专利名称：通过降低rb与细胞程序性死亡诱导蛋白的比率诱导恶性细胞中细胞程序性死亡的方法
技术领域：
本发明涉及在哺乳动物如人中诱导恶性细胞的细胞死亡如细胞程序性死亡的方法。本发明进一步涉及用于转移遗传材料以实现恶性细胞中生长停滞以及随后的细胞程序性死亡诱导的载体的用途。本发明也涉及将遗传材料转移入恶性细胞以通过细胞程序性死亡诱导细胞死亡的载体。
背景技术：
迄今为止，只有有限数量在临床前模型中表现成功征兆的癌症基因治疗基本策略。两个主要策略是细胞因子基因辅助的肿瘤接种疫苗和选择性药物前体活化。第一个策略依赖于相对小量的遗传修饰的细胞毒性T细胞或肿瘤细胞的强免疫刺激效应，而第二种策略是基于通过编码酶的基因将非毒性药物前体转变成毒性产物，其中由于所谓的旁观者效应，也在非转导分裂肿瘤细胞上发挥毒性效应。选择性地，可以设想通过使癌基因失活或重建失活的肿瘤抑制基因以逆转细胞的恶性表型的策略。在两种情况下，都需要导向肿瘤中细胞的高效基因转移。尽管在某些情况下可以在体外甚至体内得到高效基因转移，但是通过逆转肿瘤细胞中主要致癌变化以纠正恶性表型不可能产生正常细胞。因此，选择性诱导肿瘤细胞死亡将是优选的，发展产生这种诱导的方法具有重要意义。在正常细胞恶化前，不同癌基因或肿瘤抑制基因中必然发生几种基因的改变。大多数癌基因或肿瘤抑制基因参与了一定比例肿瘤的发生，但是它们没有任何一个参与了每种单个肿瘤的发生。目前有正在增加的证据表明仅存在非常有限的参与细胞命运包括细胞周期调控关键决定的调控通路。多步骤致癌作用的共同特征是每一种通路的至少一种成分的取消。
隐性癌基因或肿瘤抑制物存在的想法首先通过成视网膜细胞瘤易感基因(Rb1)的分离得到证实。这一发现大大促进了肿瘤抑制物的寻找。自那以后，分离到了几个其它的肿瘤抑制基因。Rb1基因产物pRb的功能与细胞分裂的调节紧密相关[Goodrich和Lee(1993)，Weiberg(1995)，Bartek等(1996)，Herwig和Strauss(1997)]。它在早G1期是非磷酸化的。非磷酸化的pRb与转录因子E2F形成复合物，E2F在晚G1期通过磷酸化从此复合物释放出来，这表明其生长抑制功能是基于E2F的结合，它可以导致在G0/G1期E2F依赖的基因活性抑制物的形成或导致正常活化的E2F的结合。当前的观点认为两种不同机制作用于不同的基因，或者甚至作用于一个相同的基因。
需要某些基因的顺序活化以促进从静止期(G0)通过G1进入DNA复制期(S)及随后通过第二个间隙期(G2)进入有丝分裂(M)的进程[Pardee(1989)]。很明显，细胞周期的每一期需要一套确定的基因的活性，这些基因只有在某一时期有活性。保证这种有序的事件级联的一种机制是转录调节物的阶段特异磷酸化和去磷酸化。这些阶段特异的磷酸化是称为细胞周期蛋白依赖的激酶的酶(cdks)完成的。这些cdk的催化亚单位与称为细胞周期蛋白的调节亚单位形成复合物[Sherr(1993)]。细胞周期蛋白将cdk转变成有活性的酶并通过与某些靶蛋白特异结合决定激酶的底物特异性。细胞周期蛋白是短寿命蛋白，其mRNA和/或蛋白水平在细胞周期的某一期积累。
最近，一类新的生长调节物得到鉴定，它们是细胞周期蛋白依赖的激酶的抑制剂(CKI)[Sherr和Roberts(1996)]。一组是CKI，激酶抑制蛋白(KIP蛋白)，包括p21KIP，p27KIP和p57KIP，可抑制几种cdks，第二组(INK4蛋白)成员包括p15INK4，p16INK4，p18INK4和p19INK4，对cdk4/cdk6特异[Sherr和Roberts(1996)]。激酶的正调节物(细胞周期蛋白)和负调节物(CKI)看来以化学计量竞争与cdks的结合，这一点至少对于cdk4/cdk6与细胞周期蛋白D或p16INK4的G1特异复合物是确实的[Parry等(1995)]。这证明细胞环境中生长因子的平衡将决定cdk4/cdk6在与细胞周期蛋白D或p16INK4的复合物中的比例，由此决定pRb的磷酸化程度。另一肿瘤抑制物p53通过借助p21INK4的诱导抑制pRb磷酸化来发挥其至少一种功能[el Deiry等(1993)，Harper等(1993)，Dulic等(1994)]。这种对DNA破坏剂明确鉴定的反应是晚G1期所谓的控制点的特征。因此，看来p53介导的生长停滞的主要对象是pRb控制的生长调节机制。pRb作用为G1期进程的主要已知抑制物[Pardee(1989)，Sherr(1993)，Sherr和Roberts(1996)]。
已表明编码p16INK4的基因是肿瘤抑制物，它在某些肿瘤，甚至更普遍地在来自肿瘤的细胞系中高比率丢失[Kamb等(1994)，Nobori等(1994)]。p16INK4功能的丢失可通过多种机制发生，包括点突变、删除、也可通过由于超甲基化的沉默[Merlo等(1995)]。大多数最近的研究已表明Rb和p16INK4的丢失以相互排斥的方式发生，在几乎每一个肿瘤细胞系都丢失了这两个肿瘤抑制基因之一的功能[Otterson等(1994)，Okamoto等(1994)，Tam等(1994)，Lukas等(1995)]。
大多数分化组织持续不断地更新自己一定比例的细胞。为了保持实体组织中细胞数目稳定，需要细胞的同时死亡。这种编程性细胞死亡或细胞程序性死亡首先在肝脏中检测到，后来在淋巴样细胞中受到广泛的研究。许多参与诱导或防止细胞程序性死亡的基因已经得到鉴定[White(1994)]。在本文中研究最多的基因产物之一是肿瘤抑制物p53。此蛋白最初鉴定为与SV40 T-抗原复合的伴侣，SV40 T抗原也与pRb结合。SV40和其它DNA肿瘤病毒同时使pRb和p53失活被认为是病毒诱导的恶性转化的唯一基础[Hinds和Weinberg(1994)]。射线及其它破坏DNA的处理强烈诱导p53的表达。p53依次诱导许多其它基因包括p21INK4的表达，已证明p21INK4是细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶的主要抑制剂基因[el Deiry等(1993)]。因此，看来p53通过借助p21INK4介导的cdk4活性的封闭抑制pRb的磷酸化，在G1期发挥细胞周期抑制作用。然而，已证明p53也在晚G1期诱导细胞程序性死亡，这可能在DNA损伤不能正确修复时发生。另一方面，已证明p53不存在时的细胞程序性死亡，表明p53是细胞程序性死亡的诱导剂但可能不是细胞程序性死亡必需的，因此不是细胞程序性死亡机制的一部分[White(1996)]。p53的细胞程序性死亡作用可能是其对肿瘤细胞生长抑制最大的贡献。尽管正常细胞对p53的反应是细胞周期停滞，但是恶性细胞可能是对p53诱导的细胞程序性死亡更敏感。因此，p53阳性的肿瘤细胞可能普遍对射线或化学治疗诱导的细胞程序性死亡敏感。
Rb缺失的细胞中，有丢失p53功能强烈倾向。没有任何已知的肿瘤细胞系并且可能没有肿瘤(除成视网膜细胞瘤以外)是Rb缺陷的又是p53阳性的。G1期控制的丢失使得细胞可以增殖几轮但可能会被识别为p53的严重反常，可能由于突变的积累并会导致细胞程序性死亡。因为在细胞周期蛋白D过量表达或p16INK4丢失时Rb通路的反常不如Rb丢失时明显，p53的失活很明显对于前两种情况不是必需的。
已表明野生型p53基因的异位表达体外抑制完全缺少p53或表达突变p53的人肿瘤细胞系的增殖[Baker等(1990)，Cheng等(1992)，Takahashi等(1992)]。p53基因转导的肿瘤细胞在裸鼠中致瘤性更低。气管内输注携带p53基因的逆转录病毒载体阻碍裸鼠中常位人肺癌细胞的生长[Cai等(1993)]。球形骨针肿瘤中相似逆转录病毒载体的使用表明此载体能够渗透到内部肿瘤团中并且也诱导肺癌细胞中显著的程序性肿瘤细胞死亡[Fujiwara等(1993)]。肺癌以及食管上皮的恶性病变通常有突变的p53，表明这些恶性肿瘤是通过适当载体输注的p53基因转移的主要目标。因为逆转录病毒载体在体内基因传递方面有几个固有的困难，所以制备了带有p53基因的腺病毒载体[Zhang等(1993)]。第一代含有在CMV启动子控制下的p53基因的E1缺陷性载体已被导入p53缺陷的人非小细胞肺癌细胞[Zhang等(1994)]。在50pfu/细胞的感染复数(m.o.i)时得到几乎100％的基因转移并检测到高水平的p53蛋白表达。尽管p53缺陷的肿瘤细胞生长明显受到抑制，但是在p53基因没有缺陷的细胞中几乎没有影响。p53载体的肿瘤抑制效应在多种动物模型中得到验证[Wills等(1994)，Liu等(1994)]。最近，发表了p53基因转移应用的首次临床试验[Roth等(1996)]。在这项研究中，逆转录病毒载体用于将p53基因传递到肺癌末期病人中，这些病人都在治疗后几周内死亡。在某些病人中，可检测到与细胞程序性死亡相关的肿瘤抑制的明显征兆。然而，从这项研究很难评估肿瘤细胞死亡和肿瘤块退化的程度。肺癌细胞不仅经常是p53缺陷的，而且易于由过量表达的p53诱导细胞程序性死亡，使得这种肿瘤尤其适于p53基因治疗。
p16INK4是(MTS1)真实的肿瘤抑制物。p16INK4基因的功能在多种肿瘤类型中丢失，相当于约60％的所有肿瘤细胞，在胰腺肿瘤和黑色素瘤中达到80-90％的功能丢失[Kamb等(1994)，Nobori等(1994)，Merlo等(1995)，Otterson等(1994)，Okamoto等(1994)，Tam等(1994)，Hannon和Beach(1994)，Marx(1994)，Zhang等(1994)，Jen等(1994)，Washimi等(1995)，Hussussian等(1994)]。如上文所述，p16INK4基因产物特异地抑制cdk4，由此抑制pRb的磷酸化[Serrano等(1993)，Serrano等(1995)]。因此，它直接作用在pRb的上游[Lukas等(1993)，Koh等(1995)]。所以，pRb和p16INK4丢失是二者择一的事件。Rb缺陷的肿瘤通常是p16INK4阳性的，p16INK4缺陷的肿瘤有正常的Rb[Strauss等(1995)，White等(1996)]。因此，在肿瘤细胞中p16INK4功能的重建可以恢复正常的生长控制[Lukas等(1995)]，但不一定导致肿瘤生长的抑制。最近含有p16INK4的腺病毒载体在裸鼠中的应用表明肿瘤生长的某些停滞。此结果证实了p16INK4的肿瘤抑制功能，也表明通过这个肿瘤抑制物不会得到显著的肿瘤退化。
发明概述本发明的目标在于基于抑制细胞增殖的肿瘤抑制物和细胞程序性死亡(apoptosis)诱导的联合应用的癌基因治疗。现有技术已表明多种肿瘤抑制物可以普遍抑制细胞增殖而不是特异性地针对肿瘤细胞。多种试剂可以诱导正常细胞中的细胞程序性死亡，但诱导肿瘤细胞中的细胞程序性死亡难得多。对细胞程序性死亡诱导剂反应的能力主要依赖于正常p53基因的存在。这个基因的产物是主要的细胞程序性死亡内源诱导剂。在大多数癌中p53功能失活。肿瘤生长的速度主要依赖于细胞增殖增加和细胞程序性死亡之间的平衡。当p53丢失时，不会发生自发的细胞程序性死亡而且化疗诱导的细胞程序性死亡的效率很低。既然肿瘤治疗的主要目标不仅是肿瘤生长抑制，而且是诱导肿瘤细胞死亡，那么结合两种原理尤其重要。已将功能性Rb的存在与细胞程序性死亡的阻碍联系起来[Hass-Kogan等(1995)，Herwig和Strauss(1997)]。因此，看来细胞周期调控和细胞程序性死亡的调节通过pRb和p53紧密协调。两种功能的丢失可能导致没有细胞程序性死亡的无限制生长。出现的问题是一个或另一个肿瘤抑制物的重建是否能导致生长调控的重建和/或细胞程序性死亡。
本发明是基于p16INK4基因的产物(也称为MTS-1＝CDKI4＝CDKN2)[Hannon等(1994)]抑制所有具有功能性Rb1基因的细胞中的细胞增殖，并且在约85％的所有肿瘤中也是这种情况这一原始发现。通过多种方法将p16INK4基因转入不同类型的肿瘤细胞可通过Rb蛋白磷酸化的抑制导致细胞增殖的抑制，只要p16INK4蛋白从转入的基因得到合成，这种抑制作用就存在。以后，细胞能从阻断回复并恢复分裂。因此，细胞分裂的瞬间抑制对于肿瘤生长的有效抑制和肿瘤退化是不够的。关于p16INK4基因的异位表达，使用所选腺病毒载体过量表达p16INK4基因时，观察到p53阳性的肿瘤细胞中某些程度的自发细胞程序性死亡(实施例2)。在p53缺陷的肿瘤细胞和正常细胞中观察不到细胞程序性死亡。p16INK4(Ad-p16-9)(ECACC注册号V97021335)和p53的联合过量表达在p53阳性或阴性的肿瘤细胞中但令人惊奇地不在正常细胞中导致无前例的高度细胞程序性死亡(高达100％)(实施例3)。p16INK4过量表达的肿瘤细胞特异的细胞程序性死亡效应这一惊人发现得到了更详尽的研究。据观察，p16INK4过量表达时，Rb蛋白(pRb)的水平在三天期间有很大程度的降低(实施例4)。此效应可能是由于Rb1基因受到其非磷酸化产物pRb的自身抑制。因此，p16INK4的过量表达不仅阻断了细胞分裂，而且随后降低pRb的水平，继而导致p53阳性的肿瘤细胞进行细胞程序性死亡的能力增加。后者可通过p53的同时过量表达显著增加。
本发明非常重要的方面是不仅pRb和细胞程序性死亡诱导蛋白如p53的绝对水平对细胞程序性死亡的诱导是重要的，而且这两种蛋白的比率对细胞程序性死亡的诱导也是重要的(实施例5)。在不同细胞类型之间不同的pRb/细胞程序性死亡诱导蛋白的比率(若细胞程序性死亡诱导蛋白是p53，比率在1∶1-1∶20之间)必须通过两种途径在细胞周期停滞后降低。首先，pRb水平必须降低至少5倍(在原始水平的20％以下)，优选地至少10倍(10％以下)或甚至20倍(5％以下)。同时，p53的水平优选地提高到原始水平的两倍以上。对于在80-100％的恶性细胞中有效的细胞程序性死亡，只提高p53的水平而不降低pRb的水平是不够的。p53和pRb水平变化的定量可以通过抽提来自诊断为肿瘤的组织及来自经根据本发明所述的治疗后同位置的组织并通过运用标准免疫学技术如免疫印迹、ELISA或其它技术，使用对pRb和细胞程序性死亡诱导蛋白特异的抗体比较组织样品中Rb和细胞程序性死亡诱导蛋白的水平来进行。一般地，pRb的总量包括磷酸化pRb和非磷酸化pRb将得到测量。当根据本发明的观点降低pRb的总量时，是非磷酸化pRb的水平降低，因为降低只在几乎没有磷酸化的pRb存在时才发生。
治疗通常包括用包含p16INK4基因的优选形式的载体，优选地与细胞程序性死亡诱导基因结合转染肿瘤组织，通常在开始治疗后一周或两周后抽提用于Rb和细胞程序性死亡诱导蛋白定量的组织。
因此，本发明涉及包含遗传材料的、用于制备治疗恶性疾病的组合物的载体的用途，所述载体一旦施用给患恶性疾病的对象，就通过降低恶性细胞中Rb水平与细胞程序性死亡诱导蛋白水平的比率，通过降低pRb的水平并提高细胞程序性死亡诱导蛋白的水平，在通过此处诱导pRb蛋白磷酸化的抑制首次实现所述恶性细胞的生长停滞之后，诱导恶性细胞中细胞程序性死亡。
本发明也涉及用于遗传材料转移的载体。发明详述本发明提供了通常在几小时或几天时间以有顺序的方式发生的几个事件，开始是导致细胞分裂阻断和随后的pRb水平降低的基因过量表达(对于此基因，p16INK4是原型)，随后是细胞程序性死亡诱导蛋白如p53的过量表达诱导细胞程序性死亡。后者在可很好检测到野生型p53表达的肿瘤细胞中省略。Rb/细胞程序性死亡诱导蛋白的比率的降低是关键点。过量表达优选地通过使用病毒载体，优选地腺病毒载体实现。需要仔细选择高表达者(在正常水平的5倍以上)。最有利的载体是可同时表达两个基因的载体。
因此本发明优选的工具是使p16INK4或其一种相关物和p53或其下游效应物之一同时表达的腺病毒(或其它病毒)载体。因为p16INK4和p53是某些通路的主要调节子，所以有几个潜在的p16INK4和p53替代物，p16INK4可由p15INK4、p18INK4或p19INK4或选择性地由p21KIP、p27KIP或p57KIP成功地替换。P53基因诱导许多前细胞程序性死亡基因如bax，bak，bcl-X，它们可替代p53用作治疗载体的一部分。当使用术语“细胞程序性死亡诱导蛋白”时，涉及这些基因的蛋白产物。
本发明的方法用于在裸鼠中引起转导前细胞的肿瘤发生的抑制(实施例6)并且通过将基因体内转移到已存在的肿瘤中引起肿瘤生长的抑制。数据清楚地表明，p16INK4或p53的单独施用效果极小或没有效果，而两个基因的结合效果很强。联合治疗抑制大多数动物中的肿瘤生长，甚至其它的某些表现肿瘤的完全退化。因此，本发明方法的体内应用的结果主要依赖于载体向肿瘤组织的适当传递。
关于本发明，运用了基于p16INK4抑制生长和p53诱导细胞程序性死亡联合效应的肿瘤基因治疗新策略。第一次表明，p16INK4过量表达诱导pRb蛋白合成的负调节，导致肿瘤细胞对细胞程序性死亡刺激的敏感性提高。因此，只要能够在大多数肿瘤细胞中诱导，细胞周期蛋白D/cdk-pRb通路的有效阻断就是对于生长停滞和由于细胞程序性死亡的肿瘤退化的关键步骤。本发明首次讲述了在活生物体中诱导大多数恶性细胞细胞程序性死亡的方法。因此，本发明满足了有效抗肿瘤治疗的长期需要。
WO96/27008公开了包含在腺病毒载体中的编码p16INK4的遗传材料向细胞的转移以治疗肿瘤和其它增生。本文件不公开或讨论是否p16INK4的细胞表达的一定水平是必需的或优选的。与此相反，本发明公开只有在p53蛋白存在的情况下，p16INK4蛋白的显著过量表达才导致有效和广泛的细胞死亡。
WO95/11301涉及通过提高p53蛋白的细胞水平或通过提高p53的活性以降低增殖哺乳动物细胞如癌细胞存活率的方法。未讨论或谈及与肿瘤抑制有关的其它细胞蛋白。单独使用p53与本发明所用的方法正好相反，在恶性细胞中表达或过量表达p53不足以通过细胞程序性死亡诱导细胞死亡(见实施例3)。
WO96/20207公开了用于治疗多种病理生理细胞增殖疾病的pRb和p53蛋白的突变体。癌细胞用编码上述两种蛋白的核酸同时或连续治疗。然而，未提及使细胞死亡需要的表达水平。也未讨论这两种蛋白的细胞比率的意义。而且，仅仅证明阳性治疗效果只在缺失p53或pRb的细胞系中得到。这不能说明WO96/20207的方法普遍适于治疗癌症。
从WO96/27008可知p16INK4在多种肿瘤细胞中的异位表达可以抑制这些细胞的增殖。然而本发明表明，导致生长停滞的p16INK4的显著过量表达对于表达p53的肿瘤细胞中通过pRb水平的负调节及p53水平的同时提高导致pRb蛋白与p53蛋白比率(pRb/p53)的降低，诱导细胞程序性死亡是至关重要的。而且本发明已证明了几种细胞中pRb和p53水平变化的真实数量。
本发明涉及包含遗传材料的、用于制备治疗恶性疾病的组合物的载体的用途，所述载体一旦施用给患恶性疾病的对象，就通过降低恶性细胞中Rb蛋白水平与细胞程序性死亡诱导蛋白水平的比率，通过降低pRb水平并提高细胞程序性死亡诱导蛋白水平，在通过此处诱导pRb蛋白磷酸化的抑制首次实现所述恶性细胞的生长停滞之后，诱导恶性细胞中细胞程序性死亡。
在本文中，术语“生长停滞”是指细胞分裂的基本上阻断，应理解为几乎完全阻断，通常至少90％。
在本发明优选的实施例中，通过将降低pRb水平至少5倍(原始水平的20％以下)、至少10倍(原始水平的10％以下)或至少20倍(原始水平的5％以下)，并且优选地将细胞程序性死亡诱导蛋白如p53的水平提高至少两倍来降低恶性细胞中pRb蛋白水平与细胞程序性死亡诱导蛋白水平的比率。
本发明人首次表明，在多种类型恶性细胞中，pRb/细胞程序性死亡诱导蛋白的比率决定首次实现生长停滞之后通过细胞程序性死亡诱导细胞死亡的可能性。实际比率看来根据目的细胞类型而变动。通过使用本发明的方法，本发明人已能够诱导肿瘤中至少90％恶性细胞中的细胞程序性死亡。这个杀细胞百分数空前地高，并且由此提供了癌症治疗方面的显著进步。
根据本发明，pRb蛋白水平与细胞程序性死亡诱导蛋白水平的比率(如pRb/p53)优选地通过用特异抗体在同一块胶上免疫印迹细胞程序性死亡诱导蛋白(如p53)和pRb蛋白来定量。可检测到的一级抗体的量例如通过通用的二级抗体和链亲和素-POD反应与各自靶蛋白的量(分子)大约一致来测定。因此，比率不能给出非常精确的摩尔比而是检测到的免疫复合物的相对测定。因此，pRb水平降低及细胞程序性死亡诱导蛋白水平升高的测定比这两个蛋白摩尔比的测定更具重复性、更可靠。
pRb和细胞程序性死亡诱导蛋白水平变化的定量将优选地通过抽提来自诊断为肿瘤的组织及来自经根据本发明所述的治疗后相同位置的组织并通过运用标准免疫学技术如免疫印迹、ELISA或其它技术，使用对pRb和细胞程序性死亡诱导蛋白特异的抗体比较组织样品中Rb和细胞程序性死亡诱导蛋白的水平来进行。使用分别对pRb和细胞程序性死亡诱导蛋白免疫染色的来自肿瘤的组织的切片与来自经根据本发明所述的治疗后相同位置的组织切片相比较也是优选的。根据本发明所述的治疗将优选地包括用有效量的包含p16INK4基因的优选形式的载体，选择性地与p53基因或p53前细胞程序性死亡的下游基因结合转染肿瘤组织。用于对pRb和细胞程序性死亡诱导蛋白水平定量的组织或组织切片优选地在开始治疗后至少一个星期，优选地两个星期分别提取或切出。如果Rb和细胞程序性死亡诱导蛋白水平的比率没有足够降低，则可以重复治疗。
在本发明的一个实施方案中，恶性细胞是p53阳性的。术语“p53阳性”是指正常(野生型)蛋白已表达并可通过标准技术如免疫组织化学或免疫印迹检测到。
在本发明的另一实施方案中，恶性肿瘤细胞是p53缺陷的。术语“p53缺陷”是指由于基因的总重排或删除导致的表达缺乏。
在本发明的优选实施方案中，恶性细胞中的pRb水平降低。
根据本发明背后的中心观点，pRb/细胞程序性死亡诱导蛋白(如pRb/p53)的比率对于恶性细胞中诱导细胞程序性死亡至关重要。而且，本发明人已证明正常野生型pRb水平的降低是比率降低起始点必需的。同样，p53的存在是必需的。因此，根据本发明，通过控制pRb和p53的水平诱导p53阳性的恶性细胞的细胞程序性死亡是可能。如果细胞是p53缺陷的，必需根据本发明使它们成为p53阳性。
在本发明另一优选的实施方案中，恶性细胞中pRb水平与细胞程序性死亡诱导蛋白(如pRb/p53)水平的比率通过将遗传材料转入所述细胞降低pRb的水平并提高细胞程序性死亡诱导蛋白如p53的水平而降低。
术语“遗传材料”是指核酸。
在本发明特别优选的实施方案中，遗传材料是选自由p16INK4、p15INK4、p18INK4、p19INK4、p21KIP、p27KIP、p57KIP和p53组成的群体的一个或多个基因。p16INK4基因的修饰形式，特别是只编码p16INK4蛋白cdk结合区或此区的突变形式的p16INK4基因的修饰形式也是优选的。
术语“修饰形式”是指通过在遗传序列中删除、添加或替换特定核酸从原始基因衍生的遗传材料。
p16INK4和cdk4的相互作用产生根据本发明所述的生长停滞效应，因此，得到尽可能强而有效的相互作用是有利的。可通过构建p16INK4基因的修饰形式进行，它一旦转入细胞，就产生比正常p16INK4更强地与内源性cdk4蛋白相互作用的p16INK4蛋白类型。
如实施例4所示，基因转移及随后的p16INK4基因在恶性细胞中的异位细胞表达将导致pRb的细胞水平降低。这种降低将导致该恶性细胞生长停滞，根据本发明，这是诱导细胞程序性死亡的前提条件。根据本发明，可能通过模拟恶性细胞中表达p16INK4的效应的任何方法得到细胞程序性死亡后的生长停滞。由p15INK4、p18INK4、p19INK4、p21KIP、p27KIP、p57KIP基因编码的蛋白是p16INK4的相关物并能够在细胞中以某种程度模拟p16INK4的效应。因此根据本发明，可以将编码这些蛋白的基因转入恶性细胞以实现生长停滞及随后细胞程序性死亡的诱导。这同样适用于经修饰的但仍具有功能的p16INK4基因形式。
在本文中，术语“p16INK4相关物”是指同样认可的INK4家族的基因如p15INK4、p18INK4和p19INK4。
在本发明特别优选的实施方案中，被转移的遗传材料是与p53基因结合的p16INK4基因。同样优选的是与p53前细胞程序性死亡下游基因结合的p16INK4的修饰形式。
术语“p53前细胞程序性死亡下游基因”是指在p53下游作用而在调控级联反应的前面的基因(如pRb)。作为转录调节子，P53活化和抑制许多基因，所有的这些基因都称为下游基因。其中某些基因仅仅是细胞周期抑制子(如p21KIP)，其它的是前细胞程序性死亡的。p53前细胞程序性死亡下游基因的例子是bax、bak和bcl-X基因。
p16INK4和p53的联合转移使得在p53阳性和p53缺陷的恶性细胞中实现所需的生长停滞效应及随后的细胞程序性死亡诱导成为可能。实施例3表明这两个基因同时转移的协同效应。在相似模式中，可以使用与p53下游基因结合的p16INK4基因的修饰形式。
在本发明进一步优选的实施方案中，遗传材料在载体中转移。载体可以是非病毒载体或病毒载体。如果载体是病毒载体，根据本发明，选自由腺病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体和杂合载体组成的群体的载体是优选的。尤其优选地，病毒载体是Ad-p16-9载体(ECACC注册号V97021335)。
在本发明特别优选的实施方案中，得到被转移的遗传材料的高水平过量表达。优选地，得到了2倍以上的过量表达，更优选地4倍以上，进一步更优选地6倍以上，甚至更优选地8倍以上，最优选地得到10倍以上的过量表达。
在本文中，术语“过量表达”是指超过正常细胞中水平的表达。
本发明人证明p16INK4基因的细胞过量表达对于实现根据本发明所述的生长停滞和细胞程序性死亡的诱导是至关重要的。在本发明公开以前，还不知道p16INK4的异位表达本身就足以获得效应。因此，本发明通过公开过量表达，优选地高水平的过量表达是必需的，首次提供了大多数恶性细胞中诱导细胞程序性死亡的基础。
在特别优选的实施方案中，根据本发明使p53缺陷细胞变成p53阳性。特别优选地，通过转移p53基因，将p53缺陷细胞变成p53阳性。
本发明特别优选的实施方案是根据本发明所述的用于治疗恶性疾病的用途。优选地，此恶性疾病是实体瘤。更优选地，恶性疾病选自由结肠癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、头和颈癌、肾癌和黑色素瘤组成的群体。
本发明的重要方面是包含遗传材料的、用于制备治疗恶性疾病的组合物的载体的用途，所述载体一旦施用给患恶性疾病的对象，就通过降低恶性细胞中Rb蛋白水平与细胞程序性死亡诱导蛋白水平的比率，通过降低pRb水平并提高细胞程序性死亡诱导蛋白水平，在通过此处诱导pRb蛋白磷酸化的抑制首次实现所述恶性细胞的生长停滞之后，诱导恶性细胞死亡如细胞程序性死亡。
本发明优选的实施方案是根据本发明所述的用途，其中的载体是非病毒载体。使用病毒载体，特别是腺病毒载体也是优选的。
本发明特别优选的实施方案是根据本发明所述的用途，其中病毒载体选自由腺病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体和杂合载体组成的群体。尤其优选的是根据本发明所述的Ad-p16-9载体(ECACC注册号V97021335)的用途。
在本文中，术语“杂合载体”是指通过结合不同载体的部分产生的载体。可以结合两个或多个病毒的不同部分，也可以结合病毒部分与非病毒成分。
在实施例1中，本发明人证明Ad-p16-9载体(ECACC注册号V97021335)的使用确保了通过此载体转入细胞的基因的高水平细胞过量表达。既然根据本发明，这样的过量表达水平是优选的，那么公开的腺病毒载体代表了超过迄今为止公开的载体的重要优点，那些载体已知不能介导它们转移的基因的明显过量表达。
本发明优选的实施方案是根据本发明所述的用途，其中的遗传材料是选自由p16INK4、p15INK4、p18INK4、p19INK4、p21KIP、p27KIP、p57KIP和p53组成的群体的一个或多个基因。特别优选的是p16INK4基因的修饰形式或其多种衍生物的用途。更优选的是只编码p16INK4蛋白cdk结合区的p16INK4基因的修饰形式的用途。甚至更优选的是与p53基因结合的p16INK4基因的用途。最优选的是与p53前细胞程序性死亡下游基因结合的p16INK4基因的修饰形式。
本发明的特别优选的实施方案是根据本发明所述的用途，其中获得了被转移遗传材料的高水平过量表达。优选的是获得所选基因2倍以上的过量表达。更优选的是获得所选基因4倍以上的过量表达。进一步更优选的是获得所选基因6倍以上的过量表达。甚至更优选的是获得所选基因8倍以上的过量表达。最优选的是获得所选基因10倍以上的过量表达。
本发明特别优选的实施方案是根据本发明所述的用途，其中比率(pRb/细胞程序性死亡诱导蛋白)是通过降低pRb水平至少5倍(原始水平的20％以下)，优选地至少10倍(原始水平的10％以下)或甚至至少20倍(原始水平的5％以下)降低的。同时，p53水平应升高到原始水平的至少两倍。对于在80-100％的恶性细胞中有效的细胞程序性死亡，只提高细胞程序性死亡诱导蛋白(如p53)的水平而不降低pRb的水平是不够的。然而，只降低pRb的水平而不改变细胞程序性死亡诱导蛋白的水平可能是足够的。因此，其中pRb降低而细胞程序性死亡诱导蛋白如p53保持在相同水平的用途在本发明范围之内。
本发明的重要方面涉及包含编码p16INK4蛋白或其功能相当物的核酸序列并且进一步选择性地包含编码p53或其功能相当物的核酸序列以及载体本身的遗传元素的载体，所述本身的遗传元素使所述基因明显过量表达。
本发明的另一非常重要的方面涉及特定腺病毒载体Ad-p16-9，由Humboldt Universitat zu Berlin，Lehrstuhl MolekulareZellbiologie，Max-Delbruck-Haus，Robert-Rossle-Str.10，D-13122Berlin，德国，于1997年2月13日以注册号V9702135保藏于欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)。此保藏根据Budapest条约的条款进行。
附图简述
图1此图表示用载体Ad-p16-9进行基因转移后p16INK4在IMR-90中的过量表达。用50m.o.i感染滴度感染1小时，48小时后洗涤并收集细胞，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并将蛋白转印到硝酸纤维素膜上。用抗p16INK4的单克隆抗体(DCS50)检测p16INK4。右边泳道内上面的带与在病毒感染细胞中被上调的内源性p16INK4一致。下面的带代表来自具有短的N-端截短的编码序列的基因p16INK4的异位过量表达。
图2此图表示Ad-p16INK4基因转移对细胞周期调节的影响。用PBS(上面栏)作为对照的两个缺乏内源性p16INK4表达的细胞系(HuH7，LOVO)和两个Rb阴性细胞系(BT549，C33A)或用Ad-bg(中间栏)或分别以50、30、50和50m.o.i Ad-p16INK4腺病毒感染细胞。感染后48小时，向细胞培养基中加入溴脱氧尿苷(BrdU)。30分钟后，用胰酶消化、固定细胞并通过流式光度术用碘化丙锭染色分析DNA的含量，用BrdU的摄入分析DNA的合成。在Ad-p16INK4处理的HuH7和LOVO中几乎没有增殖细胞的碎片，而此病毒对BT549和C33A没有影响。在Ad-p16INK4处理的HuH7细胞中发现了DNA含量少于G1细胞的部分细胞(G1峰的臂)(在两种肿瘤细胞中的单个实验中此臂的存在与否有差异)。
图3此图表示p16INK4和p53基因同时转移导致的饿细胞程序性死亡的刺激。碘化丙锭染色后通过流式光度术分析了HuH7、LOVO和IMR-90中的DNA含量。分析前，用PBS处理(-)或用Ad-p53和Ad-p16INK4腺病毒以25(HuH7)或15(LOVO)m.o.i处理96小时。以25(HuH7)和15(LOVO)m.o.i加入Adβgal病毒。Ad-p53或Ad-p16INK4病毒都以25(HuH7)和15(LOVO)m.o.i进行两次感染。在Ad-p53处理的细胞中，只有轻微的S期下降，细胞周期曲线保持正常，Ad-p16INK4感染的细胞中G1和G2峰变宽(典型实验)。大多数两次处理的HuH7和LOVO细胞的DNA含量显著降低。没有G1和G2峰。在IMR-90中未观察到亚-G1(细胞程序性死亡的)DNA峰。
图4此图表示用Ad-p16INK4感染HuH7细胞后，pRb表达和磷酸化的时间进程。以50m.o.i.进行感染并在标明的时间点制备提取物。按方法中所述对提取物进行SDS-PAA电泳、Western印迹及免疫检测pRb。
图5此图表示转移及Ad-p16INK4和p53过量表达后pRb水平降低和p53水平升高的检测。此图表示用Ad-p16(15m.o.i.)和Ad-p53(15m.o.i.)在含有1mM MgCl2存在的磷酸缓冲盐中进行的1小时的腺病毒感染HuH7细胞。在37℃培养细胞3天，洗涤后用裂解缓冲液提取。在10％的聚丙烯酰胺-SDS凝胶上分离蛋白(50μg)，然后通过半干转印将蛋白转印到硝酸纤维素膜上并进行免疫检测。一级抗体是抗pRb的G3245(Pharmingen)和抗p53的Ab-2(Oncogene Sciences)。用生物素标记的抗小鼠抗体和链亲和素-POD偶联物(ECL系统，Amersham)检测特异的免疫复合物通过对X-光片曝光检测化学发光。
图6此图表示用p53和p16INK4处理后肿瘤大小随时间变化的函数。将3×106HuH7细胞注射到裸鼠的左侧腹股沟区。15天后，当长出可见肿瘤时，将腺病毒载体(6×109，150μl)注射到肿瘤内(第一天)。4天后重复注射。根据方法中所述测定肿瘤的大小。
材料和方法重组腺病毒的构建和制备p16INK4cDNA[Lukas等(1995)]与CMV聚腺苷酸化信号相连并被克隆至CMV立即早期启动子下游。完全的表达单位被插入腺病毒穿梭载体PdE1sp1A[Bett等(1994)]。用改良的Ca-PO4沉淀技术通过将此穿梭质粒与pJM17共转染入新近传代的分会合培养的293细胞产生重组病毒[Lieber等(1995)]。病毒经噬斑纯化一次及限制酶切分析。一个噬斑产生Ad-p16-9。含有由CMV启动子驱动的p53基因的腺病毒由Wei-wei Zang(Houston)惠赠，含有在RSV启动子控制下的β-半乳糖苷酶基因的腺病毒由Michel Perricaudet(Paris)提供。为了制备大的纯化的病毒原种，以5m.o.i.感染293细胞并致细胞病变清晰可见后收集细胞(48小时)。以含有0.2％NP40的PBS裂解细胞。将细胞碎片去除，病毒悬液进行两轮CsCl梯度离心[Kanegae等(1994)]。通过SephadexG25柱(PD25，Phmarcia)凝胶过滤除去CsCl，病毒液于含有159mMNaCl，3mMKCl，1mMMgCl2，10mMTis pH7.4及10％甘油的贮存缓冲液中贮存于-70℃。在293细胞上进行噬斑分析确定滴度。细胞培养和病毒感染HuH7(人肝细胞癌)、BT549、MCF7(人乳腺癌)、IMR-90(正常人成纤维细胞)和293细胞(人初级胚肾)在含有10％FCS和2mM谷氨酰胺的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)中于5％CO2中培养。C33A(人宫颈癌)和LOVO细胞(结肠癌)在含有10％FCS的RPMI中培养。在感染前1天以8×105细胞/平板接种细胞，用存在于含有1mMMgCl2的PBS中腺病毒感染细胞60分钟，m.o.i.分别是50(HuH7、BT549、C33A)、30(LOVO)、100(IMR-90)和300(MCF7)。导致100％细胞中表达而没有可见毒性效应的病毒的最佳浓度通过以不同剂量具有β-半乳糖苷酶表达的病毒感染细胞并且随后用Xgal染色来确定。细胞周期分析为了脉冲标记增殖的细胞，将溴脱氧尿苷以终浓度10mM加入到细胞培养基中，然后细胞在37℃培养30分钟。用PBS洗涤细胞两次，消化后以70％乙醇固定。通过在0.1MHCl/0.5％Triton×100中孵育30分钟使DNA被变性、RNA降解。经0.1MNa2B4O7中和后，依次用抗BrdU的小鼠单克隆抗体(Becton Dickinson)、FITC-偶联的山羊抗小鼠抗体与细胞作用。为了检测DNA含量，以5μg/ml终浓度的碘化丙锭加入到经PBS洗涤的细胞中，用EPICS-MCL流式光度仪(Coulter)进行流式光度术分析。实施例1载体Ad-p16-9过量表达p16INK4基因正常的人成纤维细胞(IMR-90，ATCC CCL186)与Ad-p16-9(ECACC注册号V97021335)培养1个小时，随后在37℃培养两天，收集感染的及对照细胞，洗涤后以裂解缓冲液提取细胞。在15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离总蛋白(50μg)并将其转印到硝酸纤维素膜上。印迹与依次与抗p16INK4抗体、二级抗体孵育。结果示于图1。扫描印迹以确定蛋白的相对量。实验表明，p16INK4蛋白的量增加了43倍。较低的带相应于由截短了的基因编码的蛋白，而上面的带表明内源性的p16INK4基因也被基因转移方法活化了。从较低的带的强度计算得到的过量表达程度是38倍。实施例2 p16INK4过量表达导致生长抑制和细胞程序性死亡制备了含有截短的但有功能的、在CMV启动子控制下的p16INK4基因的腺病毒载体，并将其用于感染多种不同组织来源的各种癌细胞系。根据材料和方法所述，通过流式光度术分析确定p16INK4过量表达对细胞周期的影响。用含有LacZ基因(Ad-bg)的对照载体感染的所有细胞系没有明显的作用。在第二天，Rb阳性的癌细胞系HuH7和LOVO(ATCCCCL229)到S1期的进程完全被阻断(图3)。有趣地是，感染后2天，在HuH7细胞的DNA分布图上可观察到G1峰左侧的臂。两天后，在同一实验中，这个臂更加明显但在其它实验中不存在(未显示)。据猜测它反映了小部分的细胞程序性死亡。为了证明这一假设，进行检测少数细胞程序性死亡的细胞的TUNEL(未显示)。10天中可观察到完全的生长停滞，仅仅偶然可以检测到肿瘤细胞中的的细胞程序性死亡而在正常二倍体成纤维细胞(IMR-90)中根本检测不到(未显示)。实施例3 p16INK4和p53对细胞程序性死亡的协同效应因为p16INK4过量表达不仅可以诱导细胞周期停滞而且使Rb-阳性的癌细胞对细胞程序性死亡刺激较敏感，有兴趣探讨p53基因的过量表达是否可有效诱导表达p16INK4细胞的细胞程序性死亡。用可比较的有限的感染复数的Ad-p16INK4和Ad-p53单独或同时感染HuH7和LOVO细胞以及正常IMR-90细胞，三天后，以流式光度术分析DNA分布。结果示于图3。在三种细胞类型中显示，Ad-p53本身对细胞周期没有明显的影响，而在这些条件下，Ad-p16INK4可诱导所有细胞系的G1停滞。两种病毒的联合应用导致两种肿瘤细胞系的DNA分布完全转移至亚-G1位置，表明几乎所有的细胞在这个时间点进入了细胞程序性死亡。在IMR-90细胞中未检测到效应(图3)。在病毒感染后3天，通过TUNEL分析HuH7细胞中的细胞程序性死亡表明p53能够诱导某些细胞的细胞程序性死亡，p16INK4过量表达可导致偶尔出现细胞程序性死亡，两种基因的联合诱导大多数细胞的细胞程序性死亡。在LOVO细胞中得到相似的结果，Ad-p53本身能够诱导Rb缺失的BT549癌细胞有效的细胞程序性死亡(未显示)。实施例4 p16INK4过量表达对pRb的时间效应另人惊奇地是，p16INK4过量表达三天不仅导致磷酸化形式的pRb的消失而且使Rb蛋白总量显著降低，这一点在肝细胞癌系HuH7中最为明显。时间过程实验表明在5天中pRb水平渐渐降低(图4)。免疫印迹用PBS洗涤细胞两次，将其从培养板上刮下并用细胞裂解缓冲液裂解。以Braford法确定蛋白浓度。在8％(对于pRB)或10％(对于p53)或15％(p16INK4和p21)聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳分离50μg蛋白。通过半干印迹将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，并用增强化学发光系统ECL进行免疫检测。针对p16INK4、Rb(G3245，Pharmingen)、p53(Ab-2，Oncogene Sciences)和p21(DCS60)的小鼠单克隆抗体被用作一级抗体，生物素化的山羊抗小鼠抗体和链亲和素-POD偶联物(Amersham)被用为次级检测。pRb的负调节和细胞程序性死亡结果表明肿瘤抑制基因产物p16INK4的过量表达不仅在G1阻断细胞周期也可以诱导后来的pRb合成的退化。这依次使肿瘤细胞更容易对细胞程序性死亡的刺激的作用。这种刺激也许在培养物的延长的生长停滞条件下会出现。因为p16INK4也诱导正常细胞的细胞周期停滞但不导致随后的细胞程序性死亡[Lukas等(1995)和本实施例]，这些数据暗示对持续的细胞周期停滞的细胞程序性死亡刺激是肿瘤细胞特有的。因此，细胞程序性死亡调控机制也许识别在肿瘤细胞发展过程中发生的其它变化。已知功能性p53的存在并不是诱导细胞程序性死亡绝对必须的[White等(1996)，Bates等(1996)]，此观念受到使用含有突变p53的HuH7细胞的实验的一定程度上的支持。然而，在Ad-p16INK4转导的p53-阳性的肿瘤细胞中更一致地观察到低程度的细胞程序性死亡(LOVO，数据未显示)。不过，在Rb途径被p16INK4过量表达阻断的野生型p53过量表达可大大加速细胞程序性死亡。尽管目前有关细胞程序性死亡调控的途径的知识不足以完全解释观察到的协同作用，渐渐降低的pRb水平暗示了一种可能的场景(图2)。由p16INK4导致的持续的G1阻断产生的出乎意料的效应也许是由对非磷酸化pRb积累和/或其水解产物反应的RB-1基因表达[Gill等(1994)]自我抑制产生的[An和Dou(1996)]。当pRb水平降低的足够多时，Rb对细胞程序性死亡的保护作用不能再被保持。依次，其原因也许是在某些情况下可诱导细胞程序性死亡的[Qin等(1994)，Shan和Lee(1994)，Wu和Levins(1994)]转录因子E2F的释放引起的[Weinberg(1995)，Nevins(1992)]。P53促进功能的解释为存在一种机制，其中被阻断的Rb途径(及随后的pRb水平降低)与p53协同作用，如通过对下游效应物协同作用。Bax基因产物[Oltvai等(1993)]是一个很好的候选效应物因为已有证据表明它被p53诱导[Oltvai等(1993)]并且E2F也参与其上行调节。某些肿瘤，尤其是缺乏p53和pRb的肿瘤很明显地对只有p53的过量表达引起的细胞程序性死亡敏感[Yang等(1995)，Roth等(1996)]。在此实施例中的两个Rb阳性的肿瘤细胞(HuH7，LOVO)不很强地被p53过量表达停滞在G1期也不通过细胞程序性死亡作出反应。可以得出结论，至少在Rb阳性的肿瘤细胞系中，通过Rb途径阻断和/或随后的Rb水平负调控导致的G1期停滞是因为p53过量表达加速的细胞程序性死亡的前提。因此，可以假设，低的pRb/p53比率是细胞程序性死亡必需的，单独的G1期停滞不够。接近正常水平的p16INK4表达足以导致G1期停滞但不支持依赖于p53的细胞程序性死亡[Lukas等(1995)及未发表结果]。重要的是，应该强调这种对细胞程序性死亡的协同作用未在正常IMR-90细胞中观察到(图4)。因此，在野生型p53过量表达时，依赖于pRb的下行调控只诱导肿瘤细胞细胞程序性死亡，而正常细胞停滞于G1期。在p53存在时肿瘤细胞特异的pRb下行调控的分子基础仍不清楚，但很可能是除了Rb途径的无效之外的肿瘤发生过程中出现的原癌基因或肿瘤抑制基因的突变。在正常细胞中，G1期停滞后的pRb的下行调控也许是普遍的可作为分化刺激事件。实施例5 p16INK4和p53的共表达降低pRb/p53的比率并导致细胞程序性死亡感染前一天接种HuH7细胞(8×105细胞/10cm碟)。用Ad-p16INK4(15m.o.i.)和Ad-p53(15m.o.i.)在含有1mMMgCl2存在的磷酸缓冲盐中进行的1小时的腺病毒感染。病毒悬浮液被新鲜的细胞培养液取代，细胞在37℃培养细胞3天。之后，用PBS洗涤细胞两次并用裂解缓冲液提取。测定细胞浓度，在10％的聚丙烯酰胺-SDS凝胶上分离蛋白，每个泳道内有50μg蛋白。然后通过半干转印将蛋白转印到硝酸纤维素膜上并进行免疫检测。一级抗体是抗pRb的G3245(Pharmingen)和抗p53的Ab-2(Oncogene Sciences)。用生物素标记的抗小鼠抗体和链亲和素-POD偶联物(ECL系统，Amersham)检测特异的免疫复合物。如图5所示，通过对X-光片曝光检测化学发光。通过密度计扫描不同曝光以保证图象的线形记录带的强度。扫描的图5中pRb和p53特异带的相对强度列于表1。表1
因此，这个处理将pRb/p53的比率降低了20多倍，是pRb降低5倍及伴随的p53升高4倍的结果。按实施例2所述分析细胞周期分布，从流式光度术扫描图的亚-G1峰上发现几乎50％的细胞同时进入了细胞程序性死亡(未显示)。用高量的Ad-p16INK4和Ad-p53(每种病毒为25m.o.i.)重复这个实验，导致更低的pRb/p53比率并且几乎100％被诱导细胞程序性死亡。实施例6 p16INK4和p53抑制肿瘤发展调查了是否体外进行用腺病毒转导癌细胞将阻碍裸鼠中肿瘤生长。为了达到这个目的，用Ad-p16INK4或Ad-p53，对照Adtk(m.o.i.为100)，或Ad-p16INK4或Ad-p53的混合物(每一种为50m.o.i.)感染HuH7细胞并通过皮下注射到裸鼠体内。在第二个实验中，使用半量的Ad-p16INK4或Ad-p53，添加Ad-βgal使总m.o.i.为100。六周后测量肿瘤大小。结果总结于表2。所有的对照动物形成肿瘤，注射Ad-p16INK4感染的细胞或双感染的两组动物10只中只有2只形成肿瘤。这些肿瘤大小不到对照动物肿瘤的10％，与滴度无关。通过p53转导细胞得到的结果很强地依赖于滴度。高滴度有某些抑制生长的作用，但不如由p16INK4得到的效应明显。裸鼠实验将HuH7细胞接种于培养瓶中并长至80％会合。以m.o.i.为100使用下文表2所列的腺病毒。在PBS中感染1.5小时后，使用培养基。另外7小时后，收获细胞并将其以3×106细胞/动物通过皮下注射裸鼠左腹股沟(实验#1中，雌性CD1-nu/nu，harles River(Sulzfeld，德国)，实验#2中，雌性NMRI-I-nu/nu，在MDC杂交，柏林)。六周后，根据公式V＝a×b2/2[Carlsson等(1983)]测定肿瘤大小。
表2通过用p16INK4和p53基因转导抑制肿瘤生长
用包含标明的基因的腺病毒载体转导人肝细胞癌细胞(HuH7)，随后皮下注射到裸鼠内。六周后测量肿瘤的大小。数字是经处理每一群5只动物中发展肿瘤的动物数目。给出了肿瘤的平均大小及标准差。实验#1中，Adtk，Ad-p16INK4或Ad-p53以每种100m.o.i.单独使用或每种50m.o.i.联合使用。实验#2中，如果单独使用，Ad-p16INK4或Ad-p53的剂量为50m.o.i.，以Ad-βgal调节总病毒m.o.i.为100。实施例7p16INK4和p53抑制肿瘤生长因为希望用病毒载体预转导肿瘤细胞具有增强的生长抑制效应，在具有预先建立的肿瘤的体内实验中，病毒载体被直接注射到从HuH7肝细胞癌细胞发展而来的肿瘤中。这个实验的结果列于图6。数据显示了联合方法的威力。Ad-p16INK4具有某些效应，Ad-p53具有微弱的生长抑制作用，两个基因的结合导致至少12天的肿瘤生长几乎完全的阻断。在那时，一个肿瘤完全被消除。裸鼠实验为了进行体内基因转移实验，将3×105HuH7细胞经皮下注射到裸鼠的左腹股沟。当长出可见的肿瘤时，切开皮肤，使肿瘤暴露并以150μl/动物的量用腺病毒载体体积注射。4天后重复此过程。检测18天肿瘤体积的发展情况。p16INK4和p53在肿瘤生长抑制中协作本实施例已表明用腺病毒载体联合转移Ad-p16INK4和Ad-p53基因有效诱导细胞程序性死亡。这是通过p53自身在表达正常或突变p53的Rb阳性的肿瘤细胞中不能实现的。将这两个基因转移到肝细胞癌细胞(HuH7)和结肠癌细胞(LOVO)完全裸鼠中发展出皮下肿瘤。在这些情况下，即使p16INK4本身也不足以导致肿瘤生长抑制(表1)。将腺病毒载体体内注射肿瘤导致几种不同的结果。观察到由p16INK4引起的某些生长阻滞，p53几乎没有作用，两种基因联合使用可导致很强的肿瘤生长抑制(图6)。如Adβgal检测的对照感染，即使是多次注射肿瘤也不能导致100％的感染。18天后肿瘤大小的缓慢增加也许反映了未感染细胞的快速生长。
建立了癌基因治疗的有效载体和生物原理，但需要发展好的方法以在坚韧的实体肿瘤组织中分散载体。关于这一点，用表面电极进行电脉冲可能会有所帮助(Rols，M.P.等，1998)。传统的化疗和自杀基因治疗也需要有效的分布，其中内部瘤组织的接触是肿瘤中的主要问题，否则对治疗无反应。然而，所述的基因治疗策略的具有对肿瘤细胞有选择性的优势，并且可适用于大多数人类恶性疾病。此处陈述的数据指出了对于特定肿瘤的细胞程序性死亡诱导途径诸如p53和Rb途径的了解在选择合适治疗方案中的重要性。诊断和将来的治疗都会从对目前对于细胞周期调控和细胞程序性死亡[White(1996)]的基本机制了解中受益[Weinberg等(1995)，Strauss等(1995)，Sherr和Roberts(1995)]。对于两种机制的联合了解有助于进一步改进针对选择性清除肿瘤细胞的策略。
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权利要求
1.一种包含遗传材料的、用于制备治疗恶性疾病的组合物的载体的用途，所述载体一旦施用给患恶性疾病的对象，就通过降低恶性细胞中Rb蛋白水平与细胞程序性死亡诱导蛋白水平的比率，通过降低pRb水平并提高细胞程序性死亡诱导蛋白水平，在通过此处诱导pRb蛋白磷酸化的抑制首次实现所述恶性细胞的生长停滞之后，诱导恶性细胞中细胞程序性死亡。
2.根据权利要求1所述的用途，其中载体是非病毒载体。
3.根据权利要求1所述的用途，其中载体是病毒载体。
4.根据权利要求1所述的用途，其中载体是选自由腺病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体和杂合载体组成的群体的病毒载体。
5.根据权利要求1所述的用途，其中载体的ECACC注册号是V97021335。
6.根据权利要求1所述的用途，其中遗传材料是选自由p16INK4、p15INK4、p18INK4、p19INK4、p21KIP、p27KIP、p57KIP、p53、bax、bak和bcl-X组成群体的一个或多个基因。
7.根据前述权利要求中的任意一项所述的用途，其中恶性细胞是细胞程序性死亡诱导蛋白如p53阳性的。
8.根据权利要求7所述的用途，其中遗传材料是p16INK4基因的修饰形式。
9.根据权利要求7所述的用途，其中遗传材料是只编码p16INK4蛋白cdk结合区的p16INK4基因的修饰形式。
10.根据前述权利要求的任意一项所述的用途，其中细胞程序性死亡诱导蛋白缺失的恶性细胞通过转移选自由p53、bax、bak和bcl-X组成的群体的一个或多个基因形成细胞程序性死亡诱导蛋白阳性。
11.根据权利要求10所述的用途，其中遗传材料是p16INK4与编码细胞程序性死亡诱导蛋白的基因的组合。
12.根据权利要求10所述的用途，其中遗传材料是只编码p16INK4蛋白cdk-结合区的p16INK4基因的修饰形式与编码细胞程序性死亡诱导蛋白的基因的组合。
13.根据前述权利要求的任意一项所述的用途，其中实现了转移遗传材料的高水平过量表达。
14.根据权利要求13所述的用途，其中实现了所选基因的2倍以上的过量表达水平。
15.根据权利要求13所述的用途，其中实现了所选基因的4倍以上的过量表达水平。
16.根据权利要求13所述的用途，其中实现了所选基因的6倍以上的过量表达水平。
17.根据权利要求13所述的用途，其中实现了所选基因的8倍以上的过量表达水平。
18.根据权利要求13所述的用途，其中实现了所选基因的10倍以上的过量表达水平。
19.根据前述权利要求的任意一项所述的用途，其中比率(pRb/细胞程序性死亡诱导蛋白)降低至0.4以下。
20.根据前述权利要求的任意一项所述的用途，其中比率(pRb/细胞程序性死亡诱导蛋白)是通过降低pRb水平至少5倍并增加细胞程序性死亡诱导蛋白水平至少两倍而降低的。
21.根据权利要求20所述的用途，其中比率(pRb/细胞程序性死亡诱导蛋白)是通过降低pRb水平至少10倍并增加细胞程序性死亡诱导蛋白水平至少两倍而降低的。
22.根据权利要求20所述的用途，其中比率(pRb/细胞程序性死亡诱导蛋白)是通过降低pRb水平至少20倍并增加细胞程序性死亡诱导蛋白水平至少两倍而降低的。
23.根据前述权利要求的任意一项所述的用途，其中恶性疾病是实体肿瘤。
24.根据权利要求23所述的用途，其中恶性疾病是选自由结肠癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、头和颈癌、肾癌和黑色素瘤组成的群体。
25.一种载体，包含编码p16INK4蛋白或其功能相当物的核酸序列，并且进一步选择性地包含编码细胞程序性死亡诱导蛋白的核酸序列，以及载体本身的遗传元素，所述本身的遗传元素使所述基因序列显著过量表达。
26.载体Ad-p16-9(ECACC注册号为V97021335)。
全文摘要
本发明涉及包含遗传材料的、用于制备治疗恶性疾病的组合物的载体的用途,所述载体一旦施用给患恶性疾病的对象,就通过降低恶性细胞中Rb蛋白水平与细胞程序性死亡诱导蛋白水平的比率,通过降低pRb水平并提高细胞程序性死亡诱导蛋白水平,在通过此处诱导pRb蛋白磷酸化的抑制首次实现所述恶性细胞的生长停滞之后,诱导恶性细胞中细胞程序性死亡。本发明进一步涉及用于有效转移的特异载体。
文档编号C12N15/09GK1248290SQ98802680
公开日2000年3月22日 申请日期1998年2月20日 优先权日1997年2月20日
发明者M·施特劳斯, V·桑迪格, J·巴泰克, J·卢卡斯 申请人:赫帕维科基因治疗股份公司