。该斜面豆芽汁绿豆汁固体培养基的配方有利于纳豆芽抱杆菌保藏。
[0044] 本发明中，采用基因组重排技术选育纳豆芽抱杆菌BN-NKPQQ-RWX-202时，选育平 板中添加一定比例的发酵培养基组分（绿豆汁），而发酵培养基中添加一定比例的选育平 板组分（豆芽汁），使得选育与发酵两环节之间形成关联，促使选育环节表现出高产表型的 菌株在发酵时依然表现出高产表型，此即为本发明的底物诱导适应性策略。
[0045] 步骤2)中，所述的从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，具体包括；① 制备2个平板MRS固体培养基，其中一个将甲硫氨酸（Met)配入（Met添加量为10-15mg/ L)，为平板C，另一个为单纯MRS固体培养基平板（平板D)，为平板D ;②将诱变后的干酪乳 杆菌（Lactobacillus casei化irota)涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个 平板，使平板C和平板D互为影印平板；③在平板C与平板D的同一位置，平板C出现菌落 而平板D未出现菌落，或平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则该菌落为甲硫氨酸营 养缺陷型干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌LcS-Mef，保藏于斜面MRS固体培养基中。
[0046] 所述的平板MRS固体培养基和斜面MRS固体培养基W 1L计，由W下量的组分组 成：
[0047] 蛋白膝 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 恃樣酸氨二镑 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钢 5.0g; 憐酸氨二钟 2.0g; 硫酸镑 〇.58g; 硫酸猛 0.25g; 琼脂 20g; 化温 80 l.OmL; 水 余量； 该MRS固体培养基的pH值保持在6.2?6.4。
[0048] 该MRS固体培养基有利于干酪乳杆菌菌落形成和甲硫氨酸营养缺陷型干酪乳杆 菌的筛选。
[0049] 本发明中，采用随机诱变技术获得甲硫氨酸营养缺陷（MeO的干酪乳杆 菌（Lactobacillus casei Shirota-Met-，LcS-Met-)。LcS-Met-在生长速度上商于 BN-NKPQQ-RWX-202,但前者对后者营养依赖，两者之间形成稳定共生关系，通过构建共生关 系的策略实现纳豆芽抱杆菌与干酪乳杆菌的共发酵，获得富含NK和PQQ的绿豆乳。
[0050] 步骤3)中，在共发酵之前，将BN-NKPQQ-RWX-202和LcS-Met-分别进行活化培 养，BN-NKPQQ-RWX-202在豆芽汁绿豆汁液体培养基中进行活化培养，培养温度为34? 36C (优选35C )，LcS-Met-在MRS液体培养基中进行活化培养，培养温度为36?38C (优 选 37〇C )。
[0051] 所述的豆芽汁绿豆汁液体培养基W 1L计，由W下量的组分组成：
[0052] 绿豆汁 100?150血；
[005引 藏糖 4. 0?6. Og ;
[0054] 豆芽汁 余量。
[00巧]所述的豆芽汁绿豆汁液体培养基W 1L计，优选的，由W下量的组分组成：
[0056] 绿豆汁 100 ?150mL ；
[0057] 藏糖 5. Og ;
[005引豆芽汁 余量。
[0059] 该豆芽汁绿豆汁液体培养基的配方有利于纳豆芽抱杆菌增殖培养。豆芽汁制备： 刚出芽的大豆500g，加水2500血，煮沸浓缩至1000血后过滤，得到豆芽汁。
[0060] 所述的MRS液体培养基W 1L计，由W下量的组分组成：
[0061] 蛋白膝 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 梓樣酸氨二倭 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸销 5.0g; 憐酸氨二钟 2.0g; 硫酸镑 0.58g; 硫酸猛 0.25g; 化温 80 l.OmL： 水 余量； 该MRS液体培养基的班值保持在6.2?6.4。
[0062] 该MRS液体培养基有利于干酪乳杆菌增殖培养。
[0063] 将BN-NKPQQ-RWX-202和LcS-Mef共发酵含绿豆汁的绿豆乳发酵培养基，具体包 括；将活化后的BN-NKPQQ-RWX-202和LcS-Met-混合，形成混合菌液，将混合菌液接种至含 绿豆汁的绿豆乳发酵培养基，纱布封口培养后得到富含NK和PQQ的绿豆乳。
[0064] 所述的绿豆乳发酵培养基W 1L计，由W下量的组分组成：
[0065] 黯糖 50.0g; 酪氨酸 0.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麦芽糖 20.0g; 豆芽汁 lOOmL 绿豆汁 余量。
[0066] 所述的绿豆汁的制备包括；在水中加绿豆，浸泡2?12小时，在90°C?99°C碼磨 成浆汁，得到绿豆汁，其中，所述的水的体积与绿豆的质量比为lOOmL ;10?25g。具体地， 如100血水中加10?25g绿豆，浸泡2小时W上后，9(TCW上碼磨成浆汁。
[0067] 混合菌液中，所述的BN-NKPQQ-RWX-202和LcS-Mef的混合密度比为1:2?1:5。 [006引所述的混合菌液接种至含绿豆汁的绿豆乳发酵培养基的接种量为1 %?5%。
[0069] 所述的纱布封口培养的条件为；37°C?42C六层纱布封口培养2化?36h。
[0070] 共发酵时，在绿豆乳培养基中，添加酪氨酸和谷氨酸对BN-NKPQQ-RWX-202进行代 谢调控，促进PQQ合成，添加麦芽糖对BN-NKPQQ-RWX-202进行代谢调控，促进NK生成，添加 豆芽汁促进BN-NKPQQ-RWX-202在绿豆乳发酵过程中的增殖。本发明中，纳豆芽抱杆菌与干 酪乳杆菌选育及其共发酵制备的绿豆乳，除富含纳豆激酶和化咯唾晰酿之外，呈均一淡绿 色，组织细腻均匀，具有绿豆乳固有的滋味和发酵后特有的风味。
[0071] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0072] -、本发明使用的纳豆芽抱杆菌和干酪乳杆菌均属于食品级安全微生物。
[0073] 二、首次采用基因组重排技术优化NK和PQQ合成途径，对纳豆芽抱杆菌所有可能 与NK和PQQ合成有关的主流及旁支途径统筹优化，实现多位点协同突变，进而通过高通量 筛选使多位点协同突变的表型从突变库中凸显。同时，在基因组重排技术基础上进一步采 用底物诱导适应性策略，保障了选育环节表现出高产表型的菌株在发酵时依然表现出高产 表型，获得能够在绿豆乳发酵中高产NK兼PQQ的纳豆芽抱杆菌BN-NKPQQ-RWX-202。
[0074] H、首次采用构建共生关系的策略实现纳豆芽抱杆菌与干酪乳杆菌的共发酵。通 过随机诱变获得甲硫氨酸营养缺陷（Met-)干酪乳杆菌LcS-Met-。LcS-Met-在生长速度上 高于BN-NKPQQ-RWX-202,但前者对后者营养依赖，两者之间形成稳定共生关系，保障了共发 酵顺利完成，从而获得富含NK和PQQ的绿豆乳。
[00巧]四、从结构上看，PQQ通过酪氨酸和谷氨酸之间形成肤键连接环化而成。本发明通 过在绿豆乳培养基中添加酪氨酸和谷氨酸对BN-NKPQQ-RWX-202进行代谢调控，促进PQQ合 成。通过在绿豆乳培养基中添加麦芽糖对BN-NKPQQ-RWX-202进行代谢调控，促进NK生成。 通过在绿豆乳培养基中添加豆芽汁促进BN-NKPQQ-RWX-202在绿豆乳发酵过程中的增殖， 从而得到富含NK和PQQ的绿豆乳，PQQ含量达到67-81ng/mU高于天然食品中含量最高的 纳豆巧5-63ng/mL)和豆腐（25-30ng/mL)。NK活力达到635-llOOU/mL。所获得的绿豆乳除 富含纳豆激酶和化咯唾晰酿之外，呈均一淡绿色，组织细腻均匀，具有绿豆乳固有的滋味和 发酵后特有的风味。
【具体实施方式】
[0076] 在实施例中，有关培养基配制如下，
[0077] (a)所述的豆芽汁绿豆汁液体培养基配制完成后，12rC灭菌15min，W 1L计，由W 下量的组分组成：
[0078] 绿豆汁 130血；
[007引藏糖 5. Og ;
[0080] 豆芽汁 余量；
[0081] 该豆芽汁绿豆汁液体培养基的配方有利于纳豆芽抱杆菌增殖培养。豆芽汁制备： 刚出芽的大豆500g，加水2500血，煮沸浓缩至1000血后过滤，得到豆芽汁。
[0082] 化）所述的豆芽汁绿豆汁固体培养基（平板）配制完成后，12rC灭菌15min，W 1L 计，由W下量的组分组成：
[0083] 绿旦^"一 13〇1加,； 薦糖 5.0g; 琼脂 豆芽汁 余量；
[0084] 该豆芽汁绿豆汁固体培养基（平板）的配方有利于纳豆芽抱杆菌菌落形成和高通 量筛选。
[00财 （C)所述的豆芽汁绿豆汁固体培养基（斜面）配制完成后，12rc灭菌15min，W 1L 计，由W下量的组分组成：
[0086] 绿互汁 130m^ 藤糖 5.0g; 琼脂 1.8g; 豆芽汁 余量； 倒试管斜面
[0087] 该豆芽汁绿豆汁固体培养基（斜面）的配方有利于纳豆芽抱杆菌的保藏。
[008引 （d)所述的MRS液体培养基配制完成后，12rC灭菌15min，W 1L计，由W下量的组 分组成：
[0089] 蛋白胳 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 巧樣酸氨二较 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 这酸钢 5.0g; 憐酸氨二