专利名称：含有大鳞大马哈鱼生长因子的工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体地讲是一种含有大马哈鱼生长因子的工程菌。在水产养殖产业技术中，使用本工程菌制品，能够增强鱼、虾、贝类生物体免疫和抗病能力，可以产生较好的经济效益。
现有技术中，利用基因工程技术可以在工程菌中成功地表达外源生长因子。利用基因工程菌合成的重组鱼生长因子与鱼脑垂体中分离的天然生长因子具有相同的生理功能。这些研究中还存在着不足之处首先，工程菌培养和发酵的原料成本高，重组鱼生长因子的表达产率较低。其次，用于促生长实验的重组鱼生长因子均为纯化后的制品，其分离和纯化的步骤繁琐，消耗费用高，缺少大规模发酵工艺条件和技术，其制品在大规模水产养殖中没有切实可行的处理方法和应用技术。
总之，已有的研究仅表明重组鱼生长因子具有明显的促生长效应，但利用现有技术合成和纯化的重组鱼生长因子成本过高，若在水产养殖生产中使用，投入远远大于产出，无任何经济效益。
有文献记载有一种含有大鳞大马哈鱼生长因子sGH基因的质粒psGH4，其是由加拿大多伦多大学丘才良实验室所分离并克隆的。有关该sGH基因的DNA基因文库的构建，该sGH基因的序列分析以及质粒psGH 4的构建，均发表在《鱼类生理生化杂志》第七期，即；《Fish Physiology and Biochemistry》vol.7 nos1-4(1989)第375-380页的“鲑鱼脑垂体激素的分子克隆和表达”一文中。
该文披露了如下内容(一)实验材料的收集从美国华盛顿州哥伦比亚河捕捞的大鳞大马哈鱼，收集其脑垂体冻存于-70℃，备用。
从大鳞大马哈鱼脑垂体中提取了总RNA，过Oligo-dT柱分离总mRNA。用SstI酶切pUC13，dT-接尾，HindIII酶切，过SEPHAROSE4B柱分离大片段DNA(载体DNA)，然后poly(T)和poly(A)的配对与mRNA连接。以mRNA为模板，用逆转录酶合成单链cDNA，继而在DNA聚合酶，DNA连接酶和核酸酶H的作用下合成双链。经酚-仿抽提后，用T4连接酶环化。重组后的质粒转化E.coli的JM103菌种，扩菌构成cDNA文库。
根据sGH的部分氨基酸顺序，用DNA合成仪合成了一段20个核苷的寡聚核苷酸(CCYTCRAARTCRTTRAACAT，其中R代表dG或dA，Y代表dT或dC)，经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后作为引物，以mRNA为模板合成cDNA。将此cDNA用32P标记作为探针进行第一次筛选，然后用32P标记的20-核苷酸作为探针，进行重复筛选，得到一个阳性克隆，从这一克隆分离出插入的片段后，重新克隆至M13载体，进行DNA序列分析，证实获得了包括信号肽在内的编码sGH顺序的sGH基因cDNA序列。然后利用这一基因序列构建了重组质粒psGH4。
(二)sGH的cDNA序列分析从800个克隆中筛选出4个阳性克隆。对其中之一(GH-4)进行了序列分析。该克隆cDNA全序列为1148个碱基对，编码210个氨基酸的GH前体。其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟GH序列。在3′端的非编码序列中含有甲基化位点特有序列AATAAA。
蛋白质序列的比较表明，大鳞大马哈鱼GH与虹鳟鱼GH仅在第125位有一个氨基酸的差异(Val-Lew)，尽管这两种鲑鱼在核酸序列编码区的同源性大于95％，但在3′端非编码区的核酸序列有较大差异。
本发明在上述已有技术的基础上，进行了进一步研究与实验工作。
本发明的目的在于利用鱼生长因子sGH基因在工程菌中表达和合成重组鱼生长因子，从降低培养基成本和简化分离纯化步骤入手，在构建新的高表达的重组质粒基础上，构建sGH基因高表达活性的工程菌种，并解决大规模发酵工艺问题和产物处理技术问题，降低成本，提高产品的产率和功效，使之最终有效地应用于水产养殖产业中，创造一定的经济效益和社会效益。
本发明的任务是由以下技术方案实现的，研制了一种含有大鳞大马哈鱼生长因子的工程菌，所使用的大鳞大马哈鱼生长因子，其中的sGH cDNA基因序列是由Dr.Choy L.Hew等人构建大鳞大马哈鱼脑垂体cDNA基因文库，分离其sGH cDNA基因并构建了质粒psGH4，所述工程菌中的sGH cDNA基因序列是由质粒psGH4经PCR扩增获得的，其基本步骤如下(1)依据sGH cDNA编码区两端的序列设计了一对引物B-GH1和B-GH2，经PCR扩增合成了带有BamHI和NcoI酶切位点的PCR反应产物，再经过这两种酶酶切后，获得了带BamHI和NcoI粘性末端的sGH cDNA片段；
(2)选用质粒pET15b，用BamHI和NcoI双酶切，分离5.6kb的线性化质粒pET15bDNA片段；(3)将上述(1)中的sGH cDNA片段与(2)中的质粒pET15b的DNA片段在T4连接酶的作用下，进行重组构建成具有环状DNA的重组质粒pETsGH；(4)选用大肠杆菌(E.coli)BL21菌种，制备BL21菌的感受态细胞；(5)在42℃，1.5min热休克条件下，将pETsGH的环状DNA转化至BL21感受态细胞内；(6)在含氨卡青霉素的LB固体培养基上铺皿培养，筛选转化子，即得到转化了pETsGH质粒的工程菌种，命名为BL21/pETsGH，其菌种保藏号CGMCC No.0362-2，保藏日期1998.9.29。
所述的引物B-GH1，其核苷酸序列为5′-CAC ACC ATG GGC ATA GAA AAC CAA CGG CTC-3′，所述的引物B-GH2，其核苷酸序列为5′-CAC AGG ATC CTA CAG AGT GCA GTT GGC CTC-3′。
所述该菌种的表达培养条件为；在LB培养基中，37℃，充分供氧下培养；当菌体细胞OD600值达0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.05-1mM，继续在37℃培养2-3小时，诱导laeUV5启动子的作用，进行sGH基因的表达。
所述的转化了pETsGH质粒的BL21/pETsGH菌种，经常规扩菌培养，获得OD600值为3的发酵培养液，其菌体的处理和提取高活性的sGH基因复性表达产物的步骤为(1)从BL21/pETsGH菌种培养液中离心收集菌体；(2)加入3倍体积的pH7.5，PBS磷酸缓冲液；(3)上述溶液经超声波破碎处理2-10分钟，再经13000r.p.m，2分钟离心，收集沉淀，得sGH的包涵体；(4)用6M脲素，溶解上述包涵体；(5)将上述溶液用30mM的NH4HCO3缓冲液进行透析；(6)取上述透析液进行冷冻干燥，可得含sGH25-30％的鱼生长因子的乳白色粉末状BL21/pETsGH工程菌制品。
所述的BL21/pETsGH工程菌制品，其使用方法是按以下配方制成浸泡剂重量比为，生长因子sGH50-70份；氯霉素80-100份；氨卞青霉素100-120份；土霉素50-70份；将上述组份，溶解于20L养殖用水中，制成浸泡液；使用时，先将水产养殖品种鱼、虾、贝类、蟹类幼苗浸入2.5％的高盐度处理液，浸泡3-5分钟；该高盐度处理液配方如下重量比氯化钠450-480份；氯化钾5-10份；氯化钙3-5份；硫酸镁2-4份；碳酸钠5-10份；溶解于20L养殖水中，常温下使用；再将幼苗从上述高盐度处理液中取出，迅速转移至浸泡液中，通气下浸泡30-40分钟后，再转移至养殖池塘内养殖。
另一种含有大鳞大马哈鱼生长因子的工程菌，其中的sGH cDNA基因序列也是按权利要求1所述构建的质粒psGH4经PCR扩增获得的，其基本步骤为，(1)依据sGH cDNA编码区两端序列设计了另一对引物P-GH1和P-GH2，经PCR扩增和EcoRI酶切，获得了两端带有EcoRI粘性末端的sGH cDNA片段；(2)选用带有AX01基因和His4基因的质粒pA0815，也对其用EcoRI酶切成线性化的载体DNA片段；(3)将上述(1)中的sGH cDNA片段与(2)中的质粒pA0815的载体DNA片段，在T4连接酶作用下，进行连接构建成重组质粒pAOsGH；(4)用BgLII和BamH I双酶切该重组质粒pAOsGH，分离1.92Kb的pAOsGHCDNA片段，再连接成多拷贝基因的复合表达区段；(5)用BamHI酶切并提纯线性化的重组质粒pAOsGHcDNA片段；(6)将上述(4)中的多拷贝基因的复合表达区段与(5)中的线性化的重组质粒pAOsGHcDNA片段在T4连接酶作用下，进行连接构建成多持贝基因的表达重组质粒pAOnsGH；(7)选用酵母菌(pichia pastoris)GS115菌种，该菌种的染色体中具有AOXI基因和His4基因；(8)用Stu I酶切上述(6)中的重组质粒pAOnsGH的His4基因区，制成线性化的pAOnsGH的DNA片段；(9)用BIO-RADGene PulserII电脉冲仪将线性化的pAOnsGHDNA整合导入GS115的细胞内染色体的His4基因区；(10)将转化后的酵母菌GS115菌种铺于MD培养基的平皿中30℃培养，筛选该转化子，即得含有外源生长因子sGH基因的酵母工程菌种，命名为GS115/pAOnsGH；其菌种保藏号CGMCC No.0362-1，保藏日期1998.9.29。
所述的引物P-GH1其核苷酸序列如下5′-CCC GGG GAA TTC CTA CAG AGT GCA GTT GGC-3′所述的引物P-GH2其核苷酸序列如下5′-CCC GGG GAA TTC ATG GGA CAA GTG TTT CTG-3′。
所述的转化了线性化的pAOnsGHDNA的GS115/pAOsGH菌种，其表达培养条件为在改良培养基中，在28-30℃下，充分供氧条件下，培养该菌种细胞；当菌体细胞OD600值为2-3时，加入改良培养液至OD600值为1.0，并保持甲醇浓度在0.5％，培养菌体24小时，诱导AOX I启动子的作用，在甲醇的诱导作用下，有效地启动sGH基因的表达培养。
所述的转化了线性化的pAOnsGHDNA的GS115/pAOnsGH菌种，其表达培养的改良培养基以及扩菌培养的改良培养基都可采用如下的配方重量比，葡萄糖15-20份，硫酸铵4-5份，磷酸钾0.5-1份，氯化钠0.1-0.2份，硫酸铁100-200PPM，硫酸锌200-400PPM，生物素2-5PPM，用水定容1000份培养液。
所述的GS115/pAOnsGH菌种，扩菌培养的工艺是采用常规扩菌培养方案，适当调整培养温度在25-30℃，培养菌液的OD600值逐步由4增至20，再在中试发酵罐内定容300L改良培养液，流加甲醇溶液，并保持甲醇终浓度0.5％，通入过滤空气，搅拌12小时，扩菌培养至OD600值＝10-50，对表达了sGH基因的GS115/pAOnsGH酵母菌发酵培养液，采用两种处理方法(1)一种是直接将菌液离心沉淀，取鲜湿菌体冷冻保存；(2)另一种是将菌液经低温喷雾干燥处理，制成具有活性的干酵母粉；这两种GS115/pAOsGH工程菌制品均可作为水产动物和家禽类动物的饲料添加剂。
本发明的工程菌——BL21/pETsGH，菌种保藏号CGMCC No.0362-2，保藏日期1998.9.29。在构建过程中，由于设计的B-GH1和B-GH2一对引物是根据sGH cDNA两端序列所设计的，这样就可以准确无误地分离出sGH基因。该对引物的两端要以分别加上BamHI和Nco I酶切位点，以便插入质粒pET15b的BamHI和NcoI酶位点之间。这对分离sGH基因和构建环状DNA的重组质粒pETsGH都是最合适的。由于选择了从Novagen公司购进的质粒pET15b，其带有噬菌体T7RNA聚合酶启动子(简称laeUV5启动子)。该启动子在IPTG的诱导作用下能有效地启动该质粒pET15b接入的带BamHI和Nco I粘性末端的sGHcDNA片段能够成功地表达sGH基因。因此质粒pET15b是sGH重组质粒较好的载体。由于选择了从美国Novagen公司购进的，(E.coli)BL21菌种作为感受菌。该菌具有pET15b及其重组质粒pETsGH生长和扩增的有利条件，在该菌感受态细胞中重组质粒pETsGH可以高速扩增，有效地表达外源sGH基因。由于选择的表达质粒pET15b是胞内表达型的，在BL21细胞中表达的sGH以包涵体的形式存在于细胞内，因此本发明设计了一种简化的提取分离步骤，以较低的提取成本获得了高活性的sGH粗提物。这其中尤其是由于在离心分离溶解的sGH表达产物后，采用30mM的NH4HCO3复性缓冲液进行透析复性，使表达的sGH产物蛋白质复性，从而提高了该工程菌的粗提取物sGH制品的高活性。本工程菌BL21/pETsGH的淡黄色粉末在作为浸泡剂时，首先将水产养殖品种的幼苗进行高盐度浸泡处理；采用高渗处理后的幼苗，其次再转移至浸泡液中，通气条件下在含有本sGH浸泡剂的浸泡液中浸泡处理30-40分，其实质上是对幼苗进行高盐度的渗入处理，使sGH活性物质渗入幼苗体内，达到促生长的目的。本工程菌制品经多次水产养殖证明，显著地提高了养殖鱼、虾的成活率和生长速度，提高单位水体养殖产量20％以上。增产的收入大于使用本工程菌制品投入的十倍以上。本工程菌制品的功效有(1)能够增强养殖动物幼体的体质的摄取食物的竞争能力。(2)能够促进养殖动物新陈代谢作用和食物消化吸收能力，提高饲料利用率。(3)能够促进糖类分解代谢和蛋白质的合成代谢，提高肝脏和肌肉细胞对氨基酸吸收和核酸的合成代谢。(4)能够促进养殖动物肌肉组织、软骨组织和骨骼的生长。(5)能够提高白细胞的吞噬能力，增强养殖动物机体的免疫功能和抗病能力。
本发明的另一种工程菌——GS115/pAOsGH菌种保藏号CGMCC No.0362-2，保藏日期1998.9.29。在构建过程中，由于设计的P-GH1和P-GH2，该对引物是根据sGHcDNA两端序列所设计的，这样就可以准确无误地分离出sGH基因。该对引物的两端分别加上EcoRI酶切位点，以便插入质粒pA0815的EcoRI位点中，这对于分离所需sGH和构建所需两端带有EcoRI粘性末端的sGHcDNA片段的重组质粒PAOsGH都是最合适的。由于选择了从美国的Invitrogen公司购进的质粒p A0815，其带有乙醇氧化酶启动子，并可以在甲醇的诱导作用下有效地启动该质粒pA0815所连接的sGH基因成功地表达。因此质粒pA0815是酵母菌sGH重组质粒较好的载体。由于选择了美国的Invitrogen公司购进的GS115菌种作为受体菌种。该菌的染色体中具有AOXI基因和His4基因。可以与质粒pA0815进行同源重组，能够有效地将重组质粒pETnsGH转化并整合插入GS115菌种的细胞染色体中，使外源基因sGH正常表达。本酵母工程菌GS115/pAOnsGH构建后，由于改良了培养基配方，在sGH基因的表达培养中和扩菌培养中都可应用。原该酵母菌的培养基配方中需要的主要原料为YNB(酵母氮碱)价格昂贵，每500g价约为人民币2000元。原培养基的原料费；每培养1升菌液费用约为56元/1升菌液。改良的新培养基配方，可以使原料费用降低至0.25元/1升菌液，是原配方的1/224。新的改良培养基配方虽然省去YNB原料，但该酵母工程菌的生长情况和发酵产率都保持原有水平，甚至还高于原有水平，扩菌培养所达到的OD600值为10-50，其效果相当明显。由于所选择的表达质粒pA0815是胞内表达型，因此在GS115/pAOsGH工程菌细胞中表达的sGH产物也都存在于菌体中。本发明采用两种菌体处理方法得到工程菌制品作为养殖动物的饲料，在养殖动物的后肠中可以被吸收进而产生促生长和抗病的功效。总之，本发明的多拷贝基因酵母菌表达重组质粒pAOsGH，经多次实验证明具有很高的表达活性；所设计的实验条件和发酵工艺条件使本工程菌制品达到了生产成本低、效率高的水平，经多次水产养殖试验及养鸡试验证明，使用添加本工程菌制品的饲料饲喂养殖的动物可以明显地提高其生长速度和抗病害能力，提高单位养殖产量20％以上，增产的收入大于使用本制品投入的五倍以上。
本发明的实施例结合附图进一步描述如下本发明的保护范围，不仅限于实施例中。
图1为重组质粒pETsGH构建过程示意图。
图2为多拷贝基因的表达重组质粒pAOsGH构建过程示意图。
图3为重组鱼生长因子表达产物电泳分析图。
图4为重组鱼生长因子表达产物免疫杂交分析图。
图1中，N表示为NcoI的酶切位点，Ba表示为BamHI酶切位点。图2中，E表示为EcoRI酶切位点，Bg表示为BgLI酶切位点，Ba表示为BamHI酶切位点。图3，图4中1、2为大肠杆菌中sGHDNA表达产物；3为对照sGH；4-10为酵母菌中sGHDNA表达产物。
参见图1由sGH cDNA编码区两端的序列设计的一对引物P-GH1和P-GH2与含有sGH cDNA的质粒psGH4，经PCR扩增合成带有BamHI和NcoI酶切位点的PCR反应产物，该产物再经BamHI和NcoI酶切制得带BamHI和NcoI粘性末端的sGH cDNA片段；选用质粒pET15b同样用前述双酶酶切成5.6kb的带BamHI和NcoI酶切位点线性化质粒pET15bDNA片段；最后将上述sGH cDNA片段与pET15bDNA片段，在T4连接酶的作用下，进行重组构建具有环状DNA的重组质粒pETsGH。
参见图2由sGH cDNA编码区两端的序列设计的另外一对引物P-GH1和P-GH2与含有sGH cDNA的质粒psGH4，经PCR扩增反应和酶切，制得两端带有EcoRI粘性末端的sGH cDNA片段；选取质粒pA0815，也用EcoRI酶切成线性化的载体DNA片段；再将上述带EcoRI粘性末端的sGH cDNA片段与质粒pA0815的载体DNA片段，在T4连接酶作用下，构建成重组质粒pAOsGH；再用另外两种酶BgLII和BamHI双酶切该重组质粒pAOsGH，分离制得1.92kb的pAOsGHcDNA片段，再将前述pAOsGHcDNA片段依次连接成两持贝基因的复合表达pA02sGHcDNA区段；还用BamHI酶切并提纯线性化的重组质粒pAOsGHcDNA片段；最终将前述两持贝基因的复合表达区段与线性化的重组质粒pAOsGHcDNA片段，在T4连接酶作用下，进行连接构建两拷贝基因的表达重组质粒pA02sGH。
本发明的实施例如下(一)转化了pETsGH质粒的BL21/pETsGH工程菌的扩菌培养的步骤和条件实例。
(1)接种含pETsGH的BL21单一菌落于5mlLB培养液；(2)37℃，250rpm振荡培养约16小时，至OD600＝2；(3)在1升三角瓶中以1∶20扩菌培养子100mILB培养液；(4)37℃，250rpm振荡培养约8小时，至OD600＝2；(5)在5升Bio-FI03000型生物反应器中以1∶50扩菌比例分别培养于4升，4.5升，5升，LB培养液中；(6)37℃，400rpm搅拌分别培养约6小时，至OD600＝2-2.1；
(7)加入IPTG至诱导终浓度1mM，继续培养和诱导表达2小时，至OD600＝3。
其中LB培养基(液)的组成参见《分子克隆指南》1992第二版科学出版社p908。
(二)BL21/pETsGH工程菌扩菌培养后菌体处理与提取活性的sGH基因产物制品的实例如下(1)从上述三批次BL21/pETsGH工程菌扩菌培养液中，以7000rpm分别离心10分钟，收集菌体得57g，57g，60g的湿菌体；(2)分别加入PBS磷酸缓冲液240ml，200ml，250ml；(3)将上述溶液分别经超声波破碎处理6，6，7分钟，再经1300rpm离心处理，收集沉淀得200，200，250ml包涵体；(4)用6M脲素溶解上述包涵体1小时后，再以7000rpm分别离心10分钟，取上清液；(5)将上述上清液用30mM的NH4HCO3缓冲液分别进行透析；(6)取上述透析液分别进行冷冻干燥，分别得1.50g，1.45g，1.60g干重的淡黄色粉未BL21/pETsGH工程菌制品，测得该制品含sGH26-30％。
(三)BL21/pETsGH工程菌制品应用于养殖实验例(A)幼苗的高渗处理(重量单位克)表1
将表1中(1)-(3)配方，溶于20l养殖水中，将幼苗浸入高渗液中常温高渗处理3-5分钟后，迅速转移至浸泡液中，在通气下，浸泡30-40分钟；(B)幼苗的浸泡液实例(重量单位毫克)表2
将上述浸泡液处理的幼苗转移至养殖池塘内养殖实验实验结果如下，表3
(四)转化了线性的pAOsGH DNA的GS115/pAOsGH工程菌应用实例表4改良培养基用于GS115/pAOsGH工程菌扩菌培养实例
按以上配方配制1000kg培养液备用。分别在97年5、6、7三个月内，用700升发酵罐定容→300升发酵液接种GS115/pAOsGH工程菌，进行发酵实验，经常规扩菌培养，按上述三个实例的工艺条件，流加甲醇溶液，通风搅拌发酵12小时后，菌体表达的sGH可达sGH100mg/l发酵液，上述三个实例的湿菌体，冷冻保存。
将上述酵母工程菌湿菌体应用于鱼类养殖实验。实验结果如下表5<
五)两种工程菌表达的sGH产物的检测两种表达产物的检测方法基本一致，步骤如下(1)离心分离菌体；(2)破碎菌体，分离蛋白质粗提液；(3)用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质样品；(4)对蛋白质带进行马斯亮兰染色，结果如图3所示；(5)使用纯化的sGH抗体，进行蛋白质印迹-免疫杂交法(Westerm-Immunoblot)分析，结果如图4所示。
权利要求
1.一种含有大鳞大马哈鱼生长因子的工程菌，所使用的大鳞大马哈鱼生长因子，其中的sGH cDNA基因序列是由Dr.Choy L.Hew等人构建大鳞大马哈鱼脑垂体cDNA基因文库，分离其sGH cDNA基因并构建了质粒psGH4，其特征在于所述工程菌中的sGH cDNA基因序列是由质粒psGH4经PCR扩增获得的，其基本步骤如下(1)依据sGHcDNA编码区两端的序列设计了一对引物B-GH1和B-GH2，经PCR扩增合成了带有BamHI和NcoI酶切位点的PCR反应产物，再经过这两种酶酶切后，获得了带BamHI和NcoI粘性末端的sGH cDNA片段；(2)选用质粒pET15b，用BamHI和NcoI双酶切，分离5.6kb的线性化质粒pET15bDNA片段；(3)将上述(1)中的sGH cDNA片段与(2)中的质粒pET15b的DNA片段在T4连接酶的作用下，进行重组构建成具有环状DNA的重组质粒pETsGH；(4)选用大肠杆菌(E.coli)BL21菌种，制备BL21菌的感受态细胞；(5)在42℃，1.5min热休克条件下，将pETsGH的环状DNA转化至BL21感受态细胞内；(6)在含氨卡青霉素的LB固体培养基上铺皿培养，筛选转化子，即得到转化了pETsGH质粒的工程菌种，命名为BL21/pETsGH，其菌种保藏号CGMCC No.0362-2，保藏日期1998.9.29。
2.根据权利要求1所述含有大鳞大马哈鱼生长因子的工程菌，其特征在于所述的引物B-GH1，其核苷酸序列为5′-CAC ACC ATG GGC ATA GAA AAC CAA CGG CTC-3′，所述的引物B-GH2，其核苷酸序列为5′-CAC AGG ATC CTA CAG AGT GCA GTT GGC CTC-3′。
3.根据权利要求1所述的含有大鳞大马哈鱼生长因子的工程菌，其特征在于该菌种的表达培养条件为；在LB培养基中，37℃，充分供氧下培养；当菌体细胞OD600值达0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.05-1mM，继续在37℃培养2-3小时，诱导laeUV5启动子的作用，进行sGH基因的表达。
4.根据权利要求1或3所述含有大鳞大马哈鱼生长因子的工程菌其特征在于所述的转化了pETsGH质粒的BL21/pETsGH菌种，经常规扩菌培养，获得OD600值为3的发酵培养液，其菌体的处理和提取高活性的sGH基因复性表达产物的步骤为(1)从BL21/pETsGH菌种培养液中离心收集菌体；(2)加入3倍体积的pH7.5，PBS磷酸缓冲液；(3)上述溶液经超声波破碎处理2-10分钟，再经13000r.p.m，2分钟离心，收集沉淀，得sGH的包涵体；(4)用6M脲素，溶解上述包涵体；(5)将上述溶液用30mM的NH4HCO3缓冲液进行透析；(6)取上述透析液进行冷冻干燥，可得含25-30％鱼生长因子的乳白色粉末状BL21/pETsGH工程菌制品。
5.根据权利要求1所述的含有大鳞大马哈鱼生长因子的工程菌，其特征在于所述的BL21/pETsGH工程菌制品，其使用方法是按以下配方制成浸泡液重量比为，生长因子sGH50-70份；氯霉素80-100份；氨卞青霉素100-120份；土霉素50-70份；将上述组份，溶解于20L养殖用水中，制成浸泡液；使用时，先将水产养殖品种鱼、虾、贝类、蟹类幼苗浸入2.5％的高盐度处理液，浸泡3-5分钟；该高盐度处理液配方如下重量比氯化钠450-480份；氯化钾5-10份；氯化钙3-5份；硫酸镁2-4份；碳酸钠5-10份；溶解于20L养殖水中，常温下使用；再将幼苗从上述高盐度处理液中取出，迅速转移至浸泡液中，通气下浸泡30-40分钟后，再转移至养殖池塘内养殖。
6.另一种含有大鳞大马哈鱼生长因子的工程菌，其中的sGHcDNA基因序列也是按权利要求1所述构建的质粒psGH4经PCR扩增获得的，其特征在于其基本步骤为，(1)依据sGH cDNA编码区两端序列设计了另一对引物P-GH1和P-GH2，经PCR扩增和EcoRI酶切，获得了两端带有EcoRI粘性末端的sGH cDNA片段；(2)选用带有AXO1基因和His4基因的质粒pA0815，也对其用EcoRI酶切成线性化的载体DNA片段；(3)将上述(1)中的sGH cDNA片段与(2)中的质粒pA0815的载体DNA片段，在T4连接酶作用下，进行连接构建成重组质粒pAOsGH；(4)用BgLII和BamH I双酶切该重组质粒pAOsGH，分离1.92Kb的pAOsGHDNA片段，再连接成多拷贝基因的复合表达区段；(5)用BamHI酶切并提纯线性化的重组质粒pAOsGHcDNA片段；(6)将上述(4)中的多拷贝基因的复合表达区段与(5)中的线性化的重组质粒pAOsGHcDNA片段在T4连接酶作用下，进行连接构建成多拷贝基因的表达重组质粒pAOnsGH；(7)选用酵母菌(pichia pastoris)GS115菌种，该菌种的染色体中具有AOXI基因和His4基因；(8)用Stu I酶切上述(6)中的重组质粒pAOnsGH的His4基因区，制成线性化的pAOnsGH的DNA片段；(9)用BIO-RADGene PulserII电脉冲仪将线性化的pAOnsGHDNA整合导入GS115的细胞内染色体的His4基因区；(10)将转化后的酵母菌GS115菌种铺于MD培养基的平皿中30℃培养，筛选该转化子，即得含有外源生长因子sGH基因的酵母工程菌种，命名为GS115/pAOnsGH；其菌种保藏号CGMCC No.0362-1，保藏日期1998.9.29。
7.根据权利要求6所述含有大鳞大马哈鱼生长因子的工程菌，其特征在于所述的引物P-GH1其核苷酸序列如下5′-CCC GGG GAA TTC CTA CAG AGT GCA GTT GGC-3′所述的引物P-GH2其核苷酸序列如下5′-CCC GGG GAA TTC ATG GGA CAA GTG TTT CTG-3′。
8.根据权利要求6所述含有大鳞大马哈鱼生长因子的工程菌，其特征在于所述的转化了线性化的pAOnsGHDNA的GS115/pAOsGH菌种，其表达培养条件为在改良培养基中，在28-30℃下，充分供氧条件下，培养该菌种细胞；当菌体细胞OD600值为2-3时，加入改良培养液至OD600值为1.0，并保持甲醇浓度在0.5％，培养菌体24小时，诱导AOX I启动子的作用，在甲醇的诱导作用下，有效地启动sGH基因的表达培养。
9.根据权利要求6或8所述含有大鳞大马哈鱼生长因子的工程菌，其特征在于所述的转化了线性化的pAOnsGHDNA的GS115/pAOnsGH菌种，其表达培养的改良培养基以及扩菌培养的改良培养基都可采用如下的配方重量比，葡萄糖15-20份，硫酸铵4-5份，磷酸钾0.5-1份，氯化钠0.1-0.2份，硫酸铁100-200PPM，硫酸锌200-400PPM，生物素2-5PPM，用水定容1000份培养液。
10.根据权利要求6所述含有大鳞大马哈鱼生长因子的工程菌，其特征在于所述的GS115/pAOnsGH菌种，扩菌培养的工艺是采用常规扩菌培养方案，适当调整培养温度在25-30℃，培养菌液的OD600值逐步由4增至20，再在中试发酵罐内定容300L改良培养液，流加甲醇溶液，并保持甲醇终浓度0.5％，通入过滤空气，搅拌12小时，扩菌培养至OD600值＝10-50，对表达了sGH基因的GS115/pAOnsGH酵母菌发酵培养液，采用两种处理方法(1)一种是直接将菌液离心沉淀，取鲜湿菌体冷冻保存；(2)另一种是将菌液经低温喷雾干燥处理，制成具有活性的干酵母粉；这两种GS115/pAOsGH工程菌制品均可作为水产动物和家禽类动物的饲料添加剂。
全文摘要
本发明公开了含有大鳞大马哈鱼生长因子的工程菌,利用已有的sGH DNA,采用特定的引物和质粒,重组构建了含有pETsGH质粒高效表达sGH的大肠杆菌工程菌,其菌种保藏号:CGMCC NO.0362—2。还重组构建了含有pAOnsGH质粒高效表达sGH的酵母菌工程菌,其菌种保藏号:CGMCCNO.0362—1。本发明从降低培养基成本和简化分离纯化步骤入手,突破技术难点,解决发酵工艺和产物处理问题,降低成本,提高产率和功效,研制了由这两种工程菌分别制成的促生长浸泡剂和饲料添加剂,用于水产养殖和禽畜养殖生产中,可大幅度提高养殖产量。
文档编号C12N1/21GK1267722SQ9911212
公开日2000年9月27日 申请日期1999年3月19日 优先权日1999年3月19日
发明者张培军, 徐永立 申请人:中国科学院海洋研究所