGC840CTTTTAAATG TACCAATAAT AGATTCCGTA TCGAACGAGT ATGTTTTGAT TACCTGGTCA900TGATGTTTCT ATTTTTTACA TTTTTTTGGT GTTGAACTGC AATTGAAAAT GTTGTATCCT960ATGAGACGGA TAGTTGAGAA TGTGTTCTTT GTATGGACCT TGAGAAGCTC AAACGCTACT 1020CCAATAATTT CTATGAATTC AAATTCAGTT TATGGCTACC AGTCAGTCCA GAAATTAGGA 1080TATGCTGCAT ATACTTGTTC AATTATACTG TAAAATTTCT TAAGTTCTCA AGATATCCAT 1140GTAACCTCGA GAATTTCTTT GACAG 1165(2)SEQ ID NO2资料(i)序列特征(A)长度317碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否(xi)序列描述SEQ ID NO2GTATGTTTGA TAATTTATAT GGTTGCATGG ATAGTATATA AATAGTTGGA AAACTTCTGG 60ACTGGTGCTC ATGGCATATT TGATCTGTGC ACCGTGTGGA GATGTCAAAC ATGTGTTACT 120TCGTTCCGCC AATTTATAAT ACCTTAACTT GGGAAAGACA GCTCTTTACT CCTGTGGGCA 180TTTGTTATTT GAATTACAAT CTTTATGAGC ATGGTGTTTT CACATTATCA ACTTCTTTCA 240TGTGGTATAT AACAGTTTTT AGCTCCGTTA ATACCTTTCT TCTTTTTGAT ATAAACTAAC 300TGTGGTGCAT TGCTTGC 317(2)SEQ ID NO3资料(i)序列特征(A)长度504碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否(xi)序列描述SEQ ID NO3GTAACAGCCA AAAGTTGTGC TTTAGGCAGT TTGACCTTAT TTTGGAAGAT GAATTGTTTA 60TACCTACTTT GACTTTGCTA GAGAATTTTG CATACCGGGG AGTAAGTAGT GGCTCCATTT 120AGGTGGCACC TGGCCATTTT TTTGATCTTT TAAAAAGCTG TTTGATTGGG TCTTCAAAAA 180AGTAGACAAG GTTTTTGGAG AAGTGACACA CCCCCGGAGT GTCAGTGGCA AAGCAAAGAT 240TTTCACTAAG GAGATTCAAA ATATAAAAAA AGTATAGACA TAAAGAAGCT GAGGGGATTC 300AACATGTACT ATACAAGCAT CAAATATAGT CTTAAAGCAA TTTTGTAGAA ATAAAGAAAG 360TCTTCCTTCT GTTGCTTCAC AATTTCCTTC TATTATCATG AGTTACTCTT TCTGTTCGAA 420ATAGCTTCCT TAATATTAAA TTCATGATAC TTTTGTTGAG ATTTAGCAGT TTTTTCTTGT 480GTAAACTGCT CTCTTTTTTT GCAG 504(2)SEQ ID NO4资料(i)序列特征(A)长度146碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形
(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否(xi)序列描述SEQ ID NO4GTAGGTCCTC GTCTACTACA AAATAGTAGT TTCCATCATC ATAACAGATT TTCCTATTAA 60AGCATGATGT TGCAGCATCA TTGGCTTTCT TACATGTTCT AATTGCTATT AAGGTTATGC120TTCTAATTAA CTCATCCACA ATGCAG 146(2)SEQ ID NO5资料(i)序列特征(A)长度218碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否(xi)序列描述SEQ ID NO5GTTTTGTTAT TCATACCTTG AAGCTGAATT TTGAACACCA TCATCACAGG CATTTCGATT 60CATGTTCTTA CTAGTCTTGT TATGTAAGAC ATTTTGAAAT GCAAAAGTTA AAATAATTGT120GTCTTTACTA ATTTGGACTT GATCCCATAC TCTTTCCCTT AACAAAATGA GTCAATTCTA180TAAGTGCTTG AGAACTTACT ACTTCAGCAA TTAAACAG218(2)SEQ ID NO6资料(i)序列特征(A)长度198碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否
(xi)序列描述SEQ ID NO6GTATTTTAAA TTTATTTCTA CAACTAAATA ATTCTCAGAA CAATTGTTAG ATAGAATCCA 60AATATATACG TCCTGAAAGT ATAAAAGTAC TTATTTTCGC CATGGGCCTT CAGAATATTG120GTAGCCGCTG AATATCATGA TAAGTTATTT ATCCAGTGAC ATTTTTATGT TCACTCCTAT180TATGTCTGCT GGATACAG 198(2)SEQ ID NO7资料(i)序列特征(A)长度208碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否(xi)序列描述SEQ ID NO7GTTTGTCTGT TTCTATTGCA TTTTAAGGTT CATATAGGTT AGCCACGGAA AATCTCACTC 60TTTGTGAGGT AACCAGGGTT CTGATGGATT ATTCAATTTT CTCGTTTATC ATTTGTTTAT120TCTTTTCATG CATTGTGTTT CTTTTTCAAT ATCCCTCTTA TTTGGAGGTA ATTTTTCTCA180TCTATTCACT TTTAGCTTCT AACCACAG 208(2)SEQ ID NO8资料(i)序列特征(A)长度293碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否(xi)序列描述SEQ ID NO8GTATGTCTTA CATCTTTAGA TATTTTGTGA TAATTACAAT TAGTTTGGCT TACTTGAACA 60AGATTCATTC CTCAAAATGA CCTGAACTGT TGAACATCAA AGGGGTTGAA ACATAGAGGA 120AAACAACATG ATGAATGTTT CCATTGTCTA GGGATTTCTA TTATGTTGCT GAGAACAAAT 180GTCATCTTAA AAAAAACATT GTTTACTTTT TTGTAGTATA GAAGATTACT GTATAGAGTT 240TGCAAGTGTG TCTGTTTTGG AGTAATTGTG AAATGTTTGA TGAACTTGTA CAG 293(2)SEQ ID NO9资料(i)序列特征(A)长度376碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否(xi)序列描述SEQ ID NO9GTTCAAGTAT TTTGAATCGC AGCTTGTTAA ATAATCTAGT AATTTTTAGA TTGCTTACTT 60GGAAGTCTAC TTGGTTCTGG GGATGATAGC TCATTTCATC TTGTTCTACT TATTTTCCAA120CCGAATTTCT GATTTTTGTT TCGAGATCCA AGTATTAGAT TCATTTACAC TTATTACCGC180CTCATTTCTA CCACTAAGGC CTTGATGAGC AGCTTAAGTT GATTCTTTGA AGCTATAGTT240TCAGGCTACC AATCCACAGC CTGCTATATT TGTTGGATAC TTACCTTTTC TTTACAATGA300AGTGATACTA ATTGAAATGG TCTAAATCTG ATATCTATAT TTCTCCGTCT TTCCTCCCCC360TCATGATGAA ATGCAG376(2)SEQ ID NO10资料(i)序列特征(A)长度172碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否
(xi)序列描述SEQ ID NO10GTAAAATCAT CTAAAGTTGA AAGTGTTGGG TTTATGAAGT GCTTTAATTC TATCCAAGGA 60CAAGTAGAAA CCTTTTTACC TTCCATTTCT TGATGATGGA TTTCATATTA TTTAATCCAA120TAGCTGGTCA AATTCGGTAA TAGCTGTACT GATTAGTTAC TTCACTTTGC AG172(2)SEQ ID NO11资料(i)序列特征(A)长度145碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否(xi)序列描述SEQ ID NO11GTATATATGT TTTACTTATC CATGAAATTA TTGCTCTGCT TGTTTTTAAT GTACTGAACA 60AGTTTTATGG AGAAGTAACT GAAACAAATC ATTTTCACAT TGTCTAATTT AACTCTTTTT120TCTGATCCTC GCATGACGAA AACAG145(2)SEQ ID NO12资料(i)序列特征(A)长度242碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否(xi)序列描述SEQ ID NO12GTAAGGATTT GCTTGAATAA CTTTTGATAA TAAGATAACA GATGTAGGGT ACAGTTCTCT 60CACCAAAAAG AACTGTAATT GTCTCATCCA TCTTTAGTTG TATAAGATAT CCGACTGTCT120GAGTTCGGAA GTGTTTGAGC CTCCTGCCCT CCCCCTGCGT TGTTTAGCTA ATTCAAAAAG180GAGAAAACTG TTTATTGATG ATCTTTGTCT TCATGCTGAC ATACAATCTG TTCTCATGAC240AG 242(2)SEQ ID NO13资料(i)序列特征(A)长度797碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否(xi)序列描述SEQ ID NO13GTACAGTTCT TGCCGTGTGA CCTCCCTTTT TATTGTGGTT TTGTTCATAG TTATTTGAAT 60GCGATAGAAG TTAACTATTG ATTACCGCCA CAATCGCCAG TTAAGTCCTC TGAACTACTA120ATTTGAAAGG TAGGAATAGC CGTAATAAGG TCTACTTTTG GCATCTTACT GTTACAAAAC180AAAAGGATGC CAAAAAAATT CTTCTCTATC CTCTTTTTCC CTAAACCAGT GCATGTAGCT240TGCACCTGCA TAAACTTAGG TAAATGATCA AAAATGAAGT TGATGGGAAC TTAAAACCGC300CCTGAAGTAA AGCTAGGAAT AGTCATATAA TGTCCACCTT TGGTGTCTGC GCTAACATCA360ACAACAACAT ACCTCGTGTA GTCCCACAAA GTGGTTTCAG GGGGAGGGTA GAGTGTATGC420AAAACTTACT CCTATCTCAG AGGTAGAGAG GATTTTTTCA ATAGACCCTT GGCTCAAGAA480AAAAAGTCCA AAAAGAAGTA ACAGAAGTGA AAGCAACATG TGTAGCTAAA GCGACCCAAC540TTGTTTGGGA CTGAAGTAGT TGTTGTTGTT GAAACAGTGC ATGTAGATGA ACACATGTCA600GAAAATGGAC AACACAGTTA TTTTGTGCAA GTCAAAAAAA TGTACTACTA TTTCTTTGTG660CAGCTTTATG TATAGAAAAG TTAAATAACT AATGAATTTT GCTAGCAGAA AAATAGCTTG720GAGAGAAATT TTTTATATTG AACTAAGCTA ACTATATTCA TCTTTCTTTT TGCTTCTTCT780TCTCCTTGTT TGTGAAG 797(2)SEQ ID NO14资料
(i)序列特征(A)长度2169碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否(xi)序列描述SEQ ID NO14ATCATGGCCA ATTACTGGTT CAAATGCATT ACTTCCTTTC AGATTCTTTC GAGTTCTCAT60GACCGGTCCT ACTACAGACG ATACTAACCC GTGGAACTGT TGCATCTGCT TCTTAGAACT 120CTATGGCTAT TTTCGTTAGC TTGGCGTCGG TTTGAACATA GTTTTTGTTT TCAAACTCTT 180CATTTACAGT CAAAATGTTG TATGGTTTTT GTTTTCCTCA ATGATGTTTA CAGTGTTGTG 240TTGTCATCTG TACTTTTGCC TATTACTTGT TTTGAGTTAC ATGTTAAAAA AGTGTTTATT 300TTGCCATATT TTGTTCTCTT ATTATTATTA TCATACATAC ATTATTACAA GGAAAAGACA 360AGTACACAGA TCTTAACGTT TATGTTCAAT CAACTTTTGG AGGCATTGAC AGGTACCACA 420AATTTTGAGT TTATGATTAA GTTCAATCTT AGAATATGAA TTTAACATCT ATTATAGATG 480CATAAAAATA GCTAATGATA GAACATTGAC ATTTGGCAGA GCTTAGGGTA TGGTATATCC 540AACGTTAATT TAGTAATTTT TGTTACGTAC GTATATGAAA TATTGAATTA ATCACATGAA 600CGGTGGATAT TATATTATGA GTTGGCATCA GCAAAATCAT TGGTGTAGTT GACTGTAGTT 660GCAGATTTAA TAATAAAATG GTAATTAACG GTCGATATTA AAATAACTCT CATTTCAAGT 720GGGATTAGAA CTAGTTATTA AAAAAATGTA TACTTTAAGT GATTTGATGG CATATAATTT 780AAAGTTTTTC ATTTCATGCT AAAATTGTTA ATTATTGTAA TGTAGACTGC GACTGGAATT 840ATTATAGTGT AAATTTATGC ATTCAGTGTA AAATTAAAGT ATTGAACTTG TCTGTTTTAG 900AAAATACTTT ATACTTTAAT ATAGGATTTT GTCATGCGAA TTTAAATTAA TCGATATTGA 960ACACGGAATA CCAAAATTAA AAAGGATACA CATGGCCTTC ATATGAACCG TGAACCTTTG 1020ATAACGTGGA AGTTCAAAGA AGGTAAAGTT TAAGAATAAA CTGACAAATT AATTTCTTTT 1080ATTTGGCCCA CTACTAAATT TGCTTTACTT TCTAACATGT CAAGTTGTGC CCTCTTAGTT 1140GAATGATATT CATTTTTCAT CCCATAAGTT CAATTTGATT GTCATACCAC CCATGATGTT 1200CTGAAAAATG CTTGGCCATT CACAAAGTTT ATCTTAGTTC CTATGAACTT TATAAGAAGC 1260TTTAATTTGA CATGTTATTT ATATTAGATG ATATAATCCA TGACCCAATA GACAAGTGTA 1320TTAATATTGT AACTTTGTAA TTGAGTGTGT CTACATCTTA TTCAATCATT TAAGGTCATT 1380AAAATAAATT ATTTTTTGAC ATTCTAAAAC TTTAAGCAGA ATAAATAGTT TATCAATTAT 1440TAAAAACAAA AAACGACTTA TTTATAAATC AACAAACAAT TTTAGATTGC TCCAACATAT 1500TTTTCCAAAT TAAATGCAGA AAATGCATAA TTTTATACTT GATCTTTATA GCTTATTTTT 1560TTTAGCCTAA CCAACGAATA TTTGTAAACT CACAACTTGA TTAAAAGGGA TTTACAACAA 1620GATATATATA AGTAGTGACA AATCTTGATT TTAAATATTT TAATTTGGAG GTCAAAATTT 1680TACCATAATC ATTTGTATTT ATAATTAAAT TTTAAATATC TTATTTATAC ATATCTAGTA 1740AACTTTTAAA TATACGTATA TACAAAATAT AAAATTATTG GCGTTCATAT TAGGTCAATA 1800AATCCTTAAC TATATCTGCC TTACCACTAG GAGAAAGTAA AAAACTCTTT ACCAAAAATA 1860CATGTATTAT GTATACAAAA AGTCGATTAG ATTACCTAAA TAGAAATTGT ATAACGAGTA 1920AGTAAGTAGA AATATAAAAA AACTACAATA CTAAAAAAAA TATGTTTTAC TTCAATTTCG 1980AAACTAATGG GGTCTGAGTG AAATATTCAG AAAGGGGAGG ACTAACAAAA GGGTCATAAT 2040GTTTTTTTAT AAAAAGCCAC TAAAATGAGG AAATCAAGAA TCAGAACATA CAAGAAGGCA 2100GCAGCTGAAG CAAAGTACCA TAATTTAATC AATGGAAATT AATTTCAAAG TTTTATCAAA 2160ACCCATTCG2169(2)SEQ ID NO15资料(i)序列特征(A)长度1165碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO15CTGTCAAAGA AATTCTCGAG GTTACATGGA TATCTTGAGA ACTTAAGAAA TTTTACAGTA 60TAATTGAACA AGTATATGCA GCATATCCTA ATTTCTGGAC TGACTGGTAG CCATAAACTG 120AATTTGAATT CATAGAAATT ATTGGAGTAG CGTTTGAGCT TCTCAAGGTC CATACAAAGA 180ACACATTCTC AACTATCCGT CTCATAGGAT ACAACATTTT CAATTGCAGT TCAACACCAA 240AAAAATGTAA AAAATAGAAA CATCATGACC AGGTAATCAA AACATACTCG TTCGATACGG 300AATCTATTAT TGGTACATTT AAAAGGCTAG AAAAAACAAA CTTCAGTAGC TATCTCAGCA 360TTATAACTTA TTATGTTTCC AGCAAAAGCC ATAACAAATC TTATATAACT TTCACAAAGA 420AACAATTTTT ATCATATCCC TGGACATATA ATGAACCCTT TATGTGTTCA GAACTTTGCC 480CTTGACCATG TATTTGTGTT GTAAAAAATC CACTTATTAT GTATACATAA TTGATTTACA 540ACAACAAACA CAATGTAATC CCACAAGTGG AGTGTGGTGA GGACTTTACC CCTACCTTAC 600GAGATAGAGA GATTGTTTCT AATAGACCCT CGGCTAAAGT AAAAGCATTT CAAAGCAACG 660CGATAATAAA GAAGGCATGA TAAAACACTA AAGGAAGCAT GCTAGAGCAT TCTTACCGAG 720GAACAATAAC TACGACAAGA TATATAATAC AATAATCGAA GTACAAGAAA CAGAAAATAG 780AATAACAAAG ATCAAATAAC AAAACAAGAA ACTACCCAAA TAATTCCACG ACTACTAGTA 840TGAAAGGATA AGCCAGACAA CACTCAAATA CCTAACTAAC CTTCTACCCC TCATCCGTGT 900CCTCCATAAC CTCCTAGAAC ACTCTTTCTA AATATTGTCT TCCCCCACCC CCCCTCCATC 960TCTCAATTTT TGAATTTTAT ACACTCAACC ACCTTGCAAA TTTGTCACAT GATACTTACA1020TATGGCTCTA CAAGTGTCAT TTTTCTTCCA TATTTGATAT TATAAAAAAT AAAATAAAAA1080ACTAAGGAGA TGATCCAGAT ATATTGGAAA ATGAAATGCA AAGGCTAAAA ATAATTGAAA1140TTAACATGAA ATTAGTAAAA ATTAC1165(2)SEQ ID NO16资料(i)序列特征(A)长度317碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO16GCAAGCAATG CACCACAGTT AGTTTATATC AAAAAGAAGA AAGGTATTAA CGGAGCTAAA 60AACTGTTATA TACCACATGA AAGAAGTTGA TAATGTGAAA ACACCATGCT CATAAAGATT120GTAATTCAAA TAACAAATGC CCACAGGAGT AAAGAGCTGT CTTTCCCAAG TTAAGGTATT180ATAAATTGGC GGAACGAAGT AACACATGTT TGACATCTCC ACACGGTGCA CAGATCAAAT240ATGCCATGAG CACCAGTCCA GAAGTTTTCC AACTATTTAT ATACTATCCA TGCAACCATA300TAAATTATCA AACATAC 317(2)SEQ ID NO17资料
(i)序列特征(A)长度504碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO17CTGCAAAAAA AGAGAGCAGT TTACACAAGA AAAAACTGCT AAATCTCAAC AAAAGTATCA 60TGAATTTAAT ATTAAGGAAG CTATTTCGAA CAGAAAGAGT AACTCATGAT AATAGAAGGA120AATTGTGAAG CAACAGAAGG AAGACTTTCT TTATTTCTAC AAAATTGCTT TAAGACTATA180TTTGATGCTT GTATAGTACA TGTTGAATCC CCTCAGCTTC TTTATGTCTA TACTTTTTTT240ATATTTTGAA TCTCCTTAGT GAAAATCTTT GCTTTGCCAC TGACACTCCG GGGGTGTGTC300ACTTCTCCAA AAACCTTGTC TACTTTTTTG AAGACCCAAT CAAACAGCTT TTTAAAAGAT360CAAAAAAATG GCCAGGTGCC ACCTAAATGG AGCCACTACT TACTCCCCGG TATGCAAAAT420TCTCTAGCAA AGTCAAAGTA GGTATAAACA ATTCATCTTC CAAAATAAGG TCAAACTGCC480TAAAGCACAA CTTTTGGCTG TTAC 504(2)SEQ ID NO18资料(i)序列特征(A)长度146碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO18CTGCATTGTG GATGAGTTAA TTAGAAGCAT AACCTTAATA GCAATTAGAA CATGTAAGAA 60AGCCAATGAT GCTGCAACAT CATGCTTTAA TAGGAAAATC TGTTATGATG ATGGAAACTA120CTATTTTGTA GTAGACGAGG ACCTAC 146
(2)SEQ ID NO19资料(i)序列特征(A)长度218碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO19CTGTTTAATT GCTGAAGTAG TAAGTTCTCA AGCACTTATA GAATTGACTC ATTTTGTTAA 60GGGAAAGAGT ATGGGATCAA GTCCAAATTA GTAAAGACAC AATTATTTTA ACTTTTGCAT120TTCAAAATGT CTTACATAAC AAGACTAGTA AGAACATGAA TCGAAATGCC TGTGATGATG180GTGTTCAAAA TTCAGCTTCA AGGTATGAAT AACAAAAC218(2)SEQ ID NO20资料(i)序列特征(A)长度198碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO20(见42-43页序列)CTGTATCCAG CAGACATAAT AGGAGTGAAC ATAAAAATGT CACTGGATAA ATAACTTATC 60ATGATATTCA GCGGCTACCA ATATTCTGAA GGCCCATGGC GAAAATAAGT ACTTTTATAC120TTTCAGGACG TATATATTTG GATTCTATCT AACAATTGTT CTGAGAATTA TTTAGTTGTA180GAAATAAATT TAAAATAC 198(2)SEQ ID NO21资料
(i)序列特征(A)长度208碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO21CTGTGGTTAG AAGCTAAAAG TGAATAGATG AGAAAAATTA CCTCCAAATA AGAGGGATAT 60TGAAAAAGAA ACACAATGCA TGAAAAGAAT AAACAAATGA TAAACGAGAA AATTGAATAA120TCCATCAGAA CCCTGGTTAC CTCACAAAGA GTCAGATTTT CCGTGGCTAA CCTATATGAA180CCTTAAAATG CAATAGAAAC AGACAAAC 208(2)SEQ ID NO22资料(i)序列特征(A)长度293碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO22CTGTACAAGT TCATCAAACA TTTCACAATT ACTCCAAAAC AGACACACTT GCAAACTCTA 60TACAGTAATC TTCTATACTA CAAAAAAGTA AACAATGTTT TTTTTAAGAT GACATTTGTT120CTCAGCAACA TAATAGAAAT CCCTAGACAA TGGAAACATT CATCATGTTG TTTTCCTCTA180TGTTTCAACC CCTTTGATGT TCAACAGTTC AGGTCATTTT GAGGAATGAA TCTTGTTCAA240GTAAGCCAAA CTAATTGTAA TTATCACAAA ATATCTAAAG ATGTAAGACA TAC 293(2)SEQ ID NO23资料(i)序列特征(A)长度376碱基对
(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO23CTGCATTTCA TCATGAGGGG GAGGAAAGAC GGAGAAATAT AGATATCAGA TTTAGACCAT 60TTCAATTAGT ATCACTTCAT TGTAAAGAAA AGGTAAGTAT CCAACAAATA TAGCAGGCTG120TGGATTGGTA GCCTGAAACT ATAGCTTCAA AGAATCAACT TAAGCTGCTC ATCAAGGCCT180TAGTGGTAGA AATGAGGCGG TAATAAGTGT AAATGAATCT AATACTTGGA TCTCGAAACA240AAAATCAGAA ATTCGGTTGG AAAATAAGTA GAACAAGATG AAATGAGCTA TCATCCCCAG300AACCAAGTAG ACTTCCAAGT AAGCAATCTA AAAATTACTA GATTATTTAA CAAGCTGCGA360TTCAAAATAC TTGAAC376(2)SEQ ID NO24资料(i)序列特征(A)长度172碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO24CTGCAAAGTG AAGTAACTAA TCAGTACAGC TATTACCGAA TTTGACCAGC TATTGGATTA 60AATAATATGA AATCCATCAT CAAGAAATGG AAGGTAAAAA GGTTTCTACT TGTCCTTGGA120TAGAATTAAA GCACTTCATA AACCCAACAC TTTCAACTTT AGATGATTTT AC172(2)SEQ ID NO25资料(i)序列特征(A)长度145碱基对
(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO25CTGTTTTCGT CATGCGAGGA TCAGAAAAAA GAGTTAAATT AGACAATGTG AAAATGATTT 60GTTTCAGTTA CTTCTCCATA AAACTTGTTC AGTACATTAA AAACAAGCAG AGCAATAATT120TCATGGATAA GTAAAACATA TATAC145(2)SEQ ID NO26资料(i)序列特征(A)长度242碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO26CTGTCATGAG AACAGATTGT ATGTCAGCAT GAAGACAAAG ATCATCAATA AACAGTTTTC 60TCCTTTTTGA ATTAGCTAAA CAACGCAGGG GGAGGGCAGG AGGCTCAAAC ACTTCCGAAC120TCAGACAGTC GGATATCTTA TACAACTAAA GATGGATGAG ACAATTACAG TTCTTTTTGG180TGAGAGAACT GTACCCTACA TCTGTTATCT TATTATCAAA AGTTATTCAA GCAAATCCTT240AC 242(2)SEQ ID NO27资料(i)序列特征(A)长度797碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形
(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO27CTTCACAAAC AAGGAGAAGA AGAAGCAAAA AGAAAGATGA ATATAGTTAG CTTAGTTCAA 60TATAAAAAAT TTCTCTCCAA GCTATTTTTC TGCTAGCAAA ATTCATTAGT TATTTAACTT120TTCTATACAT AAAGCTGCAC AAAGAAATAG TAGTACATTT TTTTGACTTG CACAAAATAA180CTGTGTTGTC CATTTTCTGA CATGTGTTCA TCTACATGCA CTGTTTCAAC AACAACAACT240ACTTCAGTCC CAAACAAGTT GGGTCGCTTT AGCTACACAT GTTGCTTTCA CTTCTGTTAC300TTCTTTTTGG ACTTTTTTTC TTGAGCCAAG GGTCTATTGA AAAAATCCTC TCTACCTCTG360AGATAGGAGT AAGTTTTGCA TACACTCTAC CCTCCCCCTG AAACCACTTT GTGGGACTAC420ACGAGGTATG TTGTTGTTGA TGTTAGCGCA GACACCAAAG GTGGACATTA TATGACTATT480CCTAGCTTTA CTTCAGGGCG GTTTTAAGTT CCCATCAACT TCATTTTTGA TCATTTACCT540AAGTTTATGC AGGTGCAAGC TACATGCACT GGTTTAGGGA AAAAGAGGAT AGAGAAGAAT600TTTTTTGGCA TCCTTTTGTT TTGTAACAGT AAGATGCCAA AAGTAGACCT TATTACGGCT660ATTCCTACCT TTCAAATTAG TAGTTCAGAG GACTTAACTG GCGATTGTGG CGGTAATCAA720TAGTTAACTT CTATCGCATT CAAATAACTA TGAACAAAAC CACAATAAAA AGGGAGGTCA780CACGGCAAGA ACTGTAC 797(2)SEQ ID 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TATTGAAAAG11340AAAGAAAATT TATAACAGAA AAAGATGTCA AAAAAAAGGT AAAATGAAAG AGTATCATAT11400ACTTAAAGAG TTGCGTAGAG ATAAGTCAAA AGAAACAGAA TTATAGTAAT TTCAGCTAAG11460TTAGAATTC 11469(2)SEQ ID NO30资料(i)序列特征(A)长度26碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝″Synthetic DNA Primer″(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO30GGAATTCCAG TCGCAGTCTA CATTAC 26(2)SEQ ID NO31资料(i)序列特征(A)长度28碱基对(B)类型核酸
(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝″Synthetic DNA Primer″(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO31CGGGATCCAG AGGCATTAAG ATTTCTGG 28(2)SEQ ID NO32资料(i)序列特征(A)长度32碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝″Synthetic DNA Primer″(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO30CGGGATCCAA AGAAATTCTC GAGGTTACAT GG 32(2)SEQ ID NO33资料(i)序列特征(A)长度32碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝″Synthetic DNA Primer″
(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO33CGGGATCCGG GGTAATTTTT ACTAATTTCA TG 32(2)SEQ ID NO34资料(i)序列特征(A)长度32碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝″Synthetic DNA Primer″(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO34CGGGATCCCG TATGTCTCAC TGTGTTTGTG GC 32(2)SEQ ID NO35资料(i)序列特征(A)长度32碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝″Synthetic DNA Primer″(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO35
CGGGATCCCC CTACATACAT ATATCAGATT AG32(2)SEQ ID NO36资料(i)序列特征(A)长度28碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝″Synthetic DNA Primer″(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO36CCATCGATAC TTTAAGTGAT TTGATGGC 28(2)SEQ ID NO37资料(i)序列特征(A)长度28碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝″Synthetic DNA Primer″(iii)假拟序列否(iv)反义序列是(xi)序列描述SEQ ID NO37CGGGATCCTG TTCTGATTCT TGATTTCC 28(2)SEQ ID NO38资料(i)序列特征
(A)长度2122碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟序列否(iv)反义序列否(xi)序列描述SEQ ID NO38GTATGTCTCA CTGTGTTTGT GGCTGTGTGT GTTTTTTTCT CTGTCTTTTT GTGTTTTGTG 60TAATTGGGGC TCTTTAAAGT TGGTATTGTG TATACCCTTT TGAGTATAGT CTTTGAGGAA 120GCAAAATGAT GAATCTTGAT TGACATTAGT AAGGGTTGTA ACTTTTTGAA GTTTGGTTAG180GTGTAATTGA GTTTGGCTTG TGTGTCTGTG TGTCGAGGTT ATTTTTTTGG TTTGTGTTAT240TGGGGATTCT TAAAAGTTGG TATTGTGTAT ACCCTTTTGA GTATAGTCTT TGAGGAAGCA300AAAATGATGA ATCTTGATTG GCATTAGTAA AGGTTGTAGC TTTTTGAAGT GTGGTTAGGT360GTAATTGAGT TTGGCTTGTG TGTCTGTGTG TTTTGGAATC CTGATGTGTG TCAAGTCCTG420ATATGGGTCG AGGTTCTTTC TTTGGTTTGT GTAATTGGGG GTTCTTAAAA GTTGGTATTA480TGTACCTTTT TAAGAATAGT GTCTGAGAAA GCAAAATCGA TGAATTTTGA TTGACAGCAT540ATTCTTTGAG AAAGCAAAAA ATGGTGAGTT TTCATGGAGA AACTTGATTG ACATTACTAA600AGGTAGCAAC TTTTTCAACT CCTGATATGG GTCAAGGTTC TTTGTTTGGT TTGTGTAATT660TGGGGTTCTT TGAAGTTTTG AGAAAGAAAA ATTATGATTT TTCATGGAGA AATTTGATTT720CATTAATAAAGGTAGTAGC TTTTTAAAGT GTGGTCAGCT GTAATGAGTT CAGCTTGGTT780TAAAGGGGCC CTACATATGG TGCTTTCTGG TGAGATATTT GTTGCTCCAC CATACGAGTT840ATAAGAATCA TAGTGTTAGG ATCTTTTTTC TTTTTTTTTT CATTTTTCAC TTGACTAGCT900ACTAGAGGAG TGATCTTGAC GGCGGAAAAT CTTAGAAAGG GGAAGGTTGT TTGCATCAAC960TGGTGTTATA TGTGCAAGGA GACGGGAGAT GATGTAGATC ATCTTCTTCT TCATTGTGGT 1020CTTTCCATGA GGTTATGATG TGATATGTTT GAATGGTTTG GTACTTCTTG GCTATGCCAA 1080GAACTGTGAA AGAATTGATA TTCAGTTGGA AGTGTGGAGT TGGAAGAGTG GAAGAATTGA 1140CACTTGGTTC CATTAGCTTT AATGTGGGTG GTGTGGAGAG AGAGAGAAAT AGGAGAGCTT 1200TTGAGGGGGT AGAGTTGAGC TTTCCTCAGT TGAGAAGTAG CCTTTGATAT CTTTTTTTTT 1260TTTTTTTGTA CACCCATAGA ATTCCCAATT GTATAGAAGA TTGGGTGGAG TTTGTAGAGA 1320ATCATCTTTT GTAGTAGATT CTTTACCTTT TGGTATATCC ATTGTATACA GCCAGGCCTT 1380TGACTATGTT TATGAATGAA TATACATTAC TTGAAAAAAA AAGAAGTGAA GCCAGTCTGT 1440TGTACCTTTG TAGACAATGT TGTTGCAGCA TCTTGATAAT TCCCTGAAAA TTGTCTCCCT 1500GAAGGAATAG TTTGGTTGAT ATTGATTATT TCTTGGTTTG TTTAATTCGG TGTTCTTGAA 1560GGCCATTTTA AATCCTTTGA CATTGTTAAA GGTGTTTACA AGTGTTGGTC TGGGTTTAAA 1620AGCACCTCTT GTATGGTGCT TTCTGGAGTG ATCTTTCTTC CTCCAAAAGA GAAGTTGCAA 1680GAATCAGTGT GTGTACTTTT TTCTCTTGTA TGATCAGATC TTTTTTCAAT TTTTCCGTTT 1740TAGTTGATTT ATCCATATAG TGAAAGTTGG TGTCATAGTT GCTGTTTGTG GACTTCCTGT 1800AAAAGTTTTT TGATATACTT AAAAAATTGT CACACAGAAG AAAGAGTTTT TTACCATTAC 1860TTAAGCTAGA TGGGACTGTT TGATTCTTAG ACCAAATAAT GAACCTTTTT GTTCTCTTAA 1920CGTGTACTTG AAATAGTTTG GTAAAATTGT GATAGGAAAA AAGATAATTC TTGATTGCTT 1980TTGGAGCATC ACTTCTAATC ATAAAAGTCT TTGCTCTCTT CAACCATGAA TGATAAATTG 2040GACACTTATG TGGCCCTAAG TTGCTCTCAG TAGTGGTCTT TAATTGTGGA GATATAACTA 2100ATCTGATATA TGTATGTAGG GA 212权利要求
1.一种影响植物(或其细胞，组织或器官)中酶活性的方法，包括在所述植物(或其细胞，组织或器官)中表达以反义方向部分或完全编码A类马铃薯淀粉分支酶的内含子的核苷酸序列，任选的，以及一种以反义或正义方向部分或完全编码B类淀粉分支酶的内含子的核苷酸序列；并且其中所述核苷酸序列不含正常地与所述内含子连接的外显子序列的反义序列。
2.权利要求1的方法，其中淀粉分支酶活性受影响和/或其中支链淀粉水平受影响和/或淀粉组成被改变。
3.影响产淀粉有机体(或其细胞，组织或器官)中酶活性的方法，包括在产淀粉有机体(或其细胞，组织或器官)中表达以反义方向部分或完全编码A类马铃薯淀粉分支酶的内含子的核苷酸序列，任选的，以及一种以反义或正义方向部分或完全编码B类淀粉分支酶的内含子的核苷酸序列；并且其中淀粉分支酶活性受影响和/或支链淀粉水平受影响和/或淀粉组成被改变。
4.权利要求3的方法，其中所述核苷酸序列不含正常地与所述内含子连接的外显子序列的反义序列。
5.前述权利要求任何之一的方法，其中所述酶活性被降低或消除。
6.前述权利要求任何之一的方法，其中所述核苷酸序列编码至少基本上全部的至少一个反义方向的内含子。
7.前述权利要求任何之一的方法，其中所述核苷酸序列编码全部的至少一个反义方向的内含子。
8.前述权利要求任何之一的方法，其中所述核苷酸序列包括SEQ.ID.No.38的互补序列或其片段。
9.前述权利要求任何之一的方法，其中所述核苷酸序列通过一个含SEQ.ID.No.14给出序列或其变体，衍生物或同系物的启动子进行表达。
10.包含权利要求8中定义的核苷酸序列或其变体，衍生物或同系物的反义序列。
11.含SEQ.ID.No.14中给出的序列或其变体，衍生物或同系物的启动子。
12.与目的基因(“GOI”)结合的权利要求11的启动子。
13.可包含或表达本发明权利要求10到12任何之一的构建体。
14.组成或表达本发明权利要求10到13任何之一的载体。
15.一种核苷酸序列的组合物，其中包含编码重组酶的第一核苷酸序列；和以反义方向对应于内含子的第二核苷酸序列；其中所述内含子是与编码所述重组酶相应的一种酶的基因组基因连接的内含子；并且其中第二核苷酸序列不含正常时与所述内含子连接的外显子序列的反义序列。
16.包含或表达本发明权利要求10到15任何之一的细胞，组织或器官。
17.包含或表达本发明权利要求10到16任何之一的转基因产淀粉有机体。
18.权利要求17的转基因产淀粉有机体，其中所述有机体是植物。
19.从本发明前述权利要求任何之一获得的淀粉。
20.A类SBE内含子的反义核苷酸序列。
21.在有机体中产生修饰淀粉的方法，包括用能表达A类SBE相关的反义内含子序列的转基因和能表达B类SBE相关的反义内含子序列的转基因转化所述有机体，从而降低或消除内源性A类与B类的产生，以及进一步用来自异源的SBE编码序列转化所述有机体。
全文摘要
描述一种抑制基因表达的方法。所述方法影响植物中的酶活性,包括在植物(或植物的细胞,组织或器官)中表达核苷酸序列,其中核酸序列编码(部分或完全的)A类SBE反义方向内含子;并且其中所述核苷酸序列不含正常时与所述内含子相连的外显子反义序列。
文档编号C12N15/29GK1248292SQ98802697
公开日2000年3月22日 申请日期1998年2月23日 优先权日1997年2月21日
发明者P·普尔森 申请人:丹尼斯科有限公司