专利名称：紫丁香蘑深层发酵的菌丝体提取物的提取方法及其在卷烟中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种烟用微生物香料的复合提取和应用，具体涉及一种紫丁香蘑深层发酵的菌丝体提取物的提取方法及其在卷烟中的应用。
背景技术：
紫丁香蘑(Lepista nuda),又称裸口蘑，紫晶蘑，俗称米汤蘑，属担子苗纲(Basidiomycetes)伞菌目口蘑科(Tricholomataceae)香蘑属(Lepista)真菌，其子实体菌柄呈紫丁香色，具有非常浓郁香气，在中国主要分布于吉林、黑龙江、辽宁、湖北、山西、青 海、福建等省。紫丁香蘑在欧洲是一种与松茸、牛肝菌齐名的珍稀食药用菌，其中富含多种 抗菌抑菌及抗氧化成分，可防止血管硬化，并可用于肾脏病、胆石、糖尿病、肝硬化等疾病的治疗。目前紫丁香蘑主要应用于食用和药用上，对其水提物和醇提物的充分利用还未做深入研究，并且，紫丁香蘑挥发油和提取物在卷烟中作为香料原料的应用尚未见报道。菌丝体是食用菌的营养器官。相当于绿色植物的根、茎、叶。它生长在基质中，分解基质，吸收营养，能从基质中吸收水分、无机盐和有机养分，以满足其生长发育的需要。菌丝体主要功能是从死亡的有机质中分解、吸收、转运养分，以满足菌丝增殖和子实体生长发育的需要，在食用菌生产中，菌丝体充分生长是获得丰收的物质基础。长期以来，植物一直是天然烟用香料的主要来源。但由于香料植物的产量受季节、气候、病害等因素的影响较大，以致原料供应不稳定。尤其是近年来，天然香料的需求急剧增大，使得香料植物资源日渐枯竭，其价格也日益高涨，因此，寻找价廉、资源丰富、供应稳定的产香原料成为目前烟用香料开发研究的迫切需求。紫丁香蘑等珍稀食药用菌含有一系列多样性极为丰富的香味化合物，有望成为天然烟用香料的新来源。然而近年来，市场对紫丁香蘑的需求不断增加，野生资源逐渐枯竭，而人工栽培产量小且不稳定，因此在香料行业中的应用并不多见。菌丝体深层发酵(Submerged Fermentation, SmF)技术是一种快速获取担子菌原料的生物技术，其生产周期短，更适合大规模工业生产。从发酵产物中提取烟用香料，不仅产量稳定，而且成本低廉。近年来，欧美等国已从法律上承认发酵生产获得的香料也属于天然香料的范畴，因而这方面的研究受到广泛重视。目前，尚未见将紫丁香蘑深层发酵的菌丝体提取物用于烟用添加剂的报道。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是提供一种紫丁香蘑深层发酵的菌丝体提取物的提取方法及其在卷烟中的应用。采用液体深层发酵技术获得紫丁香蘑菌丝体，作为提取物的原料来源，再用不同提取方法和处理步骤从紫丁香蘑菌丝体中依次得到提取物及其在卷烟中的应用。为解决上述技术问题，本发明所设计的一种紫丁香蘑深层发酵的菌丝体提取物的提取方法，该提取方法步骤包括
I)将紫丁香蘑按体积比5 15%接种于发酵培养基，在温度25 30°C，通气量为O. 8 I. OdmVmin,转速10(Tl50r/min条件下，培养3 5d，进行深层发酵获得紫丁香蘑菌丝体发酵混合物；2)将步骤I)中紫丁香蘑菌丝体发酵混合物进行水蒸汽蒸馏提取挥发油至完全，得到浅红色透明油状物，3)将步骤2)中浅红色透明油状物溶解到8(Γ100倍量重量的65 75%乙醇中，得到浅红色透明一级提取物。4)将步骤2)中浅红色透明油状物过滤，分离得到滤液和滤渣；向滤渣加入5 15倍量重量的水进行回流提取f3h后过滤，合并两次提取的滤液，浓缩至密度为O. 8^1. 2g/mL的溶液，搅拌中加入4飞倍量重量9(Γ95%的乙醇，静置3飞h，过滤，得到浅棕色液体二级提取物，其pH值为6. 5^7. O ；
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进一步地，所述步骤I)将紫丁香蘑按体积比5 10%接种于发酵培养基，在温度25 28°C，通气量为O. 8 I. OdmVmin,转速10(Tl20r/min条件下，培养3 5d。更优选方案为将紫丁香蘑按体积比8%接种于发酵培养基，在温度26°C，通气量为I. 0dm3/min，转速120r/min条件下，培养4d。再进一步地，所述I)中发酵培养基的配方为马铃薯20(T250g，加入水1000ml，100°c蒸煮20分钟，双层纱布过滤马铃薯蒸煮液，添加5 8g麸皮，食用蔗糖15 30g，硫酸锰Γ2. 5g，硫酸镁 f2. 5g。上述紫丁香蘑菌丝体提取物在卷烟中的应用，将提取物按照烟丝重量的O. 001
O.10%的比例进行加香或者加料。作为优选方案，其特征在于所述提取物为一级提取物和二级提取物任选一种或两种。对紫丁香蘑菌丝体发酵混合料液一级提取物进行了分析测定，具体结果如下一级提取物为挥发油，用美国Agilent公司产(6890N/5975C)气相质谱联用仪进行分析，分析条件如下色谱柱DB-WAX毛细管柱(30mX250MmX0. 25μπι);载气He ;流量1. OmL/min ;分流比4 I ;进样量lyL;升温程序进样口温度220°C，起始温度40°C，停留3min，以10°C/min升至250°C，最后停留12 min。EI电离能量70eV ;离子源温度250°C;质谱接口温度280°C ;扫描质量范围40 500 m/z。采用NIST05检索谱库法定性，结果发现其主要成分有I-辛烯-3-醇、I-辛烯-3-酮、大茴香醛、苯甲醛、糠醛、苯丙醇、芳樟醇、橙花叔醇、莪术烯、亚油酸、棕榈酸等。
I-辛烯-3-醇、I-辛烯-3-酮是紫丁香蘑的特有香味成分，赋予其独特的风味。从分析结果看，挥发油中还含有较高含量的致香化学成分，如苯甲醛赋予烟气苦杏仁和樱桃样的甜香味；大茴香醛具有木香和杏仁香香气，可改善烟气吃味；糠醛则赋予烟草以坚果香味；苯甲醇、苯乙醇可使烟气增加花香香气，其中苯乙醇可增加卷烟香味的原熟和津醇的吸味。棕榈酸、亚油酸等长链的脂肪酸对烟气的香味没有特别明显的直接作用，但是可以调节烟草的酸碱度，使吸味醇和，增加烟气甜味和丰满度，降低刺激性，还可以增加烟气的浓度，从而间接影响烟气的香味，在烟气中起着重要的平衡作用。这些成分与I-辛烯-3-醇、I-辛烯-3-酮构成了一级提取物的特征香气。
二级提取物为水提液，经过常规检测手段分析，发现该提取物通过醇沉作用，基本上不含有蛋白质、果胶、多糖等，而这些大分子类的蛋白质、果胶和多糖在卷烟中燃烧后，会产生不同程度的刺激性，从而对卷烟的吸味产生负面的作用。本发明的优点是本发明方法简单，实施容易，并且能够做到对紫丁香蘑菌丝体发酵混合料液中有效成分的完全提取，经过组合应用到卷烟中，产生不同的加香加料效果，成本低廉，使用方便。
具体实施例方式下面列举一部分实施例对本发明的有关技术问题作进一步详细的描述，有必要在此指出以下具体实施例只是对本发明的进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。实施例I
首先按照发酵培养基的配方为马铃薯200g，加入水1000ml，100°C蒸煮20分钟，双层纱布过滤马铃薯蒸煮液，添加5g麸皮，食用蔗糖15g，硫酸锰I. 0g，硫酸镁I. 0g。然后将紫丁香蘑按体积比8%接种于发酵培养基，在温度26°C，通气量为I. 0dm3/min，转速120r/min条件下，培养4d，进行深层发酵获得紫丁香蘑菌丝体发酵混合物；再按照《中国药典》2005年版的标准将紫丁香蘑菌丝体发酵混合物进行水蒸汽蒸馏提取挥发油至完全，得到浅红色透明油状物，将浅红色透明油状物溶解到100倍量重量的70%乙醇中，得到浅红色透明一级提取物。实施例2首先按照发酵培养基的配方为马铃薯250g，加入水1000ml，100°C蒸煮20分钟，双层纱布过滤马铃薯蒸煮液，添加8g麸皮,食用鹿糖30g,硫酸猛2. 5g,硫酸镁2. 5g。然后将紫丁香蘑按体积比10%接种于发酵培养基，在温度28°C，通气量为1.0dm3/min，转速150r/min条件下，培养3d，进行深层发酵获得紫丁香蘑菌丝体发酵混合物；再按照《中国药典》2005年版的标准将紫丁香蘑菌丝体发酵混合物进行水蒸汽蒸馏提取挥发油至完全，得到浅红色透明油状物，将浅红色透明油状物过滤，分离得到滤液和滤渣；向滤渣加入10倍量重量的水进行回流提取2h后过滤，合并两次提取的滤液，浓缩至密度为I. Og/mL的溶液，搅拌中加入6倍量重量95%的乙醇，静置3飞h，过滤，得到浅棕色液体二级提取物，其pH值为 7. O。实施例3首先按照发酵培养基的配方为马铃薯220g，加入水1000ml，100°C蒸煮20分钟，双层纱布过滤马铃薯蒸煮液，添加6g麸皮，食用蔗糖20g，硫酸锰2. 0g，硫酸镁I. 0g。然后将紫丁香蘑按体积比9%接种于发酵培养基，在温度27°C，通气量为0. 9dm3/min,转速IlOr/min条件下，培养5d，进行深层发酵获得紫丁香蘑菌丝体发酵混合物；再按照《中国药典》2005年版的标准将紫丁香蘑菌丝体发酵混合物进行水蒸汽蒸馏提取挥发油至完全，得到浅红色透明油状物，将一部分浅红色透明油状物溶解到100倍量重量的75%乙醇中，得到浅红色透明一级提取物。再另一部分将浅红色透明油状物过滤，分离得到滤液和滤渣；向滤渣加入15倍量重量的水进行回流提取3h后过滤，合并两次提取的滤液，浓缩至密度为I. 2g/mL的溶液，搅拌中加入5倍量重量93%的乙醇，静置4h，过滤，得到浅棕色液体二级提取物，其pH值为6.8。实施例4首先按照发酵培养基的配方为马铃薯200g，加入水1000ml，100°C蒸煮20分钟，双层纱布过滤马铃薯蒸煮液，添加5g麸皮，食用蔗糖15g，硫酸锰I. 0g，硫酸镁2. 5g。然后将紫丁香蘑按体积比5%接种于发酵培养基，在温度25°C，通气量为O. 8dm3/min，转速IOOr/min条件下，培养3d，进行深层发酵获得紫丁香蘑菌丝体发酵混合物；再按照《中国药典》2005年版的标准将紫丁香蘑菌丝体发酵混合物进行水蒸汽蒸馏提取挥发油至完全，得到浅红色透明油状物，将一部分浅红色 透明油状物溶解到80倍量重量的65%乙醇中，得到浅红色透明一级提取物。再另一部分将浅红色透明油状物过滤，分离得到滤液和滤渣；向滤渣加入5倍量重量的水进行回流提取3h后过滤，合并两次提取的滤液，浓缩至密度为O. 8g/mL的溶液，搅拌中加入4倍量重量90%的乙醇，静置3h，过滤，得到浅棕色液体二级提取物，其pH值为6. 5。实施例5本发明采用提取物不同组合进行加香加料，并对样品卷烟进行了评吸对比实验，添加方案见表I。添加实施例1、2为提取物的单独添加方案I和2，实施例3、4的提取物为组合方案3和4，其添加比例为提取物与烟丝重量之比值。本添加方案中只是列举不同的组合方式，在同一种方案中，还可根据具体的烟丝配方进行添加量的调节。表I、提取物的组合添加方案
权利要求
1.一种紫丁香蘑深层发酵的菌丝体提取物的提取方法，该提取方法步骤包括 1)将紫丁香蘑按体积比5 15%接种于发酵培养基，在温度25 30°C， 通气量为O. 8 I. OdmVmin,转速10(Tl50r/min条件下，培养3飞d，进行深层发酵获得紫丁香蘑菌丝体发酵混合物； 2)将步骤I)中紫丁香蘑菌丝体发酵混合物进行水蒸汽蒸馏提取挥发油至完全，得到浅红色透明油状物； 3)将步骤2)中浅红色透明油状物溶解到8(Γ100倍量重量的65 75%乙醇中，得到浅红色透明一级提取物； 4)将步骤2)中浅红色透明油状物过滤，分离得到滤液和滤渣；向滤渣加入5 15倍量重量的水进行回流提取f 3h后过滤，合并两次提取的滤液，浓缩至密度为O. 8^1. 2g/mL的溶液，搅拌中加入4飞倍量重量9(Γ95%的乙醇，静置3飞h，过滤，得到浅棕色液体二级提取物，其pH值为6. 5 7. O。
2.根据权利要求I所述的紫丁香蘑深层发酵的菌丝体提取物的提取方法，其特征在于所述步骤I)将紫丁香蘑按体积比5 10%接种于发酵培养基，在温度25 28°C，通气量为O.8 I. 0dm3/min，转速 10(Tl20r/min 条件下，培养 3 5d。
3.根据权利要求I或2所述的紫丁香蘑深层发酵的菌丝体提取物的提取方法，其特征在于所述I)中发酵培养基的配方为马铃薯20(T250g，加入水1000ml，100°C蒸煮20分钟，双层纱布过滤马铃薯蒸煮液，添加5 8g麸皮，食用蔗糖15 30g，硫酸锰f2. 5g，硫酸镁Γ2. 5g。
4.一种根据权利要求I所得紫丁香蘑菌丝体提取物在卷烟中的应用，其特征在于将提取物按照烟丝重量的O. 001 O. 10%的比例进行加香或者加料。
5.根据权利要求4所述的紫丁香蘑菌丝体提取物在卷烟中的应用，其特征在于所述提取物为一级提取物和二级提取物任选一种或两种。
全文摘要
本发明公开了一种紫丁香蘑深层发酵的菌丝体提取物的提取方法及其提取物在卷烟中的应用。该方法首先将紫丁香蘑按体积比5~15%接种于发酵培养基，培养3~5d，进行深层发酵获得紫丁香蘑菌丝体发酵混合物；然后进行水蒸汽蒸馏提取挥发油至完全，得到浅红色透明油状物，然后不同方法得到一级提取物和二级提取物。再根据实际的需求将提取物按照烟丝重量的0.001~0.10%的比例进行加香或者加料。本发明方法简单，实施容易，并且能够做到对紫丁香蘑菌丝体发酵混合料液中有效成分的完全提取，经过组合应用到卷烟中，产生不同的加香加料效果，成本低廉，使用方便。
文档编号A24B15/20GK102823937SQ201210295820
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者郭国宁, 刘冰, 张耀华, 岳海波 申请人:湖北中烟工业有限责任公司, 武汉市黄鹤楼科技园有限公司