专利名称：回收β内酰胺抗生素的方法
技术领域：
本发明涉及从溶液中大量含有β内酰胺抗生素和D苯基甘氨酸(FG)的混合物回收β内酰胺抗生素的方法，混合物的pH调节到3和8之间，温度调节到-5和20℃之间，浓度调节到可使FG保留在溶液中，回收获得固体β内酰胺抗生素并且将残留的液体的温度升高到10和60℃，生成了固体FG，把FG以固体的形式分离，再循环母液。
通常，在用D苯基甘氨酸衍生物酰化β内酰胺核从而制备β内酰胺抗生素的过程中，β内酰胺抗生素是难于回收的，并且反应混合物难于加工。加工过程中经常基本丢失有价值的成分，特别是β内酰胺抗生素，部分是溶解性丢失，部分是由于β内酰胺抗生素的稳定性有限而降解。
本发明提供了回收β内酰胺抗生素的新概念，由此，在可以用于工业规模的简单方法中，β内酰胺抗生素的丢失强烈减少，同时回收了有价值的D苯基甘氨酸。本发明的基础是已经发现在相当低的温度时，在含有FG和抗生素的溶液中，FG可以严重地超饱和，并且可以长时间保留而没有FG沉淀或结晶。结果是，可以在低温下，通过不引起FG结晶的pH转换，使β内酰胺抗生素结晶然后把其分离，从而选择性地回收β内酰胺抗生素。另外，已经发现升高母液的温度可引起FG快速结晶，而β内酰胺抗生素并不结晶。以这种方式，可以选择性地回收FG。在前面提到的方法中，可以进行β内酰胺抗生素和FG的完全分离。
在内酰胺核和适当的酰化试剂的酰化反应过程中，特别是在利用例如D苯基甘氨酸的酰胺，例如D苯基甘氨酸的酰胺(FGA)和D苯基甘氨酸的酯，例如D苯基甘氨酸(FGM)的甲基酯的酶酰化反应中，酰化试剂水解β内酰胺抗生素形成D苯基甘氨酸(FG)。
在酰化反应后获得的混合物除了含有β内酰胺抗生素和FG之外，可能还含有仍未转换的β内酰胺核和／或酰化试剂，例如FGA或FGM。已经发现本发明方法可以利用的混合物的准确组成并不是特别关键。可以适用于本发明方法的混合物优选地是含有10-1500毫摩尔／升，特别是50-1000毫摩尔／升β内酰胺抗生素；0-1500毫摩尔／升，特别是0-1000毫摩尔／升FG；0-1000毫摩尔／升，特别是0-200毫摩尔／升β内酰胺核；以及0-1000，特别是0-400毫摩尔／升D苯基甘氨酸衍生物的混合物。
将含有β内酰胺抗生素和FG的混合物调节到一定的浓度和pH以使所有成分特别是上面提到的成分溶解。为此目的，优选地选择pH是低的，例如在0和3之间，特别是在0．3和2之间。当大规模地进行该方法时，优选地选择程度不同的连续工作过程。连续溶解过程可使残留时间在相当高或低的pH下更短。如果需要，可以通过例如过滤或超滤把仍然存在的固体成分分离。
根据本发明，通过采取措施，例如加入水，首先将可能仍然含有固体β内酰胺抗生素的混合物的pH调节到3至8之间，优选地5．5至8之间，特别是6．5至7之间，以便保证反应试剂的浓度，特别是FG的浓度达到一定水平，从而保证所有的试剂，可选地除了β内酰胺抗生素之外，不管是否达到过饱和，都保留在溶液中。温度是在-5和20℃之间，优选地在-3和15℃之间，特别是在0和10℃之间。保持相对较低的温度，因为惊人地发现在这些条件下FG可以严重地超饱和，而并不产生FG沉淀。
另外，已经发现，在β内酰胺抗生素的分离后，残留的母液的温度升高引起FG以可以容易地过滤的大结晶的形式快速结晶。将温度的值升高到10和60℃之间，优选地在12和50℃之间，特别优选地在15和40℃之间，其中混合物的pH原则上可以在3到8的范围变化。优选地pH在5．5和8之间，特别是在6．5和7．5之间。
既然FG已经结晶，浓度降低了，所以在冷却后，在结晶和FG分离后残留的母液至少可以部分再循环到例如溶解容器，该容器同时接受了β内酰胺抗生素和FG的新鲜混合物。这样的再循环发生的速度优选地使FG保留在溶解容器中，并且仍然在β内酰胺抗生素结晶容器中超饱和。因为FG母液至少可以部分地再用于β内酰胺抗生素的结晶，所以溶解性的丢失可以保持在低水平。由于有利的工序条件，降解丢失也相对较低。
优选地连续地进行该方法，在所有时间都可以加入β内酰胺抗生素和FG的新鲜混合物，在所有时间都可以排放小部分的例如FG结晶母液。优选地，选择排泄流的流速使在工序中不同时间点的流的体积保持恒定。在连续的过程中，排泄流原则上可以更小。在
图1中图解了可能的方案。
本发明的方法可以适用于如具有苯基甘氨酸侧链，例如头孢氨苄，氨苄青霉素，头孢氯，新戊基氨苄青霉素，beca氨苄青霉素，酞氨苄青霉素，和头孢甘氨酸的β内酰胺抗生素的制备中。
原则上可以利用任何β内酰胺核，特别是具有下面通式(1)的β内酰胺核， 其中R0代表H或具有1-3个碳原子的烷氧基；Y代表CH2，O，S或硫的氧化形式，并且Z代表CH3CH3，R1，R1，or CH2其中R1代表例如H，OH，卤素，具有1-5个C原子的烷氧基，具有1-5个碳原子的烷基基团，具有4-8个碳原子的环烷基基团，具有6-10个碳原子的芳基或杂合芳基，这些芳基或杂合芳基被或不被例如烷基，芳基，具有1-8个碳原子的羧基或烷氧基基团所取代；并且其中如果需要，羧酸基团可以是酯基团。
可以用于本发明方法的β内酰胺核的适当例子是青霉素衍生物，例如6-氨基青霉烷酸(6-APA)和头孢菌酸衍生物，例如在3-位置有或没有取代基的7-氨基头孢菌酸，例如7-氨基头孢菌酸(7-ACA)，7-氨基去乙酸基头孢菌酸(7-ADCA)，和7-氨基-3-氯-cef-3-em-4-羧酸(7-ACCA)。
原则上，在偶联反应中适于作为催化剂的任何酶都可以用作本发明的酶。这样的酶包括总称为青霉素酰胺酶或青霉素酰基转移酶的酶。在例如，J．G．Shewale等人，Process Biochemistry 1989年8月，146-154，和在J．G．Shewale等人，Process BiochemistryInternational，1990年6月，97-103中叙述了这样的酶。合适的酶的例子是来源于以下的酶醋杆菌属，特别是巴氏醋杆菌，Aeromonas，Alcaligenes，特别是粪产碱菌，Aphanocladium，芽胞杆菌属，特别是，巨大芽胞杆菌，cephalosporium，埃希氏菌属杆菌，特别是大肠杆菌，黄杆菌属，Fusarium，特别是Fusarium oxysporum和Fusarium Solani，克吕沃尔氏菌属，Mycoplana，精朊杆菌属，Proteus，特别是Proteum rettgari，假单胞菌，和黄单胞菌属特别是Xanthomonas citrii。
优选地利用固定酶，因为这种酶可以容易地分离和再利用。例如在EP-A-222462中叙述了适当的固定的技术。另一个适当的技术包括在含有凝胶化试剂，例如明胶，含有游离氨基基团的多聚物，例如海藻胺，几丁质或聚乙烯亚胺的载体上固定青霉素G酰基转移酶。另外，也可以利用晶态的酶(CLEC’STM)。
在可从商业途径获得的固定酶中特别合适的酶是商品名为Enzygel的Boehringer Mannheim GmbH的大肠杆菌酶，来自Recordati的固定的青霉素G酰基转移酶；和来自PharmaBiotechnolugy Hannover的固定的青霉素G酰基转移酶。
在(酶的)酰化反应中，酰化试剂例如可以是活化形式的D苯基甘氨酸，优选地是其(伯，仲或叔)酰胺或盐，或低级烷基(1-4C)的酯，例如甲基酯。
通常进行酶酰化反应的温度低于40℃，优选地在-5和35℃之间。通常进行酶酰化反应的pH是在5．5和9．5之间，优选地在6．0和9．0之间。
当完全达到最大转换时，优选地把反应差不多完全终止。终止反应的适当实施方案是降低pH，优选地降到4．0和6．3之间，特别是在4．5和5．7之间。另一个适当的实施方案是在达到最大转换时降低反应混合物的温度。也可以结合以上两个实施方案。
一旦在达到最大转换时把反应终止，通常反应混合物将以含有许多固体，例如抗生素，D苯基甘氨酸和可能的固定酶的悬浮液的形式存在。为了使方法经济，优选地对固定酶进行回收。例如可以通过在搅拌的同时把反应混合物用筛过滤来完成，选择搅拌器的旋转方向以使悬浮液在搅拌器的中心处被向上泵起。随后，可以通过本发明的方法，通过例如pH转换，使可能除了固体抗生素以外的固体成分首先溶解，由此来回收如抗生素和FG的有价值成分。
在本发明的构架内，可以例如通过在混合物中加入酸等几种方法来降低pH。适当的酸例如是无机酸，特别是硫酸，盐酸或硝酸。优选地，利用盐酸。通过在混合物中加入碱可以提高pH。适当的碱例如是无机碱，特别是氢氧化铵，氢氧化钾，或氢氧化钠，优选地，利用氢氧化铵。
在实践中，通常在水中进行酶酰化反应和反应混合物的加工。如果需要，反应混合物也可以含有优选地小于30％体积的有机溶剂或多种有机溶剂的混合物。适用的有机溶剂的例子是具有1-7个碳原子的醇，例如单醇，特别是甲醇或乙醇；二醇，特别是聚乙二醇；或三醇，特别是甘油。
本发明的方法特别适用于对酶酰化反应后获得的反应混合物进行加工，在上述反应中利用D苯基甘氨酸的酰胺，例如FGA，或D苯基甘氨酸的酯，例如FGM，酰化6-APA。
在本方法的优选的实施方案中，采取措施保证溶解于反应混合物中的6-APA的浓度保持相对较低的水平，从而比起当溶解的6-APA的浓度选择为尽可能高的情况可以达到更高的转换。
另外，已经发现当溶解的6-APA的浓度保持低水平时，反应混合物的搅拌度明显更高。
在本文中，“转换”指的是形成的氨苄青霉素和利用的6-APA的量的摩尔比例。将溶解的6-APA的浓度表示为每公斤反应混合物中所含的6-APA的摩尔量；将6-APA的溶解的和未溶解的总浓度表示为每公斤总反应混合物中所含6-APA加氨苄青霉素的摩尔量；总反应混合物除了含有溶液以外，还含有许多固体，例如6-APA，氨苄青霉素，苯基甘氨酸和固定酶。
酰化试剂和6-APA的摩尔比例，即所加入的苯基甘氨酸衍生物的总量，除以所加入的6-APA的总量(以摩尔数表示)优选地小于2．5。优选地摩尔比例在1．0和2．0之间，特别是在1．2和1．8之间。
优选地分批进行酶酰化反应。如果需要，也可以连续地进行反应。同时对溶解的6-APA的浓度进行在线控制。
把反应混合物中6-APA加氨苄青霉素(溶解和未溶解形式)的总浓度优选地选择为高于250毫摩尔／升，更优选地高于300毫摩尔／升，特别是高于350毫摩尔／升。
在这一优选的实施方案中，在氨苄青霉素的制备过程中溶解的6-APA的浓度基本保持低于300毫摩尔／升，优选的低于250毫摩尔／升。当酰化试剂的浓度较高时，可以可选地选择溶解的6-APA的浓度高于酰化试剂浓度较低时的水平。这是因为当酰化试剂的浓度较高时，反应速度较快，以致6-APA只在较短的时间内溶解成高浓度。
可以各种不同方式使溶解于反应混合物的6-APA的浓度保持在低水平。把溶解的6-APA的浓度保持在低水平的一个可能性是最初只进料6-APA总量的一部分，并且在反应过程中补充平衡。其缺点是在这种情况下6-APA需要以固体形式供给，这存在技术问题。所以，在分批加工过程中，优选地在反应开始时供给6-APA总量，在此基础上，在酶酰化反应的过程中，反应混合物中6-APA的浓度将下降，氨苄青霉素的浓度将升高。溶解的6-APA的浓度保持低水平的适当方法是例如使pH保持比反应试剂达到最大的溶解度时更低的值。使溶解的6-APA浓度保持在低水平的特别适当的方法是，例如通过在反应过程中部分供给苯基甘氨酸衍生物来保证苯基甘氨酸衍生物的浓度处于低水平。
在本文中，已经发现，如果苯基甘氨酸衍生物的浓度在低水平，那么只溶解少量的6-APA，这样可以通过供给苯基甘氨酸衍生物来控制溶解的6-APA浓度。
当FGA以它的一种盐的形式，优选地是FGA和矿质酸的盐，例如FGA．HCl，FGA．1／2H2SO4和FGA．HNO3，加入时，可以获得特别适当的实施方案。在这一方法中，通过保持pH恒定，可以容易地保证最适地供给量。优选地，利用FGA．1／2H2SO4，因为这一盐具有特别高的溶解度。
在本发明的构架内，各种成分可以在反应混合物中以游离或盐的形式存在。在所有情况中，上面提到的pH值是在室温下测量的pH值。
通过下面的实施例将进一步阐明本发明，但并不用于限制。
缩写
AMPI=氨苄青霉素AMPI．3H2O=三水合氨苄青霉素6-APA=6-氨基-青霉素烷酸FGA=D苯基甘氨酸酰胺FG=D苯基甘氨酸FGHM=D-p-羟苯基甘氨酸甲基酯如WO-A-97／04086所述，AssemblaseTM是来自大肠杆菌ATCC1105的固定的大肠杆菌青霉素酰基转移酶。如EP-A-22462中阐述进行固定，用明胶和几丁质作为凝胶化试剂，用戊二醛作为交联试剂。
通过加入到活化的球晶的酶量来确定大肠杆菌青霉素酰基转移酶的最终活性，并计算为3ASU／克干重，1ASU(阿莫西林合成单位)被定义为在1小时内能够用6-APA和FGHM生成1克阿莫西林。3H2O的酶量(在20℃；6．5％6-APA和6．5％FGHM)。
实施例1FGA．1／H2SO4溶液的制备在T=5℃时，在650克水中悬浮301．6克FGA(2．00摩尔)。搅拌的同时在1小时内逐滴加入102．1克96％H2SO4(1．00摩尔)，通过冷却维持温度在T＜25℃。
实施例Ⅱ氨苄青霉素的酶合成把300克net-wet assemblaseTM装于装配有174微米网状筛底的酶反应器(1．5升，直径11厘米)之中(术语net-wet指在玻璃过滤器的辅助下从酶浆液中分离酶所能获得的酶的质量)。
把131．6克6-APA(0．600摩尔)，30．2克FGA(0．200摩尔)和400毫升水(T=10℃)装于一制备反应器(1．2升)之中。在T=10℃搅拌反应混合物15分钟，然后在t=0，在100毫升水(T=10℃)的辅助下转移到酶反应器。
在t=0时打开酶反应器中的搅拌器。在所有的时间保持温度为10℃。在233分钟的时间内，以恒定的速度加入423．7克FGA．1／2H2SO4溶液(0．800摩尔)。pH大约为6．3。从t=295分钟开始用6N H2SO4滴定维持pH6．3。在t=570分钟，AMPI的量最大，加入6N H2SO4使pH降到4．7。此时酶反应器含有575毫摩尔AMPI15毫摩尔6-APA50毫摩尔FGA365毫摩尔FG实施例Ⅲ从酶反应器分离AMPI／FG浆液用搅拌过滤的方法通过筛底从酶反应器除去如实施例Ⅱ所述制备的AMPI／FG浆液。这是通过用定位于筛上0．5厘米的螺旋刀片搅拌器来完成的。搅拌是向上的，约500rpm。在G3玻璃过滤器上过滤从反应器分离的AMPI／FG浆液。将AMPI／FG湿块放在一边，将母液返回到酶反应器中，在此基础上重新对AMPI／FG浆液进行搅拌过滤，然后用G3过滤。以这一方式用AMPI／FG母液洗涤酶反应器直到不再有固体物质冲洗出反应器。将在G3过滤中收集的最后的母液与AMPI／FG湿块合并形成AMPI／FG浆液。
这样获得的AMPI／FG浆液含有＞99．0％的酶反应器中产生的总AMPI量，和＞95．5％在酶反应器中产生的总FG的量。经过如此搅拌过滤之后，在酶反应器中存在＞99．5％的AssemblaseTM。
实施例Ⅳ氨苄青霉素的重结晶在包括储藏容器(V1；2升)，泵，溶解容器(V2；0．05升)，装备了Seitz过滤板、泵、AMPI结晶容器(V3；0．5升)的过滤器(F0)，平行安排的两个玻璃过滤器1A和1B(F1A和F1B)，泵，热交换器，FG结晶容器(V4；0．5升)，平行安排的两个玻璃过滤器2A和2B(F2A和F2B)，泵以及连接着溶解容器的热交换器的成套设备(图1)中进行再结晶。在过滤器2A和2B和溶解容器之间的管道上含有能够使部分流卸载的三通阀。所有容器都装配有搅拌器，温度计和pH电极。
将如实施例Ⅲ所述分离的AMPI／FG浆液定量转移到储藏容器，并且在搅拌的同时冷却到2℃。
利用总共约1350克含有0．6％AMPI和0．6％FG的水溶液的初始溶液填充重结晶环(从储藏容器到热交换器)。将再结晶环(除了FG结晶容器、玻璃过滤器2A和2B以外)冷却到1-2℃。将FG结晶容器和玻璃过滤器2A和2B保持在20℃。开始再结晶环中的循环(流速=1．2升每小时)。利用8N HCl溶液滴定将溶解容器的pH调节到pH1．25。利用25％(w／v)NH3溶液滴定，将AMPI结晶容器中的pH调节到6．5。在AMPI结晶容器中加入13．0克AMPI．3H2O充当核。把10．0克FG核加入到FG结晶容器中。
在t=0时，通过在溶解容器中加入来自储藏容器的AMPI／FG浆液(流速0．14升／小时)开始再结晶。把储藏容器的内容物在8小时的时间内加入到溶解容器中。在整个过程中，溶解容器和AMPI及FG结晶容器中的水平一直保持恒定。这是通过把部分FG母液排放到溶解容器中而不是再循环它来完成的。
当将母液泵到FG结晶容器中时，在玻璃过滤器1A上不中断地过滤来自AMPI结晶容器的AMPI浆液。在玻璃过滤器2A上过滤来自FG结晶容器的FG浆液，将母液泵回储藏容器。在整个实验过程中，在溶解容器中一直以1比8．6的比例混合来自储藏容器的AMPI／FG浆液和FG母液。在约8小时后排空储藏容器，此时已经在溶解容器中加入了330毫升8N HCL溶液。
在t=8小时时，用已经如实施例Ⅲ所述分离的新鲜AMPI／FG浆液填充储藏容器。把再结晶环中的AMPI分离从玻璃过滤器1A转换到1B，同样，把FG分离从玻璃过滤器2A到2B。
利用2×175毫升水(T=5℃)洗涤玻璃过滤器F1A上的AMPI湿块，并且把其干燥。利用2×60毫升水洗涤玻璃过滤器2A上的FG湿块并且把其干燥。
通过每8小时用AMPI／FG浆液填充储藏容器，并且交替地插入和倒空玻璃过滤器1A和1B和2A和2B可以连续地进行再结晶。FG和母液的流速是平均约0．18升每小时。
在储藏容器中每次装载(在实施例Ⅱ的酶反应器中供给600毫摩尔6-APA)的平均产量达到220克AMPI．3H2O(除去AMPI核，91％，相对于600毫摩尔／升6-APA)和30克FG(除去FG核)。
权利要求
1．从在溶液中含有β-内酰胺抗生素和D苯基甘氨酸(FG)的混合物回收β-内酰胺抗生素的方法，将混合物的pH调节到3和8之间，温度在-5和20℃之间，调节浓度使FG保留在溶液中，回收获得固体β-内酰胺抗生素，并且将残留的液体的温度升高到10和60℃之间，形成固体FG，FG以固体的形式分离，至少部分再循环母液。
2．根据权利要求1所述的方法，其中混合物的温度是-3和15℃之间。
3．根据权利要求2所述的方法，其中混合物的温度在0和10℃之间。
4．根据权利要求1-3的任何一个所述的方法，其中将温度升高到12和50之间。
5．根据权利要求4所述的方法，其中将温度升高到15和40℃之间。
6．根据权利要求1-5的任何一个所述的方法，其中将混合物的pH值调节到4和7之间。
7．根据权利要求1-6的任何一个所述的方法，其中把母液再循环到含有溶解的β内酰胺抗生素和FG的混合物。
8．根据权利要求1-7的任何一个所述的方法，特征是该过程连续地进行。
9．根据权利要求1-8的任何一个所述的方法，其中基本含有β内酰胺抗生素和FG的初始混合物来源于酶酰化反应，在该反应中利用D苯基甘氨酸衍生物酰化相应的β内酰胺核。
10．根据权利要求9所述的方法，其中首先将在酰化反应后获得的混合物的pH降到0和3之间。
11．根据权利要求10所述的方法，其中将混合物的pH降到0．3和2之间。
12．根据权利要求1-11的任何一个所述的方法，其中混合物含有10-1500毫摩尔／升β内酰胺抗生素，0-1500毫摩尔／升FG，0-1000毫摩尔／升D苯基甘氨酸衍生物，和0-1000毫摩尔／升β内酰胺核。
13．根据权利要求1-12的任何一个所述的方法，其中β内酰胺核是6-氨基青霉烷酸(6-APA)，而β内酰胺抗生素是氨苄青霉素。
14．根据权利要求1-12的任何一个所述的方法，其中内酰胺核是7-氨基去乙酸基头孢菌酸(7-ADCA)，而β内酰胺抗生素是头孢氨苄。
15．根据权利要求1-12的任何一个所述的方法，其中内酰胺核是7-氨基-3-氯-头孢-3-em-4-羧酸(7-ACCA)，而β内酰胺抗生素是头孢氯。
全文摘要
从在溶液中含有β内酰胺抗生素和D苯基甘氨酸(FG)的混合物回收β内酰胺抗生素的方法,将混合物的pH调节到3和8,温度调节到－5和20℃,浓度调节到可使FG保留在溶液中,回收获得固体β内酰胺抗生素,并且将残留的液体温度升高到10和60℃之间,形成固体FG,FG以固体形式分离,至少部分再循环母液。优选地利用来源于酶酰化反应的基本含有β内酰胺抗生素和FG的初始混合物,在上述反应中利用D苯基甘氨酸衍生物酰化对应的β内酰胺核,特别是6－氨基青霉烷酸,7－氨基去乙酸基头孢菌酸,和7－氨基－3－氯－头孢－3－em－4－羧酸。
文档编号C12P35/04GK1279684SQ98811278
公开日2001年1月10日 申请日期1998年9月18日 优先权日1997年9月19日
发明者W·H·J·博斯登, H·M·穆迪, H·M·J·赫罗登 申请人:Dsm有限公司