专利名称：抗hpv16e6核酶质粒及其在人乳头瘤病毒与肿瘤治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及含抗HPV16E6核酶基因的真核表达质粒，可用于人乳头瘤病毒及其相关肿瘤，如宫颈癌、口腔癌、喉癌等的治疗。
目前所知，人乳头瘤病毒(HPV，Human Papillomaviruses)是人类肿瘤病毒病因中最为重要的一类病毒。高危HPV易引起恶性肿瘤，与宫颈癌、阴茎癌、口腔癌、喉癌及皮肤癌等发病密切相关，其中最常见的类型是HPV16和HPV18。核酶(Ribozyme)是指有催化活性的RNA分子，它可以有效地、序列特异地切割靶RNA。由于Ribozyme可以序列特异性地切割靶RNA，从而可以在mRNA水平阻断靶基因的表达。研究已表明，HPV的致癌性主要与其E6、E7基因有关。因此本研究设计、合成了抗HPV16E6核酶，其靶位点是HPV16E6基因上的第170位点，并将其克隆于真核表达质粒PcDNA3中。目前国内外尚未见有关抗HPV16E6核酶的研究报道。
本发明的目的是提供一种可用来治疗和研究人乳头瘤病毒及其相关肿瘤的含抗HPV16E6核酶基因的真核表达质粒。
我们以HPV16E6基因为靶基因，设计了能特异切割它的核酶，并进行了克隆、表达与活性鉴定；证实该抗HPV16E6核酶能有效地、序列特异地切割HPV16E6mRNA。质粒可应用于人乳头瘤病毒及其相关疾病，如宫颈癌、喉癌、口腔癌等，的治疗与研究。细胞和动物实验证实，抗HPV16E6核酶能在RNA水平阻断HPV16E6基因的表达，阻断HPV相关肿瘤的细胞周期进展，诱导肿瘤细胞凋亡，部分逆转宫颈癌等肿瘤的恶性表型，因此可用于宫颈癌、口腔癌、喉癌等肿瘤的治疗。另一方面以核酶为研究工具，通过阻断癌基因的表达，可研究细胞癌基因、抑癌基因、信号转导机制的变化，从而深入探讨HPV的致癌机制。
抗HPV16E6核酶质粒的有效浓度0.1ug/ul-100ug/ul，最佳浓度0.1ug/ul-10ug/ul.
本发明的来源(1)设计以HPV16基因序列为分析序列，采用计算机软件针对HPV16E6基因设计特异性锤头状核酶。
(2)人工合成了抗16HRz ribozyme基因(各两条链)，并引入酶切位点，以便于克隆组装。A.5’CTAGATATCATGTACTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGTTGTTTGGGTAC3’Xba IKpn IB.5’CCAAACAACTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGTACATGATAT3’(3)将抗16HRz ribozyme基因装入原核表达质粒中，进行核酶的体外切割实验，而后又将核酶基因装入真核表达质粒(PcDNA3)中，构建成抗HPV16E6核酶质粒。该质粒借助于脂质体或病毒载体等的携带，用于人乳头瘤病毒及其相关肿瘤，如宫颈癌、喉癌、口腔癌等，的治疗与研究。
以下所述的实例详细说明了本发明实施例1实验材料1.pc16Rz、pcDNA3质粒的制备pRSV-Rz523为抗HPV16E6核酶的真核表达质粒，pcDNA3为无目的基因的真核表达质粒，将其转化JM105受体菌，大量制备并纯化。2.CaSKi细胞、HL60细胞、K562细胞的培养CaSKi细胞为HPV16阳性的人宫颈癌细胞株HL60细胞为人粒细胞白血病细胞株，系NK抵抗细胞；K562细胞为人红白血病细胞株，系NK敏感细胞。以上三种细胞均由本室传代培养。3.动物4周龄裸鼠，雌性，体重20-26克，由第一军医大学动物中心提供。4.主要试剂G418，MTT，HPV16E6单抗，FITC标记的bcl-2、c-myc、fas、p-53单抗。实验方法1.转染CaSKi细胞以脂质体法将浓度为10ug/ul的pc16Rz、pcDNA3分别转染CaSKi细胞，通过G418(400ug/ml)抗性筛选，将阳性克隆细胞扩增并保存，分别命名为CaSKi-R、CaSKi-P细胞。以RNA点杂交法检测抗HPV16E6核酶在CaSKi-R、CaSKi-P细胞中的表达，结果证实抗CaSKi-R细胞中能稳定表达。
2.转染的CaSKi细胞生物学特性观察于倒置显微镜下观察细胞的形态和生长状态，测定细胞生长曲线，测定细胞软琼脂克隆形成率，并通过免疫组化SABC法和流式细胞术检测转染的CaSKi细胞中HPV16E6蛋白的表达。CaSKi、CaSKi-R、CaSKi-P细胞生长速率相近。与CaSKi细胞相比，CaSKi-R细胞表达HPV16E6蛋白明显减少，软琼脂克隆形成率显著降低，而CaSKi-P细胞无此改变。
3.将CaSKi、CaSKi-R、CaSKi-P细胞按常规方法收集，上流式细胞仪检测，每例样品测5千个细胞核，检测结果输至计算机作数据处理，专用软件作细胞周期分析。结果发现CaSKi-R细胞凋亡率明显高于CaSKi和CaSKi-P。利用流式细胞仪测定CaSKi、CaSKi-R、CaSKi-P三种细胞bcl-2、c-myc、fas、p-53等基因表达的变化情况，发现上述基因的表达均有改变。与CaSKi细胞相比，CaSKi-R细胞bcl-2表达降低，c-myc表达增强，fas表达增强，p-53表达增强。而CaSKi-P与CaSKi相比，上述基因表达无明显改变。研究结果证实，转染核酶可上调c-myc、fas、p-53的表达，降低bcl-2的表达，从而启动凋亡机制，促进肿瘤细胞凋亡。
4.免疫活性细胞的杀伤活性检测从健康人血中诱导和制备免疫活性NK、LAK、CD3AK细胞，并分别诱导CaSKi、CaSKi-R细胞与rIL-2共激活杀伤细胞(称CASKI和CASKI-R细胞)，将它们作为效应细胞(简称E)。以CaSKi-R、CaSKi-P、CaSKi、K562和HL60细胞为靶细胞(简称T)，取效靶比分别为20∶1、10∶1、5∶1、2.5∶1、1∶1，于96孔板内混合培养24小时后掺入MTT(1mg/ml)，以单独的效应细胞和靶细胞为对照，每个实验均设三个复孔。MTT作用4小时后加入异丙醇振荡，测570nmOD值，取每个实验OD570值均数，计算效应细胞杀伤百分率，比较杀伤活性。NK、LAK、CD3AK细胞对CaSKi-R细胞杀伤率显著高于CaSKi细胞，CaSKi、CaSKi-R分别与rIL-2共激活杀伤细胞的杀伤活性无明显差别，对CaSKi-R的杀伤活性高于CaSKi细胞。
5.裸鼠成瘤性实验取一定数量、指数期生长、活力在95％以上的CaSKi、CaSKi-R、CaSKi-P细胞，依次接种于裸鼠右后肢大腿外侧皮内，约1×106个瘤细胞；肿瘤移植后对成瘤情况每周观察2次，共观察6周，记录肿瘤的长，宽。结果发现，CaSKi-R细胞的成瘤能力显著低于CaSKi细胞，而CaSKi-P与CaSKi细胞成瘤能力无明显差别。
实施例2将浓度为0.1ug/ul的pc16Rz、pcDNA3质粒分别转染CaSKi细胞，然后按照实施例1的方法进行(1)细胞生长曲线测定和形态学观察；(2)细胞软琼脂克隆率形成实验；(3)细胞凋亡率测定和凋亡基因分析；(4)免疫活性细胞杀伤实验；(5)裸鼠成瘤性实验。可以得出以下结论0.1ug/ul的pc16Rz能降低肿瘤细胞软琼脂克隆形成率，提高肿瘤细胞凋亡率，启动凋亡基因，提高肿瘤细胞对免疫活性细胞杀伤的敏感性，降低肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤能力。
实施例3将浓度为100ug/ul的pc16Rz、pcDNA3质粒分别转染CaSKi细胞，然后按照实施例1的方法进行(1)细胞生长曲线测定和形态学观察；(2)细胞软琼脂克隆率形成实验；(3)细胞凋亡率测定和凋亡基因分析；(4)免疫活性细胞杀伤实验；(5)裸鼠成瘤性实验。可以得出以下结论10ug/ul的pc16Rz能降低肿瘤细胞软琼脂克隆形成率，提高肿瘤细胞凋亡率，启动凋亡基因，提高肿瘤细胞对免疫活性细胞杀伤的敏感性，降低肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤能力。
权利要求
1.抗HPV16E6(人乳头瘤病毒16型E6基因)核酶的真核表达质粒，其特征在于(1)设计以HPV16基因序列为分析序列，采用计算机软件针对HPV16E6基因设计特异性锤头状核酶，该核酶的靶位点是E6基因上170位点。(2)人工合成了抗16HRz ribozyme基因(各两条链)，并引入酶切位点，以便于克隆组装。A.5’CTAGATATCATGTACTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGTTGTTTGGGTAC3’Xba I Kpn IB.5’CCAAACAACTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGTACATGATAT3’(3)将抗16HRz ribozyme基因装入原核表达质粒中，进行核酶的体外切割实验，将该核酶基因克隆于PcDNA3等真核表达载体中，构成抗HPV16E6核酶的真核表达质粒。可溶于水或TE等缓冲液配成溶液，或用冷冻干燥法制成干粉。
2.按照权利要求1所述的质粒，其特征在于溶液中有效浓度0.1ug/ul-100ug/ul.
3.按照权利要求1所述的质粒，其特征在于溶液中最佳浓度0.1ug/ul-10ug/ul.
4.按照权利要求1至3所述的质粒，该质粒借助于脂质体或病毒等载体的携带，用于人乳头瘤病毒及其相关疾病，如宫颈癌、喉癌、口腔癌等，的治疗与研究。
全文摘要
本发明公开了抗HPV16E6核酶质粒及其在人乳头瘤病毒与肿瘤治疗中的应用。该质粒可溶于水或TE等缓冲液配成溶液,或用冷冻干燥法制成干粉。该质粒能在RNA水平阻断HPV16E
文档编号C12N15/85GK1241636SQ9911626
公开日2000年1月19日 申请日期1999年7月5日 优先权日1999年7月5日
发明者张积仁, 郑燕芳 申请人:第一军医大学珠江医院