专利名称：植物的延迟衰老和逆境耐力的制作方法
技术领域：
本发明的背景技术许多高等植物在它们生命周期的某些阶段会遭受至少暂时的相对水分缺失，因此，进化了一些干燥保护机能。然而，如果水分缺失的变化状态延长，对植物生长和发育的影响就会很大。由于干旱，寒冷或盐度逆境造成的水分缺失会不可恢复地损失植物细胞，限制植物生长及农业作物产量。
对干旱，盐度及寒冷不利条件反应，植物会有一些形态上和生理上的变化。尽管我们对植物对于这些逆境耐力机能了解是不完整的，但植物激素落叶酸(ABA)已被提议为环境刺激与植物反应间的重要介质。对水分缺失反应，ABA含量增加，外源使用的ABA模拟许多种通常由水分缺失诱发的反应。一旦ABA合成，它会引起叶子气孔关闭，从而减少蒸发造成的水分损失。
对将ABA传导到细胞反应的基因的确定，开拓了利用这些调节基因增强农作物物种干旱耐力的可能。一般地，这些ABA信号基因可与适当的控制因子偶联以最优化植物的生长和发育。这样，这些基因不仅仅使农作物遗传改性(tailoring)可抵挡暂时的环境侵害，它们还可拓宽传统农作物可生长的环境。
此外，有关控制植物生长和发育的遗传机理几乎不被了解。进一步影响其他代谢过程如植物的衰老和生长习性的基因可应用在多种农作物和园艺植物中。
本发明的概述本发明涉及编码包括SEQ ID NO:1的法呢基转移酶(Farnesyl Transferase)的分离的核酸。本发明包括的核酸还有编码SEQ ID NO:1的功能等同物的杂交序列。本发明还涉及使用由这些核酸编码的产品的抑制剂来增强植物的干旱耐力的方法。另外，本发明涉及控制光合成有机体内的调节功能；如控制这样有机体的生长习性，开花，种子制备，种子发芽，和衰老。
本发明还涉及通过改变编码法呢基转移酶(Ftase)蛋白质或其功能等同物的分离或重组核酸来增强植物干旱耐力的方法。当这样的杂交序列编码法呢基转移酶蛋白质的功能等同物时，与编码法呢基转移酶基因(ERA1)杂交的核酸也包括在本发明中。本发明还涉及通过对ERA1基因和其功能等同物的基因处理改进农作植物的逆境耐力，来增强植物的干旱耐力的方法。失去ERA1基因功能，就给成熟植物带来了增强的干旱耐力。失去法呢基转移酶活性的ERA1突变基因的特性显示，抑制法呢基作用增强了植物的ABA反应。
进一步，本发明涉及通过抑制法呢基转移酶活性，抑制光合成有机体的衰老。产物光合有机体可保持绿色，组织生存能力维持更长的时间。这样，提供常绿植物及延缓衰老的方法也是本发明的一部分。
在另一个具体实施中，提供了改变植物生长习性和促进开花的方法。在特殊环境条件下失去ERA1基因功能会使植物生长的侧枝数量减少，每个开花期花朵数量增加。
本发明还涉及用于植物细胞基因工程的调节序列，以提供控制与这种新型调节序列联接的DNA序列表达的组织模式的方法。
图2是ERA1蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图3A-3B表示ERA1启动子的核酸序列(SEQ ID NO:3)。
图4是拟南芥[Arabidopsis(Arab.)](SEQ ID NO:2)β-亚单元法呢基作用域和豌豆(SEQ ID NO:4)，酵母(SEQ ID NO:5)和鼠(SEQ ID NO:6)β-亚单元法呢基作用域的氨基酸序列。与拟南芥序列相同的残基用点标出。破折号表示空白。拟南芥基因的氨基酸位置标在右手边。
图5是eral-转化的拟南芥植物(右)与野生型(对照物，如自然生长的)植物(左)在非常干燥的条件下的对比照片。
图6是失活的或突变法呢基转移酶活性(M.Columbia,eral-2)的拟南芥植物与对照物(M.C.对照物，era 1-2对照物)的水含量对比图。
图7是失活的或突变法呢基转移酶活性(M.Columbia,eral-2)的拟南芥植物与对照物(M.C.对照物，era 1-2对照物)的水失去速率对比图。
图8是对照物(野生型)和era-2突变植物的老叶对比。
图9是对照物(野生型)和era-2突变植物老叶的转录水平对比。
本发明的详细描述本发明涉及改变植物生长、繁殖和衰老的分离核酸和由这些核酸编码的蛋白质。具体地，本发明的构建物包括编码含SEQ IDNO:1的法呢基转移酶(Ftase)多肽或其功能等同物的分离的核酸，和由这些核酸编码的法呢基转移酶多肽或蛋白质。特别是，本发明涉及其中序列是SEQ ID NO:2的蛋白质。
本发明中还包括核酸构建物，其中包括与含SEQ ID NO:1分离核酸、或其功能等同物、或两者中任何一个的互补体可工作地联接的启动子(ERA1启动子)。当掺入到植物中时，ERA1启动子在植物保卫细胞内被调节，可影响通过气孔的水分失去。这种启动子由含SEQ ID NO:3(图3)的核酸构成。
掺入这些构建物的转基因植物、种子、植物细胞和组织也是本发明的一部分。因此，本发明的一方面是，提供一种制备基因产品方法，在主要于保卫细胞内工作的启动子的控制下，通过在植物细胞内对编码基因产品的基因进行表达来实现，该方法包括步骤用包括含SEQ ID NO:3或其功能部分的调节区域，含编码基因产品的结构基因的DNA，和含多腺苷化区域的3’非翻译区域的DNA构建物来转化植物细胞；从细胞再生植物、光合成有机体或组织培养物；将植物、光合成有机体或组织培养物置于使启动子诱导结构基因转录及基因产品表达的条件下。
在本篇公开的上下文中，“调节区域”和“启动子”是指DNA的序列，通常处于结构基因编码序列的上游(5’)，其通过为RNA聚合酶提供识别和结合位置，和/或为在正确位置开始转录提供所需要的因素，来控制编码区域的表达。“功能部分”或“功能片段”是指本发明的启动子的截断序列，其在描述的法呢基转移酶蛋白质活性条件下，维持诱导ERA结构基因转录的能力。
本文所描述的构建物和方法可适用于所有类型的植物和其他光合成有机体，包括但不限于被子植物(单子叶植物和双子叶植物)，裸子植物，带孢子的或营养性再生的植物和藻类，包括蓝(蓝-绿藻类)。特别推荐的植物是那些提供商业价值的农作物，如玉米，小麦，棉花，稻米，canola，甘蔗，甜菜，向日葵，土豆，番茄，椰菜，胡萝卜，莴笋，苹果，棕榈，橙子，柠檬，玫瑰等等。
进一步，本发明的构建物和方法还适用于植物的任何植物部分、原生质体、或组织培养物，其中组织是从光合成有机体获得的。“植物部分”意指包括能产生再生植物的部分植物。较好的植物部分包括根和桠枝和它们的分生部分。本发明包括的其他植物部分有叶子，花，种子，上胚轴，子叶下轴，子叶，子叶节点，移植体，花粉，胚珠，分生或胚胎组织，原生质体，等等。转基因植物可从任何这些植物部分包括组织培养物或原生质体再生，并且也可从移植体再生。具体方法根据植物物种的不同而变化。
本发明涉及包括编码法呢基转移酶的分离核酸(DNA和RNA)和其光合成有机体部分的组合物和构建物。本发明进一步涉及包括编码法呢基转移酶启动子的分离的核酸的组合物和构建物。具体地，编码拟南芥法呢基转移酶β亚单元的ERA1基因，和调节ERA1基因转录的调节序列已被分离和测序。编码光合成有机体法呢基转移酶的核酸，和这些核酸的同源物和同类物也包括在本发明中。
本发明进一步涉及使用分离的和/或重组的核酸(DNA和RNA)的方法，核酸的特点在于它们与(a)编码法呢基转移酶蛋白质或多肽，如含序列SEQ ID NO:1的核酸杂交，或与(b)部分前述物，如含编码功能法呢基转移酶蛋白质所需的最小核苷酸的部分杂交的能力；或其编码含法呢基转移酶氨基酸序列的多肽(如SEQ ID NO:2，或编码其功能等同物；如含与SEQ IDNO:2至少80％相同序列的多肽，当掺入到植物细胞内时，可用如SEQ ID NO:1相同的方式促进光合成有机体的生长习性，种子发芽，和新陈代谢)的能力。因此，法呢基转移酶的功能等同物，应含与由SEQ ID NO；2编码的多肽至少80％相同的氨基酸序列，具有与由SEQ ID NO；2编码的多肽相同特点，或用与由SEQ ID NO；2编码的多肽基本上相同的方法工作。与编码法呢基转移酶多肽如SEQ ID NO:2的核酸杂交的核酸可以是双链的，或是单链的。与DNA如含序列SEQ ID NO:1的DNA的杂交作用，包括与所显示出的链的杂交，以及与其互补链的杂交。
在一个具体实施中，法呢基转移酶多肽如SEQ ID NO:2，和其功能等同物之间氨基酸序列的相同率为至少约60％。在一个较好的具体实施中，法呢基转移酶多肽和其功能等同物之间氨基酸序列的相同率为至少约75％(≥75％)。更好地，法呢基转移酶多肽和其功能等同物之间氨基酸序列的相同率为至少约80％，还要好地是，当比较连续的氨基酸序列时，相同率为至少约90％。
符合这些标准的分离的和/或重组的核酸包括，与天然的ERA1基因或其部分基因、或天然的基因的变异体含相同序列的核酸。这样的变异体包括通过添加、删除或替代一个或多个核苷酸而不同的突变体，其中一个或多个核苷酸被修饰的修饰核酸(如DNA,RNA的类似物)的突变体，及包含一个或多个修饰核苷酸的突变体。
这样的核酸，包括DNA和RNA，可通过在高度严紧条件或中度严紧条件下的杂交进行检测和分离，如选出不允许含非互补序列的核酸进行杂交的核酸。杂交的“严紧条件”是本领域的术语，是指温度和缓冲液浓度条件允许一种特定的核酸与另一种核酸杂交，其中第一种核酸可能与第二种核酸完全互补，或第一种和第二种核酸可能共有比完全互补少的一定程度的互补。如，某些高度严紧条件可以用来从互补性小的核酸中将完全互补核酸区分出来。核酸杂交的“高度严紧条件”和“中度严紧条件”在《现代分子生物学手册》(Ausubel,F.M.et al.,eds.,Vol.1，包括补充部分至补充29,1995)6.3.1-6页和2.10.1-2.10.16页上作了解释。决定严紧杂交的确切条件不仅仅取决于离子浓度，温度和脱稳定剂如甲酰胺浓度，还取决于其他因素如核酸序列长度，碱基组合，杂交序列之间的误配率，和在其他非一致序列内那种序列小分子团的出现频率。这样，高度或中度严紧条件可以经验确定。
高度严紧杂交过程可以(1)使用低离子浓度和高温进行淋洗，如0.015MNaCl/0.0015M柠檬酸钠，pH7.0(0.1xSSC)和0.1％十二烷基硫酸钠(SDS),50℃；(2)杂交期间使用50％(体积/体积)甲酰胺和5xDenhardt溶液(0.1％重量/体积高度提纯的牛血清清蛋白/0.1％重量/体积Ficoll/0.1％重量/体积聚乙烯基吡咯烷酮),50mM磷酸钠缓冲液，pH6.5和5xSSC,42℃；或(3)杂交使用50％甲酰胺，5xSSC,50mM磷酸钠(pH6.8),0.1％焦磷酸钠，5xDenhardt溶液，超声波降解的鲑鱼精液DNA(50μg/ml),0.1％SDS，和10％右旋糖苷硫酸盐，42℃，在42℃用0.2xSSC和0.1％SDS淋洗。除了杂交使用25％甲酰胺替换50％甲酰胺，中度严紧条件的其它方面是相同的。
通过改变杂交条件，从没有杂交发生的严紧程度到第一次观察到杂交发生的程度，使给定序列能与样品中最相似序列杂交的条件可以被确定。
示例条件在Krause,M.H.和S.A.Aaronson的(1991)《酶学中的方法》,200∶546-556中作了描述。同样，参阅《当代分子生物学手册》(咄处同上)中2.10.11页，其中描述了如何确定中度或低度严紧条件的淋洗条件。淋洗是这样一种步骤，其中通常设定的条件是为了确定杂交体之间的最小程度的互补性。一般，对于任何选取的SSC浓度，从仅有同源杂交发生的最低温度，杂交核酸间的1％误配会导致解链温度Tm降低1℃。通常，加倍SSC浓度会使Tm增加约17℃。利用这些准则，根据查寻的误配程度，可经验性地确定中度或低度严紧杂交的淋洗温度。
以(a)与编码法呢基转移酶多肽的核酸，如SEQ ID NO:1描述的核酸杂交，(b)与SEQ ID NO:1的互补序列杂交，(c)与部分(a)和(b)(如在高度和中度严紧条件下)杂交的能力为特征的分离的和/或重组的核酸，还可进一步编码含有至少一种法呢基转移酶多肽功能特性的蛋白质或多肽，如昼夜光照循环下调节侧分枝，或调节对ABA的反应，或调节衰老。
在确定和/或分离编码多肽如含氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽或这种多肽的功能等同物的核酸的过程中，还可以使用酶学检测，互补检测，或其他适当的方法。由杂交核酸编码的蛋白质或多肽的抗原属性可以通过免疫法使用与法呢基多肽结合的抗体来确定，如免疫印迹法，免疫沉淀法，放射免疫测定法。PCR方法，包括RAGE(基因组DNA末端快速扩增法)，也可用来筛查和探测编码类-法呢基转移酶蛋白质和多肽的核酸的存在，并协助从基因组DNA中克隆出这样的核酸。适用于此的PCR方法可在Innis,M.A.，等人的《PCR手册》(Innis,M.A.,et al.,(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.,San Diego,CA)中找到。
本文所描述的核酸使用在本发明的方法中，以制备掺入细胞、组织、植物部分、植物和其他光合成有机体内的蛋白质和多肽。在一个具体实施中，含有全部或部分法呢基转移酶多肽编码序列的DNA，或与含序列SEQ ID NO:2的DNA杂交的DNA，被引入到在适当的宿主细胞内对被编码的多肽进行表达的载体中。包含法呢基转移酶亚单元或其功能等同物的被编码的多肽具有法呢基转移酶活性。本文中所用的“载体”指一种核酸分子，能转运与其已联接的其他核酸。
包含20个或更多个上述核酸的邻接核苷酸的引物和探针也是本发明所包括的一部分。这样，本发明的一种核酸包括约20个到约200个或更多个核苷酸的特殊序列，其与编码法呢基蛋白质DNA或转录的mRNA的核苷酸特异序列相同或互补。这些引物和探针可用来在其他光合成有机体中识别和分离编码法呢基转移酶的核酸。
本文所称为“分离的”核酸是从它们的原始来源(如当存在于细胞中或核酸混合物中如文库中)的基因组DNA或细胞RNA的核酸中分离出来的核酸，并可能进行进一步的加工。“分离的”核酸包括用本文描述的方法、类似的方法、以及其它的适宜的方法所获得的核酸，包括几乎纯的核酸，化学合成制备的核酸，通过生物和化学方法制备的核酸，分离的重组体核酸。本文所称为“重组体”核酸是用重组DNA方法制备的核酸，包括那些用人工重组方法制备的核酸，如聚合酶链反应(PCR)和/或使用限制酶克隆到载体内。“重组体”核酸还有那些通过细胞天然机能发生的重组事件中产生的核酸，但在为所需重组事件发生或可能发生而设计的核酸被引入细胞中后进行选取。编码具有某种功能的多肽的部分分离核酸可用如Jasin,M.等人的美国专利第4,952,501号中的方法进行识别和分离。
本发明的另一个具体实施是全部或部分与含有义链的靶分子互补，并能与靶分子杂交的反义核酸或寡聚核苷酸。靶分子可以是DNA，或其相对的RNA(如其中DNA的T残基相对RNA的U残基)。当引入细胞时，反义核酸和寡聚核苷酸可抑制有义链编码基因的表达或从有义链转录的mRNA的表达。反义核酸可以用标准技术制备。参阅，如Shewmaker等人的美国专利第5,107,065号。
在一个具体实施中，反义核酸或寡聚核苷酸全部或部分与靶核酸(DNA或RNA)互补，并能杂交，其中靶核酸能与含SEQ IDNO:1链互补序列的核酸杂交。如反义核酸或寡聚核苷酸可以与含如SEQ ID NO:1的开放读框链所示序列的靶核酸互补，或与编码法呢基转移酶功能等同物的核酸互补，或与足够允许杂交的部分这些核酸互补。部分核酸，如16个核苷酸的序列足够抑制蛋白质的表达。含与SEQ ID NO:1互补的25个或更多个连续核苷酸的片段也可被使用。或者，与ERA1基因的5’或3’非翻译区域，或重叠翻译起始密码子(5’未翻译的和翻译的区域)，或编码功能等同物的基因互补的核酸或寡聚核苷酸也是有效的。在另一个具体实施中，反义核酸与编码法呢基转移酶多肽的靶核酸全部或部分互补并与之杂交。
除了本发明的反义核酸，还可构建寡聚核苷酸，其与基因中或转录DNA∶RNA复合体中的复式核酸结合，形成稳定的含三重螺旋体或三联核酸，抑制编码法呢基转移酶多肽或其等同物的基因的表达和/或转录。参见Frank-Kamenetskii,M.D.和Mirkin,S.M在《生物化学回顾年刊》的文献[Frank-Kamenetskii,M.D.andMirkin,S.M.(1995)Ann.Rev.Biochem.64∶65-95]。本发明的这种寡聚核苷酸的构建是采用三重螺旋形成的碱基配对原则和法呢基转移酶mRNA或基因的核苷酸序列。这些寡聚核苷酸可以用一些方式阻碍法呢基转移酶类的活性，如预防ERA1基因转录，或当它被基因转录时与mRNA结合。
本发明还涉及如本文所描述的新型核酸编码的蛋白质或多肽。本发明的蛋白质或多肽可以是分离的和/或是重组体。本文称作“分离的”蛋白质或多肽是指提纯到超过它们在细胞中存在的程度的蛋白质或多肽。在一个较好的具体实施中，它们至少是10％纯度；如充分提纯的。“分离的”蛋白质或多肽包括用下文描述的方法，相似的方法，或其他适当方法获得的蛋白质或多肽，包括基本上纯的蛋白质和多肽，用化学方法或用生物及化学结合的方法合成的蛋白质或多肽，和分离的重组体蛋白质或多肽。本文称作“重组体”蛋白质或多肽是指由重组体核酸表达制备的蛋白质或多肽。
在一个较好的具体实施中，蛋白质或其部分至少具有一种法呢基转移酶功能特性；如，影响正常例分枝，花/花序，种子发芽，或气孔张开，结合功能，和/或抗原功能(如，结合的抗体也与自然产生的法呢基转移酶结合)的催化活性。因此，这些蛋白质被称作植物来源法呢基转移酶，包括如天然的法呢基转移酶，这些蛋白质和/或其部分的变异体(如突变体)。这样的变异体包括由于添加、删除或替代一个或多个氨基酸残基而不同的突变体，或其中一个或多个残基被修饰的修饰多肽，含一个或多个修饰残基的突变体。
本发明还涉及如上所述的法呢基转移酶的分离和/或重组体部分，特别是法呢基转移酶蛋白质的β-亚单元。可制备本身具有全部或部分功能的部分酶，或当部分酶混合时(全部地，部分地，或仅为非功能地)，自然与一个或多个其他多肽装配，重新组成含至少一种本发明法呢基转移酶功能特性的功能蛋白质。
被ABA诱导的一些基因已确定。这说明不利环境条件的ABA-诱导的耐力是复杂的多基因事件。这样，识别及转移信号基因进入农作植物中，由于对ABA反应的增加，以改进植物在不同环境条件下的生存能力，这是很新颍的并且非常有用。
为了识别可能是ABA-调节植物过程的全局控制物的基因，在一些植物物种中使用基因筛查，以分离改变植物对激素反应的突变。
增强拟南芥种子对ABA(era)反应的突变，可通过它们在通常使野生型植物(对照物，如自然生长的)种子发芽的低浓度ABA下能预防种子发芽来确定。其中，era1突变类型，其包括一种转运DNA(T-DNA)系(era1-1，生态型Wassilewskija)和两种中子-产生的突变(era1-2,era1-3，生态型Columbia)，因为这种era1突变类型在正常吸收后作用下显示降低的发芽率，所以引起更多的关注。一般来讲，增强ABA反应的突变应是休眠更深的。通过4天的冷冻处理，era等位基因的休眠减弱；随着种子冷冻时间增长，era1发芽率增加。在许多植物物种中，打破休眠发芽需要进行春化处理并曝露在湿润低温环境下一段时间(Baskin和Baskin,1971)。Era突变的发芽情况可反映出ABA-诱导休眠的增加状况。因此，这些种子发芽需要较长时间的春化处理。对这种论点的支持来自era的ABA生物合成突变体(abi1-1)和不敏感突变体(abi1-1和abi3-6)的双突变体构建物。在所有情况中，与era1相比，双突变体减缓了休眠程度，说明在era1种子中观察到的增强的休眠取决与ABA的合成或敏感性。
除了拓宽新ABA反应突变体的型谱，超敏感性筛查也用来识别ABA敏感性的负调节基因。也就是，对这些基因功能抑制增强了ABA反应。这些基因中的一种(ERA1)已被克隆并显示编码异源二聚蛋白质法呢基转移酶(Ftase)的β-亚单元(Cutler等人，1996)。T-DNA插入产生的era1-1突变，使得插入点侧翼植物基因组区域可被分离。使用侧翼区域作为探针，野生型cDNA和基因组克隆体被分离。对这些进行序列分析显示了含3.5kb基因组DNA的基因。这种基因含13个内含子，在
图1A-1C中以下划线标出，T-DNA在era1-1中的插入位置在内含子8中。对用EralcDNA探测的野生型DNA,era1-2，和era1-3进行Southern(DNA)分析显示，两个快速-中子等位基因含有跨越ERA1位点的删除。快速-中子突变形成诱导拟南芥中的小型删除(Shirley等人，1992)，随后用14-kb探针进行跨越ERA1位点的基因组分析，确定era1-2的删除大小约为7.5 kb,era1-3的删除稍大些。这样，全部三个era1等位基因在相同位点含有DNA中断，证实了ERA位点的同一性。
在ERA基因中最长的开放读框(404氨基酸)的概念上的翻译，产生与酵母，豌豆，和哺乳动物蛋白质法呢基转移酶β-亚单元基因序列高度相似性的蛋白质(图2和图4)(Goodman等人，1988；Chen等人，1991；Yang等人，1993)。法呢基转移酶由α和β亚单元构成，二元聚合形成酶，催化法呢基焦磷酸酯(15个碳)与含COOH-终端CaaX基元序列的蛋白质装配(Schafer和Rine,1992)，其中C指的是半胱氨酸残基，aa一般为脂族氨基酸，X可指的是半胱氨酸，丝氨酸，蛋氨酸，谷氨酸残基。植物β亚单元的两种基因在邻近COOH终端都含有约50个氨基酸的区域，在酵母和动物β亚单元基因中不含。
在酵母和哺乳动物系统中，法呢基转移酶修饰几种膜定位信号转导蛋白质。这是通过法呢基转移酶将亲脂性法呢基侧链装配到蛋白质靶标上完成的。装配法呢基基团使靶标的整体疏水性发生变化，使得蛋白质锚定在通常它与其他信号转导分子相互作用的膜中。在era1突变体中失去法呢基活性，导致种子对ABA反应增强，这说明在拟南芥中的靶蛋白质一定位于膜内以削弱ABA信号。这样，在拟南芥中的法呢基化可被认为是ABA敏感性的负调节基因的正常功能所必需的。
随后的研究显示在拟南芥中ERA1基因功能的失去，增强了成熟植物对环境逆境的耐力。如，在标准实验室条件下，比较在土壤中成长的野生型植物和era1突变体植物(24小时光照，150μE m-2sec-1,30％湿度)显示，突变体不象野生型植物一样为了维持生存频繁需要浇水(图5)。当突变体和野生型植物成长到开花时，停止浇水，观察植物随后每天的逆境迹象。与野生型植物相比，突变体植物中的水分失去显著降低(图6和图7)。
为了确定所观察的era突变体增加的干旱耐力是否与ERA1基因功能有关，构建含融合到报告基因GUS基因的ERA1启动子的转基因植物(通过将5kb ERA1启动子片段插入到无启动子的GUS T-DNA质粒中制备)。分析转基因植物显示ERA1转录表达在拟南芥的表皮组织中，这种表达是保卫细胞特异性的。ERA1表达也在植物分生组织和根须中记录到。ERA1的保卫细胞表达与突变体的干旱耐力相一致，因为这些细胞是植物水分蒸发的主要调节细胞。可以认为ERA1-调节的气孔传导率需要ERA1基因在保卫细胞中的表达。因此ERA1基因功能的失去产生对ABA有更强反应的保卫细胞，这样，就产生更强的对干旱反应的保卫细胞调节作用。因此，在高等植物中修饰法呢基转移酶表达或活性，特别是农作植物，会对植物中的气孔传导率和蒸发速率有很大的影响。
在拟南芥中的era1突变特性说明，抑制法呢基作用会增强植物中的ABA反应及农作物物种中这种酶活性的改变。对农作植物中法呢基转移酶活性的抑制可通过一些方法完成。如，不同农作物物种的同类ERA1基因的反义技术可用来减弱法呢基转移酶活性，这样增强干旱耐力。通过特异制备保卫细胞内的ERA1的反义RNA，可将合成的法呢基转移酶的量减到可模拟era突变体显型的程度。ERA1启动子的调节，发生在从桠枝分生组织到根须的一些不同组织内。通过确定使ERA1启动子在特异组织表达的要素，使制作仅适合一种组织或细胞类型，如保卫细胞的反义ERA1表达成为可能。
在植物中抑制法呢基转移酶活性的另一种方法是，在转基因植物中制备法呢基作用的特异肽抑制剂。在哺乳动物和酵母系统中，使法呢基基团装配到特异蛋白质上的羧基终端靶序列(CaaX，其中C=半胱氨酸，x=脂族，X=任何氨基酸)已清楚确定。模拟这些靶序列的肽已被制备，并显示在这些系统中抑制内源靶蛋白质的法呢基作用。并且，CAIM在拟南芥活体内是法呢基化的。这样，类似的抑制剂可于高等植物以竞争抑制活体内法呢基转移酶。此外，这也可通过在转基因植物中表达抑制剂肽完成，通过合成CaaX肽的DNA序列并将其融合到保卫细胞特异启动子内。在这两种方法中，使用适当的启动子，可特异性地靶中和控制反义法呢基转移酶或肽抑制剂。
这样，本发明提供了一种制备耐干旱植物的方法，其包括制备包括可与含有或编码SEQ ID NO:1反义序列的核酸，或与含有反义序列功能等同物的核酸可工作联接的启动子的核酸构建物；将核酸构建物插入到载体中；用载体转化植物，组织培养物，或植物细胞；培养植物或从组织培养物或植物细胞再生植物；其中，制备了耐干旱植物。可使用这种方法的情况是，其中核酸是从下列基团中选取的，含25-100个或更多个与SEQID NO:1互补的连续核苷酸基团，含25个或更多个SEQ ID NO:1的连续核苷酸或其互补体的寡聚核苷酸，或编码法呢基转移酶的抑制剂肽的核酸。
除了对ABA非常敏感的气孔调节外，era植物还表现出在干旱条件下延迟衰老现象，说明法呢基作用负调节拟南芥内的一些干旱诱导反应。在正常实验室条件下生长的era植物用更长的时间变黄。在野生型植物衰老死亡后，突变体植物长时间保持绿色并存活。Era突变体植物的离体叶子不象野生型植物的离体叶子一样快速变黄(图8)。将发育相同的大小相似的野生型植物和era植物叶子取下，并置于含琼脂的陪替氏培养皿上(参阅实例7)。通常，野生型叶子在约5天后失去叶绿素并最终脱色。突变体植物叶子保持绿色两倍长的时间。因为叶子持续与琼脂接触，它们不是在干旱逆境中，说明era1突变体的减缓衰老不是干旱诱导现象。
另外，在10小时白天/16小时夜晚循环下，植物生命周期可以是野生型植物的两倍(3个月)。因此，看来era突变体中叶绿素换新率和衰老信号被改变了。如，野生型植物和突变体植物在充分水分条件下在罐中培养到发育阶段，野生型植物叶子开始衰老(约在花发育阶段)。在这个时候，通过Northnern印迹分析对发育相同的叶子进行衰老诱导标记基因检测(实例8)。两种基因，SAG12和SAG13，它们通常在野生型植物衰老期间基因内转录被诱导，但在era1突变体中不被诱导(图9)。并且，保持CAB转录(图9)。综合起来，这些结果说明在era1突变体中的衰老诱导程序与野生型植物相比被延迟了，表示即使在水分逆境不是环境因素的条件下，法呢基作用活性的降低也会迟滞植物的衰老诱导。
除了对衰老和水分失去的影响，当在昼夜光照循环下培养时，era1突变体显示出在分枝和开花习性上的不同。在连续光照下(24小时光照/天)，突变体的分枝模式与野生型植物没有不同。然而，当给予一定的黑暗时间时，突变体不象野生型植物一样产生许多侧枝。测量的结果是，与每株野生型植物产生3.6个侧枝相比，每株法呢基作用活性失去的植物仅产生2.4个侧枝。这表示每株植物减少30％的侧枝。
开花也受法呢基转移酶活性失去的影响。每株缺少法呢基转移酶活性的植物(25-30个花蕾/花序)比每株野生型植物(10-15个花蕾/花序)产生更多的花。这样，突变体上的花蕾平均是野生型植物上的两倍。
缺失一定功能的era1突变体对整体植物发育的这些多效影响说明，ERA1基因可以是一些植物发育功能的协调调节基因。
直到现在，在高等植物中还没有法呢基作用的功能已被了解，包括ABA信号转导的作用。法呢基转移酶已在许多高等植物如番茄和豌豆中发现，所以这种酶具有跨越物种界限的功能这一点很清楚。并且，法呢基转移酶靶肽的过量产生或使用法呢基作用抑制剂可完全抑制哺乳动物和酵母系统中的法呢基转移酶。这样，同样的抑制剂可使用在高等植物上以抑制活体内法呢基转移酶。在两种情况中使用适当的启动子，可特异地靶中及控制反义法呢基转移酶或肽抑制剂。
法呢基作用缺失突变体对外源植物生长素也是超敏感的。这些突变体表现出分枝减少及在分裂组织中较小的变化，可用改变植物生长素的调节作用来解释。这样，其他激素功能在这种突变体中受到影响，这说明除了ABA途径，其他激素调节途径也受法呢基转移酶活性控制。这些结果显示ERA1基因提供分子机能以协调不同激素信号分子的调节作用。
根据本发明，包括在本发明范围内的植物有植物界中的高等植物和低等植物。成熟植物、秧苗和种子也包括在本发明的范围内。成熟植物包括秧苗后发育的任何阶段的植物。秧苗是非常年幼，在发育早期的未成熟植物。本发明也提供植物部分，原生质体和组织培养物。
具有era1突变的表型特征的转基因植物也包括在本发明的范围内。本发明也提供转基因植物的种子，这些种子可用来繁殖更多含本发明的构建物的植物。
在一些农作植物中ERA1功能可以被抑制，以增强植物对需要ABA调节信号的不利环境条件的反应。控制高等植物的法呢基作用调节了胚胎和植物性组织对这种激素的反应(Cutler等人，1996)。增加的敏感性转变为组织对逆境条件的快速反应，从而给环境逆境中的植物带来增加的保护性。因为这仅需要对单一基因，即ERA1的控制，所以通过控制这种酶的合成或活性来控制各种植物中法呢基作用应是可能的。并且，本文所描述的研究清楚地表明，通过改变控制ABA反应的基因来改变ABA信号转导途径，使改进植物对不利水分逆境条件的反应成为可能。
为了制备本发明的转基因植物，可通过本领域中技术人员已知或已使用的方法，将包括编码法呢基转移酶的基因构建物，或编码其功能等同物的核酸，和启动子整合到载体中。启动子可以包括全部或部分的SEQ ID NO:3。构建物也可包括任何其他必要的与编码序列可工作地联接的调节因子，如终止子或类似因子。在该构建物中包括5’前导序列，如从紫花苜蓿嵌合病毒的外被蛋白mRNA获取的非翻译前导序列(Jobling,S.A.和Gehrke,L.1987自然325∶622-625)或玉米萎黄病色斑病毒(MCMV)前导序列(Lommel,S.A.等人，1991滤过性微生物学81∶382-385)等，将是有益的。本领域的技术人员可认识到用作不同目的其他前导序列的适用性。
靶标序列也是有用的，也可整合到本发明的构建物中。靶标序列通常被翻译成肽，指导编码核酸序列的多肽产物到细胞内所需的位置上，如到质粒上，并在肽转换完成后从肽分离出来或随转换同时存在。用于本发明中的靶标序列实例包括但不限于，酵母线粒体RNA前序列(Schmitz等人，1989，植物细胞，1:783-791)，从烟草致病原因有关基因(PR-1)中获取的靶标序列(Cornellisen等人，1986,EMBO J.5:37-40)，液泡靶信号(Chrispeels,M.J.和Raikhel,N.V 1992细胞68:613-616),分泌途径序列如ER或Golgi(Chrispeels,M.J.1991，植物生理学和植物分子生物学年刊，42:21-53)。内细胞器序列对内部位点，如叶绿体内的类囊体也是有用的(Theg,S.M.和Scott,S.V1993细胞生物学趋势，3:186-190)。
除了5’前导序列，终止序列通常也包括在构建物中。在植物构建物中，3’非翻译区域(3’UTR)一般是表达质粒的一部分，并含polyA终止序列。使用的终止区域通常是一种方便区域，因为终止区域呈现出相当的可互换性。从根瘤农杆菌(A.Tumefaciens)的Ti质粒获得的章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区域，在本发明的构建物中用作这种用途是适合的。
任何适用的技术可用来引入本发明的核酸和构建物，以制备带有改变基因组的转基因植物。对于禾本植物如玉米，可使用微型射弹轰击法(参阅如，Sanford J.C.等人的美国专利第5,100,792号，1992)。在这个具体实施中，核苷酸构建物或含这种构建物的载体涂在小颗粒的表面，小颗粒用高速弹子穿击而引入到靶组织(细胞)内。载体可以是任何允许外源DNA在引入该载体的植物细胞内进行表达的载体。然后将转化细胞在适合植物再生的条件下培养，产生转基因植物。
使用多种方法对带有构建物的转基因植物进行所需要的表型的检测，这些方法包括但不限于，适当的表型标记，如对抗生素或除草剂的抵抗性，或与自然生长植物相比，对花诱导时间的视觉观察。
其他已知的将核酸构建物插入到植物中的方法包括农杆菌属(Agrobacterium)-调节转化法(参阅如Smith,R.H.，等人的美国专利第5,164,310号,1992)，电穿孔法(参阅如Calvin,N.等人的美国专利第5,098,843号，1992)，使用激光束引入法(参阅如Kasuya,T.等人的美国专利第5,013,660号，1991)，或使用试剂如聚乙烯乙二醇引入法(参阅如Golds,T.等人，1991,生物技术，11∶95-97)，等等。通常，根据已熟知的技术，植物细胞可用多种载体转化，如病毒，游离基因载体，Ti质粒载体等等。对于本发明，将核酸引入植物细胞的方法不是至关重要的。
本发明的方法可与不需要培养或再生的in planta或种子转化技术一起使用。这些技术的实例在下列文献中公开了，Bechtold,N.等人，1993 CR.Acad.Sci.巴黎/生命科学316∶118-93；Chang,S.S.等人，1990，关于拟南芥研究第四次国际会议摘要，维也纳，P.28；Feldmann,K.A.和Marks,D.M.1987,Mol.Gen.Genet.208:1-9；Ledoux,L.等人，1985,Arabidopsis Inf.Serv.22:1-11；Feldmann,K.A.1992,In拟南芥研究方法(Eds.Koncz,C.,Chua,N-H,Schell,J.)pp.274-289；Chee，等人美国专利序第5,376,543号。
转录开始区域可提供组成表达和调节表达。除了ERA1启动子，在植物中起作用的许多启动子可以使用。
植物基因表达的组成启动子包括但不限于，章鱼碱合成酶，胭脂碱合成酶，或从农杆菌属获取的甘露碱合成酶启动子，花椰菜嵌合病毒(35S)启动子，玄参嵌合病毒(FMV)启动子，及烟草嵌合病毒(TMV)启动子。植物基因组成表达也可由谷酰胺合成酶启动子(Edwards等人，1990 PNAS 87:3459-3463)，玉米蔗糖合成酶1启动子(Yang等人，1990 PNAS 87:4144-4148)，从Ri质粒TLDNA的Rol-C基因获取的启动子(Sagaya等人，1989，植物细胞生理，30:649-654)，和pRVC-S-3A启动子的韧皮-特异区域(Aoyagi等人，1988,Mol.Gen.Genet.213:179-185)提供。
热击启动子，核酮糖-1,6-双磷酸盐(RUBP)羧基酶小亚单元(ssu)启动子，组织特异启动子等等也可用来调节植物基因的表达。也可使用发育调节，逆境诱导，伤害诱导或致病诱导启动子。
调节区域可对物理刺激反应，如光照，如用RUBP羧基酶ssu启动子，分化信号，或代谢物刺激。有义和反义取向表达水平和时间对所产生的表型有一定的影响。因此，启动子的选择，与外源DNA取向的偶联，在基因组中载体整合位置，将决定引入基因的效果。
调节启动子的具体实例包括但不限于，低温Kin1和cor6.6启动子(Wang，等人，1995植物分子生物学28:605；Wang，等人，1995植物分子生物学28:619-634),ABA可诱导启动子(Marcotte Jr.等人，1989植物细胞1:969-976)，热击启动子，如从Drosphilia melanogaster获取的可诱导hsp70热击启动子(Freeling,M.等人，1985，年刊修订本，基因学19:297-323),从B.napus获取的可冷诱导启动子(White,T.C等人，1994,植物生理学，106:917)，由乙醇诱导的乙醇脱氢酶启动子(Nagao,R.T.等人，Miflin,B.J.，植物分子和细胞生物学牛津概观Vol.3,p384-438，牛津大学出版社，牛津1986)，从拟南芥获取的韧皮特异蔗糖合成酶ASUS1启动子(Martin，等人，1993植物J.4:367-377),ACS1启动子(Rodrigues-Pousada等人，1993植物细胞5:897-911)，从玉米获取的22kDa玉米蛋白启动子(Unger等人，1993植物细胞5:831-841)。豌豆ps1植物凝集素启动子(de Pater等人，1993植物细胞5:877-886)，从Phaseolusvulgaris获取的phas启动子(Frisch等人，1995植物J.7:503-512),lea启动子(Thomas,T.L.1993植物细胞5:1401-1410),从番茄获取的E8基因启动子(Cordes等人，1989植物细胞1:1025-1034),PCNA启动子(Kosugi等人，1995植物J.7:877-886),NTP303启动子(Weterings等人，1995植物J.8:55-63),OSEM启动子(Hattori等人，1995植物J.7:913-925)，从土豆获取的ADP GP启动子(Muller-Rober等人，1994植物细胞6:601-604)，从大麦获取的Myb启动子(Wisenbach等人，1993植物J.4:411-422)，和从拟南芥获取的质体蓝素启动子(Vorst等人，1993植物J.4:933-945)。
载体可用适合宿主细胞类型的方法引入细胞(如转化法，电穿孔法，转染法)。对本文来说，“用…转化的”,“转化体”,“转化”“用…转染”，和“转染”都是指通过一种本领域技术人员已知的方法将核酸引入细胞内的过程。如，原核细胞的转化一般通过用氯化钙处理细胞以使它们有能力接纳外源DNA，然后混合这样的DNA和“有能力”细胞而实施的。原核细胞也可用重组体噬菌载体感染。
取决于具体细胞类型，也可采用病毒感染法，细菌调节转移法(如Agrobacterium T-DNA运送系统)，电穿孔法，磷酸钙共沉淀法，微注射法，脂转染法，用核酸覆盖颗粒轰击法或其他技术，将核酸引入高等有机体的细胞内。对于禾本植物如农作物和高梁属植物，可使用如在Sanford,J.C.等人的美国专利第5,100,792号(1992)中所描述的微粒轰击法。植物细胞转化的其他有用方案在Gelvin等人1992的文献中提供。转化及转染细胞的适用方案也可在Sambrook等人1989的文献中找到。通过本文所描述的转化和转染技术，本发明的核酸构建物也可被引入到如前面所描述的那些具体的植物部分中。
为了帮助确定转化的植物细胞，可对本发明的构建物进行进一步的加工以包括编码植物可选择性标记的基因。有用的可选择性标记包括提供对抗生素如庆大霉素、匀霉素、卡那霉素等有抗性的酶。同样地，提供产生通过颜色改变可识别的化合物如GUS(β-葡萄糖苷酸酶)，或通过发光可识别的化合物如荧光素酶的酶也可使用。
如，反义法呢基转移酶可通过将与含SEQ ID NO:3 DNA联接的ERA1基因的互补体，整合到进入宿主细胞的病毒基因组内来制备。通过感染宿主细胞，允许反义基因的转录的系统的组成就存在于宿主细胞中。
当获得被本发明的启动子驱动的含反义基因的细胞和原生质体时，细胞或原生质体再生成整体植物。然后在适合植物再生的条件下培养转化细胞，产生转基因植物。选择再生步骤的方法不是至关重要的，已经存在着众多的适用于植物，组织和其他光合有机体的适当方案。参阅如Gelvin S.B.和Schilperoort R.A.eds.植物分子生物学手册，第二版，增刊1,1995 Kluwer学院出版社，波士顿，马萨诸塞州，美国。
可使用多种方法对带有构建物的转基因植物进行所需要的表型的检测，这些方法包括但不限于，适当的表型标记，如对抗生素或除草剂的抗性，如前所述，或视觉观察生长状况，与在相同的条件下自然生长植物的生长状况相比较。
在本文所使用的术语，转基因植物，包括，含在野生型植物(天然的)或已知变异体中不是自然产生的DNA或RNA的植物，或含如本文所描述的方法引入的自然产生的DNA另外的或反向复制体的植物。转基因植物包括其中分离核酸已被引入的植物，和由种子，营养性繁殖，细胞，组织或原生质体培养物等产生的其中维持着这种改变的它们的后代。
在一个具体实施中，这样的转基因植物包括，转基因植物是被子植物，单子叶植物和双子叶植物。转基因植物包括DNA已被引入的植物，和由种子，营养性繁殖，细胞，组织或原生质体培养物等产生的它们的后代。
种子可从再生植物获得，或从再生植物和适当的同物种植物杂交获得。另外，植物也可通过在适合这种植物部分再生的条件下，培养植物部分进行营养性繁殖而获得。
另一方面，本发明提供了植物组织培养物和原生质体，其中含有包括反义基因或可与REA1启动子可工作地联接的改变的ERA1核酸的DNA，这改变了植物组织或原生质体对不同环境条件的反应。
本发明的方法还与不需要培养或再生的in planta或种子转化技术一起使用。这些技术的实例在Bechtold,N.等人，1993 CR.Acad.Sci.巴黎/生命科学316:118-93；Chang,S.S.等人，1990,关于拟南芥研究第四次国际会议摘要，维也纳，P.28；Feldmann,K.A.和Marks,D.M.1987,Mol.Gen.Genet.208:1-9；Ledoux,L.等人，1985,Arabidopsis Inf.Serv.22:1-11；Feldmann,K.A.1992,In:Arabidopsis研究方法(Eds.Koncz,C.,Chua,N-H,Schell,J.)pp.274-289；Chee，等人美国专利第5,376,543号中作了描述。
具体实施本发明的方法和构建物有许多具有商业价值的应用，特别是在水分逆境期间预防植物组织干燥方面。掺入法呢基转移酶的抑制剂或抑制编码外源植物法呢基转移酶的基因，对农作植物的基因加工会使这样的植物能忍耐暂时的环境逆境，并能拓宽这些植物可以生长的环境。这样改进农作植物对寒冷，盐度和干旱逆境的耐力，可提高植物在这样的不利条件下的产量。
本文所描述的技术也可用来改变植物的收获时间和收获质量。如，过度表达法呢基转移酶会导致农作物快速干燥，如谷物和其他禾本植物。干燥谷物包括使用大量的丙烷气体。农作物如干草的干燥时间，在田地里自然干燥会被缩短，使雨水对农作物毁坏的可能减小。
此外，对植物法呢基作用的抑制也可用来控制植物的衰老程序，这样叶子可以保持在绿色状态更长些，果实可以保持不成熟。例如，如果将ERA1的反义构建物或CaaX框抑制剂蛋白质构建物置于衰老诱导启动子的控制下，那么当衰老程序被启动，植物会诱导法呢基作用的抑制剂，这样聚抑制了衰老。结果是植物保持绿色或果实保持不成熟。这样，植物会坚持更长时间来生产产物，如营养性部分，花或果实。这样，园艺师可以制备出保持绿色并持续生长的植物，在相同的条件下，相同种类的野生型植物甚至开始衰老了。切花可被保持更长的时间。或果实可保持不成熟，对蔬菜工业是重要成果，产物寿命对市场是非常重要的。
并且，抑制果实和蔬菜中的法呢基转移酶可减缓枯萎。这样，在运送和运输期间产物的枯萎能被减缓。果实和蔬菜在商店货架上也会需要较少水雾以保持它们的新鲜和味道，这样就较少需要给产物如黄瓜，苹果和橙子涂蜡以防止它们变干。
较少浇水也意味着真菌和细菌对农作物，或果实和蔬菜的袭击会减小。如，由于植物病原体从土壤飞溅到植物叶子和果实而产生的田地中的植物疾病会被抑制。
在园艺领域中，可制备许多抗干旱植物品种用来美化风景及用作装饰房屋的植物。特别有价值的是用作盆栽的各种植物，如用作办公室和家居内外的装饰，并且不常浇水也能存活。这对园艺师来说是相当实惠的，特别在干旱夏季的几个月期间，忘记照顾的植物在太阳下很快变干。并且，生长在树下和其他阴暗区域内的植物常常遭受干旱条件和有限的光照。本文所提供的技术可提供在这些条件下能较好生存的植物品种。
在另一个具体实施中，园艺师会发现其侧分枝和/或花的数目可用光照/黑暗循环来调节的植物的许多用途。茎干较长且无分枝会带来市场利益的植物实例包括玫瑰，康耐馨，百合等。能增加植物上的花或菊科小花的数目也具有很高的价值。这些特性对于许多农作物也是有用的，使用更容易收获的方式使产量增加。
本文提供的方法和构建的另一个优点是，ERA1启动子在叶子的保卫细胞中是活性的。部分ERA1基因启动子可融合到ERA1基因的反义核酸中，这样法呢基转移酶的活性只在保卫细胞中被减小。
另一个具体实施是使用抗干旱特性作为植物，植物细胞，植物组织转化作用的可选择标记。检测植物转化作用的一种方法包括(a)掺入含可与含SEQ ID NO:1反义基因核酸，或含反义基因功能等同物的核酸可工作地联接的启动子的核酸构建物；(b)将核酸构建物插入到植物，植物细胞，或植物组织中；(c)培育植物，或从植物细胞或植物组织再生植物直到气孔形成；(d)将植物或再生植物置于植物处于干旱逆境条件下，其中在干旱条件下存活植物与未转化植物相比较说明转化。这样这种技术可用作可选择的基因标记，如特别当与植物选择和转化设计结合时可用作视标记。
此外，在没有采取措施处理基因植物的情况下，失去法呢基转移酶功能的植物的分枝和或开花习性与野生型植物显著不同，这可用作转化成功的标记。在采用植物中(in planta)转化技术的领域中，这种方法非常有用。在昼夜光照条件下，转基因植物的桠枝显示比未转化的桠枝较少分枝，这样在没有使用选择性抗生素标记的情况下，有效显示出法呢基转移酶活失去。实例实例1突变发生条件本研究所使用的拟南芥(Arabidopsis)植物在连续光照在土壤或含琼脂的陪替氏培养皿中培养，如在其他文献中所描述的(Haughn和Somerville)使用两种不同的野生型拟南芥Meyerowitz的Colombia(Col)(Lelhe种子，Dripping Springs,TX)和Wassilewskija(Ws)(ABRC，俄亥俄州立大学)。将用筛查T-DNA基因突变种子分离出的突变体置于Wssailewkija背景中。这些从俄亥俄州拟南芥种子储备站(ABRC储备号CS2606-2654)获得。T-DNA种子站包括从100个基因突变亲体获取的49组1200个第四代(T4)后代。基因突变亲体是通过在充满农杆菌属的含T-DNA质粒的培养物中培育野生型种子(T1)获得的。种子用水冲洗并种在罐中。T2代种子从每株植物获得并作抗卡那霉素试验(在T-DNA上实施)。抗卡那霉素植物培育到T3代。T4代种子交给储备中心。每组独立筛查。
将通过筛查快速中子照射过的种子分离的突变体置于Meyerowitz的Columbia背景中。基因突变的野生型种子(N1)用60Gy的快速中子照射并培育到下一代。获得从1387个N1亲体产出的约11,000个种子的N2种子库。十个种子库独立进行ABA超敏感突变筛查。在初始筛查时种子保存在4℃不吸胀置于板上。所有后面重筛查的种子在4℃0.3μM ABA下吸胀一周，并评定在22℃光照下5-7天后的子叶突出体。
实例2基因分析突变体组与野生型植物反交三次。T-DNA突变与Ws反交，快速中子突变与Mcol反交。Era表型隔离后，将F2种子覆在0.3μM ABA板上并吸胀4天。吸胀后，将板转移到室温光照下。在吸胀后一周当秧苗上存在或不存在张开的子叶时测定发芽。通过杂交隔离后每种突变的纯合子组，及识别带有一种突变体显型的组构建双突变体。使用在本研究中的abi3等位基因是abi3-6(Nambara等人，1994)和abi1-1(Koornneef等人，1982)。Era1-2等位基因用作era亲体。隔离分析显示era1部分地抑制abi1的不敏感性，这样，F2植物首先被筛查到对3mM ABA不敏感性，对从这些植物获取的F3种子评定对0.3μM ABA敏感性。推定双突变体是在F4代中测试的后代，并通过Abi1和Era1的DNA多态性证实。对于era1和abi1双突变体，对F2种子筛查不敏感性(对3μMABA)，对突变体植物进行突出心皮和不成熟绿色种子评定(Nambara等人，1994)。推定的双突变体组被Abi1和Era1的DNA多态性证实。
实例3:DNA和RNA分析用已描述的方法提取DNA(Dellaporta等人，1983)和RNA(Verwoerd等人，1989)。如所描述在65C实施高度严紧Southerns(Sambrook等人，1989)。依据制造商(Gelman Sciences)建议在Gelman BioTrace NT膜上实施基因组和cDNA文库筛查。克隆T12W突变体(era1-1)内的T-DNA和基因组DNA之间插入结合点，T12W DNA文库在γ-ZAPⅡ(Stratagene)中制备。用EcoRI消化及用T-DNA右边探测的T12W DNA的基因组Southern印迹产生三条带(13kb,7.0kb，和8.0kb)。随后用其他限制酶证实7和8kb的带含T-DNA的插入点，并是侧翼植物DNA。通过用EcoRI消化基因组DNA克隆这些片段，使用Prep细胞(Pharmacia)分级分离DNA。使用PB作探针，通过对汇集分级进行Southern分析确定分级含7和8kb片段。依据制造商建议(Stratagene)将这些汇集体结合在γ-ZAPⅡ臂上。对40,000重组体文库进行筛查。确定5个阳性噬菌斑，并依据制造商建议(Stratagene)分离克隆插入的切除质粒形式。选定pL4B和pL7的两个质粒，与PB探针杂交进一步定性。使用pBluescript，从pL4B获取的2.3kb的EcoRI BamHⅠ片段亚克隆，选定pSC10，从pL7获取的1.3kb的HindⅢ BamHⅠ片段亚克隆，选定pSC11。这两个质粒含约1.2kb T-DNA与侧翼植物DNA相连。将pSC10用作探针筛查拟南芥cDNA文库，PRL21-ZipLox(ABRC,StockCD4-7)。确定5个cDNA和最长的cDNA插入，pZL23，用来筛查其他200,00 PRL2噬菌体。从这次筛查，较长cDNA插入，pZL51,(1.35kb)被分离。测序这些克隆体，并用来筛查从部分消化的EcoEI野生型Columbia基因组DNA制备的30.000γ-ZAPⅡ噬菌斑。如上所述除了不分级分离消化的DNA构建这种文库。确定4个阳性克隆体。插入被切除，对含pZL51克隆的6kb区域进行彻底测序。用同样的方法(ABRC,Stock CD4-7)。可将从1-FIX Lansberg erecta基因文库中分离的这种基因组插入和14kb基因组插入用作探针,以筛查在快速中子突变体(era1-2,era1-3)中的删除部分。
实例4蛋白质法呢基转移酶测试使用从野生型植物和突变体植物中提取的游离细胞作为法呢基转移酶源，合成七肽作为反应底物，实施法呢基转移酶(Ftase)测试。肽从Genemed生物技术公司购得。肽的适当序列以Randall等人的1993年资料为根据；它们是GGCCAIM(-CAIM)和GGCCALL(-CALL)。肽溶液制备在含10mM的二硫苏糖醇(DTT)的100％二甲基亚砜(DMSO)中，并用无DNSO的10mM DTT稀释。作转移酶测试的法呢基转移酶源是取自三周大的植物萌芽的可溶蛋白质。收集1g野生型植物和突变体植物的萌芽(鲜重)，并均匀分布在(含50mM Hepes pH7.5,1mMMgCl2,1mM EGTA,5mM DTT,2μg/ml亮肽素，2μg/ml抑肽素，和1mM PMSF)缓冲液中。在4℃,10,000g 10分钟和100,000g,30分钟离心分离细胞碎片和膜。保留留在表面的物质,依据Bradford(1976)测定可溶蛋白质的总量。可溶提取物用肽底物和3H-法呢基焦磷酸酯(Amershem)在30℃温育40分钟。每种总体积25μl的反应混合物含有下列组分50mMHepes pH7.5,5mM MgCl2,5mM DTT,50μM肽，0.5μM[3H]FPP,100μg可溶蛋白质提取物。作为对照一个含可溶提取物的反应煮沸5分钟。加入EDTA到最终浓度为50mM反应终止，然后点在薄层硅胶60色谱板上(Millipore)。用n-丙醇-水(7∶3v/v)将板显影4-5小时。干燥板，用En3Hance(新英格兰Nuclear)喷洒，在-70℃，对柯达X-OMAT AR胶片曝光4天。
实例5:ERA1-GUS基因构建和转基因植物ERA1-GUS融合构建是通过将ERA1启动子的5kb EcoEⅠ-HindⅢ基因组片段插入到无启动子的GUS T-DNA质粒(pBI121)中制备的。将这种构建转化成农杆菌属菌株LB4404。将农杆菌属培育到(0.8O.D.单位，595nm)，然后用水彻底冲洗，将细胞重新悬浮在10％甘油中，在电穿孔器中在200 Ohms,25μF,2.5伏特下脉冲处理。然后将细胞铺在有LB介质和氨比西林(100μg/ml)板上，并在28℃培育2天。抗氨比西林转化株使用在随后的植物转化试验中，用充满农杆菌属的培养物(0.8O.D.单位，595nm)真空渗透植物制备转基因植物。野生型植物在标准实验室条件(25℃,150μEm-2sec-1，湿润，连续光照)下培育，直到约5周它们产生它们的最初抽苔。移出茎干，并将植物浸没在农杆菌属溶液中，置于真空(20mBar)下5分钟。真空中断后将植物转移到土壤中，并在标准实验室条件下恢复。植物产生2个月后收获的新的花和种子，并干燥2周。从个体植物获取的种子种在最小限度介质MS的培养皿(含50μg/ml卡那霉素)上。确定绿色抗卡那霉素植物小芽，并将其2周后移到土壤中，使其培育到接种。将这些种子发芽，使用荧光GUS底物Imagene绿(分子探针，Eugene,Oregon)检测秧苗的GUS活性。在室温下黑暗中，通过将秧苗悬浮在GUS-缓冲液(50mM磷酸钠，pH7.0,10mM EDTA,0.1％Triton X-100,0.1％sarcosyl钠，4mM Imagene绿)中2-4小时来实施检测。将秧苗直接在显微镜(25X)下观察，对正荧光信号使用蓝色激发光，其在红色叶绿素自荧光背景上呈黄色。
实例6干旱试验六株野生型秧苗和六株era1-2秧苗在连续光照(25℃,150 μEm-2 sec-1,70％湿度，连续光照)下培育4周。然后用锡纸将罐盖住以减缓土壤蒸发，植物和罐称重。这时，不再给植物浇水，每天称重罐。在试验的最后将植物移出，将罐再干燥两周，然后称重以确定干燥土壤和罐的重量。将这个重量从每个样品中减去。
实例7离体叶子中与年龄有关的变化当拟南芥植物成年叶子离体后，将野生型Columbia和era1-2突变体成年叶子中的叶绿素含量作比较。植物在连续光照(150μE m-2sec-1)和22℃温度下培育到相同的发育年龄(发芽后3周)。这时，摘掉发芽后已长出叶子的几株植物的第五片叶子，并将其置于陪替氏培养皿中含最小限度盐的0.8％琼脂上。将植物密封并置于连续光照(50μE m-2sec-1)环境中12天。拍摄并比较0,3,6,9,12天的颜色。
实例8在衰老叶子中选择基因的转录水平确定植物在连续光照(150μEm-2sec-1)和22℃温度下培育到相同的发育年龄(发芽后4周)，这时，摘掉突变体(era1-2)植物和野生型植物发芽后长出的第五片叶子。用Northern分析对这些叶子作三种基因(CAB,SAG12,SAG13)表达的检测。CAB基因编码涉及光合作用中捕获光的拟南芥叶绿素结合蛋白质。CBA对于叶子绿色是必需的，并且它也是植物中叶绿素换新率很好的标记。一旦衰老被诱导，野生型植物中CBA显示转录水平降低。在era1-2突变体的衰老叶子中没有观察到转录水平降低。SAG12和SAG13是衰老期间由差异表达克隆的拟南芥基因(SAG表示衰老激活基因)。在野生型拟南芥植物中衰老开始期间两种基因的转录都被诱导。可以确定这些基因在相同的发育条件下在era-2突变体中没有被诱导。
参考文献Baskin,JM和Baskin,CC(1971)在Can J Bot 50:277的文献。Chandler,PM和Robertson,M(1994)由落叶酸调节的基因表达及其与逆境耐力的关系。Ann Rev植物生理和植物分子生物学45:113-141。Chen,W-J,Anders,DA,Goldstein,JL,Russell,DW, Brown,MS(1991)细胞66:327。Cutler,S,Ghassemian,M,Bonetta,D,Cooney,S,McCourt,P(1996)在拟南芥中涉及落叶酸信号转导的蛋白质法呢基转移酶。科学273:1239-1241。Dellaporta,S.L.Wood,J.和Hicks,J.B.(1983)。植物DNA的微量制备译本Ⅱ，植物分子生物学，Rep.1:19-21。Eisenmann,D.M.和Kim,S.K.(1994)。Caenorhabditis elegans阴门发育期间信号转导和细胞fate特异性。Curr.Opin.Genet.Dev.4:508-516。Ellington,A.(1987),DNA的制备和分析。分子生物学最新方案，F.Ausubel等人，eds.(Boston,Greene).pp.2.0.1-2.12.5。Goodman,LE,Perou,CM,Fujiyama,A,Tamanoi,F(1988)酵母4:271。Haughn,G和Somerville,C.R.(1986),Arabidopsis thaliana的抗磺脲突变体，Mol.Gen.Genet,204:430-434。Koornneef,M,Reuling,G和Karssen,CM(1984),Arabidopsisthaliana的落叶酸不敏感突变体的分离和特性，植物生理学，61:377-383。Leung,J,Bouvier-Durand,M,Morris,P-C,Guerrier,D,Chefdor,F,和Giraudat,J(1994)拟南芥落叶酸反应基因ABI1钙调节蛋白质磷酸酯酶的特性，科学264:1448-1455。Meyer,K,Leube,MP，和Grill,E(1994)Arabidopsis thaliana中涉及落叶酸信号转导的蛋白质磷酸酯酶2C，科学264:1452-1455。Randall,SK,Marshall,MS,Crowell,DN(1993)，悬浮培养烟草细胞的蛋白质异戊二烯基化作用，植物细胞5:433-442。Reid,JB，和Howell,SH(1995)，植物生长及发育中激素的功能，植物激素生理学，生物化学及分子生物学，2nd ed.P.Davies ed.(Dortrencht Kluwer)PP.448-485。Sambrook,J.,E.F.Fritsch和Maniatis,T.(1989).分子克隆实验室手册，第二版(寒春码头，纽约寒春码头实验出版社)。Schafer,WR，和Rine,J(1992)，蛋白质异戊二烯基化作用基因，酶，靶和功能，Ann Rev Genet 30:209-237。Shirley,BW,Hanley,S,Goodman,HM(1992)植物细胞4:333。Verwoerd,T.C.,Deeker,B.M.M和Hoekema,A.(1989)，植物RNA快速分离小规模技术，核酸研究17:2362。Yang,Z,Cramer,CL，和Watson,JC(1993)植物蛋白质法呢基转移酶，植物生理学101:667-674。
权利要求
1．一种分离的核酸，其包括SEQ ID NO:1或其功能等同物。
2．一种分离的核酸，其包括20-200个SEQ ID NO:1的连续核苷。
3．一种分离的核酸，其(a)在高度严紧条件下与权利要求2的DNA杂交；(b)与权利要求1的DNA有80％的相同序列；(c)含有权利要求2的DNA的互补序列。
4．一种分离的蛋白质，其包括SEQ ID NO:2或其功能等同物。
5．一种多肽，其与权利要求2的蛋白质有80％的相同序列。
6．一种分离的核酸构建物，其包括(a)启动子；以及(b)编码植物法呢基转移酶抑制剂的核酸。
7．一种转基因植物，其含有根据权利要求6的核酸构建物。
8．根据权利要求7的转基因植物的种子。
9．一种植物部分，其含有根据权利要求6的核酸构建物。
10．根据权利要求7的转基因植物，其中植物是单子叶植物。
11．根据权利要求7的转基因植物，其中植物是双子叶植物。
12．根据权利要求11的转基因植物，其中植物是Brassica sp。
13．一种细胞或组织培养物，其含有根据权利要求6的核酸构建物。
14．从权利要求13的细胞或组织培养物再生的植物。
15．一种含权利要求6的核酸构建物的植物，与在相同环境条件下自然生长的相同种类植物相比具有改进的抗干旱，盐度，寒冷逆境的耐力。
16．一种含编码法呢基转移酶基因突变的植物，导致法呢基转移酶活性失去。
17．转基因植物种子，其中由于植物转化，或再生制备转基因植物的植物部分转化造成种子内法呢基转移酶活性被抑制，其中所说的转化导致法呢基转移酶活性失去。
18．一种改变植物中法呢基转移酶水平的方法，该方法包括(a)转移核酸到植物从中再生的植物细胞中，其中核酸包括在高度严紧条件下与含SEQ ID NO:1核苷酸序列的DNA杂交的分离核酸，其中所说的核酸编码法呢基转移酶活性必需的产物；(b)从植物细胞再生植物，这样植物表达核酸。
19．根据权利要求18的方法，其中的核酸包括拟南芥(Arabidopsis)法呢基转移酶基因的核苷酸序列。
20．一种制备抗干旱植物的方法，该方法包括(a)制备核酸构建物，其含可与含SEQ ID NO:1反义序列的核酸或与含反义序列功能等同物的核酸可工作地联接的启动子；(b)将核酸构建物插入到载体中；(c)用载体转化植物，组织培养物，或植物细胞；(d)从组织培养物或植物细胞培育植物或再生植物；其中抗干旱植物被制备。
21．一种检测植物转化的方法，该方法包括(a)掺入核酸构建物，其含可与含SEQ ID NO:1反义序列的核酸或与含反义序列功能等同物的核酸可工作地联接的启动子；(b)将核酸构建物插入到植物，植物细胞或植物组织中；(c)从组织培养物或植物细胞培育植物或再生植物直到气孔形成；(d)将植物或再生植物置于其中植物处于干旱逆境条件下，其中在干旱条件下存活的植物与未转化植物相比较说明转化。
22．一种减少侧分枝的方法，其中包括将编码抑制内源法呢基转移酶活性的产物的核酸引入到植物或植物细胞内。
23．根据权利要求22的方法，其中核酸是从含25-200个或更多个与SEQ ID NO:1互补的连续核苷酸，或含25个或更多个SEQ ID NO:1连续核苷酸或其互补体的寡聚核苷酸；编码法呢基转移酶抑制剂肽的核酸中选取的。
24．根据权利要求22的方法制备的植物。
25．根据权利要求22的方法制备的植物的种子。
26．一种延迟衰老的方法，其包括将编码抑制内源法呢基转移酶活性的产物的核酸引入植物或植物细胞中。
27．根据权利要求26的方法，其中核酸是从含25-200个或更多个与SEQ ID NO:1互补的连续核苷酸，或含25个或更多个SEQ ID NO:1连续核苷酸或其互补体的寡聚核苷酸；编码法呢基转移酶抑制剂肽的核酸中选取的。
28．根据权利要求26的方法制备的植物。
29．根据权利要求26的方法制备的植物的种子。
30．一种在相同环境条件下与自然生长植物相比，通过抑制植物中法呢基转移酶活性在植物中延迟衰老，维持叶绿素含量，减少侧分枝，增加每个花序的花朵数量的方法。
全文摘要
本发明的新型构建物和方法改进了植物对环境逆境和衰老的耐力。描述了编码法呢基转移酶的核酸,也描述了掺入这些核酸和蛋白质的转基因植物和种子。还提供了天然法呢基转移酶的抑制剂,当表达时,会增强植物对干旱的耐力,提高抗衰老能力,改变生长习性。
文档编号C12N15/09GK1314944SQ98808770
公开日2001年9月26日 申请日期1998年7月29日 优先权日1997年8月1日
发明者彼得·麦克康特, 马奇德·戈斯梅恩, 肖恩·卡特勒, 达里奥·伯尼塔 申请人:波夫曼斯种植公司