专利名称：新的降解蛋白金属蛋白酶、其突变体、片段等的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的蛋白质、其片段和突变体，以及它在检测和测试治疗骨关节炎和其它以金属蛋白酶正调控为特征的疾病的药物方面的用途。
这些酶有调的产生和活性在组织结构的正常发育中起着重要作用。但在过量时，这些酶会造成相关组织的病理性破坏。参见，J．Saus等，“人基质金属蛋白酶-3的完整一级结构”，J．Biol．Chem．2636742(1988)。其中许多是含锌金属蛋白酶，例如血管紧张肽转化酶和脑啡肽酶。胶原酶、溶质素及相关酶在介导许多疾病的症状方面具有重要作用，这些疾病包括类风湿关节炎(Mullins，D．E等，Biochim Biophys Acta(1983)695117-214)；骨关节炎(Henderson，B．等，Drugs ofthe Future(1990)15495-508)；癌细胞转移(ibid，Broadhurst，M．J．等，欧洲专利申请276436(1987年公开)，Reich，R．等，48 Cancer Res 3307-3312(1988))；和各种溃疡性疾病。碱灼伤或者假单孢菌aeruginosa、Acanthamoeba、单纯性疱疹和牛痘病毒感染会在角膜内造成溃疡。
实际上，在癌组织内进行的金属蛋白酶测定显示，金属蛋白酶水平的升高与转移能力有关。参见，M．J．Duffy等，“在人乳房癌中用ELISA进行的8型和9型基质金属蛋白酶测试”，Br．J．Cancer 711025(1995)。
以不希望的金属蛋白酶活性为特征的疾病还包括牙周病、表皮松解大疱和巩膜炎。考虑到金属蛋白酶涉及了多种疾病，人们已经开始试图制备出这类酶的抑制物。现有文献中公开了大量此类抑制物。本发明试图提供新的、好在对此类蛋白酶具有特异性的抑制物，它们在治疗由此类蛋白酶介导或调节的疾病方面具有更强的活性。
金属蛋白酶抑制物可被用于治疗至少部分地由结构蛋白降解引起的疾病。已经制备出了多种抑制物，但是人们仍然需要金属蛋白酶抑制物的筛选方法来设计出治疗所述疾病的药物。
因为基质金属蛋白酶与许多疾病有关，所以人们一直试图鉴定到这种酶的抑制剂。例如，已知TaoI-2和1，10-菲咯啉是金属蛋白酶的抑制剂。参见，J．Arribas等，“各种细胞表面蛋白的胞外域是由一个对金属蛋白酶抑制剂敏感的系统分泌的”，J．Biol．Chem．27111376(1996)。
金属蛋白酶是一大类具有多种不同功能的蛋白质。降解蛋白(disintegrin)是锌金属蛋白酶，富含于蛇毒中。哺乳动物降解蛋白是包含约18个已知亚群的一族蛋白。它们起着细胞吸附干扰剂的作为，而且已知在繁殖中十分活跃(例如，在精子对卵的受精作用中，包括两者的融合以及精子的成熟)。
这些及其它金属蛋白酶的分子生物学和生物化学已经为人所知。结果，Genbank，即基因序列库，提供了几条金属蛋白酶的序列，其中有些据说编码降解蛋白的片段。例如，1994年2月25日的GenBank登记号Z48444公开了据说是大鼠降解蛋白金属蛋白酶基因的2407核苷酸的大鼠基因；1995年3月2日的GenBank登记号Z48579公开了据说是人降解蛋白金属蛋白酶基因部分序列的1842核苷酸；1994年10月25日的GenBank登记号Z21961公开了据说是牛锌金属蛋白酶基因的部分序列的2397核苷酸。
因为金属蛋白酶的种类如此之多，所以人们一直需要ⅰ)专一性检测特定金属蛋白酶的方法和ⅱ)鉴定候选抑制剂的方法。
将金属蛋白酶与特定疾病相关联，并利用这些金属蛋白酶作为工具来检测并最终治愈、控制这些疾病或设计出治愈的方法将是十分有益的。发明目的本发明目的之一是提供一种鉴定能够与降解蛋白结合的化合物的方法。
本发明另一目的是提供包含降解蛋白的重组表达载体的宿主细胞和编码降解蛋白的重组表达载体。
本发明另一目的是提供一种检测例如癌症、关节病(包括关节强硬性脊椎炎、类风湿关节炎、痛风性关节炎(痛风)、炎性关节炎、Lyme病和骨关节炎)等由金属蛋白酶介导的疾病的筛选方法。
本发明另一目的是提供一种所述蛋白的抗体，它可以用在筛选、分离所述蛋白或作为针对所述蛋白的寻靶部分。
本发明还提供了用于所述目的、包含降解蛋白的重组表达载体的宿主细胞和编码降解蛋白和人降解蛋白金属蛋白酶蛋白、其片段或突变体的重组表达载体。
本发明还提供了用于检测骨关节炎和其它例如癌症等基于金属蛋白酶的疾病的体内与体外的方法，该方法可以制造成试剂盒并以试剂盒的方式来使用。详细说明“基因”指一段DNA序列，它包括产生成熟蛋白或其前体所必需的调控和编码序列。蛋白可以是由编码序列的全长编码的，也可以是由其中任意一部分编码的，只要具有所需的酶活性。
“寡核苷酸”定义为包含两个或两个以上脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，通常包含三个以上，一般是十个以上，可以多达100个或更多(但是以20至30个为佳)。寡核苷酸的确切大小取决于许多因素，这些因素又取决于寡核苷酸最终的功能与用途。寡核苷酸可以用各种方法产生，其中包括化学合成、DNA复制、限制性核酸内切酶消化逆转录产物或以上方法的综合运用。
因为单核苷酸反应生成寡核苷酸的方式为一个单核苷酸五糖环的5’磷酸通过磷酸二酯键以同一方向与相邻核苷酸的3’氧结合，所以，如果一段寡核苷酸末端的5’磷酸没有与另一单核苷酸五糖环上的3’氧结合，则称该末端为“5’末端”，如果末端的3’氧没有与下一单核苷酸五糖环上的5’磷酸结合，则称该末端为“3’末端”。在本文中，一段核酸序列，即使它位于一段大核苷酸的内部，也具有5’和3’末端。
当两段不同且无重叠的寡核苷酸与同一线性互补核酸序列上不同区域结合时，而且一段寡核苷酸的3’末端指向另一段的5’末端，则称前者为“上游”寡核苷酸，后者为“下游”寡核苷酸。
“引物”指这样的寡核苷酸，当所处条件引发引物的延伸时，它能够作为合成的起始点。寡核苷酸引物可以是天然存在的，例如纯化自限制性消化产物，或者是合成的。
引物的选择需与模板上一段特定序列“基本”互补。引物必需具有足够的互补性与模板链杂交以便延长引物。引物序列不必完全反映模板的序列。例如，可以在引物的5’末端接一段非互补核苷酸片段而引物的其余序列则与模板链基本互补。非互补碱基或更长的序列可以分散在引物内部，只要引物序列与模板序列的互补性足以杂交形成模板引物复合物以便合成引物的延伸产物。
“杂交”法包括令一段互补序列与靶核酸(其序列待测)结合。两个含有互补序列的核苷酸多聚物能够发现彼此并通过碱基配对反应相互结合，这是一种众所周知的现象。Marmur&Lane，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 46453(1960)和Doty等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 46464(1960)最早发现“杂交”过程，其后对该方法的不断改进使之成为了现代生物学的重要工具。但是，有许多问题阻碍了将杂交广泛用于对人的诊断。这些难题中有1)杂交效率低；2)基因组DNA混合物中特定靶序列的浓度低；和3)只是部分互补的探针与靶杂交。
至于效率，据实验观察，在杂交反应中只形成了探针-靶复合物可能数中的一部分。用短的寡核苷酸探针(短于100碱基)时，尤其如此。这有三个主要原因a)由于二级结构和三级结构的相互作用而无法杂交；b)含有靶序列的DNA链重又与互补链杂交(结合)；和c)当采用需将靶核酸与固相表面固定的杂交法时，有些靶分子无法发生杂交。
即使探针的序列与靶序列(即靶的一级结构)完全互补，还必需通过高级结构的重排使得靶序列能够与探针接触。所述高级结构的重排可能涉及分子的二级结构或三级结构。二级结构是由分子内连接决定的。以DNA或RNA为例，这就是同一连续碱基链内的杂交(与不同的两链之间的杂交相反)。根据分子内连接的程度和位置，探针可能被从靶序列上置换下来，因而无法杂交。
较长的靶链可能复性或重结合，这使得寡核苷酸探针与变性的双链DNA的溶液杂交更加复杂。同样，这一过程会置换下已经杂交的探针。这将造成相对于探针和靶的起始浓度的低杂交率(低“有效区域”)。
至于靶序列浓度低，在基因组DNA中，含有靶序列的DNA片段通常较少。这造成了很大的技术困难在如此低的水平，使采用寡核苷酸的许多常规方法缺乏检测出杂交的必要灵敏度。
试图解决靶序列浓度问题的方法之一是放大检测信号。大多数情况下，这需要给寡核苷酸探针加一个或多个标记。如果是非放射性标记，即使是高亲和性反应剂也被发现不适于用寡核苷酸探针检测基因组DNA中的单基因拷贝。参见，Wallace等，Biochimie 67755(1985)。如果是放射性寡核苷酸探针，只有极高的比放射性(specific activities)才被发现能够产生令人满意的结果。参见，Studencki&Wallace，DNA 31(1984)和Studencki等，Human Genetics 3742(1985)。
本文参考的K．B．Mullis等的美国专利4，683，195和4，683，202提供了不通过克隆或纯化，提高任何DNA混合物中靶序列片段浓度的方法。该扩增靶序列的方法(可以与本发明联用来制造靶分子)包括在包含所需靶序列的DNA混合物中引入大大过量的两段寡核苷酸引物，然后在DNA聚合酶存在下按序进行准确的热循环。两段引物分别与双链靶序列中的相应链互补。为了引发扩增，将混合物变性，然后两引物与靶分子内各自的互补链退火结合。退火结合后，引物经聚合酶延长形成一对新的互补链。变性、引物退火和引物延长这些步骤可以重复多次(即，变性、退火和延长构成一轮“循环”，可以有多轮“循环”)以获取高浓度的扩增所需靶序列片段。扩增的所需靶序列片段的长度取决于引物彼此间的相对位置，所以，该长度是一个可调参数。由于该过程是重复的，所以被发明者称为“聚合酶链反应”(后文称“PCR”)。由于所需的扩增后的靶序列片段变成了混合物中的主要序列(就浓度而言)，它们被说成是经“PCR扩增的”。
利用PCR，可以放大基因组DNA内特定靶序列单拷贝的水平，使得它能够被多种方法(例如，与标记过的探针杂交；先引入生物素化的引物然后进行亲和素-酶偶联检测；在扩增片段内引入32p标记的三磷酸脱氧核苷酸例如dCTP或dATP)测得。除基因组DNA之外，任何寡核苷酸序列都能够用合适的一组引物分子来扩增。特别是，经PCR产生的扩增片段本身又是其后PCR扩增反应的有效模板。
已知，PCR扩增会达到特定靶序列的平台浓度，约10-8M。典型反应体积是100μl，相当于双链分子产物的得率6×1011。
至于互补性，杂交反映的是完全互补还是部分互补对于某些诊断用途来说是十分重要的。例如，如果只需要测出有没有病原体的DNA或RNA(例如来自病毒、细菌、真菌、支原体属、原虫)，重要的只是杂交方法确保当有相关序列存在时能够发生杂交反应；选择的条件可以是使得部分互补探针和完全互补探针都发生杂交。但是，其它诊断可能要求杂交方法区分部分互补和完全互补。这对于测定基因多态性是有意义的。例如，人血红蛋白的一部分是由4条多肽链构成的。其中两链是全同的141氨基酸链(α链)，另外两链是全同的146氨基酸链(β链)。已知，编码β链的基因具有多态性。正常等位基因编码在第6位为谷氨酸的β链。突变等位基因编码的β链在第6位为缬氨酸。氨基酸的差异具有深刻的生理影响，就是临床上已知的细胞性贫血。已知，氨基酸改变的基因基础是正常等位基因DNA序列和突变等位基因DNA序列间的单碱基差异。
除非与其它技术结合(例如限制性酶分析)，允许部分互补序列与完全互补序列发生相同水平杂交的方法一般对于这类用途是不适合的；探针会同时与正常和变异的靶序列都发生杂交。不论所采用的方法，杂交都要求在待测序列(靶序列)和用来进行测试的DNA片段(探针)之间具有一定的互补性。(当然，没有任何互补性也可能发生结合，但是这种结合是非特异性的，应该注意避免。)一段核酸序列的互补序列是指这样的寡核苷酸，当它与核酸序列对齐，使得序列之一的5’末端正对另一序列的3’末端时，寡核苷酸与核酸序列成“反平行结合”。本发明的核酸可能包含某些非天然存在的碱基，例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤，不必完全互补；稳定的双链可能包含错配或不匹配的碱基。根据以下变量，核酸技术领域的熟练技术人员可以凭经验判断双链的稳定性，例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对几率。
核酸双链的稳定性是用熔点温度或“Tm”来测定的。具体核酸双链在特定条件下的Tm是平均半数碱基对发生解离的温度。计算核酸Tm的公式是本领域众所周知的。如参考文献所显示的，估计Tm值可由以下公式计算Tm-81．5℃+16．6logM+0．41(％GC)-0．61(％甲酰胺)-500／L其中，M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中所形成的甲酰胺的百分比，L=以碱基对为单位的杂交链长度(参见，分子克隆技术指导，S．L．Berger&A．R．Kimmel编辑，Methods in Enzymology，第152卷，401(1987))。其它参考文献包括更完善的计算方法，它们在计算Tm时将结构和序列特征都考虑在内。
“探针”指标记过的寡核苷酸，因为其中至少一段序列与另一核酸内的一段序列互补，因而与另一核酸内的一段序列形成双链结构。
“标记”指任何能够提供可测(最好是可定量的)信号，并且能够与核酸或蛋白质结合的原子或分子。标记提供的可测信号包括荧光、放射性、颜色、比重、X光衍射或吸收、磁性、酶活性等。这样的标记可以加到本发明的寡核苷酸上。
“核酸底物”和“核酸模板”在此可互换使用，都指包含单链或双链DNA或RNA的核酸分子。
当称核酸底物为“基本上是单链的”时，表示底物分子主要以单链核酸形式存在，而不是双链核酸即由链间碱基配对作用结合在一起的两条链。
“序列变异”指两个核酸模板之间的核酸序列差异。例如，野生型结构基因与突变体可能因单个碱基置换和／或一个或多个核苷酸的缺失或插入而存在序列差异。结构基因的这两种形式被说成在序列上彼此不同。还可能存在第二种结构基因的突变体。这第二种突变形式被说成在序列形式上与野生型基因及其第一突变体都不同。必需指出的是，虽然本发明不要求进行某基因一种或多种形式之间的比较以确定序列的改变，但是利用本发明的寡聚／固相支持基质并利用美国专利申请08／231，440(本文纳为参考)所述的特定的杂交条件，这样的比较是可以进行的。
“与基因序列匹配或互补的寡核苷酸引物”指能够促进单链或双链核酸的模板依赖性合成的寡核苷酸引物。与基因序列匹配或互补的寡核苷酸引物可以用于PCR、逆转录-PCR(RT-PCR)等。
“共有基因序列”是通过比较两段或两段以上基因序列得出的基因序列，它描述在给定基因片段中最常出现的核苷酸；共有序列是规范序列。
在本文中，“蛋白”和“蛋白酶”都指金属蛋白酶。“金属蛋白酶”指天然的金属依赖性蛋白酶、保留了其功能的片段、突变体或同系物。本发明包含来自不同物种的金属蛋白酶(或“降解蛋白)，以及用重组法、体外方法或标准肽合成法制备的金属蛋白酶。较好的是，该蛋白为人降解蛋白或其突变体。为了定义蛋白的突变体，优选的“天然”蛋白上如本文参考引用的Gen Bank#Z48579部分所描述，可参见后文的序列。同源降解蛋白包括如本领域所知至少具有90％同源性的完整蛋白或其片段。人们已经认识到，可能发生某些种间变异，其中包括可能改变也可能不改变功能的插入或缺失。例如，根据肽序列与某蛋白具有95％同源性的大鼠蛋白，和前300碱基对具有97-98％同源性的牛蛋白都被认为是同系物。参见，1994年2月15日Gen Bank#Z48444公开了一个大鼠基因的2407碱基，该基因被认为是大鼠降解蛋白金属蛋白酶基因；1994年10月25日的Gen Bank#Z21961公开了一个基因部分序列的2387碱基，该基因被认为是牛的锌金属蛋白酶。较好的是，该金属蛋白酶是下文所述的人降解蛋白。
“抗体”是指降解蛋白或其片段的抗体。它们可以是单克隆的，或者是多克隆的，而且可具有多种来源。本发明也考虑利用蛋白质或肽领域任何一种方法制得的所述抗体的片段。
“疾病的检测”即检测一种疾病或疾病状态。疾病状态是疾病的生理或细胞或生物化学表征。较好的是，所述的检测是利用ELISA等已知技术对机体组织或动物或细胞培养物的液体进行的。本发明还考虑在全身进行疾病的“定位(mapping)”，例如全身性给予经标记的上述抗体，不论什么检测方法都可以，所述检测方法较好的包括荧光、X射线(包括CAT扫描)、NMR(包括MRI)等。
“化合物的筛选”指该方法与筛选是关于寻找化合物、测定其与蛋白酶的亲和性、或者根据筛选结果设计和选择化合物。在另一种实施方案中，本发明考虑按照本领域所知的，利用三维结构设计药物，称为“推理性药物设计”更好。较好的是，蛋白酶是“基本纯形式”的，即蛋白质基本上不含其它杂质，使得它能够被用于实验或特征描述。使用所述的筛选方法有助于技术人员寻找结合并且最好抑制蛋白酶的新的合成或者天然的化学结构。这些“抑制物”可能在调节蛋白酶的活性中起作用，而且可能因此被用于调节有它们参与的一连串生物学连续活动。该方法提供了新的药学上有用的化合物。
“降解蛋白”指一种降解蛋白、或保留其功能的片段、突变体同系物。它包括参与或调节组织重塑的聚集蛋白聚糖酶(aggracanase)以及其它蛋白酶。它涉及来自不同物种的降解蛋白，以及由重组法、体外方法或标准肽合成法制备的降解蛋白。所述蛋白最好是人降解蛋白或其突变体。为了定义所述蛋白的突变体，较好的“天然”蛋白是GenBank Z48579号所部份描述的，所述内容在此作为参考并为后文序列所涉及。SEQ ID NO1描述了所述DNA序列的片段及其转录产物，SEQ ID NO2描述由该基因编码的蛋白质。同源降解蛋白包括，如本领域公知的，具有至少90％同源性的完整蛋白或其片段。例如，根据由包含SEQ ID NO1的DNA或cDNA序列得出的氨基酸序列，与SEQ ID NO2具有95％同源性的大鼠蛋白，以及具有97％至98％同源性的牛蛋白(以相同的方法得出)都被认为是同源蛋白。所以，由其它生物克隆得到的同源cDNA可以产生同源蛋白。
单单根据氨基酸序列，同样地蛋白质也可被认为是同源的。氨基酸测序实践中的限制可能会使人通过例如比较蛋白的前50个氨基酸而认为某蛋白与另一蛋白是同源的。由此，90％的同源性就允许同源蛋白前50个氨基酸链中有5个氨基酸的差异。
熟练技术人员能够理解的是，遗传密码的简并性可用于改变DNA序列来提供对等性转录产物，以及由此产生相同蛋白。有时，制备编码相同蛋白但是不同于天然DNA的DNA序列的优点包括---方便了测序与合成；---提高蛋白质的表达；---某些异源宿主对某些密码子较之其它密码子具有偏爱。
以上实践中的考虑是众所周知的，并由此提供了对本发明使用者来说有利的实施方案。所以，可以清楚的认识到，天然DNA并不是本发明考虑的唯一实施方案。
此外，对熟练技术人员来说显而易见的是，可以在筛选、药物设计等中使用蛋白的片段，而对于使用本发明的目的而言，可能不要求完整的蛋白。所以，可以清楚的认识到，对于蛋白质及其用途的揭示包括其有用的肽片段。
熟练技术人员在选择是否使用片段以及使用何片段时，将对蛋白的表达、纯化得率、稳定性、溶解度等实施中的问题予以考虑。结果，使用本领域的常规方法，由于本发明的公开内容，技术人员使用蛋白片段同样可以实施本发明。
所以，本发明特别考虑了使用基因的不完整核酸序列和蛋白质的不完整氨基酸序列。可以在筛选、药物设计等中使用蛋白质的片段，就本发明目的而言可能不必需使用完整蛋白。蛋白质本身可以用来测定小分子与蛋白质的结合亲和性。本领域有使用酶靶进行的药物筛选，它可以利用自动化、高产率技术来进行。
蛋白或蛋白酶本身可以用于测定小分子与所述蛋白的结合亲和性。本领域有使用酶靶进行的药物筛选，它可以利用自动化、高产率技术来进行。
对降解蛋白活性的抑制作用可能被用于预见骨关节炎以及其它涉及关节软骨和其它组织退化的疾病的治疗效果，所述的退化包括基质降解，例如组织重塑等。基因疗法不管理论上如何说，金属蛋白酶被认为在骨关节炎病程中在组织中是受正调节的。我们惊奇地发现，在骨关节炎中，人降解蛋白在人软骨细胞中是受正调节的。抑制信号传导机制能够有效中断骨关节炎以及其它涉及软骨退化的疾病中的一连串连锁反应。技术人员能够理解的是，如果正调节是引发关节炎的原因之一，那么干扰该基因的活性在治疗骨关节炎中将是有效的。
这可以通过许多方法中的任一方法而达到，其中包括基因(即反义)疗法。蛋白酶的纯化包含重组降解蛋白或该蛋白全长的片段的来自哺乳动物、酵母、昆虫或真核细胞的培养基、细胞提取物或包涵体被用来纯化降解蛋白或降解蛋白片段。可以在连续层析树脂纯化前或在最后的分离之后重新加入包含变性降解蛋白的溶液。根据要求，在一种或多种组合物除垢剂、变性剂或有机溶剂(例如辛基葡糖苷、脲或二甲基砜)存在下，制备培养基、细胞提取物或溶解的降解蛋白。单独或联合使用离子交换和疏水作用层析来将重组降解蛋白与细胞物种杂质相分离。将这些物质上样在层析柱上，通过调节pH、改变离子强度、加入变性剂和／或使用有机溶剂来洗脱降解蛋白。然后通常将含有降解蛋白的溶液通过一根抗体亲和性层析柱或配体亲和性层析柱来进行降解蛋白的位点特异性纯化。免疫亲和性层析柱含有降解蛋白的特异性抗体，它们被固定在固相载体上，例如Sepharose4B(Pharmacia)或其它类似材料。较好的是，通过洗柱来去除非结合蛋白，利用低pH甘氨酸缓冲液或高离子强度来洗脱降解蛋白。配体亲和性层析柱可能具有对降解蛋白活性位点的特异性，或对活性位点附件的一部分的特异性或将其从该位点上去除。洗柱，通过在洗脱缓冲液中添加竞争分子来洗脱降解蛋白。较好的是，在纯化的全过程中都存在着包含一种或多种蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂混合物，这类抑制剂例如苯甲脒、亮抑蛋白酶肽、膦酰二肽、苯基甲基磺酰氟和1，10-菲咯啉。可以加入例如辛基硫代葡糖苷和Triton X-100的各种除垢剂，或例如甘油的化学试剂来提高降解蛋白的溶解度和稳定性。根据需要，最后通过层析载体上的凝胶过滤来纯化蛋白。降解蛋白的抑制物本发明的蛋白酶可以被用于寻找该蛋白酶的抑制物。因此，它可以被用作筛选工具或用于推理性药物设计。不管理论上如何说，蛋白酶可以调节细胞重塑，而且实际上可能加强细胞胞外基质(matrix)重塑，并由此促进组织的降解。因此，抑制降解蛋白提供了一种治疗以上述过程为特征的疾病的治疗途径。
在筛选中，药物化合物可以用于对抑制作用的定性和定量。结果，所述的筛选方法为选择可有效治疗所述疾病的活性成分-尤其是小分子活性成份-提供了信息。
在治疗中，通过小分子、合成金属蛋白酶抑制物(例如被用于抑制基质金属蛋白酶的那些)对降解蛋白金属蛋白酶活性的抑制作用可以被用于抑制胞外基质的重塑。蛋白的抗体通过将金属蛋白酶抑制物与抗体或其片段偶联可以寻找金属蛋白酶。偶联的方法是本领域公知的。由此，这类抗体可以用于治疗，和监测抑制剂的量。
本发明的抗体还可以与固相载体偶联。这样的偶联物可以被用作亲和性反应试剂用于纯化所需的金属蛋白酶，尤其是降解蛋白。
此外，可将本发明抗体与标记直接偶联。当抗体与金属蛋白酶结合时，可利用标记在体内或体外细胞培养物中检测是否存在较高水平的金属蛋白酶。
例如，可以使用能与预期的靶组织的标记起特异性反应的寻靶配体。将本发明的化合物与寻靶配体偶联的方法是公知的，而且与后文所述与载体的偶联方法类似。偶联物的配制与使用参见前文所述。抗体的制备与用途抗体可由多种方法制得，例如，可将蛋白输注给合适的受试者(例如哺乳动物)，包括小鼠、家兔等。较好的方案包括按照一定的程序，重复输注含于佐剂中的免疫原，由此增强血清中抗体的产生。利用免疫分析方法可以方便地测得免疫血清的效价，所述的方法现已成为本领域的标准方法。
可以直接使用由此获得的抗血清，或者可以制备单克隆抗体，即通过收集外周血淋巴细胞或被免疫动物的脾脏，保持产生抗体细胞的活力，然后用标准免疫分析技术鉴定出合适的抗体生产者。
多克隆或单克隆制剂可用于监测使用了本发明化合物的治疗或预防方案。在疗程中的不同时刻，利用使用了本发明抗体制剂的标准免疫分析技术测试例如由血液、血清、尿液或唾液得到的合适样品，测试其中是否存在所述蛋白。
所述抗体还可以利用标准偶联技术与以锝99或Ⅰ-131为例的闪烁扫描标记等标记偶联。给受试者使用标记过的化合物，检测体内过量存在的一种或多种金属蛋白酶的部位。因此，经标记的蛋白的抗体可以作为所述加强表达的筛选工具，指示疾病的存在。
所以，抗体选择性结合金属蛋白酶的能力被用来做出酶的原位分布图。该技术还可以用在组织学方法中，标记过的抗体可以用在竞争性免疫分析法中。
抗体最好利用已知方法与其它化合物或物质相偶联。例如，具有羧基官能团的物质，可以将其羧基残基还原成醛，并通过与侧链氨基的反应与载体偶联，可以接着还原形成的亚氨键。羧基残基还可以利用例如二环己基碳化二亚胺或其它碳化二亚胺脱水剂等缩合剂与侧链氨基反应。也可以使用接头化合物来引发偶联反应；同源双官能和异源双官能接头化合物都可以向Pierce Chemical Company，Rockford，I11购买。
以上抗体与合适的色谱法材料偶联时可以用于分离蛋白。利用亲和性色谱的分离方法是本领域公知的，也是技术人员所知道的。疾病标记如上所述，本发明可在包括患病组织在内的样品中监测金属蛋白酶基因的表达。本发明并不受核酸(DNA或RNA)来源的特性的限制；本发明考虑了多种来源，其中包括但不限于哺乳动物性来源(例如癌组织、淋巴细胞等)。
不管理论如何说，基因表达-尤其是可能具有局限性组织分布及表达-受潜在骨关节炎介导物的正调控。例如，所述基因(并由此涉及其蛋白)在关节软骨细胞内的加强表达提供了监测包括最初期、无症状期和进展期在内的骨关节炎病程发展的标记。所以，因所述蛋白而产生的抗体将起到所述加强表达的检测工具的作用，由此指示疾病的存在。
此外，用于检测疾病时，可将抗体与含生色团或荧光团的物质偶联，或者可以与在特定情况下生成生色团或荧光团的酶偶联。所述的偶联方法和偶联物质是本领域公知的。以此方式使用时，对技术人员来说利用免疫分析来检测蛋白是易懂易做的。例如，可以以此方式检测体液(血清、尿液、滑液)，用于标定和检测金属蛋白酶的分布或所述蛋白酶水平的升高。
本发明以此方式使用时，是一种有用的例如骨关节炎或其它关节软骨退化疾病之类金属蛋白酶介导的疾病的诊断和／或临床标记。疾病一旦被检测出来，就可以在症状或失能虚弱开始前加以治疗。
而且，这样的抗体还可以寻找靶患病组织，以用于前文所述的检测或治疗由核酸衍生的工具细胞内的核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA包含着细胞的遗传蓝图。RAN作为中间体参与基于DNA序列的蛋白质的生产。细胞内的RNA有三种形式结构RNA(即核糖体RNA，“rRNA”)，参与翻译的转运RNA(“tRNA”)和信使RNA(“mRNA”)。因为mRNA是DNA内编码的遗传信息与相应蛋白质之间的中介者，在任何时候，细胞内的mRNA组分总代表着细胞的生理状态。为了研究和利用细胞的分子生物学，能够纯化mRNA，包括从样品的总核酸中纯化mRNA是十分重要的。
RNA的制备因为存在降解RNA核糖核酸酶而变得复杂(例如，T．Maniatis等，分子克隆，PP．188-190，Cold Spring Harbor Laboratory(1982))。而且，制备可扩增RNA因为存在着与RNA结合的核糖体蛋白而变得困难。(参见，R．J．Slater分子生物学技术，J．M．Walter&W．Gaastra编辑，Macmillan，NY，pp．113-120(1983))。
通常，从细胞中纯化核酸的步骤包括1)细胞裂解；2)灭活细胞的核酸酶；和3)将所需的核酸与细胞碎片及其它核酸分离。细胞裂解可以通过多种方法进行，包括酶、除垢剂或离液剂处理。灭活细胞核酸酶可以用蛋白酶和／或用强盐进行。最后，分离所需的核酸通常通过用苯酚或苯酚-氯仿萃取核酸来进行；该方法将样品分配到液相(含有核酸)和有机相(含有包括蛋白质在内的其它细胞成份)中。常用的方法要求与盐一起使用苯酚(P．Chomczynski&N．Sacchi，Anal．Biochem．162156(1987))或通过离心来去除蛋白质(R．J．Slater，同上)。
一旦从细胞中分离出核酸后，就可以用mRNA分子的结构来帮助从DNA和其它RNA分子中纯化mRNA。因为高等生物的mRNA在其3’末端一般是聚腺苷酸化的(“聚A尾”或“聚A段”)，从细胞分离RNA的方法之一是基于聚A尾与连接在纤维素之类载体上的互补序列(即寡聚dT)的结合。通常，通过离心将杂交的mRNA／寡聚dT与样品中的其它组份分离，或者在磁性方法中则通过接受磁场作用来分离。将杂交的mRNA／寡聚dT与样品中的其它组份分离后，一般立即将mRNA从寡聚dT上分开。但是，对某些用途来说，mRNA可以仍然与连接在固相载体上的寡聚dT结合着。
已经开发出了许多连接了寡聚dT的固相载体，而且可以购买到。对于大多数寡聚dT系统来说，纤维素仍然是最常用的载体，但是已经开发出并可以购买到寡聚dT与胶乳微珠和顺磁颗粒共价连接的系统。可在生物素-亲和素系统中使用顺磁颗粒，该系统中，生物素化的寡聚dT在溶液中与mRNA退火结合。然后用涂了链霉亲和素的顺磁颗粒捕捉杂交体，利用磁场来分离。除上述方法之外，还有许多改进方法，例如在离心柱层析中利用亲和性从真核生物的总RNA中纯化出聚腺苷酸化的RNA。这些方法都发生聚A mRNA的杂交，但是效率和灵敏度各不相同。
实施方案之一中，mRNA经逆转录酶处理生成cDNA。使用下文的引物，该cDNA可以用在引物延伸反应和PCR中。所以，本发明包括通过使用下文引物用引物延伸反应测定的核酸分子。引物延伸反应(PCR)可以在这样的条件下(又称“高严谨条件”)进行，即只有互补的核酸发生杂交(与部分互补的核酸的杂交相反)。这样的条件包括在或者接近双链熔点温度进行退火。针对特定降解蛋白金属蛋白酶基因的引物本发明提供了新的降解蛋白金属蛋白酶基因中一段新的全长蛋白编码区序列，该序列可用于鉴定降解蛋白金属蛋白酶基因的表达。实施方案之一中，用针对该序列段部分的引物来检测该基因序列是否存在。这类引物还可以用来鉴定代表全基因的cDNA克隆，允许编码降解蛋白金属蛋白酶或其片段(或突变体)的核酸序列在宿主细胞内重组表达。
较好的引物是SEQ ID NO9(5’-AGCCTGTGTC-3’)和SEQ ID NO10(5’-AGCCTGTGTCTGAACCACT-3’)。但是，根据SEQ ID NO5和SEQ ID NO1给出的序列可方便地设计出其它引物。通过差异展示来比较生物样品的方法可以通过鉴定反应产物的特征来确认扩增反应的成功。本发明并不局限于诉述的检测延伸产物或PCR产物的方法。实施方案之一中，通过使用2％琼脂糖凝胶(BRL)的高分辨率琼脂糖凝胶电泳来分析PCR产物，通过溴乙锭染色和UV照射发光来观察扩增的DNA片段。在实施方案之一中，本发明利用电泳来确认产物的形成并比较样品间的结果差异。
所以，本发明包括在核酸混合物中鉴定新的降解蛋白金属蛋白酶基因序列(例如cDNA或RT-mRNA)。通过核酸混合物的PCR，然后将产物走凝胶电泳，由此“分离”出包含引物所定义的序列的核酸。然后可以通过从凝胶上切取该条带来“纯化”产物(或者通过例如电洗脱等其它合适的方法)。序列表概述为了帮助读者理解，序列表中的相互关系如下所述SEQ ID NO1是一段DNA片段，是SEQ ID NO3的一部分。SEQ ID NO1的第一个碱基(胞嘧啶或C)是SEQ ID NO3的第940个碱基。两DNA序列在其交迭部分是完全相同的。
SEQ ID NO2和SEQ ID NO4分别是SEQ ID NO1和SEQ ID NO3核酸序列所表达的氨基酸序列。SEQ ID NO2的第一个氨基酸Gln是SEQ ID NO4中第309个氨基酸。两序列直至蛋白质的羧基末端是同源的。
SEQ ID NO7是差异展示实验产生的DNA中的有意义链。SEQ ID NO7中第一个碱基对应于SEQ ID NO1中第1371位碱基和SEQ ID NO3中第2310位碱基。这些序列在452个碱基内是同源的，直至SEQ ID NO1的碱基1822和SEQ IDNO3的碱基2761。SEQ ID NO1和SEQ ID NO3最末两个碱基的差异可能是因为测序误差或PCR中常见的重复误差，或者可能是某克隆载体的一部分。在同源部分之后，SEQ ID NO7还多284个碱基，所以远远超过SEQ ID NO1和SEQ IDNO3的末端。
此外，SEQ ID NO7中的碱基477至碱基716是SEQ ID NO6。SEQ IDNO6是SEQ ID NO5的有意义链，SEQ ID NO5是通过差异展示克隆发现的反义链。所以，SEQ ID NO6展示了DNA的取向，和在mRNA中所出现的一样。这两段序列被发现靠近该基因的3’末端。
虽然SEQ ID NO7中碱基452至3’末端与SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的不同，SEQ ID NO7仍是有效的。必需指出的是，表达出的肽序列不受上述差异的影响。似乎，这些碱基不存在于SEQ ID NO1和SEQ ID NO3是因为使用了不同的聚腺苷酸化信号。
SEQ ID NO8是一段新的全长DNA序列。SEQ ID NO9是SEQ ID NO8表达的新蛋白。SEQ ID NO9与SEQ ID NO4的差别在于，SEQ ID NO4中氨基酸162(Ser)-213(Tyr)被SEQ ID NO9中第162位的一个氨基酸Asn所替代。这一改变使得DNA从碱基501至654总共缺失153个碱基，破坏了读码框的完整性，但是与SEQ ID NO4相比只改变了一个残基和缺失了51个氨基酸。
SEQ ID NO10和SEQ ID NO11是PCR所用的反义引物，是SEQ ID NO7的3’末端的负链，根据本文中提到的序列，熟练技术人员能够识别引物的其它序列。
实施例以下非限制性实施例说明了本发明较好的实施方案，简要说明了本发明的用途。这些实施例可作为对本领域技术人员的引导，但完全不是对本发明的限定。借助于本文的公开内容和实施例，本领域技术人员能够制造和使用本发明。
这些实施例使用的是标准起始物。这些物质中许多是已知和可购买的。例如，大肠杆菌CJ236和JM101是已知菌株，pUB110是已知质粒，而Kunkel诱变法也是本领域的公知技术。此外，某些细胞系和cDNA是可以购买的，例如，可向Clontech Inc．Palo Alto，California购买U937。
多种变异体可以由多种表达系统和在多种宿主内用多种方法制得，这些方法属于分子生物学、生物化学或其它生物技术相关领域技术人员已知范围内。实施例1从不受刺激和受白介素-1刺激的正常人关节软骨细胞培类物中分离出RNA。将RNA逆转录成cDNA。利用一系列随机引物对cDNA进行经修改的差异展示。
用刺激和非刺激软骨细胞产生的PCR样品在聚丙烯酰胺凝胶上相邻的泳道内进行电泳。从凝胶中切取差异表达的条带，进行克隆和测序。RNA酶保护和核连缀转录实验证实基因被差异表达。实施例2利用已知方法，由以白介素-1刺激的人关节(股骨端头)软骨细胞原代培养物克隆得到新的编码所述蛋白的部分人cDNA。
在其中发现了相同的序列，通过筛选人cDNA文库得到全长克隆来补全基因。实施例3利用已知方法将实施例2中的克隆DNA加入pUB110中。
上述质粒被用来转化大肠杆菌，并用于定点诱变以产生新的突变体的模板进行Kunkel诱变法将Gln1改变为Ala。实施例4用IODOBEADS(Pierce，Rockford，IL；将氯胺T固定在无孔聚苯乙烯微珠上)制备[125I]降解蛋白抗体。低温干燥的抗体(2微克)被吸收到50微升10毫摩尔浓度的乙酸中，并加到冰上的450微升磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)(Sigma，St．Louis，MO)中。在试管中加入5微升500微居里的125I(Amersham，Arlington Heights，IL)(2200居里／毫摩尔)，和一粒IODOBEAD。在冰上孵育反应10分钟，间或地加以震荡搅拌。然后通过将反应系与IODOBEAD分离来终止反应。为了去除未反应的125I，混合物被上样在PD-10凝胶过滤柱上。实施例5将发荧光的降解蛋白金属蛋白酶底物肽(Bachem，Guelph Mills，King ofPrussia，Pa)与降解蛋白混合，在2分钟时测评荧光改变，以此作为对照。然后在另一次测评中，在化合物存在下将荧光发生肽与降解蛋白混合，从2至12小时在不同时间点进行测评。利用标准方法测评数据，以提供被测化合物的相对结合。实施例6抽取患者左膝盖的滑液0．5毫升，利用ELISA测试降解蛋白水平的升高。结果显示降解蛋白水平高于正常。患者得到的处方是在一段时间内口服预防剂量的降解蛋白抑制物，或在离开诊所之前在左膝盖进行同样药物的注射。实施例7通过对降解蛋白金属蛋白酶活性的抑制作用来检测对胞外基质重塑的抑制作用。利用小分子合成金属蛋白酶抑制物，例如用于抑制基质金属蛋白酶的那些，监测组织的完整性和蛋白聚糖。
一份IL-1刺激的牛鼻关节软骨样品培养在含1微摩尔小分子降解蛋白抑制物的溶液中。将该实验与作为对照的生长在无抑制物溶液中的相同培养物比较。
7天后对培养物的测试显示，受抑制的培养物中组织降解较少，而且培养物血清中的蛋白聚糖也较少。该结果与聚集蛋白聚糖醚活性被抑制相一致。对聚集蛋白聚糖酶的抑制会抑制组织降解并减少蛋白聚糖的释放。实施例8抑制酶解加工造成与细胞膜结合的降解蛋白金属蛋白酶结构域的释放，这就抑制了膜结合降解蛋白分子“第二信使”的信号发送。所述的第二信使的信号发送会造成细胞表型的改变、基因表达的改变、有丝分裂活性的改变等。
用丝氨酸蛋白酶处理已知含有降解蛋白的细胞。用标准方法测定从细胞中释放的蛋白。具体地说，利用文献方法监测金属蛋白酶的活性。将释放的金属蛋白酶的量与处理细胞所用丝氨酸蛋白酶的量相关联。
在降解蛋白金属蛋白酶被切割和释放后，利用磷酸酪氨酸的特异性单克隆抗体通过对胞内蛋白的Western印记分析测得src酪氨酸激酶活性相对于对照组的升高。对照是没有用丝氨酸蛋白酶处理过的细胞。
用文献上技术测定细胞内(或是其细胞培养物)的src酪氨酸激酶活性。还用文献上技术监测降解蛋白上金属蛋白酶结构域的释放。在金属蛋白酶结构域的释放和胞内src酪氨酸激酶活性之问存在着正比关系。该结果与src酪氨酸激酶连锁作用刺激了降解蛋白介导的细胞信号发送是一致的。实施例9用包含序列RGD的肽测定整合素的结合。对胞间吸附分子或胞外基质组份的抑制造成了对与这类相互作用有关的细胞表型改变的抑制，所述的改变包括细胞形状的改变。
该结果与对降解蛋白相互作用的竞争或阻断是一致的。RGD肽在软骨细胞内抑制细胞改变。以基质合成增加和基质金属蛋白酶活性增强为特征的骨关节炎表型没有出现。可以利用其它便于测得的细胞改变来检验这一结果，其中包括基因的表达、有丝分裂活性改变等。实施例10按照实施例7的方法，用小分子金属蛋白酶抑制物去处理组织培养物。用文献方法测定TNF-α从细胞膜上的释放。实施例7中的抑制物也减少TNF-α从细胞膜上的释放。
由此认为，对降解蛋白金属蛋白酶活性的抑制将造成对降解蛋白相关性炎症连锁反应和对分泌酶活性的抑制。据信，监测细胞因子或IL-1从细胞膜上的释放等将得出相同的结果。实施例11利用差异展示筛选疾病从不受刺激和受IL-1刺激的正常人关节软骨细胞培养物中分离RNA。将RNA逆转录成cDNA。用前文引物来扩增(PCR)这些cDNA。受刺激和不受刺激的软骨细胞产生的PCR产物在聚丙烯酰胺凝胶上的相邻泳道进行电泳。从凝胶上切取差异表达的条带(即，只在受刺激细胞内表达，而在不受刺激的细胞内表达不明显或表达水平无法测得的条带)，克隆，并进行部分测序。SEQ ID NO5显示了部分序列，该序列表现出与大鼠金属蛋白酶(见上文)约60％的同源性。该序列表现出与人金属蛋白酶(见GenBank#Z48579，见图2)约85％的同源性。实施例12检测癌症的转移可能性检测癌组织内金属蛋白酶基因的表达。从样品中提取核酸，用前文引物进行PCR。高水平的转录产物表示有转移可能性。实施例13筛选作为表达抑制剂的药物在体外筛选金属蛋白酶基因表达的候选抑制剂。用白介素-1刺激正常人关节软骨细胞培养物，在体外令其与候选抑制剂接触。分离出RNA，逆转录成cDNA。用前文引物扩增(PCR)这些cDNA。接触了抑制剂的软骨细胞和不受抑制的软骨细胞产生的PCR样品在聚丙烯酰胺凝胶上的相邻泳道进行电泳。根据PCR产物的减少来鉴定抑制剂。实施例14筛选作为金属蛋白酶抑制剂的药物体外筛选金属蛋白酶自身的候选抑制剂。用白介素-1刺激正常人关节软骨细胞培养物，在有和没有候选抑制剂存在下，取培养物上清液在合适的金属蛋白酶底物(例如基质蛋白)上进行分析。将已知抑制剂作为对照(例如，购自Sigma Co．，St．Louis的1，10-菲咯啉)。根据底物(例如，发荧光的降解蛋白金属蛋白酶底物)降解水平的降低来鉴定抑制剂。实施例15利用标准技术筛选U-937，一个单核细胞样细胞cDNA系文库，分离出一个1400bp的克隆。最初的序列是一个截短的克隆，缺失了5’末端的一部分。通过已知的5’R．A．C．E．(5 cDNA末端快速扩增，参见PCR方法，方法和应用入门，Innis等编辑，1990 Academic Press)生成5’末端，产生一个包含其余5’序列的1600bp的克隆。这两段序列共同提供产生肽序列的SEQ ID NO8。实施例16引物SEQ ID NO9(5’-AGCCTGTGTC-3’)和SEQ ID NO10(5’-AGCCTGTGTCTGAACCACT-3’)被用于差异展示mRNA(ddrd-PCR)。在PCR中使用2-5ng sscDNA。反应系先在0．2μl薄壁试管内冰上预冷。每管含有50mMTrisHCl(pH8．5)，50mM KCl，1．5mM MgCl2，1mM各种dNTP，2-5ng sscDNA，10pmoles各种前文引物，05．μlα-P33dCTP(10μCi／μl，Amersham)，并加水定容为20μl。使用Perkin-Elmer 2400系统热循环仪(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)对混合物进行35轮变性(94℃ 30秒)、退火(36℃ 30秒)和延伸(72℃ 1分钟)。
利用以上方法，经IL-1处理的软骨细胞表达了与该基因相关的mRNA，而未处理(无IL-1)的对照软骨细胞则没有表达可测水平的mRNA。实施例17高能量可改进成高产率筛选的测试系统在动态酶抑制测试中，用荧光底物测定降解蛋白的蛋白酶活性。使用的是克隆降解蛋白酶和荧光标记的小分子蛋白底物。测定室温下底物分子经切割后的荧光度，由此定量酶活性。该测试十分简单，而且易于实现自动化。
利用标准技术，该测试可适应96孔或384孔测试板。
本文参考了文中提及的全部参考文献。
虽然以上已描述了本发明的具体实施方案，但是本领域技术人员显而易见的是，在本发明的精神和范围内可以进行许多改变和修改。后文的权利要求书旨在涵盖所有这些本发明范围内的修改。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人Tindal，Michael HHaqqi．Tariq M(ⅱ)发明名称新的降解蛋白金属蛋白酶、其突变体、片段等的用途(ⅲ)序列数量11(ⅳ)通讯地址(A)收件人The Protect&Gamble Company(B)街道8700 Mason-Montgomery Road(C)城市Mason(D)州OH(E)国家美国(F)邮政编码45040-9462(ⅴ)计算机可读形式(A)媒质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS／MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1．0，#1．30版(ⅵ)当前申请信息(A)申请号(B)申请日(C)分类(ⅷ)律师／代理人信息(A)姓名Hake，Richard A
(B)注册编号(C)参考／卷宗编号(ⅸ)电讯信息(A)电话513／622-0087(B)传真513／622-0270(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1824碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)特征(A)名称／代码CDS(B)位置2．．1477(ⅹⅰ)SEQ ID NO1的序列描述CAG ACC ACA GAC TTC TCC GGA ATC CGT AAC ATC AGT TTC ATG GTG 46Gln Thr Thr Asp Phe Ser Gly Ile Arg Asn Ile Ser Phe Met Val1 5 10 15AAA CGC ATA AGA ATC AAT ACA ACT GCT GAT GAG AAG GAC CCT ACA AAT 94Lys Arg Ile Arg Ile Asn Thr Thr Ala Asp Glu Lys Asp Pro Thr Asn20 25 30CCT TTC CGT TTC CCA AAT ATT AGT GTG GAG AAG TTT CTG GAA TTG AAT 142Pro Phe Arg Phe Pro Asn Ile Ser Val Glu Lys Phe Leu Glu Leu Asn35 40 45TCT GAG CAG AAT CAT GAT GAC TAC TGT TTC GCC TAT GTC TTC ACA GAC 190Ser Glu Gln Asn His Asp Asp Tyr Cys Leu Ala Tyr Val Phe Thr Asp50 55 60CGA GAT TTT GAT GAT GGC GTA CTT GGT CTG GCT TGG GTT GGA GCA CCT 238Arg Asp Phe Asp Asp Gly Val Leu Gly Leu Ala Trp Val Gly Ala Pro65 70 75TCA GGA AGC TCT GGA GGA ATA TGT GAA AAA AGT AAA CTC TAT TCA GAT 286Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ile Cys Glu Lys Ser Lys Leu Tyr Ser Asp80 85 90 95GGT AAG AAG AAG TCC TTA AAC ACT GGA ATT ATT ACT GTT CAG AAC TAT 334Gly Lys Lys Lys Ser Leu Ash Thr Gly Ile Ile Thr Val Gln Asn Tyr100 105 110GGG TCT CAT GTA CCT CCC AAA GTC TCT CAC ATT ACT TTT GCT CAC GAA 382Gly Ser His Val Pro Pro Lys Val Ser His Ile Thr Phe Ala His Glu115 120 125GTT GGA CAT AAC TTT GGA TCC CCA CAT GAT TCT GGA ACA GAG TGC ACA 430Val Gly His Asn Phe Gly Ser Pro His Asp Ser Gly Thr Glu Cys Thr130 135 140CCA GGA GAA TCT AAG AAT TTG GGT CAA AAA GAA AAT GGC AAT TAC ATC 478Pro Gly Glu Ser Lys Asn Leu Gly Gln Lys Glu Asn Gly Asn Tyr Ile145 150 155ATG TAT GCA AGA GCA ACA TCT GGG GAC AAA CTT AAC AAC AAT AAA TTC 526Met Tyr Ala Arg Ala Thr Ser Gly Asp Lys Leu Asn Asn Asn Lys Phe160 165 170 175TCA CTC TGT AGT ATT AGA AAT ATA AGC CAA GTT CTT GAG AAG AAG AGA 574Ser Leu Cys Ser Ile Arg Asn Ile Ser Gln Val Leu Glu Lys Lys Arg180 185 190AAC AAC TGT TTT GTT GAA TCT GGC CAA CCT ATT TGT GGA AAT GGA ATG 622Asn Asn Cys Phe Val Glu Ser Gly Gln Pro Ile Cys Gly Asn Gly Met195 200 205GTA GAA CAA GGT GAA GAA TGT GAT TGT GGC TAT AGT GAC CAG TGT AAA670Val Glu Gln Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Tyr Ser Asp Gln Cys Lys210 215 220GAT GAA TGC TGC TTC GAT GCA AAT CAA CCA GAG GGA AGA AAA TGC AAA718Asp Glu Cys Cys Phe Asp Ala Asn Gln Pro Glu Gly Arg Lys Cys Lys225 230 235CTG AAA CCT GGG AAA CAG TGC AGT CCA AGT CAA GGT CCT TGT TGT ACA766Leu Lys Pro Gly Lys Gln Cys Ser Pro Ser Gln Gly Pro Cys Cys Thr240 245 250 255GCA CAG TGT GCA TTC AAG TCA AAG TCT GAG AAG TGT CGG GAT GAT TCA814Ala Gln Cys Ala Phe Lys Ser Lys Ser Glu Lys Cys Arg Asp Asp Ser260 265 270GAC TGT GCA AGG GAA GGA ATA TGT AAT GGC TTC ACA GCT CTC TGC CCA862Asp Cys Ala Arg Glu Gly Ile Cys Asn Gly Phe Thr Ala Leu Cys Pro275 280 285GCA TCT GAC CCT AAA CCA AAC TTC ACA GAC TGT AAT AGG CAT ACA CAA910Ala Ser Asp Pro Lys Pro Asn Phe Thr Asp Cys Asn Arg His Thr Gln290 295 300GTG TGC ATT AAT GGG CAA TGT GCA GGT TCT ATC TGT GAG AAA TAT GGC958Val Cys Ile Asn Gly Gln Cys Ala Gly Ser Ile Cys Glu Lys Tyr Gly305 310 315TTA GAG GAG TGT ACG TGT GCC AGT TCT GAT CGC AAA GAT GAT AAA GAA1006Leu Glu Glu Cys Thr Cys Ala Ser Ser Asp Gly Lys Asp Asp Lys Glu320 325 330 335TTA TGC CAT GTA TGC TGT ATG AAG AAA ATC CAC CCA TCA ACT TGT GCC1054Leu Cys His Val Cys Cys Met Lys Lys Met Asp Pro Ser Thr Cys Ala340 345 350AGT ACA GGG TCT GTG CAG TGG AGT AGG CAC TTC AGT GGT CGA ACC ATC 1102Ser Thr Gly Ser Val Gln Trp Ser Arg His Phe Ser Gly Arg Thr Ile355 360 365ACC CTG CAA CCT GGA TCC CCT TGC AAC GAT TTT AGA GGT TAC TGT GAT 1150Thr Leu Gln Pro Gly Ser Pro Cys Asn Asp Phe Arg Gly Tyr Cys Asp370 375 380GTT TTC ATG CGG TGC AGA TTA GTA GAT GCT GAT GGT CCT CTA GCT AGG 1198Val Phe Met Arg Cys Arg Leu Val Asp Ala Asp Gly Pro Leu Ala Arg385 390 395CTT AAA AAA GCA ATT TTT AGT CCA GAG CTC TAT GAA AAC ATT GCT GAA 1246Leu Lys Lys Ala Ile Phe Ser Pro Glu Leu Tyr Glu ASn Ile Ala Glu400 405 410 415TGG ATT GTG GCT CAT TGG TGG GCA GTA TTA CTT ATG GGA ATT GCT CTG 1294Trp Ile Val Ala His Trp Trp Ala Val Leu Leu Met Gly Ile Ala Leu420 425 430ATC ATG CTA ATG GCT GGA TTT ATT AAG ATA TGC AGT GTT CAT ACT CCA 1342Ile Met Leu Met Ala Gly Phe Ile Lys Ile Cys Ser Val His Thr Pro435 440 445AGT AGT AAT CCA AAG TTG CCT CCT CCT AAA CCA CTT CCA GGC ACT TTA 1390Ser Ser Asn Pro Lys Leu Pro Pro Pro Lys Pro Leu Pro Gly Thr Leu450 455 460AAG AGG AGG AGA CCT CCA CAG CCC ATT CAG CAA CCC CAG CGT CAG CGG 1438Lys Arg Arg Arg Pro Pro Gln Pro Ile Gln Gln Pro Gln Arg Gln Arg465 470 475CCC CGA GAG AGT TAT CAA ATG GGA CAC ATG AGA CGC TAA CTGCAGCTTT1487Pro Arg Glu Ser Tyr Gln Met Gly His Met Arg Arg480 485 490TGCCTTGGTT CTTCCTAGTG CCTACAATGG GAAAATTTCA CTCCAAAGAG AAACCTATTA 1547AGTCATCATC TCCAAACTAA ACCCTCACAA GTAACAGTTG AAGAAAAAAT GGCAAGAGAT 1607CATATCCTCA GACCAGGTGG AATTACTTAA ATTTTAAAGC CTGAAAATTC CAATTTGGGG 1667GTGGGAGGTG GAAAAGGAAC CCAATTTTCT TATGAACAGA TATTTTTAAC TTAATGGCAC 1727AAAGTCTTAG AATATTATTA TGTGCCCCGT GTTCCCTGTT CTTCGTTGCT GCATTTTCTT 1787CACTTGCAGG CAAACTTGGC TCTCAATAAA CTTTTCG 1824(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度492氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)SEQ ID NO2的序列描述Gln Thr Thr Asp Phe Ser Gly Ile Arg Asn Ile Ser Phe Met Val Lys1 5 10 15Arg Ile Arg Ile Asn Thr Thr Ala Asp Glu Lys Asp Pro Thr Asn Pro20 25 30Phe Arg phe Pro Asn Ile Ser Val Glu Lys Pne Leu Glu Leu Asn Ser35 40 45Glu Gln Asn His Asp Asp Tyr Cys Leu Ala Tyr Val Phe Thr Asp Arg50 55 60Asp Phe Asp Asp Gly Val Leu Gly Leu Ala Trp Val Gly Ala Pro Ser65 70 75 80Gly Ser Ser Gly Gly Ile Cys Glu Lys Ser Lys Leu Tyr Ser Asp Gly85 90 95Lys Lys Lys Ser Leu Asn Thr Gly Ile Ile Thr Val Gln Asn Tyr Gly100 105 110Ser His Val Pro Pro Lys Val Ser His Ile Thr Phe Ala His Glu Val115 120 125Gly His Asn Phe Gly Ser Pro His Asp Ser Gly Thr Glu Cys Thr Pro130 135 140Gly Glu Ser Lys Asn Leu Gly Gln Lys Glu Asn Gly Asn Tyr Ile Met145 150 155 160Tyr Ala Arg Ala Thr Ser Gly Asp Lys Leu Asn Asn Asn Lys Phe Ser165 170 175Leu Cys Ser Ile Arg Asn Ile Ser Gln Val Leu Glu Lys Lys Arg Asn180 185 190Asn Cys Phe Val Glu Ser Gly Gln Pro Ile Cys Gly Asn Gly Met Val195 200 205Glu Gln Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Tyr Ser Asp Gln Cys Lys Asp210 215 220Glu Cys Cys Phe Asp Ala Asn Gln Pro Glu Gly Arg Lys Cys Lys Leu225 230 235 240Lys Pro Gly Lys Gln Cys Ser Pro Ser Gln Gly Pro Cys Cys Thr Ala245 250 255Gln Cys Ala Phe Lys Ser Lys Ser Gln Lys Cys Arg Asp Asp Ser Asp260 265 270Cys Ala Arg Glu Gly Ile Cys Asn Gly Phe Thr Ala Leu Cys Pro Ala275 280 285Ser Asp Pro Lys Pro Asn Phe Thr Asp Cys Asn Arg His Thr Gln Val290 295 300Cys Ile Asn Gly Gln Cys Ala Gly Ser Ile Cys Glu Lys Tyr Gly Leu305 310 315 320Glu Glu Cys Thr Cys Ala Ser Ser Asp Gly Lys Asp Asp Lys Glu Leu325 330 335Cys His Val Cys Cys Met Lys Lys Met Asp Pro Ser Thr Cys Ala Ser340 345 350Thr Gly Ser Val Gln Trp Ser Arg His Phe Ser Gly Arg Thr Ile Thr355 360 365Leu Gln Pro Gly Ser Pro Cys Asn Asp Phe Arg Gly Tyr Cys Asp Val370 375 380Phe Met Arg Cys Arg Leu Val Asp Ala Asp Gly Pro Leu Ala Arg Leu385 390 395 400Lys Lys Ala Ile Phe Ser Pro Glu Leu Tyr Glu Asn Ile Ala Glu Trp405 410 415Ile Val Ala His Trp Trp Ala Val Leu Leu Met Gly Ile Ala Leu Ile420 425 430Met Leu Met Ala Gly Phe Ile Lys Ile Cys Ser Val His Thr Pro Ser435 440 445Ser Asn Pro Lys Leu Pro Pro Pro Lys Pro Leu Pro Gly Thr Leu Lys450 455 460Arg Arg Arg Pro Pro Gln Pro Ile Gln Gln Pro Gln Arg Gln Arg Pro465 470 475480Arg Glu Ser Tyr Gln Met Gly His Met Arg Arg485 490(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度2763碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)特征(A)名称／代码CDS(B)位置17．．2414(ⅹⅰ)SEQ ID NO3的序列描述GGCGGCGGCA CGGAAG ATG GTG TTG CTG AGA GTG TTA ATT CTG CTC CTC 49Met Val Leu Leu Arg Val Leu Ile Leu Leu Leu495 500TCC TGG GCG GCG GGG ATG GGA GGT CAG TAT GGG AAT CCT TTA AAT AAA 97Ser Trp Ala Ala Gly Met Gly Gly Gln Tyr Gly Asn Pro Leu Asn Lys505 510 515TAT ATC AGA CAT TAT GAA GGA TTA TCT TAC AAT GTG GAT TCA TTA CAC 145Tyr Ile Arg His Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Asn Val Asp Ser Leu His520 525 530 535CAA AAA CAC CAG CGT GCC AAA AGA GCA GTT TTA CAT GAA GAC CAA TTT 193Gln Lys His Gln Arg Ala Lys Arg Ala Val Ser His Glu Asp Gln Phe540 545 550TTA CGT CTA GAT TTC CAT GCC CAT GGA AGA CAT TTC AAC CTA CGA ATG 241Leu Arg Leu Asp Phe His Ala His Gly Arg His Phe Asn Leu Arg Met555 560 565AAG AGG GAC ACT TCC CTT TTC AGT GAT GAA TTT AAA GTA GAA ACA TCA 289Lys Arg Asp Thr Ser Leu Phe Ser Asp Glu Phe Lys Val Glu Thr Ser570 575 580AAT AAA GTA CTT GAT TAT GAT ACC TCT CAT ATT TAC ACT GGA CAT ATT 337Asn Lys Val Leu Asp Tyr Asp Thr Ser His Ile Tyr Thr Gly His Ile585 590 595TAT GGT GAA GAA GGA AGT TTT AGC CAT GGG TCT GTT ATT GAT GGA AGA 385Tyr Gly Glu Glu Gly Ser Phe Ser His Gly Ser Val Ile Asp Gly Arg600 605 610 615TTT GAA GGA TTC ATC CAG ACT CGT GGT GGC ACA TTT TAT GTT GAG CCA 433Phe Glu G1y Phe Ile Gln Thr Arg Gly Gly Thr Phe Tyr Val Glu Pro620 625 630GCA GAG AGA TAT ATT AAA GAC CGA ACT CTG CCA TTT CAC TCT GTC ATT 481Ala Glu Arg Tyr Ile Lys Asp Arg Thr Leu Pro Phe His Ser Val Ile635 640 645TAT CAT GAA GAT GAT ATT AGT GAA AGG CTT AAA CTG AGG CTT AGA AAA 529Tyr His Glu Asp Asp Ile Ser Glu Arg Leu Lys Leu Arg Leu Arg Lys650 655 660CTT ATG TCA CTT GAG TTG TGG ACC TCC TGT TGT TTA CCC TGT GCT CTT 577Leu Met Ser Leu Glu Leu Trp Thr Ser Cys Cys Leu Pro Cys Ala Leu665 670 675CTG CTT CAC TCA TGG AAG AAA GCT GTA AAT TTT CAC TGC CTT TAC TTC 625Leu Leu His Ser Trp Lys Lys Ala Val Asn Ser His Cys Leu Tyr Phe680 685 690 695 Ser Gln Val Leu Glu Lys Lys Arg Asn Asn Cys Phe Val Glu Ser Gly985 990 995CAA CCT ATT TGT GGA AAT GGA ATG GTA GAA CAA GGT GAA GAA TGT GAT 1585Gln Pro Ile Cys Gly Asn Gly Met Val Glu Gln Gly Glu Glu Cys Asp100010051010 1015TGT GGC TAT AGT GAC CAG TGT AAA GAT GAA TGC TGC TTC GAT GCA AAT 1633Cys Gly Tyr Set Asp Gln Cys Lys Asp Glu Cys Cys Phe Asp Ala Asn102010251030CAA CCA GAG GGA AGA AAA TGC AAA CTG AAA CCT GGG AAA CAG TGC AGT 1681Gln Pro Glu Gly Arg Lys Cys Lys Leu Lys Pro Gly Lys Gln Cys Ser103510401045CCA AGT CAA GGT CCT TGT TGT ACA GCA CAG TGT GCA TTC AAG TCA AAG 1729Pro Ser Gln Gly Pro Cys Cys Thr Ala Gln Cys Ala Phe Lys Ser Lys105010551060TCT GAG AAG TGT CGG GAT GAT TCA GAC TGT GCA AGG GAA GGA ATA TGT 1777Ser Glu Lys Cys Arg Asp Asp Ser Asp Cys Ala Arg Glu Gly Ile Cys106510701075AAT GGC TTC ACA GCT CTC TGC CCA GCA TCT GAC CCT AAA CCA AAC TTC 1825Asn Gly Phe Thr Ala Leu Cys Pro Ala Ser Asp Pro Lys Pro Asn Phe108010851090 1095ACA GAC TGT AAT AGG CAT ACA CAA GTG TGC ATT AAT GGG CAA TGT GCA 1873Thr Asp Cys Asn Arg His Thr Gln Val Cys Ilc Asn Gly Gln Cys Ala110011051110GGT TCT ATC TGT GAG AAA TAT GGC TTA GAG GAG TGT ACG TGT GCC AGT 1921Gly Ser Ile Cys Glu Lys Tyr Gly Leu Glu Glu Cys Thr Cys Ala Ser111511201125TCT GAT GGC AAA GAT GAT AAA GAA TTA TGC CAT GTA TGC TGT ATG AAG 1969Ser Asp Gly Lys Asp Asp Lys Glu Leu Cys His Val Cys Cys Met Lys 435 440 445Glu Cys Thr Pro Gly Glu Ser Lys Asn Leu Gly Gln Lys Glu Asn Gly450 455 460Asn Tyr Ile Met Tyr Ala Arg Ala Thr Ser Gly Asp Lys Leu Asn Asn465 470 475 480Ash Lys Phe Ser Leu Cys Ser Ile Arg Asn Ile Ser Gln Val Leu Glu485 490 495Lys Lys Arg Asn Asn Cys Phe Val Glu Ser Gly Gln Pro Ile Cys Gly500 505 510ASh Gly Met Val Glu Gln Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Tyr Ser Asp515 520 525Gln Cys Lys Asp Glu Cys Cys Phe Asp Ala Asn Gln Pro Glu Gly Arg530 535 540Lys Cys Lys Leu Lys Pro Gly Lys Gln Cys Ser Pro Ser Gln Gly Pro545 550 555 560Cys Cys Thr Ala Gln Cys Ala Phc Lys Ser Lys Ser Glu Lys Cys Arg565 570 575Asp Asp Ser Asp Cys Ala Arg Glu Gly Ile Cys Asn Gly Phe Thr Ala580 585 590Leu Cys Pro Ala Ser Asp Pro Lys Pro Asn Phe Thr Asp Cys Asn Arg595 600 605His Thr Gln Val Cys Ile Asn Gly Gln Cys Ala Gly Ser Ile Cys Glu610 615 620Lys Tyr Gly Leu Glu Glu Cys Thr Cys Ala Ser Ser Asp Gly Lys Asp625 630 635 640Asp Lys Glu Leu Cys His Val Cys Cys Met Lys Lys Met Asp Pro Ser645 650 655Thr Cys Ala Ser Thr Gly Ser Val Gln Trp Ser Arg His Phe Ser Gly660 665 670Arg Thr Ile Thr Leu Gln Pro Gly Ser Pro Cys Ash Asp Phe Arg Gly675 680 685Tyr Cys Asp Val Phe Met Arg Cys Arg Leu Val Asp Ala Asp Gly Pro690 695 700Leu Ala Arg Leu Lys Lys Ala Ile Phe Ser Pro Glu Leu Tyr Glu Asn705 710 715 720Ile Ala Glu Trp Ile Val Ala His Trp Trp Ala Val Leu Leu Met Gly725 730 735Ile Ala Leu Ile Met Leu Met Ala Gly Phe Ile Lys Ile Cys Ser Val740 745 750His Thr Pro Ser Ser Asn Pro Lys Leu Pro Pro Pro Lys Pro Leu Pro755 760 765Gly Thr Leu Lys Arg Arg Arg Pro Pro Gln Pro Ile Gln Gln Pro Gln770 775 780Arg Gln Arg Pro Arg Glu Ser Tyr Gln Met Gly His Met Arg Arg785 790 795(2)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度239碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构不明(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅳ)反义是(ⅹⅰ)SEQ ID NO5的序列描述 (2)SEQ ID NO6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度239碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)SEQ ID NO6的序列描述 (2)SEQ ID NO7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度736碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)SEQ ID NO7的序列描述 AATGTACATA CCTTGTTATA TGCAGACATG TATTTCTTAC GTACACTGTA CTTCTGTGTG 600CAATTGTAAA CAGAAATTGC AATATGGATG TTTCTTTGTA TTATAAAATT TTTCCGCTCT 660TAATTAAAAA TTACTGTTTA ATTGACATAC TCAGGATAAC AGAGAATGGT GGTATTCAGT 720GGTTCAGACA CAGGCT 736(2)SEQ ID NO8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度2625碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)特征(A)名称／代码CDS(B)位置17．．2263(ⅹⅰ)SEQ ID NO8的序列描述GGCGGCGGCA CGGAAG ATG GTG TTG CTG AGA GTG TTA ATT CTG CTC CTC 49Met Val Leu Leu Arg Val Leu Ile Leu Leu Leu800 905810TCC TGG GCG GCG GGG ATG GGA GGT CAG TAT GGG AAT CCT TTA AAT AAA 97Ser Trp Ala Ala Gly Met Gly Gly Gln Tyr Gly Asn Pro Leu Asn Lys815 820 825TAT ATC AGA CAT TAT GAA GGA TTA TCT TAT AAT GTG GAT TCA TTA CAC 145Tyr Ile Arg His Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Asn Val Asp Ser Leu His830 835 840CAA AAA CAC CAG CGT GCC AAA AGA GCA GTC TCA CAT GAA GAC CAA TTT 193Gln Lys His Gln Arg Ala Lys Arg Ala Val Ser His Glu Asp Gln Phe845 850 855TTA CGT CTA GAT TTC CAT GCC CAT GGA AGA CAT TTC AAC CTA CGA ATG 241Leu Arg Leu Asp Phe His Ala His Gly Arg His Phe Ash Lau Arg Met860 865 870AAG AGG GAC ACT TCC CTT TTC AGT GAT GAA TTT AAA GTA GAA ACA TCA 289Lys Arg Asp Thr Ser Leu Phc Ser Asp Glu Phe Lys Val Glu Thr Ser875 880 885 890AAT AAA GTA CTT GAT TAT GAT ACC TCT CAT ATT TAC ACT GGA CAT ATT 337Asn Lys Val Leu Asp Tyr Asp Thr Ser His Ile Tyr Thr Gly His Ile895 900 905TAT GGT GAA GAA GGA AGT TTT AGC CAT GGG TCT GTT ATT GAT GGA AGA 385Tyr Gly Glu Glu Gly Ser Phe Ser His Gly Set Val Ile Asp Gly Arg910 915 920TTT GAA GGA TTC ATC CAG ACT CGT GGT GGC ACA TTT TAT GTT GAG CCA 433Phe Glu Gly Phe Ile Gln Thr Arg Gly Gly Thr Phc Tyr Val Glu Pro925 930 935GCA GAG AGA TAT ATT AAA GAC CGA ACT CTG CCA TTT CAC TCT GTC ATT 481Ala Glu Arg Tyr Ile Lys Asp Arg Thr Leu Pro Phe His Ser Val Ile940 945 950TAT CAT GAA GAT GAT ATT AAC TAT CCC CAT AAA TAC GGT CCT CAG GGC 529Tyr His Glu Asp Asp Ile Asn Tyr Pro His Lys Tyr Gly Pro Gln Gly955 960 965 970GGC TST GCA GAT CAT TCA GTA TTT GAA AGA ATG AGG AAA TAC CAG ATG 577Gly Cys Ala Asp His Ser Val Phe Glu Arg Met Arg Lys Tyr Gln Met975 980 985 CTGAAAATTC CAATTTGGGG GTGGGAGGTG GAAAAGGAAC CCAATTTTCT TATGAACAGA 2493TATTTTTAAC TTAATGGCAC AAAGTCTTAG AATATTATTA TGTGCCCCGT GTTCCCTGTT 2553CTTCGTTGCT GCATTTTCTT CACTTGCAGG CAAACTTGGC TCTCAATAAA CTTTTACCAC 2613AAAAAAAAAA AA 2625(2)SEQ ID NO9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度749氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)SEQ ID NO9的序列描述Mat Val Leu Leu Arg Val Leu Ile Leu Leu Leu Ser Trp Ala Ala Gly1 5 10 15Met Gly Gly Gln Tyr Gly Ash Pro Leu Ash Lys Tyr Ile Arg His Tyr20 25 30Glu Gly Leu Set Tyr Asn Val Asp Set Leu His Gln Lys His Gln Arg35 40 45Ala Lys Arg Ala Val Ser His Glu Asp Gln Phe Leu Arg Leu Asp Phe50 55 60His Ala His Gly Arg His Phc Asn Leu Arg Met Lys Arg Asp Thr Ser65 70 75 80Leu Phc Ser Asp Glu Phc Lys Val Glu Thr Ser Asn Lys Val Leu Asp 675 680 685Ile Met Leu Met Ala Gly Phe Ile Lys Ile Cys Ser Val His Thr Pro690 695 700Ser Ser Asn Pro Lys Leu Pro Pro Pro Lys Pro Leu Pro Gly Thr Leu705 710 715 720Lys Arg Arg Arg Pro Pro Gln Pro Ile Gln Gln Pro Gln Arg Gln Arg725 730 735Pro Arg Glu Ser Tyr Gln Met Gly His Met Arg Arg740 745(2)SEQ ID NO10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)SEQ ID NO10的序列描述AGCCTGTGTC 10(2)SEQ ID NO11的信息(ⅹ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)SEQ ID NO11的序列描述AGCCTGTGTC TGAACCACT 19
权利要求
1．一段DNA片段，它编码在关节炎发展过程中被差异表达的人降解蛋白SEQID NO9或其片段，它能够被用于筛选降解蛋白拮抗剂、药物的设计和筛选。
2．人降解蛋白或其片段，它们具有权利要求1所述的DNA编码，并且为基本纯的形式。
3．筛选能够结合人降解蛋白的化合物的方法，所述的人降解蛋白包括权利要求1所述的降解蛋白。
4．筛选能够结合人降解蛋白的化合物的试剂盒，所述的人降解蛋白包括根据权利要求1所述的降解蛋白。
5．检测骨关节炎的试剂盒，它包括权利要求2所述人降解蛋白的抗体或其片段。
6．一种表达载体或质粒，它包含权利要求1所述的DNA。
7．分离出的如权利要求1所述的核酸分子，它包含SEQ ID NO8中描述的序列。
8．根据权利要求1所述的核酸分子，它经过引物延伸实验能够被测定，所述的引物选自SEQ ID NO10和SEQ ID NO11。
9．根据权利要求3所述的方法，它包括(A)将一份受白介素-1刺激的软骨细胞培养物与候选的金属蛋白酶基因表达抑制剂接触；(B)从所述的接触样品中分离RNA，所述的RNA包括与金属蛋白酶基因对应的mRNA；(C)比较接触样品和非接触样品中所述金属蛋白酶基因的mRNA的水平；(D)所述mRNA水平的降低说明是抑制剂。
10．根据权利要求3所述的方法，它包括(A)在候选抑制剂存在下，在对照抑制剂存在下，无任何抑制剂存在下，培养用白介素-1刺激的正常人关节软骨细胞，分离出培养物上清液；(B)在各份样品中加入底物，所述底物能够测定金属蛋白酶活性；(C)测定各份样品的金属蛋白酶活性水平。
全文摘要
本发明提供了一种鉴定能够结合降解蛋白的化合物的方法,该方法还可测定样品中能够结合降解蛋白的化合物的量及亲和性。本发明还提供了用于所述目的的、包含降解蛋白的重组表达载体的宿主细胞以及编码降解蛋白和编码人降解蛋白金属蛋白酶蛋白、其片段或突变体的重组表达载体。本发明还提供了用于检测骨关节炎和其它基于金属蛋白酶的疾病的体内或体外方法,该方法可以制造成试剂盒产品并以试剂盒的方式来使用。
文档编号C12Q1/68GK1283232SQ98802774
公开日2001年2月7日 申请日期1998年2月25日 优先权日1997年2月28日
发明者M·H·廷德尔, T·M·哈克基 申请人:普罗克特和甘保尔公司, 凯斯西部预备大学