专利名称：利用条件雌性不育性生产杂种种子的方法
技术领域：
本发明涉及植物杂种种子的生产。具体地，本发明涉及用在雌性繁殖结构中表达时产生催化外源施用的前毒素转化为毒素由此使授精无效的蛋白的嵌合基因转化的植物作为杂交的一个亲本生产杂种种子的方法。本发明也包括条件雌性不育植物和条件雄性不育植物联合应用以更有效地生产杂种种子、用于本发明的嵌合基因、包含嵌合基因的转基因植物以及用于在植物雌性繁殖结构中表达的新型启动子。
背景技术：
农作物植物中的杂交优势由于其对产量提高的显著影响而受到很大重视。玉米不同株系的杂交导致的产量提高在十九世纪后期开始受到注意，后来根据系统遗传方法得到发展。培育杂交玉米的常用方法是建立许多近交品系、进行杂交并确定在一个给定的区域内哪一个杂种产率更高。
杂交玉米的成功促使植物育种者探索其它具有经济意义物种中杂交优势的存在及强度。总的来说，与非杂交变种相比，杂种表现提高的产量。杂种通常在利用生长因素方面更有效并且对于诸如水和化肥的生长因素给出的单位回报更大。在压力条件下，杂种通常比亲本栽培品种更有优势，在多种环境条件下有更稳定的表现。对于杂种，具有产品和成熟方面的均一性，这通常促进收获并提高产品的市场价值。杂种可以组合通过其它方式难以或不可能组合的性状。这对于种间或属间杂交尤其正确。从研究得出的普遍结论是如果采用适当的技术，植物中的普遍现象——杂交优势——强度足以保证商业开发。
多年以来，杂交优势一直被认为是植物和动物中广泛存在的现象。现在商业杂种广泛用于多种农作物，包括玉米、高粱、甜菜和向日葵。其它大面积的农作物如小麦、玉米和水稻仍然主要以近交变种栽培。对于这些和其它将来可能允许商业化的杂种广泛应用的农作物的研究工作正在进行之中，但是新的杂种农作物培育的主要限制因素是缺少经济的制备这些农作物的杂种种子的方法。
传统上，大规模的杂种种子的制备是通过种植分开行或块的雌性亲本品系并且用雄性亲本品系对它们传粉。只收获在雌性亲本行中产生的种子。为了保证这个种子是未受自身种子污染的杂种种子，需要在雌性植物上采用传粉控制方法以保证在它们上形成的种子是交叉传粉的结果而不是自花传粉的结果。已知的传粉控制方法通常是机械的、化学的或遗传的。
从某些物种如雌雄同株植物玉米的雌性亲本上去除能育花粉通过手工去雄完成。这样的能育花粉的去除是通过将雌性亲本群中植物的雄性花序(雄花穗)拉出或切掉实现的。这种简单的方法通过在花粉散落前机械地去除雌性植物的花穗防止自交从而防止自身受精。然而，大多数的主要目的农作物在同一花内有功能性雌性和雄性器官从而使去雄不可行。即使是可行，这种制备杂种种子的方法是极其的劳动密集型从而很昂贵。为了消除杂种杂交中自身受精进行的费力的去除花穗，在某些物种中利用了导致雄性不育的遗传因素。
雌性亲本的雄性不育可由核基因或胞质遗传体系控制。遗传雄性不育是由核基因控制，其中不育的等位基因对于育性等位基因是隐性的。遗传雄性不育发生于很多物种中。通常，它是由必须是纯合才能导致雄性不育的单个隐性基因控制。利用遗传雄性不育制备杂种种子的育种者通常培育表型一致的、分离出50％雄性不育和50％雄性能育个体的雌性品系。这些品系的种子的分离通过紧密间隔制备亲本得到提高，除了防止在雌性亲本植物上形成活的花粉外，还应防止在雄性亲本植物上形成活的种子。
防止活的种子形成的方法之一是利用雌性不育植物。天然发生的雌性不育在几种农作物中被报导(Honma和Phatak，遗传杂志55143-145(1964)；Sniezdo和Winiarczyk，原生质18731-38(1995)；Justus和Meyer，遗传杂志54167-168(1963)；Hanna和Powell，遗传杂志65247-249(1974)；Brown和Bingham，农作物科学241207-1208(1984))但维持这些品系有问题而且它们不能被用于商业上。构建显性雌性不育基因的方法已被描述(EP412，006A1(1990)；Goldman等，欧洲分子生物学组织杂志132976-2984(1994))，但是由于不能制备雌性不育基因纯合的品系，包含这个基因的雌性不育品系的维持是困难的。已描述杂种种子制备中维持和利用这个雌性不育基因的方法(EP402,270(1990))。然而，在复合的一系列的顺序转化以产生雌性不育雄性亲本品系的过程中它要求导入雌性不育基因、第一个雄性不育基因的恢复基因、第二个雄性不育基因和两个除草剂抗性基因并且在复合的一系列的顺序转化以产生雄性不育亲本品系的过程中它还要求导入第一个雄性不育基因、雌性不育基因的恢复基因和一个除草剂抗性基因。在每一轮的品系操作过程中需要除草剂处理以选择正确的基因型并且为了制备杂种种子制备田需要被除草剂之一处理以除掉这个过程导致的不希望的基因型。尽管上述体系能够提供雄性和雌性品系间作的经济优势，它对于商业应用太复杂。
相应地，需要制备杂种种子的简单经济的方法。
发明概述本发明提供杂种种子生产的方法，包括(a)制备包含与编码催化前毒素向毒素转化的酶的编码序列可操作性相连的雌性优先启动子的条件雌性不育植株，(b)将条件雌性不育植株与雄性不育植株间作，(c)通过向条件雌性不育植株施用前毒素诱导雌性不育性，并且(d)制备杂种种子。在本发明的一个优选实施方案中，植株是正常自花传粉的或异花传粉的，在特别优选的实施方案中，植株选自小麦、玉米和大麦。本发明也提供通过此方法生产的杂种种子。
本发明进一步提供包含与编码催化前毒素向毒素转化的酶的编码序列可操作连接的雌性优先启动子的表达元件盒。优选的实施方案包含与argE基因的编码序列可操作连接的雌性优先启动子。雌性优先启动子的优选实施方案包括来自B200i4克隆、P26克隆或P19克隆的启动子。特别优选的实施方案包括与argE编码序列可操作连接的来自BZ00i4-2克隆或P19克隆的雌性优先启动子。用于本发明的编码序列的其它实施方案是可从P450sul一氧化物酶基因和pehA基因得到的那些编码序列。
本发明也提供包含含有与编码催化前毒素向毒素转化的酶的编码序列可操作连接的雌性优先启动子的表达元件盒的植株及这样的植株的种子。
本发明的另一目的是前毒素在包含与编码催化前毒素向毒素转化的酶的编码序列可操作连接的雌性优先启动子的植株中诱导雌性不育性的方法中的用途。
本发明的另一目的是来自argE基因的编码序列在制备杂种种子的方法中的用途，其中argE编码序列与雌性优先启动子可操作连接，雌性优先启动子表达时催化前毒素向毒素的转化，从而诱导雌性不育性。发明详述定义和命名如此处所用的术语“雌性繁殖结构”，是指植物包含心皮或雌蕊群(有关雌蕊群，过去所用的常用术语是“雌蕊”)的那些部分。植物花的心皮包括但不限于柱头、花柱、子房以及组成柱头、花柱和子房的细胞或组织。如此处所用的“雌性优先”启动子是指仅在或主要在植物的雌性繁殖结构的一种或多种细胞或组织中具有转录活性的启动子。
如此处所用的“表达元件盒”，是指能指导基因在植物细胞中表达的DNA序列，包含与氨基酸编码序列可操作连接的启动子，其中编码序列与终止区域可操作连接。基因可以是嵌合的，即基因的一个成分相对于基因的另一成分是异源的，基因也可以是天然存在的，但已以对植物遗传转化有用的重组形式得到。
如此处所用的“前毒素”是指具有基本生理毒性的化学品，它们能通过酶作用活化产生反应产物，而反应产物对植物细胞有毒或以足以延迟、抑制或阻碍正常生长、发育或代谢活性的方式破坏植物细胞功能。毒性反应产物在此处称为“毒素”。在本发明中，原毒素以外源方式施用给植株，这可以通过任何有助于叶面吸收、根吸收、与靶植株部分直接接触或从植物一部分到另一部分的系统移动的方式实现。
如此处所用的“雌性可育性”是指当用有功能的或可育的花粉传粉时能支持可育种子形成的植物雌性繁殖结构。如此处所用的“雌性不育性”是指当用有功能的或可育的花粉传粉时不能支持可育种子形成的植物雌性繁殖结构。如此处所用的“条件雌性不育性”是指基于随后由酶活化产生毒性反应产物的原毒素的外源施用产生的雌性不育性。如此处所用的“雄性不育性”是指植株的雄性繁殖结构不能产生可育或有功能的花粉。植物中雌性可育性的控制本发明的一个优势方面是其通过控制雌性可育性在田间条件下控制植物中可育种子形成的用途。雌性可育性可通过得到含有编码催化前毒素向毒素转化的酶的嵌合或重组核苷酸序列的转基因植物而得到控制，编码酶的核苷酸序列在雌性优先启动子的控制下表达时，将在外源施用原毒素时提供不能形成可育种子的雌性繁殖结构。转基因植物称为条件雌性不育性是因为雌性不育性的表型是以前毒素的存在为条件的。雌性繁殖结构中前毒素向毒素的转化可以通过几种机理防止可育种子形成，依赖于何时、在什么细胞或组织雌性优先启动子是有活性的，这些机理包括但不限于1)破坏正常雌蕊发育使得雌蕊不再能受精，2)通过转化的毒素抑制花粉管生长，3)破坏可育配子的发育，以及4)破坏受精后的种子发育。
在本发明的一个实施方案中，在田间条件下将前毒素以外源方式施用给转基因植物，并且前毒素向毒素的转化出现在雌性繁殖结构中，可育种子形成通过雌性繁殖结构中的毒素作用防止。用于本发明的编码序列和启动子用于本发明的编码序列包括但不限于任何编码能将前毒素转化为毒素的蛋白的序列。这些编码序列可以是同源或异源来源的。
在一个优选的实施方案中，来自argE基因的编码序列与雌性优先启动子可操作连接。在存在前毒素N-乙酰膦丝菌素(N-乙酰PPT)的情况下，此嵌合基因在转基因植物中的表达导致雌性不育性。argE基因的基因产物是大肠杆菌的N-乙酰-L-鸟氨酸脱乙酰基酶，它对R1-CO-NH-CH((CH)2)-R2)-COOH类型的底物的水解有较广的特异性。作为此活性的结果，argE基因产物催化前毒素乙酰膦丝菌素转化成毒素膦丝菌素(PPT)[Kiete等，植物杂志9809-818(1996)]。
在另一优选的实施方案中，来自P450sul一氧化物酶基因CPY105A1的编码序列与雌性优先启动子可操作连接。此表达在磺胺类前毒素存在的情况下导致条件雌性不育性。浅灰链霉菌P450sul一氧化物酶靶向叶绿素时介导磺酰脲化合物R7402(2-甲基乙基-2，2-二氢-N-[(4，6-二甲氧嘧啶-2-基)氨羰基]-1，2-苯并异噻唑-7-氨磺酰-1，1-二氧化物的脱烷基化并将其转为毒素[O’Keefe等，植物生理学105473-482(1994)]。
在另一优选的实施方案中，pehA基因的编码序列与雌性优先启动子可操作连接。此表达在前毒素丙三基草甘磷存在的情况下导致条件雌性不育性。石竹伯克霍尔德氏菌PG2982 pehA基因的基因产物是膦酸单酯水解酶，它催化前毒素丙三基草甘磷转化为毒素草甘磷[Dotson等，植物杂志，10383-392(1996)]。
上述例子以举例说明的方式而不是限制的方式给出。任何编码催化前毒素向毒素转化的酶的编码序列只要与雌性优先启动子可操作连接都可用于本发明。用于本发明的启动子为了实施本发明，需要将上述编码催化前毒素向毒素转化的酶的核苷酸序列与以对植物雌性繁殖结构优先的方式指导其表达的5’调控序列可操作连接。这种表达方面的特异性确保了表达的酶的效应只在那些对形成可育种子必须的组织或细胞中发挥，并且除了对可育性的影响之外对植物是无害的。
植物中用于本发明的雌性优先启动子包括但不限于双子叶植物启动子如修饰的S13启动子[Dzelkalns等，植物细胞5855(1993)]，烟草的Stig1启动子[Goldman等，EMBO J.，132976-2984(1994)]，AGL5启动子[Savidge等，植物细胞7721-733(1995)]和来自烟草TTS1的启动子[Cheung等，细胞82383-393(1995)]。上述启动子均已得到测试并表明在转基因植物中有功能。单子叶植物来源的启动子包括玉米心皮特异的ZAG2基因的启动子[Thiessen等，基因156155-166(1995)]。
另外，对应于本领域已知具有雌性优先表达的cDNA的含有启动子序列的基因组DNA可以得到分离。它们包括但不限于拟南芥Fbp7和Fbp11基因的启动子[Angenent等，植物细胞71569-1582(1995)]和兰花雌性特异cDNA 040，0108，039，0126和0141[Nadeau等，植物细胞8213-239(1996)]。
用于特定植物品种的雌性优先启动子可以通过使用本领域熟练技术人员已知的技术分离在雌性组织中表达的新转录物得到克隆。这涉及从雌性组织如玉米穗丝或小麦雌蕊分离RNA，并且通过诸如差异显示、PCR选择、cDNA扣除和扣除cDNA文库构建的技术示差筛选以分离在雌性组织中优先表达并在植物的其它部分如叶、根和雄穗中不表达的cDNA克隆。这些克隆的cDNA的组织特异性可以通过Northern分析确定。然后雌性优先克隆的启动子序列可以通过使用分离的新cDNA作为探针筛选基因组文库得到，含有对于在雌性组织中表达所需的5’和3’调控序列的基因组克隆可以得到分离。这些序列可以用于构建以雌性优先方式表达嵌合基因的表达元件盒。用于本发明的其它调控元件表达元件盒的5’调控序列也可以包括其它增强序列。例如，已知来自病毒的许多非翻译前导序列增强表达，具体地，来自烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪绿条线病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已表明对增强表达有效[例如Gallie等，核酸研究，158693-8711(1987)；Skuzeshi等，植物分子生物学1565-78(1990)]。其它本领域已知的前导序列包括但不限于细小核糖核酸病毒前导序列如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5非编码区)(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.和Moss，B.美国国家科学院院报866126-6130(1989))；马铃薯Y病毒组前导序列如TEV前导序列(烟草缺刻病毒)(Allison等，MDMV前导序列(玉米矮缩条纹病毒)；病毒学；1549-20(1986))；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak，D.G.和Sarmow，P.自然35390-94(1991)；来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导序列(Jobling，S.A.和Gehrke L.自然，325622-625(1987))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie，D.R.等，RNA的分子生物学，第237-256页(1989))；和玉米褪绿条纹病毒前导序列(MCMV)(Lommel，S.A.等，病毒学81382-385(1991))。也见Della-Cioppa等，植物生理学，84965-968(1987)。
已表明各种内含子序列加到5’调控序列上时增强表达，尤其在单子叶植物细胞中。例如，已发现玉米Adh1基因的内含子导入玉米细胞时，在其同源启动子的控制下显著增强野生型基因的表达[Callis等，基因发展，11183-1200(1987)]。
除了启动子，也可得到各种3’转录终止子用于本发明。转录终止子负责转录的终止并校正mRNA的多腺苷酸化。适当的转录终止子和那些已知在植物中起作用的终止子包括CaMV 35S终止子、tml终止子，胭脂碱合成酶终止子、豌豆rbcS E9终止子和本领域已知的其它终止子。这些可用于单子叶植物和双子叶植物。植物转化重组DNA分子可以用很多本领域公认的方法导入植物细胞。本领域技术人员将同意，方法的选择可能依赖于要转化的靶植物类型，即单子叶或双子叶。转化植物细胞的适当方法包括微注射[Crossway等，生物技术4320-334(1986)]，电穿孔[Riggs等，美国国家科学院院报835602-5606(1986)]，土壤土壤杆菌介导的转化[Hinchee等，生物技术6915-921(1988)]，直接基因转化[Paszkowski等，EMBO J.32717-2722(1984)]，和弹粒加速，使用从Agracetus，Inc.，Madison，Wisconsin和Dupont，Inc.，Wilmington，Delaware可得到的仪器[见，例如，Sanford等，美国专利4,945,050；和McCabe等，生物技术6923-926(1988)]。也见，Weissinger等，遗传学年鉴22421-477(1988)；Sanford等，微粒科学和技术527-379(1987)(洋葱)；Christou等，植物生理学87671-674(1988)(大豆)；McCabe等，生物/生物技术6923-926(1988)(大豆)；Datta等，生物/生物技术8736-740(1990)(水稻)；Klein等，美国国家科学院院报，854305-4309(1988)(玉米)；Klein等，生物/生物技术6559-563(1988)(玉米)；Klein等，植物生理学91440-444(1988)(玉米)；Fromm等，生物/生物技术8833-839(1990)；和Gordon-Kamm等，植物细胞2603-618(1990)(玉米)；Svab等，美国国家科学院院报878526-8530(1990)(烟草原生质体)；Koziel等，生物技术11194-200(1993)(玉米)；Shimamoto等，自然338274-277(1989)(水稻)；Christou等，生物技术9957-962(1991)(水稻)；欧洲专利申请EP 0 332 581(果园草和其它Pooideae)；Vasil等，生物技术111553-1558(1993)(小麦)；Weeks等，植物生理学1021077-1084(1993)(小麦)；Wan等，植物生理学10437-48(1994)(大麦)。
用于通过微粒轰击将本发明的表达元件盒导入玉米的一套特别优选的实施方案在美国专利序列号08/008,374中得到描述，此处全文引用作为参考。另一优选的实施方案是如欧洲专利申请EP 0 292 435和美国专利号5,350,689中公开的玉米原生质体转化方法，此处全文引用作为参考。用于通过微粒轰击将本发明的表达元件盒导入玉米的一套特别优选的实施方案可以在美国专利号5,610,042中找到，此处全文引用作为参考。
植物的转化可以用一种DNA分子或多种DNA分子(即共转化)进行。这两种技术都适合用于本发明的表达元件盒。很多转化载体适于植物转化，本发明的表达元件盒可与任何这样的载体结合使用。载体的选择依赖于优选的转化技术和转化的目的品种。
可得到很多用于根瘤土壤杆菌转化的载体。它们通常具有至少一个T-DNA边界序列，并且包括诸如pBIN19的载体(Bevan；核酸研究12(22)8711-8721(1984))。在一个优选实施方案中，将本发明的表达元件盒插入双元载体pCIB200和pCIB2001之一用于土壤杆菌。这些用于土壤杆菌介导转化的载体表达盒用下述方式构建。用NarI消化pTJS75(Schmidhauser & Helinski，细菌学杂志164446-455(1985))切除四环素抗性基因产生pTJS75kan，然后插入来自pUC4K携带NPTII的AccI片段(Messing & Vierra，基因19259-268(1982)；Bevan等，自然304184-187(1993)；McBride等，植物分子生物学14266-276(1990))。将XhoI接头连入含有T-DNA左右边界序列、植物可选择的nos/nptII嵌合基因和pUC多接头的pCIBT的EcoRV片段(Rothstein等，基因53153-161(1987))，并将XhoI消化的片段克隆入经SalI消化的pJJS75Kan以制备pCIB200(也见EP-O-332104，实施例19)。pCIB200含有下列单一多接头限制性位点EcoRI，SstI，KpnI，BglII，XbaI和SaII。质粒pCIB2001是通过将额外的限制性位点插入多接头制备的pCIB200的衍生物。pCIB2001多接头中的单一限制性位点为EcoRI，SstI，KpnI，BglII，XbaI，SalI，MluI，BclI，AvrII，ApaI，HpaI和StuI。pCIB2001除了含有这些单一限制性位点，还有植物和细菌卡那霉素选择，用于土壤杆菌介导的转化的T-DNA左右边界，trfA的用于大肠杆菌和其它宿主间移动的RKZ来源的功能和来自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接头适用于包含它们自身调控信号的植物表达元件盒的克隆。
用于土壤杆菌介导的转化的另一载体是双元载体pCIB10，它包含编码用于植物中选择的卡那霉素抗性基因、T-DNA左右边界序列，并且掺入了来自广谱宿主范围质粒pRK252的序列使它在大肠杆菌和土壤杆菌中都能复制。它的构建由Rothstein等，基因53153-161(1987)描述。已构建了多种pCIB10的衍生物，它们掺入了由Gritz等，基因25179-188(1983)所述的编码潮霉素B磷酸转移酶的基因。这些衍生物使得可以只用潮霉素(pCIB743)或用潮霉素和卡地霉素(pCIB715，pCIB717)选择转基因植物。
使用直接基因转化或土壤杆菌介导的转化形式的方法常常但不必须采用可以提供对抗生素(如卡那霉素、潮霉素或氨甲喋呤)或除草剂抗性的选择标记进行。然而，用于植物转化的选择标记的选择对本发明并不关键，除非此抗性的表达及其生物化学活性干扰选作用于产生条件可育性的前毒素向毒素转化的选择。
对于某些植物品种，优选的是不同的抗生素或除草剂选择标记。转化中常用的选择标记包括赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因(Messing & Vierra，基因19259-268(1982)；Bevan等，自然304184-187(1983))，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White等，核酸研究181062(1990)，Spencer等，Theor Appl.Genet.79625-631(1990))，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger &Diggelmann，分子细胞生物学42929-2931)和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等，EMBO J.21099-1104(1983))，允许在甘露糖作为碳源上选择甘露糖磷酸异构酶基因(EP 530 129，WO 94/20627)。
用于直接基因转移技术并与用除草剂Basta(或膦丝菌素)选择结合的载体是pCIB3064。此载体是基于质粒pCIB246，它包含与大肠杆菌GUS基因可操作融合的CaMV35S启动子和CaMV35S转录终止子并在PCT公开申请，WO93/07298中有所描述，此处引用作为参考。用于赋予膦丝菌素抗性的一个基因是来自吸水链霉素的bar基因(Thompson等，EMBOJ.62519-2523(1987))。此载体适用于包含它们自身调控信号的植物表达元件盒的克隆。然而应当注意，如果bar基因在雌性繁殖结构中也可以表达，那么使用bar作为选择标记可能干扰本发明的实施。此问题可以通过使用在用于转化的细胞或组织培养物中控制表达但不在雌性繁殖结构中导致bar基因表达的启动子来克服。
另一转化载体是载体pGL2[Shimamoto等，自然338，274-276(1989)]，它包含与35S启动子和35S终止子序列可操作连接的吸水链霉素磷酸转移酶基因(hpt)。
另一载体是pSOG35，它利用赋予氨甲喋呤抗性的大肠杆菌基因二氢叶酸还原酶(DHFR)作为选择标记。用pCR扩增35S启动子(约800bp)，来自玉米Adhl基因的内含子6和来自pSOG10的18bp的GUS非翻译前导序列。编码大肠杆菌二氢叶酸还原酶II型基因的250bp片段也通过PCR得到扩增，这两个PCR片段与来自包含pUC19载体骨架和胭脂碱合成酶终止子的pBI221(Clontech)的SacI-pstI片段装配在一起。这些片段的装配产生了pSOG19，它包括与内含子6序列融合的35S启动子、GUS前导序列、DHFR基因和胭脂碱合成酶终止子。用来自玉米褪绿条纹病毒(MCMV)前导序列替代pSOG19中的GUS前导序列产生了载体pSOG35。pSOG19和pSOG35携带pUC来源的氨苄青霉素抗性基因并且可用HindIII，SphI，PstI和EcoRI位点克隆外源序列。用条件雌性不育性制备杂种种子为了制备未受通过自身受精产生的种子污染的杂种种子，必须采用传粉控制方法以阻止雌性亲本自身传粉并且保证雄性亲本的交叉传粉。这通常通过机械的方法遗传雄性不育或化学杂交剂(CHAs)完成的。例如，在玉米中目前的作法是机械去除雌性(种子)亲本的花穗，这是一个耗费时间并且劳动密集型方法。在小麦中，以种子生产规模通过机械方法控制育性是不实际的并且商业上还未建立雄性不育的遗传来源。只以传粉控制为基础的杂种种子制备方法需要雄性亲本植物区与雌性亲本植物分开，因为雄性亲本植物将通过自身传粉产生种子。本发明的制备杂种种子的用途提供了可靠及简单易用的优点，最重要的是将允许雄性和雌性亲本植物间作，导致更有效的花粉转移需要更少的雄性亲本植物以及更经济的杂种种子制备。
为了用本发明制备杂种种子，需要表达以雌性优先方式催化前毒素转变成毒素酶的转基因亲本植物。获得具有这种基因型的转基因植物在上文有所描述。包含本发明嵌合或重组基因的转基因植物可被制成纯合的并用普通的植物育种方法无限地保持。
制备本发明所述的杂种种子也需要雄性不育的亲本植物。雄性不育是指不能产生活的或功能性的花粉。雄性不育是由导致花粉不能形成或花粉形成时缺乏功能活性造成的。因此，花粉没有形成或如果形成了，或不是活的或不能在正常情况下有效地受精。
已知用于杂种种子制备的许多雄性不育源(Kaul，高等植物雄性不育，Springer-Verlag(1988))。下列植物中天然存在的胞质雄性不育基因及其用途得到描述玉米(Levings，科学250942-947(1990))、小麦(Toriyama等，日本育种杂志43517-524(1993))、烟草(Gerstel等，遗传学89157-169(1978))、黑麦(Steinborn等，理论和应用遗传学85822-824(1993))、向日葵(Crouzillat等，植物分子生物学16415-426(1991))、大豆(Davis，美国专利4,763,441(1988))、白菜(Grelon等，Mol.Gen.Genet.243540-547(1994))、胡萝卜(Kitagawa等，有性植物繁殖741-50(1994))、高粱(Chen等，植物分子生物学28799-809(1995))、水稻(Kadowaki等，Mol.Gen.Genet.22410-16(1990))和大麦(Kaul和Singh，Cytobios 6671-85(1991))。
嵌合或重组雄性不育基因构建也是已知的。编码β-1，3葡聚糖酶的基因，当在只有于花药的绒毡层细胞有活性的启动子下表达时可导致转基因植物雄性不育(Worrall等，植物细胞4759-771(1992))。编码未经编辑的小麦线粒体基因atp9当在转基因植物的组成型CaMV35S启动子下表达时可导致雄性不育(Hernould等，美国国家科学院院报902370-2374(1993))。编码RNA酶的基因在只有于花药的绒毡层细胞有活性的启动子下表达时可导致转基因植物雄性不育(DeBlock等，Planta189218-225(1993)；EP344,029；Mariani等，自然347737-741(1990))。与花粉形成关键基因互补的反义RNA的表达可导致转基因植物雄性不育(EP513,884)。
另外，还有许多其它本领域熟知的雄性特异的启动子并且可用于嵌合雄性不育基因的构建。这些包括对于在花粉中、花药的绒毡层或其它结构中表达的启动子序列。雄性特异的启动子的例子包括但不限于LAT52启动子(Twell等，Dev.109705-13(1989))、番茄A127启动子(Dotson等，植物杂志10，383-392(1996))、玉米Zmg启动子(Hamilton等，有性植物繁殖2208-212(1989))、玉米CDPK启动子(Guerro等，Mol.Gen.Genet.224161-168(1990))、及美国专利5,477,002中公开的花药特异的ant32和ant43D启动子，在此将其整体引用作为参考。另外，花药特异的cDNA启动子序列可通过分离相应的基因组DNA并确定启动子调节区，例如分离兰花花粉管特异的P450(Nadeau等，植物细胞8213-239(1996))和拟南芥的Bcp1(Xu等，美国国家科学院院报922106-2110(1995))启动子序列。相似地，雄性特异的新型基因可通过多种技术如差异显示、PCR选择、cDNA扣除和差异cDNA文库筛选(PCRselect cDNA substraction and differential cDNA library screening)分离。一旦确定，可分离相应的基因组序列，鉴定启动子区域的特征，这些序列然后被用作启动子序列区构建以雄性特异的方式表达的表达盒。
上述的人工雄性不育基因的缺点在于它们是非条件性的而且是显性的。一旦转基因植物被制备，它总是雄性不育的，使得植物品系的维持很困难并且不可能产生纯合的纯种植物品系。
另外一类被描述的雄性不育基因中的雄性不育表型是条件性的。在这一类中，只有在使用了化学前毒素雄性能育性被打破。在条件雄性不育的一个实施例中，编码催化前毒素N-乙酰-L-膦丝菌素转变成除草毒素L-膦丝菌素的N-乙酰-鸟氨酸脱乙酰酶的基因被描述(Kriete等，植物杂志9809-818(1996)；EP531，716A2(1992))。只有在用N-乙酰-L-膦丝菌素前毒素处理时，才能使在花药的绒毡层细胞中表达这个基因的转基因植物雄性不育。在条件雄性不育的另一个实施例中，编码催化磺酰脲前毒素R7402转变成除草毒素的细菌细胞色素P450的基因被描述(WO91/03561；O’Keefe等，植物生理学105473-482(1994))。只有在用R7402前毒素处理时，才能使在花药的绒毡层细胞中表达这个基因的转基因植物雄性不育。在条件雄性不育的另一个实施例中，编码催化前毒素丙三基草甘膦转变成除草毒素草甘膦的磷酸单酯水解酶的基因被描述(Dotson等，植物杂志10383-392(96))。只有在用丙三基草甘膦前毒素处理时，才能使在花药的绒毡层细胞中表达这个基因的转基因植物雄性不育。
上述的或其它本领域已知的任何雄性不育源都可应用于本发明。这包括任何天然存在的雄性不育遗传体系或通过将嵌合或重组基因导入目的雌性亲本品系。
根据本发明，由于前毒素在雌性繁殖结构中转变成毒素，种子的形成在条件雌性不育植物上被阻止(雄性亲本植物)并且花粉产生在雄性不育植物上被阻止(雌性亲本植物)。为了获得杂种种子，在生产田中间作雄性亲本和雌性亲本的纯合种子以允许有效的花粉传递。用本发明的生产杂种种子的一个实施例中雌性亲本是通过任何方法成为雄性不育的而且雄性亲本在适当的外源使用的前毒素存在的情况下是雌性不育的。在植物发育的适当时机使用前毒素后，唯一存活的种子是雄性亲本(雌性不育)花粉在雌性亲本(雄性不育)的胚珠中受精的结果。在使用本发明的优选方式中，雌性亲本被改造为一旦使用了前毒素就成为雄性不育的而雌性亲本被改造为在同样的前毒素存在时为雄性不育。为了制备杂种种子，间作这两个亲本品系，在植物发育的适当时机使用前毒素后只能获得杂种种子。通过这些方法，可获得任何希望的杂种种子。
为了制备杂种小麦种子，雄性亲本被改造为在适当的外源使用的前毒素存在时就成为雌性不育的而雌性亲本被改造为在同样的前毒素存在时为雄性不育。两个转基因植物品系被制成纯合的并用工业上标准的方法进行种子繁殖。为了制备杂种种子，以确定的保证有效的传粉的雄性和雌性比率间作经改造的雄性和雌性亲本品系的纯合种子。在植物发育的适当时机将前毒素用于生产田。种子成熟后，收获整个生产田只产生杂种种子。
实施例下列的实施例进一步描述了执行本发明所用的材料和方法及随后的结果。它们以解释的方式被提供，它们的叙述不应被看作是所述发明的限制。实施例1条件雌性不育烟草植物构建的质粒pSH58包含ΔS13启动子(SLG13启动子的-339至-79与CaMV 35S启动子的-46至+8融合，Dzelkalns等，植物细胞5855-863(1993))及与它以正确的翻译阅读框架融合的argE基因(SEQ.ID NO3)。ΔS13启动子是雌性优先启动子。
argE基因是用引物5’-TATCTAGACCAGAGGTGTGTCAACAAATGAA-3’(SEQ.ID NO5)和引物5’-CGTCTAGATTGCGGCACTGGAGTTTC-3’(SEQ.IDNO6)通过PCR从大肠杆菌的基因组DNA中获得的。将得到的片段克隆入pGEM-TA(Strategene)并且证实了正确的序列。利用一系列的PCR和亚克隆步骤，用引物5’-CGCGGATCCTAAACAATGAAAAACAAATTACCGCC-3’(SEQ.ID NO7)和5’-GCGCCTAGGCGCTTAATGCCAGCAAAAATCC-3’(SEQ.IDNO8)将植物翻译共有序列和BamHI位点添加在argE翻译起始位点的上游。然后这个产物被融合在质粒pSH15中ΔS13启动子的下游(ΔS13启动子在bluescript sk中)并且nos转录终止子被添加在β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因的3’。这个ΔS13-argE-nos盒以EcoRI片段连接到包含T-DNA边界序列和功能性植物选择标记，卡那霉素抗性的pCIB200中。此质粒被命名为pSH58。
以同上述pSH58相似的方式构建质粒pFA100，其中argE基因(SEQ.IDNO3)以正确的翻译阅读框架用适当的限制性酶取代了Stig1-GUS(Goldman等，欧洲分子生物学组织杂志132976-2984(1994))中的GUS基因。然后STIG1-argE融合连接到诸如包含T-DNA边界序列、3’末端序列和功能性植物选择标记诸如卡那霉素的pCIB200中。Stig1启动子是雌性优先启动子。
按照Horsch等，科学2271229-1231(1985)描述的用pSH58转化烟草叶盘。通过PCR证实整合的转基因的存在。用Northern分析从植物组织中制备的RNA以证实argE基因在转基因植物中的组织特异性表达。这些植物是自身受精的并且具有条件雌性不育表型。自身传粉后收集T1种子。pFA100中雌性条件转基因以相似的方法导入烟草中。实施例2 条件雄性不育烟草植物构建的质粒pSH60包含与argE基因融合的TA29启动子(Kriete等，植物杂志9809-818(1996))。TA29启动子是用引物5’-AACTGCAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3’(SEQ.ID NO9)和引物5’-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAAAAC-3’(SEQ.ID NO10)通过PCR从烟草中克隆到的。利用一系列亚克隆步骤，TA29片段被连接到如实施例1所述的包含植物共有翻译的序列的argE基因的上游，nos转录终止子被添加到argE基因的3’。TA29-argE-nos盒被克隆在也包含植物选择标记潮霉素的质粒pSGCGF1的T-DNA边界序列之间。得到的质粒被命名为pSH60。
按照Horsch等，科学2271229-1231(1985)描述的用pSH60转化烟草叶盘。通过PCR证实整合的转基因的存在。用Northern分析从花药中制备的RNA以证实argE基因在转基因植物中的组织特异性表达。这些植物是自身受精的并且具有条件雄性不育表型。自身传粉后收集T1种子。
按照Horsch等，科学2271229-1231(1985)的描述，用包含在TA29启动子(Kriete等，植物杂志9809-818(1996))控制下的argE基因表达盒的pGK73转化烟草叶盘。通过PCR证实整合的转基因的存在。用Northern分析从植物组织中制备的RNA以证实argE基因在转基因植物中的组织特异性表达。这些植物是自身受精的并且具有条件雄性不育表型。自身传粉后收集T1代的种子。实施例3化学处理转化的烟草植物赋予组织特异性不育条件雌性不育植物(转化了pFA100)和条件雄性不育植物(转化了pGK73)的T1代的种子被种植在土壤中。植物幼苗一旦长到足够的大小，用PCR分析叶组织中argE转基因的存在。将PCR阳性的植物转移到温室中。这些植物在没有外源前毒素存在的情况下完全受精。用前毒素乙酰-PPT在生长阶段处理一群条件雌性不育植物和一群条件雄性不育植物。作为前毒素优先转化为毒素的结果，处理的条件雄性不育植物成为雄性不育的而且雌性不育植物成为雌性不育的。未经处理的植物仍然完全能育。经处理的雌性不育植物的花粉被收集用于对经处理的作为雌性亲本植物的雄性不育植物的雌蕊进行传粉。受精发生，杂种种子在雄性不育植物上产生。实施例4获得在玉米雌性繁殖结构中优先表达的新型基因的DNA克隆穗丝特异的cDNA片段首先用Clontech’s的PCR-Select Substraction试剂盒(Clontech cat.#1804-1)被鉴定。按照Poly(A)Quick mRNAIsolation试剂盒(Clontech cat.#200348)所述的程序从玉米近交品系CG00526的发育玉米穗丝、整个花穗中、叶和根组织中分离聚腺苷酸mRNA。从每一个组织的聚腺苷酸mRNA合成cDNA并被分成“测试cDNA”，在这种情况下代表穗丝cDNA以及包含等量的花穗、叶和根cDNA的“驱动cDNA”。cDNA扣除和PCR扩增根据使用者手册中描述的进行。PCR产物被亚克隆到TA-克隆载体，pCR II(Invitrogen cat.#2000-01)中。分别用5μg玉米穗丝、花穗、叶或根组织mRNA进行Northorn印迹以筛选每一个亚克隆的组织特异性。长为145bp克隆B200i表现出穗丝特异性的表达。B200i穗丝特异性cDNA被用于筛选发育的穗丝cDNA文库。穗丝cDNA文库是按照Stratagene’s Zap cDNAGigapack II Gold Cloning试剂盒(Stratagene cat.#200402)详细描述的程序，用从18cm长的穗的穗丝中分离的聚腺苷酸mRNA构建的。与B200i探针杂交的克隆被选择用于序列分析。一个772bp长的克隆包含B200i探针序列。这个克隆，B200i4-2被用作以1μg玉米穗丝、花穗、叶或根组织mRNA进行Northorn印迹的探针。只在穗丝中检测到了表达。克隆B200i4-2的cDNA序列列于SEQ ID N01。
为了分离相应的基因组区，B200i4-2cDNA为探针筛选Mo17玉米基因组文库(Stratagene)。与B200i4-2探针杂交强的Lambda克隆被分离。Southern分析和限制性作图用于确定包含5’和3’区的分别的cDNA序列的基因组片段。约6.5Kb的BamHI片段从一个阳性Lambda克隆中分离到并被亚克隆到Bluescript SK+(Stratagene)中，命名为pSH64。
通过序列分析分析包含5’和3’调节区的基因组B200i4-2克隆，pSH64。也应用计算机扫描以确定推断的启动子元件。包含于基因组克隆pSH64中的雌性优先基因5’和3’调节区序列被列于SEQ ID NO11。按照Budapest条约的规定，pSH64克隆于1998年2月27日贮存于农业研究机构保藏中心(NRRL)，Northern Regional Resarch Center，1815 NorthUniversity Street，Peoria，Illinois 61604，美国并且得到保藏号为NRRL B-21920。
按照下述方法构建了在雌性繁殖结构中以优先方式表达的嵌合基因。用下列引物通过PCR从pSH64中扩增了431bp的B200i的5’调节区5’-AAAACTGCAGGAATTCACTGCTGAGGGAGCGA-3’(SEQ ID NO12)和5’-GCGGGATCCTTCTTGCTGTAGTCCTCGACCACG-3’(SEQ ID NO13)并且以PstI-BamHI片段克隆到包含与nos终止序列序列融合的GUS的pSOG10中。B200i-GUS-nos表达盒然后以EcoR I片段被亚克隆到用EcoR I消化的pSH64中，有效地放置在B200i调节区(SEQID NO11的核苷酸1-3790)全长的GUS-nos下游。这个质粒被命名为pSH70。
如上文所述的pSH70的B200i调节区以Bgl II-BamH I片段克隆到BS-KS(Stratagene)中并且pSH64的B200i调节区的3’加在EcoR V片段(SEQ ID NO11的核苷酸4427-6397)的下游。这个质粒被命名为pSH73。部分BamH I消化pSH73并将其BamHI在连接到包含argE(来自实施例1)DNA片段中，有效地将argE放在B200i的5’和3’调节区之间构建pSH74。实施例5获得在小麦雌性繁殖结构中优先表达的新型基因的cDNA克隆按照试剂盒的手册描述的，用Genhunter mRNA Differential Display方法(Genhunter cat.#M502)从UC703小麦中分离雌蕊特异的cDNA片段。用于鉴定雌蕊特异的cDNA片段的引物是AP-18和T12CA。这个片段被亚克隆到pGEM-TA克隆载体中(Promega cat.#A362A)并被命名为P26。P26克隆被用作5μg小麦雌蕊、花药、叶和根组织总mRNA进行Northorn印迹的探针并且组织特异性被证实。小麦雌蕊cDNA文库是按照Stratagene’sZap cDNAGigapack II Gold Cloning试剂盒(Stratagene cat.#200402)详细描述的程序，用从UC703小麦中分离的雌蕊构建的。与P26探针杂交的克隆被选择用于序列分析。一个克隆，P26-A4长为881bp并且包含203bp的P26序列。这个克隆，包含4个发育阶段，A)顶叶，B)出现的，C)成熟的，和D)受精的雌蕊以及花药、叶和根的5μg总mRNA用881bp的P26-A4探针进行Northern印迹。主要的雌蕊表达在雌蕊中检测到根中有很微弱的表达。
用与上述相似的方法从UC703小麦中分离到了第二个雌蕊特异的cDNA片段。这个克隆被亚克隆至pGEM-TA克隆载体中(Promega cat.#A362A)并被命名为P19。P19克隆被用作5μg小麦雌蕊、花药、叶和根组织总mRNA进行Northorn印迹的探针并且组织特异性被证实。小麦雌蕊cDNA文库根据上述方法构建。与P19探针杂交的克隆被选择用于序列分析。一个克隆，P19-QA长为649bp并且包含P19序列。4个发育阶段，A)顶叶，B)出现的，C)成熟的，和D)受精的雌蕊以及花药、叶和根的5μg总mRNA用649的P19序列探针进行Northern印迹。表明表达在雌蕊中是优先的。实施例6获得在小麦雌性繁殖结构中优选表达的新型基因的基因组克隆并鉴定启动子区域为了分离相应的基因组区，P26-A4 cDNA被用作探针筛选从2周龄幼苗制备的定做的UC703小麦基因组文库。这个文库是通过用MboI部分消化总的基因组DNA并随后将8-22kb的组分与BamH I消化的lambda EMBL3DNA(Clontech Cat.#CS1013j)连接。分离与P26-A4探针强杂交的Lambda克隆。Southern分析和限制性作图用于确定包含5’和3’区的分别的cDNA序列的基因组片段。约5.5Kb的Xba I片段从一个阳性Lambda克隆中分离到并被亚克隆到Bluescript SK+(Stratagene)中。它被命名为pCIB10302。按照Budapest条约的规定，P26-A4克隆于1997年1月21日贮存于农业研究机构保藏中心(NRRL)，Northern Regional ResarchCenter，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604，美国并且得到保藏号为NRRL B-21655。
通过序列分析分析包含5’调节区的基因组P26-A4克隆，pCIB10302。也应用计算机扫描以确定推断的启动子元件。进一步地，通过内切酶限制性酶对5’区作图并且通过RACE PCR和RNAse保护确定转录起始位点。包含于基因组克隆P26-A4中的雌性优先基因5’调节区序列被列于SEQ IDNO2。
为了分离相应的基因组区，按照实施例6所述，P19 cDNA被用作探针筛选从2周龄幼苗制备的定做的UC703小麦基因组文库。分离与P19探针强杂交的Lambda克隆。Southern分析和限制性作图用于确定包含5’和3’区的分别的cDNA序列的基因组片段。约8Kb的Xho I片段从一个阳性Lambda克隆中分离到并被亚克隆到Bluescript SK+(Stratagene)中并且被命名为X2-1。
通过序列分析分析包含5’调节区的基因组P19克隆。也应用计算机扫描以确定推断的启动子元件。进一步地，通过内切酶限制性酶对5’区作图。包含于基因组克隆X2-1中的雌性优先基因5’调节区序列被列于SEQID NO14。按照Budapest条约的规定，X2-1克隆于1998年2月27日贮存于农业研究机构保藏中心(NRRL)，Northern Regional ResarchCenter，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604，美国并得到保藏号为NRRL B-21919。实施例7构建在小麦雌性繁殖结构中优先表达的嵌合基因通过用本领域熟知的标准方法和下列的成分调控连接构建质粒pFA2001)P26调节区，如上文所述(nt 1-3987)，2)包含适当的限制性位点的argE基因，以与argE开放阅读框架的ATG融合从而使P26的翻译起始位点(ATG在nt3987)同框架，由此使P26上游调节区与argE融合以及3)包含在植物中有功能的3’终止序列的载体。在P26启动子控制下的argE表达将在雌性植物繁殖结构中优先表达argE基因。
用恰恰位于X2-1质粒中的P19序列上游的限制性位点PstI和P19的ATG处的NcoI(SEQ ID NO14核苷酸1088)切割P19调节区(SEQ IDNO14核苷酸1-1093)并被连接到用PstI和NcoI切割的pSOG15(pSOG15包含GUS基因和nos终止子，PstI位于GUS基因并且NcoI位于GUS基因的ATG处)。这个质粒被命名为pXB1。
通过用本领域熟知的标准方法和下列的成分调控连接构建质粒p19arg1)P19调节区，如上文所述，2)包含适当的限制性位点的argE基因，以与argE开放阅读框架的ATG融合从而使P19的翻译起始位点(ATG在SEQ ID NO14的nt3987)同框架，由此使P19上游调节区与argE融合以及3)包含在植物中有功能的3’终止序列的载体。在P19启动子控制下的argE表达将在雌性植物繁殖结构中优先表达argE基因。
通过转移到完整组织中测定基因在雌性繁殖结构中的瞬时表达。小麦花组织(雌蕊和花药)被接种到含有15％麦芽糖的Murashige and Skoog培养基上。用标准的方法将pXB1或pSH70的DNA被沉淀在微米大小的金颗粒上。每靶含有20个雌蕊的两个靶盘被用1100psi轰击压力的DuPontBiolistic氦装置射击两次或三次。盘被置于载物台和靶之间的80目屏上进行射击。靶在被轰击后组织在转移至GUS发育混合物(200ml 0.05MpH7的磷酸钠中含100mg X-gluc)于37℃放置2-24小时以前靶在避光于26℃放置16小时。pXB1和pSH70中的GUS基因在雌蕊中产生GUS活性。pSH70瞬时转化到玉米穗丝中的分析表明GUS在雌性组织中的表达。实施例8用编码以雌性优先方式催化前毒素转化成毒素的蛋白的嵌合基因转化小麦基因型UC703的未成熟胚(0.75-1.0mm长)被接种在含3mg/l2，4-D和3％蔗糖的Murashige和Skoog培养基上。大约4小时以后，胚以胚轴侧向下被接种于包含15％麦芽糖、3％蔗糖和3mg/l2，4-D的、覆盖有滤纸的、有含有同样成分的琼脂板支持的Murashige和Skoog培养基上。在轰击前令胚质壁分离2-3小时。
用标准的方法将pFA200和pSOG35的DNA被沉淀在微米大小的金颗粒上。每靶含有20个雌蕊的四个靶盘被用1100psi轰击压力的DuPontBiolistic氦装置射击两次。盘被置于载物台和靶之间的80目屏上进行射击。靶在被轰击后在含有胚的板接种到含3mg/l2，4-D和3％蔗糖的Murashige和Skoog培养基上以前避光于26℃放置16小时。再过48小时后，将单个胚从板上取下直接放在含有相同成分的新鲜培养基中。
基因转移后约6周，将反应的组织在含3mg/l2，4-D和0.2％氨甲喋呤的Murashige和Skoog培养基上放置3周。然后将组织放置在由1mg/l玉米素核苷和1mg/l氨甲喋呤的Murashige和Skoog培养基组成的再生培养基上。2周后，再生的幼小植物被放置在含有半力Murashige和Skoog盐、2％蔗糖、1mg/l NAA和4或8mg/l氨甲喋呤的的被称为“GA7s”的无菌容器中。
在另一个实施例中，基因型UC703的未成熟胚(0.75-1.0mm长)被以上述同样的方法处理，只是含有2mg/l2，4-D的Murashige和Skoog培养基被使用。大约4小时以后，胚以胚轴侧向下被接种于包含15％麦芽糖、3％蔗糖和3mg/l2，4-D的、覆盖有滤纸的、有含有同样成分的琼脂板支持的Murashige和Skoog培养基上。在轰击前令胚质壁分离2-3小时。
用标准的方法将pFA200、pSH70或p19arg的DNA连同包含与潮霉素磷酸转移酶基因控制连接的玉米遍在蛋白启动子的pUbi-Hyg一起被沉淀在微米大小的金颗粒上。每靶含有20个雌蕊的四个靶盘被用1100psi轰击压力的DuPont Biolistic氦装置射击两次。盘被置于载物台和靶之间的80目屏上进行射击。靶在被轰击后在含有胚的板接种到含3mg/l2，4-D和3％蔗糖的Murashige和Skoog培养基上以前避光于26℃放置24小时。
基因转移后约3周，将反应的组织在含3mg/l2，4-D和3％蔗糖的Murashige和Skoog培养基上。然后将组织放置在由3％蔗糖、5mg/l GA3、1mg/lNAA和20mg/l潮霉素的Murashige和Skoog培养基组成的再生培养基上。2周后，再生的小植物被放置在含有半力Murashige和Skoog盐、2％蔗糖、1mg/l NAA和20mg/l潮霉素的被称为“GA7s”的无菌容器中。
从转化产生的植物的叶组织中提取DNA，进行PCR以检测选择标记基因dhfr或hyg以及argE基因的存在与否。PCR阳性的植物被送到温室进行繁殖。在花期阶段，从每株转基因植物上收集雌蕊并从这些组织中提取RNA。argE的表达通过Northern印迹证实。植物进行自身受精并且种子被收集。实施例9构建在雄性繁殖结构中优先表达的嵌合基因质粒pGK73作为起始点。TA29-argE-3’终止序列被从土壤杆菌转化载体中以表达盒移出来并用适当的限制性酶连接到pBluescript KS+中。得到的载体被称为pMA200。
花药特异的启动子，B6从包含以EcoRI-NheI片段从质粒pSGB6g1亚克隆到pSGBNE1的3kb的基因组克隆(见美国专利5,470,359)。1558bp的ApaII/XbaI片段以平端连接到pBluescript(KS)的SmaI位点。按照实施例2所述，构建翻译融合的argE基因。得到的质粒被成为pSH68。
花粉特异的启动子Zmg，Zmg(Hamilton等，有性植物繁殖2，208-212(1989))1kb的HindIII-PpuMI片段被以HindIII-SmaI片段从pCIB391克隆至bluescript。nos转录终止区以HindIII-XbaI片段被添加。argE的编码序列以BamHI片段(来自实施例1)被连接到BamHI位点，有效地将argE放置于Zmg启动子和nos终止序列之间。这个质粒被称为Zmgarg。实施例10用以雄性优先方式表达的嵌合基因转化小麦包含与潮霉素磷酸转移酶基因控制连接的玉米遍在蛋白启动子的pUbi-Hyg和pMA200或pSH68或Zmgarg被用作按照实施例8所述的玉米未成熟胚转化的重组序列。植物被再生并且PCR被用于证实argE转基因的存在。转基因植物被转移到温室中。在花期阶段，花药被收集并从这些组织中提取RNA。argE的表达通过Northern印迹证实。植物进行自身受精并且种子被收集。实施例11用编码以雌性优先方式催化前毒素转化成毒素的蛋白的嵌合基因转化玉米用标准的培养技术，从基因型CG00526的未成熟合子胚中获得I型愈伤组织。为了进行基因转移，通过用解剖刀片切割、用标准的含有18％蔗糖培养基洗三次制备约300mg I型愈伤组织然后立即将它们放置在18％蔗糖的半固体培养基上。大约4小时后，用BioRad的PDS-1000/HeBiolistic装置轰击组织。用标准的BioRad手册中的方法，下列质粒之一pFA200、pSH74或p19arg连同pSOG35被沉淀到1μm的金颗粒上。基因转移后约16小时，愈伤组织被转移至2％蔗糖和2mg/l氨甲喋呤的标准培养基上。愈伤组织亚克隆选择培养8周，此后存活和生长的愈伤组织被转移至标准再生培养基上制备植物。植物被得到并给出事件数。通过PCR分析每一个事件的植物以检测argE基因的存在，PCR阳性的植物被转移至温室中。在花期阶段，花序被收集并从这些组织中提取RNA。argE的表达通过Northern印迹证实。
选择性地，转基因玉米植物可通过未成熟胚的微粒轰击获得。基因型CG00526的花序自身传粉约10天后得到未成熟合子胚。约840个未成熟合子胚被分在14个不同的包含能够诱导和支持胚胎发生愈伤组织的培养基的靶盘中。未成熟合子胚立即被转移到同样的但含有12％蔗糖的培养基中。5小时后，以pFA200或pSH74或p19arg连同pSOG35用BioRad的PDS-1000/He Biolistic装置轰击未成熟合子胚。按照上文所述，基本上用发表的BioRad手册中的方法，将质粒沉淀到1μm的金颗粒上。用1550psi氦冲击压运送此颗粒。每一个靶盘被质粒和金颗粒制备物射击两次。选择剂，在基因转移的当天以2mg/L使用选择剂氨甲喋呤大约一个月后提高—。经这样得到的胚胎发生愈伤组织在选择剂氨甲喋呤存在的情况下再生。植物被得到并给出事件数。通过PCR分析每一个事件的植物以检测argE基因的存在，PCR阳性的植物被转移至温室中。在花期阶段，花序被收集并从这些组织中提取RNA。argE的表达通过Northern印迹证实。实施例12用编码以雄性优先方式催化前毒素转化成毒素的蛋白的嵌合基因转化玉米质粒pMA200或pSH68或pZmgarg连同pSOG35被用作按照实施例11所述的玉米未成熟胚转化的重组序列。植物被再生并且PCR被用于证实argE转基因的存在。转基因植物被转移到温室中。在花期阶段，花穗被收集，从这些组织中提取RNA并且argE的表达通过Northern印迹证实。植物进行自身受精并且种子被收集。实施例13用编码以雌性优先方式催化前毒素转化成毒素的蛋白转化大麦用大约1.5-2.5mm的未成熟的大麦穗状花序(栽培品种GoldenPromise)被收集，用15％(v/v)漂白剂(5.25％次氯酸钠)表面消毒10分钟并用灭菌水洗5次。从年幼的颖果中解剖未成熟胚并将它沿纵轴切成两半。将它们接种在含有Murashige和Skoog基本盐，补充有30mg/L麦芽糖、1mg/L硫胺素-HCl、0.25g/L肌醇、1mg/L酪蛋白水解物、0.691g/L脯氨酸、2.51mg/L麦草畏并被3.51g/LphytagelR(Sigma)固体化。
为了进行胚胎轰击，胚胎以盾盖侧向上在避光条件下于24-28℃培养1-3天。在转化的当天，胚胎被放置在培养皿(100×15mm)的中心以形成环。根据DuPont Biolistic Particle Delivery System手册，将质粒pFA200或pSH74或p19arg连同pUbi-hyg DNA沉淀到0.6或1.0μm的金颗粒上(Bio-Rad)。用1100psi的冲击压以DuPont PDS-1000氦枪射击每个胚胎盘一次。轰击后，胚以盾盖向下转移到新鲜的愈伤组织诱导培养基中。轰击后3-7天，胚胎被转移到选择培养基上(愈伤组织诱导培养基加10mg/l潮霉素)约14天。衍生的愈伤组织被打碎成小块并被单独维持。在随后的传代培养中约每21-28天，愈伤组织转移到20mg/l潮霉素的新鲜选择培养基中。经过2-3次传代培养后，存活的愈伤组织被转移至补充了1-3mg/L 6-苄氨基嘌呤和10-20mg/l潮霉素FHG培养基(Hunter，Ph.D.论文，Wye College，University of London，Ashford，Kent，1988)以使植物再生。植物在荧光下于23-25℃再生。出现的绿芽/幼植物被转移至Murashige and Skoog盐为基础的不含激素的25×100mm的培养皿中的培养基内。当植物长到2-3cm时被转移到Magenta GA7容器以进行进一步发育。
为了进行愈伤组织轰击，胚胎以盾盖侧向下在避光条件下于24-28℃培养至少10天。在转化的当天，来自培养胚胎的胚胎发生愈伤组织被切成小块并被放置在培养皿的中心。DNA运送及随后的植物再生步骤与胚胎轰击中所述的一致。
用PCR分析植物以检测转基因的存在并且阳性的植物被送到温室进行繁殖。在花期阶段，从每株转基因植物上收集雌蕊并从这些组织中提取RNA。argE的表达通过Northern印迹证实。植物进行自身受精并且种子被收集。实施例14用编码以雄性优先方式催化前毒素转化成毒素的蛋白的嵌合基因转化大麦质粒pMA200或pSH68或pZmgarg连同pUbi-Hyg被用作按照实施例13所述的大麦未成熟胚和愈伤组织转化的重组序列。植物被再生并且PCR被用于证实argE转基因的存在。转基因植物被转移到温室中。在花期阶段，花药被收集，从这些组织中提取RNA并且argE的表达通过Northern印迹证实。植物进行自身受精并且种子被收集。实施例15化学处理转化的植物赋予其条件不育性转化了pFA200或pSH74或p19arg的植物(赋予条件雌性不育)和转化了pMA200或pSH68或pZmgarg的植物(赋予条件雄性不育)的T1代的种子被种植在田间。植物幼苗一旦长到足够的大小，用PCR分析叶组织中argE转基因的存在。将PCR阳性的植物转移到温室中。这些植物完全能育。用前毒素乙酰-PPT在生长阶段处理一群pFA200或pSH74或p19arg的植物和一群包含pMA200或pSH68或pZmgarg的植物。转化了pMA200或pSH68或pZmgarg的植物(花粉构建体Zmgarg是需要纯合)雄性不育是乙酰-PPT在雄性繁殖结构中转化为PPT的结果。转化了pFA200或pSH74或p19arg的植物雌性不育是乙酰-PPT在雌性繁殖结构中转化为PPT的结果。未处理的转化了pMA200或pSH68或pZmgarg的植物和转化了pFA200或pSH74或p19arg的植物完全能育。实施例16用在雌性繁殖结构中将前毒素转变成毒素的转基因植物制备小麦的杂种种子实施例8和实施例10的转化了pFA200或pSH74或p19arg的(赋予条件雌性不育)和转化了pMA200或pSH68或pZmgarg的(赋予条件雄性不育)转基因小麦植物以每一个转基因纯合的植物品系进行近交并且种子以标准操作繁殖种子。以足以保证有效的花粉转移的雄性和雌性亲本比率，间作包含pFA200或pSH74或p19arg的植物的和包含pMA200或pSH68或pZmgarg的植物的纯合种子。在植物发育的适当时机，将前毒素乙酰-PPT施用于生产田间。种子成熟后，收获整个生产田，只产生杂种种子。
在此说明书中谈及的所有公开文献和专利申请显示与本发明有关的本领域普通技术人员水平。所有公开文献和专利申请在此以同样程度引用作为参考，就如每个单独公开文献和专利申请具体并独立地在此引用作为参考。
尽管前述的发明已以举例说明的方式得到详细描述，并且实施例是为了清楚理解的目的，很明显，可在本发明附属的权利要求范围内进行某些改变或修饰。
序列表(1)基本信息(i)申请人Crossland，Lyle DHarper，stacy M(ii)发明名称用条件不育性生产杂种种子的方法(iii)序列数14(iv)联系地址(A)收信人Schwarzwaldallee 215(B)街道P.O.Box 12257(C)城市Research Triangle Park(D)州名NCNY(E)国家美国(F)邮政编号22057(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(v)目前申请资料(A)申请号US TBA(B)递交日1998年2月27日(C)分类(vi)在先申请资料(A)申请号US(prov)(vii)律师/代理人信息(A)名称Pace，Gary M(B)登记号40,403(C)参考/著录号CGC 1915/Reg(vii)电信信息(A)电话919-541-8582(F)传真919-541-8689(2)关于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度772个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝称为B200i4的雌性优先转录物的cDNA序列(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO1GTCCTACGTG GTCGAGGACT ACAGCAAGAA ATGGGGGTCT ACAAGTCTGC AGTTCTGCTT 60GGTGTGGTTT TGGCCTCAGT CCTTCTCGGC TTCCTGGACG TTGTGTACGC AAGGGAGCTC 120ACTGAAGCCA ATGGCTCTGG AGTGAAGAAT AATGTGAAGC CTGCAGGAGA GCCTGGGCTC 180AAGGATGAGA AGTGGTTTGG TGGTGGATAC AAGCATGGTG GAGGGTATGG AAACAACCAG 240CCAGGATACG GTGGCGGAGG AAACAGCCAA CCTGGATACG GCGGCGGAGG AAACAGTCAG 300CCCGGATACG GTGGAGGATA CAAGCGCCAT CACCCTGGTG GCGGCTACGG GTCTGGACAA 360GGAGGGCCTG 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TAT1290Val Leu Gly Pro Gly Ser Ile Asn Gln Ala His Gln Pro Asp Glu Tyr345 350 355 360CTG GAA ACA CGG TTT ATC AAG CCC ACC CGC GAA CTG ATA ACC CAG GTA1338Leu Glu Thr Arg Phe Ile Lys Pro Thr Arg Glu Leu Ile Thr Gln Val365 370 375ATT CAC CAT TTT TGC TGG CAT TAA AACGTAGGCC GGATAAGGCG CTCGCGCCGC 1392Ile His His Phe Cys Trp His *380ATCCGGCGCT GTTGCCAAAC TCCAGTGCCG CAATAATGTC GGATGCGATG CTTGCGCATC 1452TTATCCGACC TACAGTGACT CAAACGATGC CCAACCGTAG GCCGGATAAG GCGCTCGCGC 1512CGCATCCGGC ACTGTTGCCA AACTCCAGTG CCGCAATAAT GTCGGATGCG ATACTTGCGC 1572ATCTTATCCG ACCGACAGTG ACTCAAACGA TGCCCAACTG TAGGCCGGAT AAGGCGCTCG 1632CGCCGCATCC GGCACTGTTG CCAAACTCCA GTGCCGCAAT AATGTCGGAT GCGATACTTG 1692CGCATCTTAT CCGACCTACA CCTTTGGTGT TACTTGGGGC GATTTTTTAA CATTTCCATA 1752AGTTACGCTT ATTTAAAGCG TCGTGAATTT AATGACGTAA ATTCCTGCTA TTTATTCGTT 1812TGCTGAAGCG ATTTCGCAGC ATTTGACGTC ACCGCTTTTA CGTGGCTTTA TAAAAGACGA 1872CGAAAAGCAA AGCCCGAGCA TATTCGCGCC AATGCGACGT GAAGGATACA GGGCTATCAA1932ACGATAAGAT GGGGTGTCTG GGGTAATATG AACGAACAAT ATTCCGCATT GCGTAGTAAT1992GTCAGTATGC TCGGCAAAGT GCTGGGAGAA ACCATCAAGG ATGCGTTGGG AGAACACATT2052CTTGAACGCG TAGAAACT 2070(2)关于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度384个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Asn Lys Leu Pro Pro Phe Ile Glu Ile Tyr Arg Ala Leu Ile1 5 10 15Ala Thr Pro Ser Ile Ser Ala Thr Glu Glu Ala Leu Asp Gln Ser Asn20 25 30Ala Asp Leu Ile Thr Leu Leu Ala Asp Trp Phe Lys Asp Leu Gly Phe35 40 45Asn Val Glu Val Gln Pro Val Pro Gly Thr Arg Asn Lys Phe Asn Met50 55 60Leu Ala Ser Ile Gly Gln Gly Ala Gly Gly Leu Leu Leu Ala Gly His65 70 75 80Thr Asp Thr Val Pro Phe Asp Asp Gly Arg Trp Thr Arg Asp Pro Phe85 90 95Thr Leu Thr Glu His Asp Gly Lys Leu Tyr Gly Leu Gly Thr Ala Asp100 105 110Met Lys Gly Phe Phe Ala Phe Ile Leu Asp Ala Leu Arg Asp Val Asp115 120 125Val Thr Lys Leu Lys Lys Pro Leu Tyr Ile Leu Ala Thr Ala Asp Glu130 135 140Glu Thr Ser Met Ala Gly Ala Arg Tyr Phe Ala Glu Thr Thr Ala Leu145 150 155160Arg Pro Asp Cys Ala Ile Ile Gly Glu Pro Thr Ser Leu Gln Pro Val165 170 175Arg Ala His Lys Gly His Ile Ser Asn Ala Ile Arg Ile Gln Gly Gln180 185 190Ser Gly His Ser Ser Asp Pro Ala Arg Gly Val Asn Ala Ile Glu Leu195 200 205Met His Asp Ala Ile Gly His Ile Leu Gln Leu Arg Asp Asn Leu Lys210 215 220Glu Arg Tyr His Tyr Glu Ala Phe Thr Val Pro Tyr Pro Thr Leu Asn225 230 235 240Leu Gly His Ile His Gly Gly Asp Ala Ser Asn Arg Ile Cys Ala Cys245 250 255Cys Glu Leu His Met Asp Ile Arg Pro Leu Pro Gly Met Thr Leu Asn260 265 270Glu Leu Asn Gly Leu Leu Asn Asp Ala Leu Ala Pro Val Ser Glu Arg275 280 285Trp Pro Gly Arg Leu Thr Val Asp Glu Leu His Pro Pro Ile Pro Gly290 295 300Tyr Glu Cys Pro Pro Asn His Gln Leu Val Glu Val Val Glu Lys Leu305310 315 320Leu Gly Ala Lys Thr Glu Val Val Asn Tyr Cys Thr Glu Ala Pro Phe325 330 335Ile Gln Thr Leu Cys Pro Thr Leu Val Leu Gly Pro Gly Ser Ile Asn340 345 350Gln Ala His Gln Pro Asp Glu Tyr Leu Glu Thr Arg Phe Ile Lys Pro355 360 365Thr Arg Glu Leu Ile Thr Gln Val Ile His His Phe Cys Trp His *370 375 380(2)关于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“用于argE的引物”(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO5TATCTAGACC AGAGGTGTGT CAACAAATGA A 31(2)关于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征
(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“用于argE的引物”(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO6CGTCTAGATT GCGGCACTGG AGTTTC 26(2)关于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“用于argE的引物”(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO7CGCGGATCCT AAACAATGAA AAACAAATTA CCGCC35(2)关于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其它核酸
(A)描述/desc＝“用于argE的引物”(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO8GCGCCTAGGC GCTTAATGCC AGCAAAAATC C31(2)关于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“用于argE的引物”(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO9AACTGCAGCT TTTTGGTTAG CGAATGC 27(2)关于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“用于TA29的引物”(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO10CAGACTAGTT TTAGCTAATT TCTTTAAGTA AAAAC 35(2)关于SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度6596个碱基对(B)类型核酸夹(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(ix)特征(A)名称/关键启动子(B)位置1..3790(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“B200i4-2的5’调控区域”(ix)特征(A)名称/关键misc-信号(B)位置4427..6397(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“B200i4-2的3’调控区域”/证据＝实验(ix)特征(A)名称/关键misc-feature(B)位置3789..3791(D)其它信息/功能＝“ATG翻译起始点”(ix)特征(A)名称/关键misc-feature(B)位置4402..4404(D)其它信息/功能＝“翻译终止”(xi)序列描述SEQ ID NO11GGATCCTTAG ATCTTTAGGT GCACGTTAGT TACTGGAAAT GTAAACACAA CAGGAATAGG 60TGAAGCGACA ATGGACAACA CATGACGACT CTCAAGTGGT TACCTCAAAC AGCCAAAGCA 120CAATTTTCGA TGCAAGAACT AGATGCAAAG AGCTACTAAC AAAGCGACTC TTGTAGAATG 180AACTAGGTAC AATAGAAGTA AAAAACATGG CCAAAATTTG CGGCATCCTT TTGCAATGCA 240ACCAAACGCT TTGTAGTTTG CAACATTGTT GAAGTCATTG AAGATCATTC AGGAGTACGC 300ATAGCTCTGG CCCACCTAGC TGTCAAGCCT AGGGTAGCGA AAAACAGGTG TTAGGTAAGA 360GTATTCGTTA CTAAGGTGTT GTTTGGTTCA ACCACAAAAG AGGCAACACT AATTAGGAAT 420AGCTGCTCCT GGTATCTGTT ATGATGCAAT GATCATCGGT TTTTGTTTGG TTGCAACCAA 480TGTGAGCAGT GAAATAGCGT GGCATTGAAT CATAGCTAGA TGGGAGCATT AATGATTTTT 540CACAAGCCTG TATCAGATGT CACTGTGATC GATTGCAGCC TATTGCAACC AAATTTAAAG 600TTATGATAAC AGATACCGAT GTAAACTAAT CACTTCCCTA AATCGTCAAA CCAAACATTA 660CATAAAGTTG ATAGGATCAA TGTAATTAAA AAGTACATGT CACGGAATAT TTATAGAGGG 720CTCACCTTAT TCCATATACA AAGTCAAAAA TACCACTTAA CTTTTTTTAC AATTATTCAT 780TTATATAAGG ATAATCCGGT AATTTTATCT TACATATATA TTCCATACTT CTTTTGGGCA 840CACAATCTTC ATCAGAGGCT TTGCTTCCTG TGAAGTGAAC CAATCTATCT TCTTTCGCTT 900CTAACTTTGT TTCACGCCTC GCAAAGTGAA CCGATTTGCC TCCGTTCATT TCTGACTTCA 960CTTCACATTC TACAAAGTGA ACGAGTCTGT CTCCATTTAC TTCTAACTTA GCTTTACTTT 1020CTGCAAAGTG AACCGATCTT TCGTCGTTCA CTTTTGGTTT TACTTCATGT TCTATAAAGT 1080GCACTAATGC GTCTTTGTTC ACTTCTTGCT TGCTTCTAAT GAAGATGATC CTAAAAATAA 1140ATATCAAATA AATACAAAAA TAGTTGTTAA TCAACTTTCG AAACGTAAGG GATTGCATTT 1200GTCCGAGGCC AAATCCCTAA CAACAACCCC TAGTGGGCAA AAGCCTCCTC TGAAGGTACG 1260AATCCTTTGA AATTATGATT TGGACCAGAG GTAAAATGTT ATCCTCAAGC TTCAGAGTTG 1320TCTATTGGAG GTTAGGAGGT GAGTAGTTTC GATTTCAAAT TTGTAATGAC CAAGTTTCAA 1380CAAAGTCAGG TATATAAGGA AGTTGAAGGG TCACTTTTGA CCAAAGCCAT GTATACATAC 1440CGTGCTTTCT GGGTCATAGT TTGCTACTGC TTTGATGAAA ACAAGAGGTA TTGTTGCATG 1500TTTTTATGAA TAAAAGCTTT TATGTGAAGT CTGTTTGTAG ATGTGTGTAT AAGCCTTGCA 1560AGGAAGTTAT CCGCTTGTTG ATTGTGAAGC TTATGAAAGT AATTCCCAAC TGATAACTTG 1620GTTTTTTTGT TTGTTGTATT ATGGTTTGGT TGACTCCTTT TTGTGTTGGA TGTTTAGTGT 1680TGAATGGAAT CCCCATGTGT CTTCTTATGA TTTTGAGGAT GATTTAGAAG ATTTGGAAGT 1740CTCTAGGTTA AAACTTGTTG ATGATGAAAC CAAGTCATTG AGGTTTGGAA AGTACTTGCT 1800GGATGAAGCA ACTCTTAATT TTGTTTAGAG AAAAAATATT AACCAGGGAA TGAAACAGTC 1860CTAAAGTCTA AAGTAGATGA ATGTGTTGTC TTTAAATACT TCATTACTAC CAGGCTCCAC 1920TTTCCTTCCT TAGGATTTGT TGGGTTAGAT TGTAAGTTCA TACAACATCG GAGTGTATCA 1980TTTGATGTCT AATGGTATTT CAAAGATTGC ACTTTTTGTT TCAGCCATCA AAACTCAAGA 2040ATTAACTCTC AATGTAGTTG CATTTTGTTC TTTGAATGAG ATGCACTACC AATTTAGAAG 2100CTATAATAAA ATAGACCATA AACCTTAAAC CCCCCAAACC CAAAGCCCTA AACCTTGGCC 2160CCTACTCGGG CGCCGGCTAA TCAGTCATAC ACATCGATTT ACCGGCTTTG GGGAGTGGCT 2220AATCGGTAAT CCTGGCAGAT ATATCATTTT ATTTCTTTTT TTTGTATTTT TTTAAACTTC 2280CATATTTTTA GTTTGAAATC CGTTGCGTAT TTTGAAATTT GGTTTCAGCA GAAAGTCTTC 2340AAATAATCCA TAGTATTTAT ACAAAAATTG GCATCAAAAG TTTTTAGAAT TTACAAAATT 2400CAAATTCAAA ACCGGTGATA CGGTGGAGCC GTCCGCCATC GATAACAGGC TAGCCGGATT 2460TATCAATCGG CTTCGTGACC ATTGATCGGA GCTCGCTCGC ATGCAGGAAG TAAATACAAT 2520GCATGGATCA CAAACTAAAC TATGTGCCAA GACTCAACAT GTGTAACATC ATTCTTGTTG 2580AGCATATGAT AATTTACTTG TCATAACAAA ATAAAGAATA GAGCAAAATC CACTTTGGTC 2640CTCTTTGGCA TGGCTCTTTA GGCGGCTCCA GCTCAGACTC ATTATGAAGC CCTATCAAAT 2700AGTAAAAAAA CGGCTCCTTG TCCAGAGCCC TCCAAGAGCT ATAGCCGTTT TATTGTTGGG 2760ACCCAAAGCA CAAAAAACGT AGCTTCTACT GGCTCCTACA TTTTTCTCAT ACGTCATTCC 2820AAAAGAAATA CATAATAAGT TGTTTTGCCA AACAAATTGC AAAATGGCTC CGGCTCCGCT 2880AGAGAAGCTA AGGAGATAAA AGAAACAGAG CCGAAACTGT TTTCAGAGGA GCCAGAGCCC 2940TGCTAAGGGC TTGTTCGGTT ATACCAATCC AGAAGGGGAT TGGAGGAGAT TAAATGACTA 3000GGAGGGGATT TAATCCCCTC CAATCTCCTT CTGAATTGGT ATAACCGAAC ATGCCCTAAA 3060GGAGGCCTTT GTATGCTTCA TCTTAGAGAG GAATCGAATA AAAGTCGTGT GCTACTTGTT 3120TTCGCCGTTA ATTCCTCGTG GCTAGCTTGT GCCATTGCAT CCATTGATCC ATAGTGGTGG 3180TAAATTAACA TGCTACATCT TTTATTGTGT CATCCTGTGG TCACCAGTGG TCTGAGAGAA 3240GTGGAATTTA TTGTGCCAGC ATAGTTAAAA GACCTGTTAT TCGACTACAC TAGCAATATG 3300TACTACTGTA GGGGTACTAT ATTTCACATA AGTAGGCAGT CTAATTCTAG CTCTTATTCT 3360AAACGTCATT GAATTCACTG CTGAGGGAGC GATGGGCAAC AATGAATTGT CATGCTCGCT 3420TTCAACAACA CATGTAGCTC CTCTGGTAGT AGATTACGAG AGTGTTTGGT TTATAGAGAC 3480TAATTTTTAA TTTATCTATT TTATTTTAAT AATTTAGAGA CTAAAATAGA ATAAAATGGA 3540GGAACAAACC AAACACCCTT TAAATGCCCG ATCGGCTCCA ATTTTTTGGA TAGTAGTACT 3600CCAGTAATAA CAGTTATGCT GGGTGCCTGG GTTGCCAACC GCTCATCAGT GCACTTATTT 3660TTGGTATAGC CATGGAAGCT TGTACAGCTT GCAGCCATGC TTTCCCGGCT TCTCTATAAA 3720ATGCAGGCAC TGCATTTCCA TATTCTCAAC GGCCCCAAGG GTCCACGTAG TCGAGGACTA 3780CAGCAAGAAA TGGGGGTCAA CAAGTCTGCA GTTCTGCTTG GTGTGGTTTT GGTCTCAGTC 3840CTTCTCTTCC TGGACGTTGT GTACGCAAGG GAGCTCACTG AAGCCAATGG TTGCTAATCC 3900GTCTCTCTCC CTGCTTTGTG TGTTCTGCAC TACTGTTAAC ATTAGTGCAT GAATTAACTA 3960GAACCATTTT AAAGAAGGTA TATCTTTTTG TGCTTCATTC TTTCTTCATG CAGGCTCTGG 4020AGTGAAGAAT AATGTGAAGC CTGCAGGAGA GCCTGGGCTC AAGGATGAGA AGTGGTTTGG4080TGGTGGATAC AAGCATGGTG GAGGGTATGG AAACAACCAG CCAGGATACG GTGGCGGAGG4140AAACAGCCAA CCTGGATACG GCGGCGGAGG AAACAGTCAG CCCGGATACG GTGGAGGATA4200CAAGCGCCAT CACCCTGGTG GCGGCTACGG GTCTGGACAA GGAGGGCCTG GATGTGGATG4260TGGAGGAGGG TATGGAGGTG GCAATGGTAG TCCTGGGTAC GGCGATGACA ATGGTGGTGG4320CATTGGCACT GGTGGCGGAA ATGGCAATGC TGGTGGGTAC GGAGGAGGAG GCGGCGGTTA4380TGGAGGCGGC TACGGCAGTG GTAGTGGTAC AGCACCAGGA GGCGGATATC ATGGCGGTGG4440TGGTGCACAA CGCTACGCTG GGCAGAACTA GCAAGAACAA CCCCTTATGC TAGTTTATGT4500TAAATAAACG ATCCATTGTT CATGTGACTG AGCAATTTAA GCAGTGAAGG ATCTTGACTC4560GTGTTATTTG TGTTACCATA TGTATTGATT GTTTTATGTT TAAGATGAAT GTACACCGCT4620ATTTGTATGT CGAACTCGTT GCATGGAGAT GAAAAAAAAA GGCACAAAAA CATCAGCAAA4680CCATGCTTTC CTTCCGGTCG ACCAGATTTG GGCTGATATT TATTGAGTAA AAAAAATTCT4740ATCTCTGGGA GATTGTTTCA AGTAAAAGCT AGAGCGTGAC ATTTTGTAGC GGAAAATTGG4800AACGAAAACA TGTCCAACGT CGAAATTATT GTATATATTC TAATGGATAT ATATAACGTA4860ATCAGAAGGA AAATTGTTTC CAAGTCATTT TTTCACAATG CAACAGTCAA ACATGGATGC4920GGCGAGCGAA GGATGCAGGT GGGTTCCCCT GCCGCTCCAA ATCCTATAGA GCCCTCCTAA4980AGACTCCCCT AAAATTAGAT CTTATGTTTC TCATTATGTG TTTTAAGATT TTCATTATTC5040ATGGATGTTT CGATATAAGA CTATTTTGAA TTATCATATT TGTCTATTGT GAGTCGTTTA5100GGCCCCGTTT GGTTCTATTA GTCTTAGGAT GTGTCACACC CGGATTTAAG GGACAAATAA5160GCAAGGGTGA ACTTTTACAA TGTTAGAGTG TATAGAGATA AATGTCATAA TAATATTAGA5220GTACTTTTAC AATGCGGAAG TCTTACAAAA TAAAAGATAA ACATAAAATG AACTAAAATC5280CATCTTTGGC GCCAATAAGT CAACTGAAAG ACGCCATCTA AATCAGATCG AACTCCTCGT5340TGTGTGGCTC CTCTTGAACC ACCGGTCCTT CTCCTGTGGG GGGTGTGAGA CAGCAAGGGT5400GAGCTCACAC ATGATCATAG CTCAACAAGT TGTGGAGAAA CCAGTGAGCA TGAATTCAAC5460AATGGTGGGA GCTCATGTTA TGTGTAAGGC TGATAAACAA TAAGGGTTAA AGCTGAACAT5520TGCTTTTAAT AAGTTGGTCA AAATTTTATT AGTAGTTACT AAATGTAAGT GCATACCAAA5580CCATAATAGA AATAATAGAA CAAAATTAAT AAATGATCTC ATACAATGCA AATGACAAAT5640TGAGTTTAAG TTCCATAATT TAATCCTGCG AGAGTCCTGA GTTGCTCATG ACCGTGAGCT5700CGGCTAGTAT ACCAGTTTTA CACTCTGCAG AGGTTGTACC CTGTACCCAT AAGTCATGTT5760ACCCATCTGC CAAGGGATCG CGACTCCCAT ACACCTCTAC CAAGGAAGCG AGGCAGGGCA5820ATACTACGAG GCCTTTACAA AGTTCCACTA GCTTCCGAAA ACCCGCTACA GTTTATGGGA5880AGAGCACTTA CAAGAATCCC CCGTCTGATC GCAATTGCAG CAAAATCAAC CCGAAAACCT5940CCTTGCATGC AACTCCCCTA CTGCCCTTGC CCCTTTCGGG TAAGGTAGTC TTCCACTAGC6000TTTCCTAATT AGTTAGCCAA GGGGTCTCAT TCCTCCCTTA TGGTGGCACG TGTTTCTCAA 6060GTTAAGCTCC ATGTTCCAAT TAACATTAAT GATGTTGACA TGAACATAAA TAAAATAACA 6120AATAATTGGA ACATGGATAT AATGATATAT TAACCCAAAA CCATGTGAAG CAATAGCAAA 6180ACTACCCAAG TGATTCAGGG GTAACAAGGT AAAGAGTTAA ACAGTCTAGG GTGACCTATT 6240CGGTCCCATC AGAATTAAAC CTATGCATGA ATAAGTGATA TTAAAGAACA TTATTGGGTA 6300TAAAAGTGGT CAAGGGCACA ACTTGCCTTC AATGAGCTCC TACTCAACAA CTTCTATCTG 6360CTGGGCACCA GGATCCCCCG GGCTGCAGGA ATTCGATATC AAGCTTATCG ATACCGTCGA 6420CCTCGAGGGG GGGCCCGGTA CCCAATTCGC CCTATAGTGA GTCGTATTAC AATTCACTGG 6480CCGTCGTTTT ACAACGTCGT GACTGGGAAA AACCCTGGCG TTACCCAACT TAATCGCCTT 6540GCAGCACATC CCCCTTTCGC CAGCTGGCGT AATAGCGAAG AGGCCCGCAC CGATCG 6596(2)关于SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“用于B200i的印物”(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO12AAAACTGCAG GAATTCACTG CTGAGGGAGC GA 32(2)关于SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“用于B200i的印物”(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO13GCGGGATCCT TCTTGCTGTA GTCCTCGACC ACG 33(2)关于SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度1093个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(ix)特征(A)名称/关键misc-feature(B)位置1090..1092(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“ATG翻译起始点”/证据＝实验(ix)特征(A)名称/关键启动子(B)位置1..1093(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“P19的5’调控区域”/证据＝实验(xi)序列描述SEQ ID NO14CTCGAGGATC AATTTAAAAT GAAAACGGAA AAAGTGTAAA AGCTGGTCCA GAAAAATAAG 60GTCCGAAGCT TCCAAAAACC GGGACGAGCG CCTCCCACGA AAGTGCATTA CGTGGGCCGG120CAAAACTACC CTAGCAAAGA ATGACCTGAA CCTAAGCGAT GTCTCAAATC TCGATGCCAC180GAGCAATCAA GGCGATGCCT TCAGAAGGAA AACAACGCCG TGACACACAA GCTTTGCATA240TTCATGAGAG AAGACCAAAA TAACAGTACG TGCCTCATTG CTTATTTTGT TTCCTCATAT300AACAGTACGT GCAGTTCAAC CCAGGTGTAT ATGTGTATCC CGCCACTTCT ATCGTTAGGA360AAGACTATAA ATACATCCAT TCATCTACGT ATCTCTCACG CTCTTTACTT TTGGCTTGCA420ATAATAATAC GACCAAAGAG ACTAGCGCAC CACAATACTA CATATACCCA TGCTGATAAT480CATACACCCG TCAATTCTAG CTGTGTCCAG GTCGAAGTAA CAGACGGGAA CATCACGGTG540GTGATGCAAG AGACTAGCGC GTTTGGACGC TTCGCATCAC CTACCTTTGG ATGCCTCGCA600TGAATCAAGT CGTGTCGTCC GCTAGCTTCC GCCTACCACC CACGGAGCAG AGCCAGCGAG660CAACTAACAC CGGCCAACTA TCCACTGGAG TTGAATGCAG GACGTCCAAG GTGTGCCCGT720CAACCATTCT GCTGACCGTA GTCATGGCGA GCTGGTGCAG TTCAGTGCAT GCTCTAGGTC780TAGGGTAGAG TGTTCAACGG ATTGTTACAG CGGCCGTGGG CGATTCATTA GACGGCTCCC840CGCAGGTGGG GTGTTCATTA TCCCCTGCAT CTTTCTTTAA TCGCTCACCT GCTCGGTCGG900CGGCGATGGC CGCGTACGCT CCCTACGTGT CGCCGCATGG CATGCACATG GCCGGCTCGG960GCCACGGCGG TGCGTGGCCA GCTATAAATA CCCCAGCCGG GAGCTCCTAG ATCCATCTCC 1020ACACAACTAC CAGTACACTC CACTCCCATC ACACACACGG ACACACCTGC AAGAGCGAGA 1080GCGTGAGCCA TGG 109权利要求
1.杂种种子生产的方法，包括(a)制备包含与编码催化前毒素向毒素转化的酶的编码序列可操作性相连的雌性优先启动子的条件雌性不育植株；(b)将条件雌性不育植株与雄性不育植株间作；(c)通过向条件雌性不育植株施用前毒素诱导雌性不育性；并且(d)制备杂种种子。
2.权利要求1的方法，其中所述植株是正常自花传粉植株。
3.权利要求1的方法，其中所述植株是正常异花传粉植株。
4.权利要求2的方法，其中所述正常自花传粉的植株是小麦。
5.权利要求2的方法，其中所述正常自花传粉的植株是大麦。
6.权利要求3的方法，其中所述正常异花传粉的植株是玉米。
7.权利要求1的方法，其中所述雌性优先启动子选自修饰的S13启动子、Stig1启动子、AGL5启动子、TTS1启动子、AZG2启动子、Fbp11启动子、可从B200i4-2克隆分离的启动子、可从P26克隆分离的启动子和可从P19克隆分离的启动子。
8.权利要求7的方法，其中所述雌性优先启动子是可从B200i4-2克隆分离的启动子。
9.权利要求7的方法，其中所述雌性优先启动子是可从P26克隆分离的启动子。
10.权利要求7的方法，其中所述雌性优先启动子是可从P19克隆分离的启动子。
11.权利要求1的方法，其中编码催化前毒素向毒素转化的酶的所述编码序列可从选自argE基因、P450sul一氧化物酶基因和pehA基因的基因得到。
12.权利要求11的方法，其中所述编码序列可从argE基因得到。
13.权利要求1的方法，其中所述前毒素是乙酰膦丝菌素。
14.通过权利要求1的方法生产的杂种种子。
15.表达元件盒，包含与目的编码序列可操作连接的雌性优先启动子。
16.权利要求15的表达元件盒，其中所述目的编码序列编码催化前毒素向毒素转化的酶。
17.权利要求16的表达元件盒，其中所述编码序列可从选自argE基因、P450sul一氧化物酶基因和pehA基因的基因得到。
18.权利要求17的表达元件盒，其中所述编码序列可从argE基因得到。
19.权利要求17的表达元件盒，其中所述编码序列可从P450sul一氧化物酶基因得到。
20.权利要求17的表达元件盒，其中所述编码序列可从pehA基因得到。
21.权利要求15的表达元件盒，其中所述雌性优先启动子选自修饰的S13启动子、Stig1启动子、AGL5启动子、TTS1启动子、AZG2启动子、Fbp11启动子、可从B200i4-2克隆分离的启动子、可从P26克隆分离的启动子和可从P19克隆分离的启动子。
22.权利要求16的表达元件盒，其中所述雌性优先启动子可从B200i4-2克隆分离，目的编码序列可从argE基因得到。
23.权利要求16的表达元件盒，其中所述雌性优先启动子可从P26克隆分离，目的编码序列可从argE基因得到。
24.权利要求16的表达元件盒，其中所述雌性优先启动子可从P19克隆分离，目的编码序列可从argE基因得到。
25.可从基因组B200i4-2克隆分离的雌性优先启动子，具有保藏号NRRL B-21655。
26.权利要求25的雌性优先启动子，其中所述启动子由SEQ ID NO11的核苷酸1-1390组成。
27.可从基因组P26克隆分离的雌性优先启动子，具有保藏号NRRLB-21920。
28.权利要求27的雌性优先启动子，其中所述启动子由SEQ ID NO2中所示的序列组成。
29.可从基因组P19克隆分离的雌性优先启动子，具有保藏号NRRLB-21919。
30.权利要求29的雌性优先启动子，其中所述启动子由SEQ ID NO14的核苷酸1-1093组成。
31.含有权利要求15的表达元件盒的植株。
32.含有权利要求18的表达元件盒的植株。
33.含有权利要求21的表达元件盒的植株。
34.含有权利要求22的表达元件盒的植株。
35.含有权利要求23的表达元件盒的植株。
36.含有权利要求24的表达元件盒的植株。
37.权利要求31的植株的种子。
38.权利要求32的植株的种子。
39.权利要求33的植株的种子。
40.权利要求34的植株的种子。
41.权利要求35的植株的种子。
42.权利要求36的植株的种子。
全文摘要
本发明提供杂种种子生产的方法,包括制备包含与编码催化前毒素向毒素转化的酶的编码序列可操作性相连的雌性优先启动子的条件雌性不育植株,将条件雌性不育植株与雄性不育植株间作,向条件雌性不育植株施用前毒素,并且制备杂种种子。作为雌性繁殖结构中前毒素向毒素转化的结果,条件雌性不育植株上的可育种子形成受到抑制,并且雄性不育植株上的花粉产生也受到抑制,因此使杂种杂交的两个亲本间作以提供更有效的花粉传播。本发明也提供用于本发明的表达元件盒、用表达元件盒转化的植株以及新的雌性优先启动子。
文档编号C12N15/09GK1249782SQ98803020
公开日2000年4月5日 申请日期1998年2月27日 优先权日1997年3月3日
发明者S·M·哈泼, L·D·克罗斯兰德, E·帕斯克尔 申请人:诺瓦提斯公司