专利名称：草铵膦耐受性稻的制作方法
技术领域：
本发明涉及稻植物、植物材料和种子，其特征在于带有特定的转化事件，具体而言，在稻基因组特定位点存在CaMV35S启动子控制下的bar基因。本发明的稻植物兼有草铵膦耐受性，以及最佳的综合农学特性、遗传稳定性和针对不同遗传背景的适应性。
此处引用的所有文献均特此引入作为参考。
稻生产通常受多种杂草威胁，其中有些杂草竞争性强，侵袭严重时会导致作物产量大幅下降，以至丧失经济效益。就直接播种、机械化稻耕作的典型的适度生产而言，栽培实践(例如作物轮换、灌溉管理)及除草剂均为控制杂草所必需(Hill等人，1994)。
bar基因(Thompson等人，1987，EMBO J.62519-2523；Deblock等人，1987，EMBO J.62513-2518)是编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricin acetyl transferase，PAT)的基因，在植物中表达时，可耐受除草剂化合物膦丝菌素(也叫草铵膦)或双丙氨酰膦(参见例如美国专利5,646,024和5,561,236号)及其盐和旋光异构体。其它编码PAT的基因已有描述(参见例如Wohlleben等人，1988，基因(Gene)7025-37；欧洲专利275,957号；美国专利5,276,268、5,637,489、5,273,894号)。
美国专利5,641,664号描述了单子叶植物的转化，其中利用电穿孔转化能形成致密胚性愈伤组织的完整组织，或者由这样的完整组织获得的致密胚性愈伤组织。此处公开了利用电穿孔将bar基因转化稻致密胚性愈伤组织以及转基因稻植物的再生。
已描述了利用DNA包裹的金微粒轰击法转化未成熟稻胚细胞，获得的含有gus基因以及bar基因或提供潮霉素抗性的hyg基因二者之一的转基因稻植物(Christou等人，1991，生物技术(Biotechnology)9957)。
美国专利5,679,558号描述了利用电穿孔聚集的悬浮细胞将bar基因转化稻。
然而，前述文献未能指导或者启发本发明。
iii)一对EcoRV片段，其一长度介于约2838和约4507bp之间，优选地约3，8kbp，另一长度超过约5077bp，优选地约12kbp；iv)一条HindIII片段，其长度介于约5077和约11497bp之间，优选地约5，3kbp；v)一对NcoI片段，二者长度均介于约2838和约4507bp之间，优选地其一约3，1kbp，另一约4，1kbp；vi)一条NsiI片段，其长度介于约4749和约11497bp之间，优选地约5，1kbp；其中各限制性片段在标准的严谨条件下，均能够与约1327bp的片段杂交，该片段可由EcoRI消化具有SEQ ID No 8核苷酸序列的质粒而获得；和/或，b)该植物、细胞、组织或种子的基因组DNA能够用于扩增一条介于290和350bp之间的DNA片段，优选地约313bp，所用聚合酶链式反应的两条引物分别具有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5的核苷酸序列(或者包含一条约290到约350bp的DNA片段，优选地约313bp，扩增所用聚合酶链式反应的两条引物分别具有SEQ ID No 4和SEQ ID No5的核苷酸序列)。
本发明涉及转基因的耐受草铵膦的稻植物、细胞、组织或种子，其特征在于具有该植物、细胞、组织或种子的基因组DNA能够产生至少一种，有利地至少两种或多种，例如至少三种，优选地至少四种，例如至少五种，更优选地六种选自上述包含i)、ii)、iii)、iv)、v)和vi)描述的限制性片段或限制性片段对之组中的限制性片段或限制性片段对，该选择可以包括上述i)、ii)、iii)、iv)、v)和vi)的任意组合。
本发明涉及转基因的耐受草铵膦的稻植物、细胞、组织或种子，优选地其特征在于兼有上述a)和b)所描述的特征。
本发明也涉及存放在ATCC的编号为ATCC 203352的种子，由该种子长成的植物，以及源自该植物的细胞或组织。本发明进一步涉及可从由存放在ATCC的编号为ATCC 203352的种子长成的稻植物通过繁殖和/或育种获得的植物。
本发明还涉及包含此处所述带有35S-bar基因(如此处所述)及其侧翼区的植物、种子、细胞或组织(例如稻植物、种子、细胞或组织)，或包含下述一段核苷酸序列的植物、种子、细胞或组织(例如稻植物、种子、细胞或组织)，该核苷酸序列与此处公开的序列至少65％，例如至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％或者甚至97％或100％类似，例如侧翼区-35S-bar基因-侧翼区构建体或插入区的序列。
本发明另外涉及上述本发明稻植物的栽培方法，更具体而言包含使用以草铵膦为活性成分的除草剂处理栽培稻植物的方法。
相信本发明的稻植物，如果按照上述包含使用以草铵膦为活性成分的除草剂的方法栽培，较之未转化的相同稻栽培品种，生长将得到改善(US 5,739,082)。因而，本发明包含一种增强稻植物产量或生长的方法。
本发明也提供稻育种方法，该方法包含与本发明的稻植物杂交。
本发明还提供生产稻植物转基因细胞或由此获得的植物的方法，该方法包含将特征在于具有SEQ ID No 9序列的重组DNA分子插入稻细胞的部分染色体DNA，并且任选地，从转化的稻细胞再生出稻植物。
本发明进一步涉及鉴定转基因植物或其细胞或组织的方法，该方法包含确认转基因植物或其细胞或组织的基因组DNA是否具有以下一或两个特征a)植物、细胞、组织或种子的基因组DNA能够产生至少三种，优选地至少四种，例如至少五种，更优选地六种选自下述的限制性片段或限制性片段对，选自i)一条EcoRI片段，其长度介于约1159和约1700bp之间，优选地约1327bp；ii)一对BamHI片段，其一长度介于约805和约1093bp之间，优选地约805bp，另一长度介于约1700和约2140bp之间，优选地约2，0kbp；iii)一对EcoRV片段，其一长度介于约2838和约4507bp之间，优选地约3，8kbp，另一长度超过约5077bp，优选地约12kbp；iv)一条HindIII片段，其长度介于约5077和约11497bp之间，优选地约5，3kbp；v)一对NcoI片段，二者长度均介于约2838和约4507bp之间，优选地其一约3，1kbp，另一约4，1kbp；vi)一条NsiI片段，其长度介于约4749和约11497bp之间，优选地约5，1kbp；其中各限制性片段在标准的严谨条件下，均能够与约1327bp的下述片段杂交，该片段可由EcoRI消化具有SEQ ID No 8核苷酸序列的质粒而获得；和/或，b)该植物、细胞、组织或种子的基因组DNA能够用于扩增一条介于290和350bp之间的DNA片段，优选地约313bp，其中所用聚合酶链式反应的两条引物分别具有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5的核苷酸序列。
本发明另外涉及用来鉴定包含本发明原种事件的转基因植物的试剂盒，该试剂盒包含识别外源DNA以及GAT-OS2的3’或5’侧翼序列的PCR探针，优选地分别具有SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示核苷酸序列，用于PCR鉴定程序。附图简述通过举例给出下列详述，但并非意在限制本发明于所述特定实施方案，本发明可以结合在此引入作为参考的附图理解，其中
图1消化GAT-OS2基因组DNA得到的限制性图谱。Southern印迹凝胶加样顺序泳道1，PstI消化的Lambda DNA，泳道2，EcoRI消化的GAT-OS2 DNA，泳道3，BamHI消化的GAT-OS2 DNA，泳道4，EcoRV消化的GAT-OS2 DNA，泳道5，HindIII消化的GAT-OS2 DNA，泳道6，NcoI消化的GAT-OS2DNA，泳道7，NsiI消化的GAT-OS2 DNA，泳道8，未转基因稻DNA，泳道9，EcoRI消化的质粒DNA对照。
图2使用GAT-OS2 PCR鉴定方案对不同品系进行PCR分析。凝胶加样顺序泳道1，分子量标准(100bp阶梯)，泳道2-11，包含不同转基因事件稻植物的DNA样品，泳道12，M202野生型DNA，泳道13，Bengal野生型DNA，泳道14，阴性对照(水)，泳道15，分子量标准(100bp阶梯)。发明详述此处所用术语“基因”是指任意DNA序列，该序列包含几种有效连接的DNA片段，例如共同构成启动子区的启动子和5’非翻译区(5’UTR)、编码区(编码或不编码蛋白质)以及包含多聚腺苷酸化位点的3’非翻译区(3’UTR)。一般在植物细胞中，5’UTR、编码区和3’UTR转录出一条RNA，如果是蛋白质编码基因，该RNA可翻译成蛋白质。基因可以包括另外的DNA片段，例如内含子。此处所用遗传位点为指定基因在植物基因组上的位置。
当涉及基因或DNA序列时，术语“嵌合”用于指该基因或DNA序列至少包含两种功能相关的DNA片段(例如启动子、5’UTR、编码区、3’UTR、内含子)，它们彼此间没有天然关联并起源于例如不同来源。当涉及植物种类有关的基因或DNA序列时，“外源”用于指该基因或DNA序列非天然存在于该植物种类中。
此处所用术语“转基因”是指掺入植物基因组的重组DNA分子。术语“重组DNA分子”用于例证并因而包括分离的核酸分子，该核酸分子可能是DNA并可通过重组或其它方法获得。该重组DNA分子通常包含至少一个目的基因(例如嵌合基因)的至少一个拷贝，该目的基因能够使转化植物具备一种或多种特定的特征。“转基因植物”是指其所有细胞的基因组中都包含转基因的植物。
植物基因组中重组DNA分子的掺入一般源于细胞或组织的转化(或者其它基因操作)。掺入的具体位点或出于随机，或在预定位点(如果利用定点整合方法)。
转基因可以通过重组DNA分子在植物基因组中掺入位点的位置和结构进行鉴定。转基因在植物基因组中的插入位点也称为“插入位点”或“靶位点”。转基因插入植物基因组可能与植物DNA的缺失相关联，称为“靶位点缺失”。此处所用“侧翼区”或“侧翼序列”是指植物基因组中至少20bp，优选地至少50bp，甚至多达5000bp的序列，该序列位于转基因上游或下游并与其紧密相邻。使转基因随机整合的转化方法会导致转化子带有不同的侧翼区，该侧翼区对每个转化子都是特定并唯一的。当利用传统杂交方法将转基因导入植物时，其在植物基因组中的插入位点或其侧翼区通常不会改变。此处所用“插入区”是指对应于插入位点(及可能的靶位点缺失)所涉及区域以及(未转化)植物基因组中转基因的上游和下游侧翼区的区域。
转基因表达是指表达包含在转基因中的目的基因，使得植物具有一种或多种表型特征(例如除草剂耐受性)，该表型特征是欲通过(基于部分或全部目的基因的结构和功能)转化中所用重组DNA分子-转化DNA的导入而赋予的性状。
事件定义为通过基因操作而携带包含目的基因至少一个拷贝的转基因的(人工)遗传位点。事件的一般等位基因状态是存在或不存在转基因，事件的表型特征在于转基因表达。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。在分子水平上，事件可由限制性图谱(例如通过Southern印迹鉴定)，和/或转基因的上游和/或下游侧翼序列，和/或转基因的分子结构鉴定。利用包含至少一个目的基因的转化DNA转化植物，通常引发各自独特的多个事件。
此处所用的种质事件，是指选自基于转基因表达和稳定性以及与包含该转基因的植物的最佳农学特性的相容性，转化同一转化DNA而获得的事件之一。因此，原种事件的选择标准是下列一个或多个，优选地两个或多个，有利地所有下列特征a)转基因的存在不干扰需要的其它植物特性，例如那些与农学特性或商业价值有关的特性；b)该事件的特征在于具有确知的可稳定遗传的分子结构，并可开发适当的鉴别同一性对照的工具；c)转基因中的目的基因在该事件的杂合(或半合子)及纯合条件下，具有空间和时间上正确、适当并稳定的表型表达，在携带该事件的植物于常规农业应用中可能处于的环境条件范围内，具有商业上可接受的表达水平。
优选地转基因与植物基因组中允许渐渗入所需的商业遗传背景的位置相关联。
作为原种事件的事件的状况可由该原种事件在不同的相关遗传背景中的渐渗以及与上述标准，例如a)、b)和c)中的一个、两个或全部的符合情况进行证实。
因而，“原种事件”涉及包含转基因且符合上述标准的遗传位点。植物、植物材料及其后代，例如种子，可以在其基因组中包含该原种事件。
所开发的用于鉴定原种事件或包含原种事件的植物或植物材料的“鉴定工具”，是基于该原种事件的特定基因组特性，例如包含转基因和/或转基因侧翼区序列的基因组区域的特异性限制性图谱。此处所用的“限制性图谱”是指一套Southern印迹图形，该图形通过将植物基因组DNA用某一特定的限制性酶或一套限制性酶酶切并同与转基因具有序列相似性的探针杂交(在特定条件下)而获得。由于在转基因插入前，植物基因组中存在(内源的)限制性位点，而插入转基因会改变该基因组的特异性限制性图谱。因而，可通过一种或多种限制性图形来鉴别由此获得的特定的转化子或其后代。用来确定某事件限制性图谱的条件列于限制性图谱鉴定方案中。
可替代地，可根据PCR鉴定方案的检测来鉴定包含原种事件的植物或植物材料。该PCR使用可特异性识别该原种事件的引物。基本上应用一套引物，它们可识别a)原种事件3’或5’侧翼序列内的序列以及b)外源DNA内的序列，优选地可扩增介于100和350个核苷酸之间的片段(整合片段)。优选地，包含一套扩增该植物物种管家基因内片段(优选地长于所扩增的整合片段的片段)的引物作为对照。最适PCR条件，包括特定的引物序列列在PCR鉴定方案中。
术语“相似性”，例如涉及核苷酸序列时，是指两个序列间同源性的定量测量。序列相似性百分比计算为(Nref-Ndif)*100/Nref，其中Ndif是比对时两个序列中不一致残基的总数，Nref是序列之一的残基数。因此，DNA序列AGTCAGTC与DNA序列AATCAATC的序列相似性为75％(Nref＝8；Ndif＝2)。本发明包含具有与此处公开序列有至少65％，例如至少70％，例如至少75％，或至少80％，或有利地至少85％，例如至少90％，至少95％或甚至97％或100％相似性的序列的核酸分子；以及包含这样的核酸分子的植物、细胞、组织、种子和其后代(例如稻植物、细胞、组织、种子和其后代)。可替代地或另外地，涉及序列的“相似性”是指按照Wilbur和Lipwann算法(Wilbur和Lipman，1983 PNAS USA80726)，将相同核苷酸的位点数目除以比对的两个序列中较短序列的核苷酸数目，所用的窗口大小为20个核苷酸，字节长度为4个核苷酸，缺口罚分为4，利用IntelligeneticsTMSuite程序(IntelligeneticsInc.CA)可便利地对包含比对的序列数据进行计算机辅助分析和解释。“基本相似”的序列具有至少约75％，有利地至少约80％，例如至少约85％，优选地至少约90％，特别地约95％，例如至少约97％，特别地约100％的相似性或同一性。很明显，当RNA序列被称为与DNA序列基本相似或相似，或者具有一定程度的同一性时，认为DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
本发明涉及在稻中产生原种事件GAT-OS2以及源自该事件的植物、植物细胞或植物材料。包含原种事件GAT-OS2的植物，是通过如实施例1所述转化质粒pB5/35Sbar(SEQ ID No8)的1501bp PvuI-HindIII片段获得的。用于产生该原种事件的重组DNA分子，包含编码膦丝菌素乙酰转移酶和花椰菜花叶病毒35S启动子的DNA序列，其中编码膦丝菌素乙酰转移酶的序列位于花椰菜花叶病毒35S启动子控制之下(命名为“35S-bar基因”)。该35S启动子在稻中具有“组成型”的表达形式(Battraw等人，1990，plant Mol Biol 15527-538)，意味着其在植物大部分的生命周期、大多数的植物细胞类型中均显著表达。稻植物中35S-bar基因的表达，可赋予其对除草剂化合物膦丝菌素，或双丙氨酰膦，或草铵膦，或更一般的谷氨酰胺合成酶抑制剂，或者其盐或旋光异构体的耐受性。
包含GAT-OS2的植物或植物材料可按照如此处实施例3b)(1)所述的限制性图谱鉴定方案进行鉴定。简要地，稻基因组DNA经选自以下EcoRI、BamHI、EcoRV、HindIII、NcoI、NsiI的限制性酶(优选地至少1种，例如至少2种，有利地至少3种，或至少4种，或至少5种，例如3-6种)消化，然后转到尼龙膜上，与质粒pB5/35Sbar的约1327bp的EcoRI片段杂交，然后就所用的限制性酶确定是否能鉴定出下列片段-EcoRI一条介于约1159和约1700bp之间的片段，优选地约1327bp；
-BamHI一条介于约1700和约2140bp之间的片段，优选地约2，0kbp，和一条介于约805和约1093bp之间的片段，优选地约805bp；-EcoRV一条大于约5077bp的片段，优选地约12kbp，和一条介于约2838和约4507bp之间的片段，优选地约3，8kbp；-HindIlI一条介于约5077和约11497bp之间的片段，优选地约5，3kbp；-NcoI两条均介于约2838和约4507bp之间的片段，优选地一条约4，1kbp，另一条约3，1kbp；-NsiI一条介于约4749和约11497bp之间的片段，优选地约5，1kbp。
DNA片段长度通过与一套已知长度的DNA片段相比较来决定，具体而言是噬菌体lambda DNA的PstI片段。
在使用至少1种，例如至少2种，有利地至少3种，优选地至少4种，特别地至少5种，更优选地所有的这些限制性酶进行消化以后，如果植物材料能产生与上述相同长度的DNA片段，可确定该稻植物带有原种事件GAT-OS2。
包含GAT-OS2的植物或植物材料也可根据此处实施例3b)(2)所述PCR鉴定方案进行鉴定。简要地，利用PCR扩增稻基因组DNA，所用一条引物可特异性识别GAT-OS2的侧翼序列，具体而言为具有SEQ ID No5序列的引物，另一条引物可识别转基因内序列，具体而言为具有SEQID No 4序列的引物。稻的内源性引物用作对照。如果植物材料能产生一条介于约290和约350bp之间、优选地约313bp的片段，可确定该稻植物携带有原种事件GAT-OS2。
带有GAT-OS2的植物也可通过其草铵膦耐受性鉴定。在本发明的上下文中，其包含耐受除草剂LibertyTM的植物。LibertyTM耐受性定义为在3-4叶期(3V-4V)，每公顷至少使用200g(g.a.i./ha)，优选地400g.a.i./ha，以及可能高达1600g.a.i./ha的活性成分，而不杀伤植物的标准。带有GAT-OS2的植物还可通过其细胞中经PAT分析(DeBlock等人，1987，上文)确认存在膦丝菌素乙酰转移酶而鉴定。
带有GAT-OS2的植物可以，例如得自存放于ATCC编号为ATCC203352的种子。该植物可进一步繁殖和/或用于常规育种方法，以生产具有相同特征的转化植物，或者将本发明的原种事件引入相同植物物种的其它栽培品种。得自该植物的种子包含稳定掺入其基因组的原种事件。
本发明的稻植物能以传统方式栽培，转基因的存在可确保其耐受草铵膦。因此，在生长该稻植物的田间，可以通过应用包含草铵膦为活性成分的除草剂(例如LibertyTM)来控制杂草。
携带有GAT-OS2的植物也可通过具有与下列美国市面上可买到的稻品种Priscilla、Cypress、Bengal、Cocadrie、Jefferson、Madison、M202、M201、M103、Drew、Kaybonnet、Lagrue可相比的农学特性进行鉴定，相关的农学特性是植物高度、杆强度/硬度、抗倒伏、叶片形态(长度、宽度以及剑叶角度)、成熟时间、小花形态、园锥花序育性、种荚全闭合、谷粒大小和形状以及谷物产量和产率。
已经注意到，在稻植物基因组中该区域，更具体而言在稻植物基因组中该位点存在该转基因，使该事件具有特别有利的表型和分子特征。更准确地说，在基因组该特定位点存在转基因，可导致该转基因稳定的表型表达，而不损害该植物任何方面的预期农学特性。因而，对应SEQ ID No 9的插入区域，更具体而言其GAT-OS2的插入位点，被证明特别适于引入目的基因，例如除草剂抗性基因，更准确地说，是位于35S启动子控制下的编码膦丝菌素乙酰转移酶的基因，具体而言是质粒pB5/35Sbar的PvuI-HindIII片段。
重组DNA分子能够通过定点插入方法特异性地插入该插入区。该方法为本领域的技术人员所熟知，包含比如使用重组酶的同源重组，例如但不局限于来自酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)的FLP重组酶(美国专利5,527,695)，或来自大肠杆菌(Escherichia coli)P1噬菌体的CRE重组酶(PCT申请公开WO9109957)，或来自鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii)pSRI的重组酶(Araki等人，1985，JMolBiol 182191-203)，或例如美国专利4,673,640所述的lambda噬菌体重组系统。
能够利用包括电穿孔方法、DNA包裹的金微粒轰击或生物弹射击法(biolistic methods)、或者农杆菌或聚乙二醇介导法等技术，将DNA插入植物基因组，例如稻基因组。
此处所用“包含”可解释为详细说明陈述的特征、整数、步骤或成分的存在，但不排除存在或增加一个或多个特征、整数、步骤或成分，或其组合。因而，例如包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质，可能包含比实际列举的更多的核苷酸或氨基酸，即包含在更大的核酸或蛋白质中。包含结构或功能上定义的DNA序列的嵌合基因，可以包含另外的DNA序列以及其它。
下列实施例描述了带有原种事件GAT-OS2的稻植物的开发和特征。
除非另有说明，所有的重组DNA技术均按照如下所述标准方案进行Sambrook等人(1989)分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，纽约，以及Ausubel等人(1994)通用分子生物学方案，通用方案，卷1和2，美国。在英国BIOS科学出版有限公司(英国)和布莱克威尔科学出版社出版的“Plant Molecular BiologyLabfax(1993)”中描述了标准的植物分子操作的材料和方法。
在详述和实施例中引用了下列序列SEQ ID NO 1包含GAT-OS2 5’侧翼区的序列SEQ ID NO 2包含GAT-OS2 3’侧翼区的序列SEQ ID NO 3包含GAT-OS2插入位点的序列
SEQ ID NO 4OSA03PCR鉴定方案的引物SEQ ID NO 5OSA04PCR鉴定方案的GAT-OS2-特异性引物SEQ ID NO 6OSA01稻内源性引物SEQ ID NO 7OSA02稻内源性引物SEQ ID NO 8质粒pB5/35SbarSEQ ID NO 9插入区
b)转化稻Bengal品种是由路易斯安那农业实验局稻研究站培育的中粒稻，正式推广于1992年，谱系包含MARS和M201(Linscombe S.D.等人，1993，作物科学(Crop Science)33645-646)。
采用DNA直接转移方法，将pB5/35Sbar的1501bp PvuI-HindIII片段转化稻。各阶段均用膦丝菌素(PPT)选择，幼苗再生除外，其中无PPT以促进其生长。这样产生一批初级转化子(T0代植物)。
实施例2事件的产生
a)产生转基因纯合系各种T0代半合子幼苗从组织培养过渡后，转到温室土壤，使其开花、结籽。评估幼苗的繁殖力、结实性以及对草铵膦的耐受性。选择19株植物作进一步分析。从这些植物收集自交产生的T1代种子，在田间生长。用LibertyTM除草剂喷洒T1代植物，每公顷800g活性成分(g.a.i/ha；推荐给农民的剂量是400g.a.i/ha)。选择应用除草剂后存活的、除草剂耐受性以3∶1分离的事件，作进一步鉴定，评价对耐受植物的损伤(叶尖灼伤)。
于全部所选事件的耐受性植物的圆锥花序收集T2代种子，成行播种，用LibertyTM除草剂喷洒(1600g.a.i/ha)T2代植物，以鉴定其除草剂耐受性的分离。选择那些100％存活，因而相当于转基因纯合系的行，再鉴定其除草剂损伤和表型特性。根据在圆锥花序行内的表型一致性进一步进行事件的选择(所需的特征)。
b)转基因事件的鉴定-GAT-OS2的选择转基因事件通过Southern印迹图谱，一般表型和农学特性，以及产量进一步鉴定，适宜时在田间条件下确定这些特征。
Southern印迹分析采用标准的Southern印迹分析方法，通过用EcoRV酶切消化稻基因组DNA，与pB5/35Sbar的1327bp EcoRI片段杂交，检测转基因的存在。相对带强度可指示植物在转基因位点是纯合还是半合子。发现两个事件有简单的插入，其转基因的分离模式可以通过孟德尔单位点遗传来解释证实了这一点。
植物一般表型和农学特性鉴定T1和T2代植物的多种表型性状，包括植株高度、稻杆强度/硬度、倒伏倾向、叶片形态(太细或剑叶角度不正确)、晚熟、小花构造、园锥花序不育或育性不完全、种子谷壳不完全闭合(可导致疾病易感性提高)、谷粒大小和形状以及谷物产量和产率。各系经鉴定，其显示的农学特性较之未转化的Bengal栽培品种以及下列稻品种Priscilla，Cypress，Cocadrie，Jefferson，Madison，M202，M201，M103，Drew，Kaybonnet，Lagrue相似(或有所改良)。有时，园锥花序行内的植物因为体细胞克隆变异而使上述一种或多种性状发生分离。除非这会导致引入具有商业利用价值的表型性状，否则舍弃这些植物。
产量评估的田间试验从选择的纯合群体中大批收集T2代种子，与Bengal品种标准比较。将该种子在代表每一事件的独立地块中成行种植。转基因地块用1,600g.a.i/ha的LibertyTM除草剂喷洒或者不喷洒(“未喷洒”地块)，未转基因品种标准的地决不喷洒LibertyTM。所有地块均使用标准除草剂处理，以控制本地杂草。
在不同地域对转基因事件进行产量性状的测试，包括Louisiana和Puerto Rico(冬季苗圃)。
完成农学参数的统计分析以及植物形态学和其它非参数数据的秩统计，并与亲代品种、Bengal以及下列稻品种Priscilla，Cypress，Cocadrie，Jefferson，Madison，M202，M201，M103，Drew，Kaybonnet，Lagrue比较，鉴定最具商业价值的侯选品种。在产生一系列育种系方面，GAT-OS2事件最具实用性。
实施例3GAT-OS2事件的鉴定a)位点的分子和遗传深入分析一旦GAT-OS2事件鉴定为转基因表达及全面农学特性最佳的事件，即在分子水平详细分析其转基因位点，包括详细的Southern印迹分析和转基因侧翼区域序列分析。
(1)使用多个限制酶进行Southern印迹分析从转基因及对照植物中收集叶片组织，参照Dellaporta等人(1983，植物分子生物学报告(Plant Molecular Biology Reporter)，1，vol.3，p.19-21)从叶片组织中分离总基因组DNA，在分光光度计中波长260nm处测量光密度，确定每个样品的DNA浓度。
应用制造商建议的条件，在40ul终反应体积中对10ug基因组DNA进行限制性酶切。调整酶切时间和/或限制酶用量，以保证基因组DNA样品酶切完全，而无非特异性降解。酶切后，在酶切的DNA样品中加入4ul载样染料，上样于1％琼脂糖凝胶。
下列对照DNA也上样于该凝胶-由未转基因稻植物制备的基因组DNA，用于阴性对照。该阴性对照用于证实无杂交背景。
-DNA阳性对照Oryza sativa基因组整合有杂合的单拷贝转基因，10ug基因组DNA的分子数相当于±19pg1501bp的pB5/35Sbar DNAPvuI-HindIII片段(Oryza sativa二倍体基因组大小0.8x109bp)。将代表每基因组一个质粒拷贝的数量，加入1ug酶解的未转基因Oryzasativa DNA中。该重新组成的样品用于表明杂交在允许探针与靶序列杂交的条件下完成。
用PstI消化噬菌体Lambda DNA(Clind 1 ts 857 Sam 7株，LifeTechnologies)，用作分子量标准。
电泳后，将DNA样品(消化的稻基因组DNA、对照以及分子量标准DNA)通过毛细印迹12-16小时转到尼龙膜上。用于探针制备的DNA模板通过EcoRI限制性酶切质粒pB5/35Sbar制备，产生的1327bp DNA片段包含转化DNA的相关部分(1501bpPvuI-HindIII片段)。纯化后参照标准方法标记该DNA片段，用于与膜杂交。
在标准的严谨条件下进行杂交标记的探针在95-100℃水浴中加热5-10分钟变性，冰上骤冷5-10分钟，加入杂交液(6xSSC(20xSSC为3.0M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0)，5xDenhardt’s(100xDenhardt’s＝2％Ficoll，2％聚乙烯吡咯烷酮，2％牛血清白蛋白)，0.5％SDS和20ug/ml变性的载体DNA(单链鱼精DNA，平均长度为120-3000核苷酸))。65℃杂交过夜，用洗涤溶液(2xSSC，0.1％SDS)65℃20-40分钟洗膜3次。
对放射自显影进行电子扫描用不同的限制性酶消化GAT-OS2基因组DNA，由此获得的限制性图谱列于图1，汇总于表1。
表1GAT-OS2的限制性图谱
(*)这些片段的长度是由pB5/35S的1501bpPvuI-HindIII片段的限制性图谱预测得来。
(2)鉴定侧翼序列利用Liu等人所述热不对称交错(thermal asymmetricinterlaced，TAIL-)PCR方法(1995，植物杂志(The Plant Journal)8(3)457-463)，测定GAT-OS2事件中插入转基因的侧翼区序列。该方法利用连续反应中的3个特异性嵌套引物和1个较短的随机简并(AD)引物，这样可以热控特异性与非特异性产物的相对扩增效率。根据退火条件，选择与转基因边界退火的特异性引物。用1％琼脂糖凝胶分析小量(5ul)未纯化的次级和三级PCR产物。三级PCR产物用于制备性扩增、纯化并在自动测序仪上利用DyeDeoxy Terminator cycle试剂盒测序。
1.HindIII位点的TAIL-PCR所用引物是
其中N＝A，C，T或g；W＝A或T利用MDB556-MDB411扩增的片段约400bp，其中113bp已测序(5’侧翼SEQ ID NO 1)。介于bp1和bp92之间的序列包含植物DNA，而介于bp93和bp113之间的序列对应pB5/35Sbar DNA。
2.PvuI位点的TAIL-PCR所用引物是
其中N＝A，C，T或g；S＝C或g；W＝A或T利用MDB285-MDB410扩增的片段约1200bp(3’侧翼SEQ ID NO 2)。介于bp1和bp604之间的序列对应pB5/35Sbar DNA，而介于bp605和bp1279之间的序列包含植物DNA。
(3)鉴定靶位点缺失使用对应野生型Oryza sativa上转基因侧翼区内序列的引物，以Bengal品种为模板，鉴定转基因的插入位点。
使用下列引物序列(5’→3’) 在5’侧翼区内 在3’侧翼区内的位置(SEQ ID 的位置(SEQ IDNO1) NO2)YTP059 TCg.gAC.AAC.CgC.gAT.AgT.TCg56→76 -----OSA04 TCg.CAT.ATg.TAT.gTA.ACA.CgC----- 717→697这样得到168bp的片段(SEQ ID NO 3)，其中bp 38-55对应靶位点缺失。
因而，所测序的完整的稻插入区域(SEQ ID NO 9)包含1-92 5’侧翼区 SEQ ID NO 1的bp1-9293-110靶位点缺失SEQ ID NO 3的bp38-55111-785 3’侧翼区 SEQ ID NO 2的bp605-1279(4)位点的遗传分析对几个世代的子代植物进行分子和表型分析，检查插入片段的遗传稳定性。
比较T0、T1和T2代GAT-OS2稻植物的草铵膦抗性植株的Southern印迹分析，发现是相同的，证明包含GAT-OS2的植物中转基因的分子结构稳定。
GAT-OS2事件在至少3个后续世代中展示转基因单遗传位点孟德尔分离，表明插入片段是稳定的。
根据以上结论，确定GAT-OS2为原种事件。
b)开发同一性对照的诊断工具开发以下方案，以鉴定任何包含原种事件GAT-OS2的任何稻植物材料。
(1)GAT-OS2原种事件限制性图谱鉴定方案包含原种事件GAT-OS2的稻植物基本上可利用如实施例3a)(1)所述的Southern印迹进行鉴定。这样，稻基因组DNA 1)用至少3种，优选地至少4种，特别地至少5种，更特别地所有的下列限制性酶EcoRI、BamHI、EcoRV、HindIII、NcoI、NsiI进行消化，2)转移至尼龙膜上，3)与质粒pB5/35Sbar的1327bp EcoRI片段杂交。如果就所用的每一种限制性酶而论，能鉴定出与表1所列相同长度的DNA片段，则确认该稻植物带有原种事件GAT-OS2。
(2)GAT-OS2原种事件聚合酶链式反应鉴定方案在尝试筛选未知物之前，必须用各种合适的对照做反应测试。本方案可能需要优化各实验室间有差别的组分(模板DNA样品、Taq DNA聚合酶、引物质量、dNTP、热循环仪等)在本方案中内源性序列的扩增具有重要作用。必须获得能够等摩尔量扩增已知转基因的基因组DNA模板中的内源性及转基因序列的PCR和热循环条件。根据琼脂糖凝胶电泳判断，只要未扩增出内源性靶片段，或者扩增出的靶序列溴乙锭染色强度不相同，就必须优化PCR条件。
模板DNA依照Edwards等人方法(核酸研究，19，p1394，1991)制备模板DNA。使用其它方法制备的DNA时，应该用不同的模板量做反应测试，通常50ng基因组模板DNA的结果最好。
指定阳性和阴性对照PCR测试中应包括以下阳性和阴性对照
-Master Mix对照(DNA阴性对照)，是不加DNA的PCR反应。如果观察到无PCR产物的预期结果，表明PCR混合物没有靶DNA污染。
-DNA阳性对照(已知包含转基因序列的基因组DNA样品)，成功扩增该阳性对照表明，此PCR是在允许扩增靶序列的条件下运行的。
-野生型DNA对照，该PCR中提供的模板DNA是由未转基因植物制备的基因组DNA。如果观察到没有扩增出转基因PCR产物、而扩增出内源性PCR产物的预期结果，表明在基因组DNA样品中没有可检测到的转基因背景扩增。
引物使用下列特异性识别转基因以及GAT-OS2侧翼序列的引物OSA035’-gAC.TCT.gTA.TgA.ACT.gTT.CgC-3’(SEQ ID 4)(靶P35S)OSA045’-TCg.CAT.ATg.TAT.gTA.ACA.CgC-3’(SEQ ID 5)(靶植物DNA)PCR混合物中始终包括针对内源性序列的引物，该引物在未知样品和DNA阳性对照中用作内部参照。使用内源性引物对获得阳性结果说明，在基因组DNA制剂中有适当质量的丰富DNA，足以生成PCR产物。所用内源性引物是OSA015’-gAT.CAg.TgC.Agg.CAA.TAC.Tgg-3’(SEQ ID 6)(磷脂酶D基因Acc.No.AB001919，3836→3856)OSA025’-TTC.CTA.ACA.TgT.ggg.TgT.Cg-3’ (SEQ ID 7)(磷脂酶D基因Acc.No.AB001919，4291→4272)扩增片段PCR反应预期的扩增片段是引物对OSA01-OSA02457bp(内源性对照)引物对OSA03-OSA04313bp(GAT-OS2原种事件)PCR条件50ul PCR反应混合物包含5ul模板DNA5ul 10x扩增缓冲液(与Taq聚合酶一起提供)1ul 10mM dNTP1ul OSA01(10pmole/ul)1ul OSA02(10pmole/ul)2ul OSA03(10pmole/ul)2ul OSA04(10pmole/ul)0.2ul Taq DNA聚合酶(5单位/ul)加水至50ul达到最佳结果的热循环程序见下95℃4分钟然后 95℃1分钟57℃1分钟72℃2分钟5个循环然后 92℃30秒
57℃30秒72℃1分钟22-25个循环然后72℃5分钟凝胶电泳分析将10-20ul PCR样品及适当的分子量标志(例如100bp阶梯，PHAMACIA)上样1.5％琼脂糖凝胶(Tris-硼酸盐缓冲液)。
结果确认不接受转基因植物DNA样品经单一PCR反应和单一PCR混合物获得的数据，除非1)DNA阳性对照显示预期的PCR产物(转基因的以及内源性的片段)，2)DNA阴性对照没有PCR扩增(无片段)以及3)野生型DNA对照显示预期结果(扩增出内源性片段)。
有可见量预期大小的转基因及内源性PCR产物的泳道，表明制备基因组DNA模板的相应植物已经遗传了GAT-OS2原种事件。无可见量转基因PCR产物、而有可见量内源性PCR产物的泳道，表明制备基因组DNA模板的相应植物不包含该原种事件。无可见量转基因PCR产物及内源性PCR产物的泳道，表明基因组DNA的质量和/或数量不能供PCR产物生成，不计数这样的植物。应该重新制备其基因组DNA，并且必须使用适当的对照重新运行PCR。
使用可区分PCR方案鉴定GAT-OS2依照上述方案检验包含不同转基因事件的稻植物叶片材料，将来自M202野生型以及Bengal野生型的样品作为阴性对照。
图2所示为PCR分析的结果，确认样品8和9(它们实际上包含来源于相同事件的植物的DNA)包含原种事件GAT-OS2，检验的所有其它品系均不包该原种事件。
实施例4GAT-OS2基因渐渗入优选的栽培品种通过反复回交将原种事件GAT-OS2引入下列栽培品种-California Temperate Japonicas(例如但不局限于M204，M202，M201，M103)-California Tropical Japonicas(例如但不局限于L201，L202)-Japanese and Korean Temperate Japonicas(例如但不局限于Koshihikari和Milyang)-Australian Temperate Japonicas(例如但不局限于Millin和Jarrah)-Mediterranean Temperate Japonicas(例如但不局限于Ballila、Arborio)-Chinese Indicas(例如但不局限于Guichao、Congui 314、Teqing)-Southern United State Tropical Japonicas，长粒(例如但不局限于Drew、Cypress、Jefferson、Priscilla、Cocadrie)-Southern United State Tropical Japonicas，中粒(例如但不局限于Bengal、Mars、Brazos、Mercury)-South American Tropical Japonicas，长粒(例如但不局限于E1 Paso144、IRGA409)-远东basmati和jasmine类型(Kasmir、Kwao Dak Mali)-非洲javanica类型(bulu稻)观察到该原种事件基因渐渗入这些栽培品种，对其需要的表型或农学特性没有显著影响(无连锁累赘)，而由草铵膦耐受性确认的转基因表达，达到了商业上可接受的水平，这证实GAT-OS2事件为原种事件。
除非另外明确指出，术语“植物”如同以下权利要求所用一样，是用来包括位于任何成熟期的植物组织，以及任何取自或源于该植物的细胞、组织或器官，包括但不局限于任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。
包含原种事件GAT-OS2的种子以GAT-OS2存放在ATCC，编号为ATCC203352。
权利要求
1.转基因的草铵膦耐受性稻植物、细胞、组织或种子，其特征在于a)所述植物、细胞、组织或种子的基因组DNA能够产生至少3种限制性片段或限制性片段对，其中所述限制性片段或限制性片段对选自下组i)一条EcoRI片段，其长度介于约1159和约1700bp之间；ii)一对BamHI片段，其一长度介于约805和约1093bp之间，另一长度介于约1700和约2140bp之间；iii)一对EcoRV片段，其一长度介于约2838和约4507bp之间，另一长度超过约5077bp；iv)一条HindIII片段，其长度介于约5077和约11497bp之间；v)一对NcoI片段，二者长度均介于约2838和约4507bp之间；vi)一条NsiI片段，其长度介于约4749和约11497bp之间；其中所述限制性片段在标准的严谨条件下，均能够与约1327bp的下述片段杂交，该片段可由EcoRI消化具有SEQ ID No 8核苷酸序列的质粒获得；和/或，b)从所述植物、细胞、组织或种子的基因组DNA，通过聚合酶链式反应，使用分别具有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5的核苷酸序列的两条引物，能够扩增出一条介于290和350bp之间，优选地约313bp的DNA片段。
2.如权利要求1所述的植物、细胞、组织或种子，其特征在于从所述植物、细胞、组织或种子的基因组DNA，通过聚合酶链式反应，使用分别具有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5的核苷酸序列的两条引物，能够扩增出一条介于290和350bp之间，优选地约313bp的DNA片段。
3.如权利要求1所述的植物、细胞、组织或种子，其特征在于所述植物、细胞、组织或种子的基因组DNA能够产生至少3种限制性片段或限制性片段对，其中所述限制性片段或限制性片段对选自下组i)一条EcoRI片段，其长度介于约1159和约1700bp之间；ii)一对BamHI片段，其一长度介于约805和约1093bp之间，另一长度介于约1700和约2140bp之间；iii)一对EcoRV片段，其一长度介于约2838和约4507bp之间，另一长度超过约5077bp；iv)一条HindIII片段，其长度介于约5077和约11497bp之间；v)一对NcoI片段，二者长度均介于约2838和约4507bp之间；vi)一条NsiI片段，其长度介于约4749和约11497bp之间；其中所述限制性片段在标准的严谨条件下，均能够与约1327bp的下述片段杂交，该片段可由EcoRI消化具有SEQ ID No 8核苷酸序列的质粒而获得。
4.如权利要求3所述的植物、细胞、组织或种子，其特征在于所述植物、细胞、组织或种子的基因组DNA能够产生至少4种选自所述组的限制性片段或限制性片段对。
5.如权利要求4所述的植物、细胞、组织或种子，其特征在于所述植物、细胞、组织或种子的基因组DNA能够产生至少5种选自所述组的限制性片段或限制性片段对。
6.如权利要求5所述的植物、细胞、组织或种子，其特征在于所述植物、细胞、组织或种子的基因组DNA能够产生6种选自所述组的限制性片段或限制性片段对。
7.如权利要求3-6中任一项所述的植物、细胞、组织或种子，其特征还在于从所述植物、细胞、组织或种子的基因组DNA，通过聚合酶链式反应，使用分别具有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5的核苷酸序列的两条引物，能够扩增出一条介于290和350bp之间，优选地约313bp的DNA片段。
8.由存放于ATCC，编号为ATCC 203352的种子长成的植物。
9.如权利要求8所述植物的细胞或组织。
10.存放于ATCC、编号为ATCC 203352的种子。
11.如权利要求1-7中任一项所述的转基因的草铵膦耐受性稻植物，该稻植物可通过由存放于ATCC编号为ATCC 203352的种子长成的稻植物，经过繁殖和/或育种而得到。
12.稻植物的栽培方法，该方法包含培养如权利要求1-8中任一项所述的植物。
13.如权利要求12所述的方法，该方法另外包含应用以草铵膦为活性成分的除草剂处理栽培稻植物。
14.稻育种方法，该方法包含与如权利要求1-8中任一项所述的植物杂交。
15.生产稻植物转基因细胞的方法，该方法包含将重组DNA分子插入特征在于具有SEQ ID No 9序列的稻细胞染色体DNA部分内。
16.可通过如权利要求15所述方法获得的稻植物转基因细胞。
17.生产转基因稻植物的方法，该方法包含将重组DNA分子插入特征在于具有SEQ ID No 9序列的稻细胞染色体DNA部分内，以及从转化的稻细胞再生出稻植物。
18.可通过如权利要求17所述方法获得的转基因稻植物。
19.鉴定其中包含原种事件GAT-OS2的转基因植物或细胞或组织的方法，该方法包含鉴定以下一种或两种特性a)所述植物、细胞、组织或种子的基因组DNA能够产生至少3种选自下组的限制性片段或限制性片段对i)一条EcoRI片段，其长度介于约1159和约1700bp之间；ii)一对BamHI片段，其一长度介于约805和约1093bp之间，另一长度介于约1700和约2140bp之间；iii)一对EcoRV片段，其一长度介于约2838和约4507bp之间，另一长度超过约5077bp；iv)一条HindIII片段，其长度介于约5077和约11497bp之间；v)一对NcoI片段，二者长度均介于约2838和约4507bp之间；vi)一条NsiI片段，其长度介于约4749和约11497bp之间；其中所述限制性片段在标准的严谨条件下，均能够与约1327bp的下述片段杂交，该片段可由EcoRI消化具有SEQ ID No 8核苷酸序列的质粒而获得；和/或，b)从所述植物、细胞、组织或种子的基因组DNA，通过聚合酶链式反应，使用分别具有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5的核苷酸序列的两条引物，能够扩增出一条介于290和350bp之间的DNA片段。
20.如权利要求19所述的方法，该方法包含确认所述转基因植物或其细胞或组织的基因组DNA能否产生所有6种限制性片段或限制性片段对。
21.如权利要求19所述的方法，该方法包含确认所述转基因植物或其细胞或组织的基因组DNA能否在聚合酶链式反应中，通过分别具有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5核苷酸序列的两条引物，用于扩增出一条约313bp的DNA片段。
22.鉴定包含MS-B2原种事件的转基因植物、其细胞或组织的试剂盒，所述试剂盒包含至少两个PCR探针，其一识别GAT-OS2外源DNA内的序列，另一识别GAT-OS2 3’或5’侧翼区域内的序列。
23.如权利要求22所述的试剂盒，所述试剂盒包含分别具有SEQID No 4和SEQ ID No 5核苷酸序列的PCR探针。
全文摘要
本发明涉及稻植物、植物材料和种子,其特征在于带有特定的转化事件,具体而言,在稻基因组特定位点存在CaMV 35S启动子控制下的bar基因。本发明的稻植物兼有草铵膦耐受性,以及最佳的综合农学特性、遗传稳定性和针对不同遗传背景的适应性。
文档编号C12Q1/68GK1335886SQ99814584
公开日2002年2月13日 申请日期1999年11月3日 优先权日1998年11月3日
发明者F·米啻尔斯, K·约翰森 申请人:阿温提斯作物科学公司