专利名称：一种检测猪瘟病原的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测猪瘟病毒的方法，特别是利用反转录-聚合酶链式扩增反应技术(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)技术检测猪瘟病毒的方法。
背景技术：
猪瘟是严重危害养猪业的重要传染病之一，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。猪瘟病毒(CSFV)的感染，可导致各生长阶段猪的死亡，目前，我国每年因猪瘟病死的生猪占年饲养总数的3％左右，这不仅造成了巨大的经济损失，而且也阻碍了我国猪肉制品走向国际市场。由于C-株疫苗的长期使用，有效地控制了猪瘟的急性发作和大流行。但从上世纪70年代末以来，我国猪瘟的流行特点发生了很大的变化，出现了温和性猪瘟和持续带毒现象，感染猪的临床症状不典型，难以诊断，疫苗免疫剂量加大了数倍，仍有相当数量的猪处于免疫水平低下的易感状态。近些年猪瘟的发生表现更加复杂，既有区域性大流行，又有零星散发，既有高死亡率的急性症状，又有持续感染的温和性症状。猪瘟的这一变化给防制工作带来了很大困难，貌似健康的感染猪通过流通渠道水平传播猪瘟，而由感染种猪引起的死胎、流产对猪的繁育造成严重影响，侥幸存活的带毒仔猪又成为新的传染源。目前，检测猪瘟病原的方法主要包括病毒分离法、荧光抗体检测法、病毒分离及中和试验法。但时，由于温和性猪瘟或持续带毒者组织中病毒含量低，常常难以用病毒分离等方法检测到病原，用荧光抗体检测组织切片或抹片检测，其操作复杂，设备要求较高，结果判断主观性强，难以掌握；病毒分离及中和试验虽然准确、特异，但操作繁琐，要花费较长的时间。
目前，人们已经了解了与猪瘟病毒有关的基因结构，其中猪瘟病毒基因组N(5′)端非编码区(CSFV 5′UTR)比较保守，被广泛用于特异性猪瘟病毒的扩增。扩增时，一般设计了4条特异性寡核苷酸引物(C1～C4)和1条生物素标记的杂交捕获探针(C5)(Arch Virol，1994，139217-229；J Virol Methods，2001，95101-110)。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种检测猪瘟病毒的快速、敏感的检测方法。为了达到该目的，本发明所采取的技术方案步骤如下按照扩增猪瘟病毒基因的方法，设计4条特异性寡核苷酸引物(C1～C4)和1条生物素标记的杂交捕获探针(C5)；从被检样品中按提取猪瘟病毒RNA的方式提取RNA；以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA；用所述4条特异性寡核苷酸引物(C1～C4)，进行套式聚合酶链式扩增反应扩增，并将其产物用地高辛标记的dUTP标记；将所述探针与扩增产物杂交并捕获到微载体板上；加入过氧化物酶标记的抗地高辛抗体和底物进行免疫显色；测定405nm OD值(A405)并判读结果，A405≥0.1者为阳性。
本发明将高敏感的RT-PCR技术、非放射性标记技术和ELISA技术相结合，在本文中称为RT-PCR-ELISA，提高了检测猪瘟病原的敏感性，较常规RT-PCR方法高100倍，可检出350μL1∶100稀释(相当于3.5mg)的兔脾组织悬液中的猪瘟兔化弱毒捕获探针的应用增强了其特异性，只能捕获CSFV cDNA而与其他cDNA无交叉反应，克服了PCR过程中可能的污染导致的假阳性；用本方法检测C-株兔脾组织毒、细胞适应毒和野毒感染的猪组织毒样品，效果良好。本发明可用于猪瘟的早期诊断和隐性带毒者的查毒。
具体实施例方式
1)设计引物和探针设计了4条特异性寡核苷酸引物(C1～C4)和1条生物素标记的杂交捕获探针(C5)，均采用Takara公司合成，其序列见表1。
表1引物和探针的序列及位置
*上述数字区间表示对应引物或探针在猪瘟病毒株Alforlt A19基因组中的位置(基因库中毒株Alforlt A19的序列号为U90951)2)提取RNA
用从GIBCOBRL公司购得的TRIZOL试剂作为组织裂解液，按该产品使用说明操作，分别从中国农业科学院兰州兽医研究所采集保存的样品(包括脾组织、血液、组织培养细胞等)中提取RNA，其中C-株兔脾组织毒(Cst)、石门株PK15细胞传代毒(SMpk)和C-株PK15细胞传代毒(Cpk)以及1997～1999年期间采集的6株田间野毒株(Gszy/99、GSjc/97、Gshy/98、HN/99为猪脾组织毒，GSlx/98、GSlt/98为猪血毒)。
3)反转录合成cDNA取所提取的RNA 5～10μl，加入20μl反转录体系中，内含1×RT buffer(50mMTris-HCl(pH8.3)、75nM KCl、8mMMgCl2、10mM DTT)、引物C4 50pmol、购自Takara公司的单核苷酸dNTP每种10mM、AMV RTase 10U、RNA酶抑制剂(RNase inhibitor)20U。在42℃下水浴1h，然后煮沸5min，置-20℃备用。
4)套式PCR(nest-PCR)并将其产物用地高辛标记在PCR过程中掺入地高辛标记的dUTP(购自Roche公司)，使PCR产物标记以地高辛。取5μl反转录产物加入50μl PCR反应体系中，内含1×PCR buffer(10mMTris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl2pH8.3)0.2mM dATP，dCTP，dGTP，0.19mMdTTP，0.01mM DIG-dUTP，250nM特异性引物C1/C4。PCR循环参数为94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，第一循环94℃5分钟，最后一循环72℃延伸8分钟。35个循环完成扩增反应。取第一次PCR产物0.5μl作为模板，用引物C2/C3进行第二次扩增，反应体系及循环参数同第一次扩增。每次反应均设阳性对照、阴性对照和空白对照。这样用两对引物C1/C4、C2/C3成功扩增了与预计长度相符的猪瘟cDNA片段，并用探针C5成功捕获所扩增的片段。经特异性测定结果表明，以正常PK15细胞和健康兔脾组织毒作平行对照，该方法具有很强的特异性。
5)RT-PCR-ELISA检测在20μl变性液中加入5μl地高辛标记的PCR产物，混匀，置室温(15～25℃)10分钟。然后加含10pmol/ml生物素(购自Takara公司)标记捕获探针(C5)的杂交液至250μl，混匀后取200μl加到链亲和素(购自Roche公司)包被的微孔中，在45℃振荡培养3小时。用洗液洗3次，每次用250μl洗液，甩干后加200μl工作浓度(1∶100)的抗地高辛过氧化物酶(Anti-DIG-POD)(购自Roche公司)，在37℃暗室中振荡培养30分钟。如前洗5次后加200μl ABTS底物溶液，在37℃暗室中振荡培养30分钟。在405nm测OD值。每次反应均设阳性对照、阴性对照和空白对照。阴性对照的A405应在0.1以下，A405≥0.1者为阳性。
6)测定结果6.1)敏感性将C-株兔脾组织毒用生理盐水以1∶1研磨，匀浆液以1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶100、1∶200稀释，各取350μl提取RNA。RT-PCR ELISA检测结果表明，可从1∶100稀释的该组织悬液中检测到猪瘟病毒。
同时，将地高辛标记的猪瘟阳性PCR产物做10倍系列稀释，各取5μl分别经琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR ELISA方法检测。结果显示，琼脂糖凝胶电泳可检测到1∶10，而RT-PCR ELISA可检测到1∶1000。
6.2)样品检测用RT-PCR ELISA检测了样品，结果均为阳性(见表2)。
表2 各类样品RT-PCR ELISA检测结果
权利要求
1.一种检测猪瘟病毒的方法，其特征在于按照扩增猪瘟病毒基因的方法，设计4条特异性寡核苷酸引物(C1～C4)和1条生物素标记的杂交捕获探针(C5)；从被检样品中按提取猪瘟病毒RNA的方式提取RNA；以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA；用所述4条特异性寡核苷酸引物(C1～C4)，进行套式聚合酶链式扩增反应扩增，并将其产物用地高辛标记的dUTP标记；将所述探针与扩增产物杂交并捕获到微量载体板孔中；加入过氧化物酶标记的抗地高辛抗体和底物进行免疫显色；测定405nm OD值(A405)并判读结果，A405≥0.1者为阳性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述4条特异性寡核苷酸引物(C1～C4)和1条生物素标记的杂交捕获探针(C5)如下，其中序列顺序为5’→3’，序列后的数字表示位置引物1(C1)正向GCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACT，93-116；引物2(C2)正向CCTGAGTACAGG(A/G)(C/T)AGTCGTCA，167-188；引物3(C3)反向TGGGCCTCTGCAGCACCCTATCAGG，310-334；引物4(C4)反向CAACTCCATGTGCCATGTACAGCA，359-382；探针(C5)生物素-TCACATTA(C/T)GTGATGGG(A/G)GTACGA，286-309；
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，第一次扩增使用引物1和引物4，第二次扩增以第一次扩增的产物为模板，使用引物2和引物3。
4.根据权利要求1～3之一所述的方法，其特征在于，所述微量载体板孔是用链亲和素包被的。
全文摘要
本发明提供了一种检测猪瘟病毒的检测方法，步骤包括，按照扩增猪瘟病毒基因的方法，设计4条特异性寡核苷酸引物(C1～C4)和1条生物素标记的杂交捕获探针(C5)；从被检样品中按提取猪瘟病毒RNA的方式提取RNA；以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA；用所述4条特异性寡核苷酸引物(C1～C4)，进行套式聚合酶链式扩增反应扩增，并将其产物用地高辛标记的dUTP标记；将所述探针与扩增产物杂交并捕获到微载体板上；加入过氧化物酶标记的抗地高辛抗体和底物进行免疫显色；测定405nm OD值(A
文档编号C12Q1/68GK1539993SQ20031010341
公开日2004年10月27日 申请日期2003年10月31日 优先权日2003年10月31日
发明者刘湘涛, 孙世琪, 谢庆阁 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所