专利名称：利用白腐菌酶液提高再造烟叶柔软度和感官质量的方法
技术领域：
本发明属于卷烟再造烟叶技术领域，具体涉及再造烟叶生产过程中使用白腐菌酶液处理烟梗浆料以提高再造烟叶柔软度和感官质量的方法。
背景技术：
再造烟叶是利用烟末、烟梗、碎烟片等烟草物质为原料，经过萃取、浓缩、制浆、抄造、干燥工艺制备而得，是一种具有高附加值的烟草资源再生利用产品，将再造烟叶按照一定比例掺配于卷烟产品中可大幅降低单箱生产消耗、改善烟支结构与燃烧状态、降低卷烟焦油及有害成分的释放量。目前，国内再造烟叶在产品质量方面与国外产品存在一定差距。在物理性质方面，国内再造烟叶较厚，厚薄不均，均不如进口再造烟叶，尤其在柔软性方面，与国外差距较大。在再造烟叶内在品质方面，国产再造烟叶存在木质气比较重，刺激性大，烟气不协调，纸质 气明显，烟气柔和程度差等缺点。公开号为CN101103839的中国发明专利申请报道了一种造纸法生产重组烟叶的方法，公开号为CN1739409的中国发明专利申请报道了一种用于造纸法生产烟草薄片的烟梗的制浆方法，公开号为CN102240065A的中国发明专利申请报道了一种改善造纸法薄片抄造基片湿强度和柔软性的方法，公开号为CN102068034A的中国发明专利申请报道了一种造纸法再造烟叶降焦减害的方法，公开号为CN101637298的中国发明专利申请报道了一种烟草薄片的制备方法及其应用。上述介绍的专利都是采用萃取后涂布抄造的造纸法制备再造烟叶，只是萃取工艺与制浆抄造工艺不同。这些制备技术与工艺存在共同的不足之处，就是没有对萃取后的烟草纤维原料进行处理。整个生产过程基本不涉及烟草原料的任何化学变化。公开号为CN 101427846的中国发明专利申请报道了一种用复合酶提高薄片原料萃取效率和薄片烟气质量的方法，公开号为CN 102058154A的中国发明专利申请报道了一种酶法降解烟草中木质素的方法，美国专利申请号为US20050527286的Process forreducing nitrogen containing compounds and lignin in tobacco公开了从烟草中减少含有尼古丁的复合物和木质素的过程。以上专利公开的工艺只是涉及烟草萃取液或烟梗原料烟叶表面的生物发酵处理，没有涉及烟草浆料的处理，应用的局限性较大。木质素是一种高度复杂的、不定形的芳香环聚合物，是木质植物的主要组成成分之一。其结构的基本单元是类苯基丙烧(Phenyl Propanoid),靠多种共价键连接形成一种不溶性的、异质的、无光学活性的、不规则的、高度分枝的三维网络大分子。对于烟草原料，烟梗中木质素本身热解会产生儿茶酚、烷基儿茶酚等引起涩口，有促癌活性。目前已知的木质素氧化酶系有三种类型1、Lip-Mnp-Lac组，如CoriolusVersicolor> Phlebiavadiate 和 Phanerochaete Chrysosporium,对后者一般认为不含漆酶，但有人认为是因培养基不适宜产漆酶引起；2、Mnp-Lac组，如Lentinulaedodes、Panustigrinus,能修饰木质素增加水溶性，但CO2释放量不很高；2、Lip-Lac组，如Phlebiaochraceofulva> Junghuhunia Separabalima,该组菌降解木质素非常慢。虽然并非所有白腐菌都具有全部三种主要酶，但漆酶与Lip、Mnp 一起协同作用，完成大量白腐菌特有、高效的生理过程。白腐菌对木质素的降解，依赖一个主要由细胞产生分泌的酶系统组成的细胞外降解体系，需氧并靠自身形成的H2O2激活，由酶触发启动一系列自由基链反应，实现对底物无特异性的氧化降解，主要包括单电子氧化、酯质氧化、共代谢等过程。这一系列自由基链反应导致各种连接键断裂，使木质素解聚成各种低分子量片段，再经进一步氧化降解为C02，实现对多变的木质素底物非特异性和无立体选择性的氧化降解。故菌与降解对象并非一一对应，而是与一类乃至于多类底物的广谱关系。白腐菌是一类丝状真菌，因腐生在树木或木材上引起木质的白色腐烂而得名。白腐菌菌丝体为多核，少有隔膜，无锁状联合，多核的分生孢子常为异核，担孢子却是同核体，存在同宗配合和异宗配合两类交配系统。白腐菌通过分泌非专一性的木素降解酶系以单电子氧化、共代谢及脂肪过氧化等途径进行降解活动，它的特点是1)低成本、高效率，它的生长对营养要求不高，可以利用废弃物中的木质纤维素等廉价的营养源，将其转化为腐殖质；2)它产生氧化能力极强的羟基自由基，对其他微生物具有很大杀伤力，从而在竞争中 保持一定的优势；3)降解对象不需进入细胞内代谢，因而它不易受到有害物质的伤害；4)降解底物的非专一性机制，使其能降解烟梗木质素而具有更大的实用性。在分类学上白腐菌属担子菌纲，是目前已知的唯一能在纯系培养中有效地将木质素降解为CO2和H2O的一类微生物，是自然界中木质素最有效降解者，能分泌出非专一性的木质素降解酶，以氧化还原反应形式对木质纤维素及多环芳烃衍生物进行链式反应，从而能够有效的将这类物质降解，转化成无毒、无害的物质。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是提供一种提高再造烟叶柔软度和感官质量的方法。将白腐菌(Coriolus versicolor T42)酶液处理烟梗浆料应用于再造烟叶的生产，能有效的提高再造烟叶的柔软度，同时也提高再造烟叶的感官质量。为解决上述技术问题，本发明所设计的一种利用白腐菌酶液提高再造烟叶柔软度和感官质量的方法，按照现有工艺技术方法完成烟梗原料磨浆阶段前后的工序。在再造烟叶生产过程的烟梗原料磨浆阶段，按照烟梗原料物质干量的I. (Tio. 0%的比例加入白腐菌T42酶液，在烟梗浆料温度为3(T80°C，pH值为2. 0^6. 0，处理时间为2(T90min的条件下降解烟梗衆料中木质素，其中所述的白腐菌T42菌株名为Coriolus versicolor T42,保藏号为 CCTCC NO: M 2012252。作为优选方案，所述白腐菌T42酶液制备步骤I) PDA综合琼脂培养基的制备按重量百分比进行称量配合马铃薯提取液 I. 0 4. 0%、葡萄糖 20. 0 40. 0%、KH2PO4 I. 0 6. 0%、MgSO4 7H20 I. 0 5. 0%、维生素 B1
0.OOfO. 006%、琼脂 10. (T30. 0%、酒石酸氨 0. 05^2. 5%,用 I. OmoI/L 的盐酸调节 pH 至
3.0 6. 5备用;2)产酶培养基按重量百分比进行称量配合无水CaCl2 0. 05、. 30%、KH2PO4
0.02 0. 10%、无水MgSO4 0. 05 0. 20%、葡萄糖0. I 0. 5%、酒石酸氨0. 10 0. 80%、硝酸氨
0.10^0. 90%、维生素B1 0. 00r0. 008%、微量元素混合液0. 001 0. 005%，用醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH至3. 5 6. 5备用；3)白腐菌T42菌株的培养将白腐菌T42菌株接种在PDA综合琼脂培养基上，在温度2(T50°C，转速15(T600r/min条件下摇床培养5 7d，然后将菌悬液2 7%接种于产酶培养基到发酵罐中，培养8 15d后得到发酵液；在700(Tl5000r/min下离心5 15min，上清液即为白腐菌T42酶液。作为优选方案，微量元素混合液为MnS04、NaCl、ZnSO4, FeSO4 7H20、CuSO4 5H20、AlK (SO4) 2 12H20、HB03、CoCl2 6H20和NaMoO4 2H20任选一种或几种复配而成，微量元素混合液浓度为0. 1%。本发明的优点是I、本发明的方法合理，操作方便，效果显著，能显著提高再造烟叶的柔软度，同时使再造烟叶的感官质量得到提升，木质气减少，刺激性降低。
2、本发明进行了大量的试验验证，根据白腐菌的结构特点和对烟梗木质素的降解特性，优化改性白腐菌，开发了新型的菌株白腐菌T42，该白腐菌T42菌株名为Coriolusversicolor T42，于2012年6月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M 2012252，该白腐菌T42应用于烟梗浆料木质素的降解，证明白腐菌T42能提高再造烟叶的柔软度和感官质量，并且该生物酶价格低廉、处理效果良好。3、本发明的白腐菌T42降解木质素有三个特点。第一，能彻底降解木质素生成CO2，而细菌至多将20%木质素碳转化成CO2;第二，木质素降解主要是氧化反应，产物中不出现木质素单体；第三，木质素降解本身不提供菌生长和维持所需的碳源和能源，需要提供另外的碳源和能源供菌降解木质素。
具体实施例方式下面列举一部分实施例对本发明的有关技术问题作进一步详细的描述，有必要在此指出以下具体实施例只是对本发明的进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。实施例II、白腐菌T42酶液的制备所述白腐菌T42酶液按以下方法制备(I)培养基的制备将下述物质按所述重量百分比进行称量配合。①PDA综合琼脂培养基马铃薯提取液2. 0%、葡萄糖20. 0%、KH2PO4 3. 0%、MgSO4 7H202. 0%、维生素B1 0. 002%、琼脂15. 0%、酒石酸氨0. 07%，用I. OmoI/L的盐酸调节pH至5. 0备用；②产酶培养基无水CaCl2 0. 08%、KH2PO4 0. 06%、无水 MgSO4 0. 10%、葡萄糖 0. 1%、酒石酸氨0. 50%、硝酸氨0. 20%、维生素B1O. 002%、微量元素混合液0. 001%，用醋酸-醋酸钠缓冲液调节PH至4. 5备用；③微量元素混合液由MnS04、NaCl、ZnS04、FeSO4 7H20 和 CuSO4 5H20 复配而成，浓度为0. 1%。(2)、白腐菌T42菌株的培养
将白腐菌T42菌株接种在PDA综合琼脂培养基上，在温度40°C，转速300r/min条件下摇床培养5d，然后将菌悬液2%接种于产酶培养基到发酵罐中，培养IOd后得到发酵液；在4°C，9000r/min下离心5min，上清液即为白腐菌T42酶液。2、白腐菌T42酶液处理烟梗浆料在烟梗磨浆阶段，加入2%的白腐菌T42酶液，所述酶液的用量以烟梗绝干质量计，调节烟梗浆料的PH值为5. 0，烟梗浆料的温度为50°C，保持上述温度的时间为60min。经检测，白腐菌T42酶液降解烟梗浆料中木质素后，制备的再造烟叶柔软度提高了 10. 2%，感官质量评价提高了 I. I分。实施例2I、白腐菌T42酶液的制备所述白腐菌T42酶液按以下方法制备(I)培养基的制备将下述物质按所述重量百分比进行称量配合。①PDA综合琼脂培养基马铃薯提取液3. 0%、葡萄糖30. 0%、KH2P042. 0%、MgSO4 *7H203. 0%、维生素B1O. 003%、琼脂20. 0%、酒石酸氨0. 3%，用I. OmoI/L的盐酸调节pH至5. 5备用；②产酶培养基无水CaCl2 0. 10%、KH2PO4 0. 05%、无水 MgSO4 0. 12%、葡萄糖 0. 2%、酒石酸氨0. 30%、硝酸氨0. 40%、维生素B1O. 003%、微量元素混合液0. 002%，用醋酸-醋酸钠缓冲液调节PH至5. 5备用；③微量元素混合液由ZnS04、FeSO4 7H20、CuSO4 5H20、HBO3 和 NaMoO4 2H20 复配而成，浓度为0. 1%。(2)白腐菌T42菌株的培养将白腐菌T42菌株接种在PDA综合琼脂培养基上，在温度50°C，转速400r/min条件下摇床培养6d，然后将菌悬液3%接种于产酶培养基到发酵罐中，培养9d后得到发酵液； 在8000r/min下离心lOmin，上清液即为白腐菌T42酶液。2、白腐菌T42酶液处理烟梗浆料在烟梗磨浆阶段，加入3%的白腐菌T42酶液，所述酶液的用量以烟梗绝干质量计，调节烟梗浆料的PH值为5. 5，烟梗浆料的温度为45°C，保持上述温度的时间为70min ；经检测，白腐菌T42酶液降解烟梗浆料中木质素后，制备的再造烟叶柔软度提高了 13. 4%，感官质量评价提高了 I. 3分。实施例3I、白腐菌T42酶液的制备所述白腐菌T42酶液按以下方法制备(I)培养基的制备将下述物质按所述重量百分比进行称量配合。①PDA综合琼脂培养基马铃薯提取液I. 0%、葡萄糖20. 0%、KH2PO4 3. 0%、MgSO4 *7H20 3. 0%、维生素B1O. 003%、琼脂10. 0%、酒石酸氨I. 0%，用I. OmoI/L的盐酸调节pH
至4. 5备用；②产酶培养基无水CaCl2 0. 10%、KH2PO4 0. 04%、无水 MgSO4 0. 10%、葡萄糖 0. 1%、酒石酸氨0. 20%、硝酸氨0. 70%、维生素B1O. 003%、微量元素混合液0. 004%，用醋酸-醋酸钠缓冲液调节PH至6. 0备用；③微量元素混合液由MnSO4' NaCU ZnSO4' FeSO4 7H20、CuSO4 5H20、AlK (SO4)2 12H20、HBO3> CoCl2 6H20 和 NaMoO4 2H20 复配而成，浓度为 0. 1%。(2)白腐菌T42菌株的培养将白腐菌T42菌株接种在PDA综合琼脂培养基上，在温度40°C，转速250r/min条件下摇床培养5d,然后将菌悬液4%接种于产酶培养基到发酵罐中，培养8d后得到发酵液；在7000r/min下离心7min，上清液即为白腐菌T42酶液。2、白腐菌T42酶液处理烟梗浆料在烟梗磨浆阶段，加入2%的白腐菌T42酶液，所述酶液的用量以烟梗绝干质量计，调节烟梗浆料的PH值为3. 0，烟梗浆料的温度为40°C，保持上述温度的时间为30min。 经检测，白腐菌T42酶液降解烟梗浆料中木质素后，制备的重组烟叶柔软度提高了 15. 6%，感官质量评价提高了 I. 8分。实施例4I、白腐菌T42酶液的制备所述白腐菌T42酶液按以下方法制备(I)培养基的制备将下述物质按所述重量百分比进行称量配合。①PDA综合琼脂培养基马铃薯提取液3. 0%、葡萄糖25. 0%、KH2PO4 4. 0%、MgSO4 *7H20 4. 0%、维生素B1O. 004%、琼脂25. 0%、酒石酸氨2. 0%，用I. OmoI/L的盐酸调节pH至5. 5备用；②产酶培养基无水CaCl2 0. 05%、KH2PO4 0. 08%、无水 MgSO4 0. 20%、葡萄糖 0. 2%、酒石酸氨0. 10%、硝酸氨0. 50%、维生素B1O. 004%、微量元素混合液0. 005%，用醋酸-醋酸钠缓冲液调节PH至5. 5备用；③微量元素混合液由MnSO4' NaCU CuSO4 5H20、AlK (SO4) 2 12H20、HBO3 和CoCl2 6H20复配而成，浓度为0. 1%。(2)白腐菌T42菌株的培养将白腐菌T42菌株接种在PDA综合琼脂培养基上，在温度50°C，转速350r/min条件下摇床培养7d，然后将菌悬液5%接种于产酶培养基到发酵罐中，培养IOd后得到发酵液；在9000r/min下离心8min，上清液即为白腐菌T42酶液。2、白腐菌T42酶液处理烟梗浆料在烟梗磨浆阶段，加入3%的白腐菌T42酶液，所述酶液的用量以烟梗绝干质量计，调节烟梗浆料的PH值为4. 0，烟梗浆料的温度为60°C，保持上述温度的时间为40min。经检测，白腐菌T42酶液降解烟梗浆料中木质素后，制备的再造烟叶柔软度提高了 8. 9%，感官质量评价提高了 0. 9分。实施例5I、白腐菌T42酶液的制备所述白腐菌T42酶液按以下方法制备(I)培养基的制备
将下述物质按所述重量百分比进行称量配合。①PDA综合琼脂培养基马铃薯提取液2. 0%、葡萄糖30. 0%、KH2PO4 2. 0%、MgSO4 7H20 I. 0%、维生素B1O. 005%、琼脂15. 0%、酒石酸氨0. 08%，用I. OmoI/L的盐酸调节pH至6. 0备用;②产酶培养基无水CaC l2 0. 20%、KH2PO4 0. 06%、无水 MgSO4 0. 15%、葡萄糖 0. 3%、酒石酸氨0. 40%、硝酸氨0. 10%、维生素B1O. 007%、微量元素混合液0. 003%，用醋酸-醋酸钠缓冲液调节PH至4. 0备用；③微量元素混合液由ZnS04、FeSO4 7H20、A1K (SO4) 2 12H20、HB03、CoCl2 6H20和NaMoO4 2H20复配而成，浓度为0. 1%。(2)白腐菌T42菌株的培养将白腐菌T42菌株接种在PDA综合琼脂培养基上，在温度30°C，转速200r/min条件下摇床培养6d,然后将菌悬液5%接种于产酶培养基到发酵罐中，培养IOd后得到发酵液；在10000r/min下离心IOmin,上清液即为白腐菌T42酶液。2、白腐菌T42酶液处理烟梗浆料在烟梗磨浆阶段,加入5%的白腐菌T42酶液，所述酶液的用量以烟梗绝干质量计，调节烟梗浆料的PH值为6. 0，烟梗浆料的温度为70°C，保持上述温度的时间为60min ；经检测，白腐菌T42酶液降解烟梗浆料中木质素后，制备的再造烟叶柔软度提高了 8. 7%，感官质量评价提高了 0. 8分。实施例6I、白腐菌T42酶液的制备所述白腐菌T42酶液按以下方法制备(I)培养基的制备将下述物质按所述重量百分比进行称量配合。①PDA综合琼脂培养基马铃薯提取液4. 0%、葡萄糖35. 0%、KH2PO4 5. 0%、MgSO4 7H20 2. 0%、维生素B1O. 002%、琼脂20. 0%、酒石酸氨I. 50%，用I. OmoI/L的盐酸调节pH至6. 5备用;②产酶培养基无水CaCl2 0. 30%,KH2PO4 0. 10%、无水 MgSO4 0. 05%、葡萄糖 0. 40%、酒石酸氨0. 60%、硝酸氨0. 30%、维生素B1O. 008%、微量元素混合液0. 003%，用醋酸-醋酸钠缓冲液调节PH至4. 5备用；③微量元素混合液由MnS04、NaCl、ZnS04、FeSO4 7H20、HB03、CoCl2 6H20、NaMoO4 2H20复配而成，浓度为0. 1%。(2)白腐菌T42菌株的培养将白腐菌T42菌株接种在PDA综合琼脂培养基，在温度50°C，转速500r/min条件下摇床培养7d，然后将菌悬液5%接种于产酶培养基到发酵罐中，培养13d后得到发酵液；在8000r/min下离心12min，上清液即为白腐菌T42酶液。2、白腐菌T42酶液处理烟梗浆料在烟梗磨浆阶段，加入10%的白腐菌T42酶液，所述酶液的用量以烟梗绝干质量计，调节烟梗浆料的PH值为5. 0，烟梗浆料的温度为50°C，保持上述温度的时间为70min ；经检测，白腐菌T42酶液降解烟梗浆料中木质素后，制备的再造烟叶柔软度提高了 16. 5%，感官质 量评价提高了 2. I分。
权利要求
1.一种利用白腐菌酶液提高再造烟叶柔软度和感官质量的方法，按照现有工艺技术方法完成烟梗原料磨浆阶段前后的工序，其特征在于在再造烟叶生产过程的烟梗原料磨浆阶段，按照烟梗原料物质干量的I. (Γιο. 0%的比例加入白腐菌Τ42酶液，在烟梗浆料温度为30^80°C, pH值为2. (Γ6. 0，处理时间为2(T90min的条件下降解烟梗浆料中木质素，其中所述的白腐菌 T42 菌株名为 Coriolus versicolor T42，保藏号为 CCTCC NO: M 2012252。
2.根据权利要求I所述的利用白腐菌酶液提高再造烟叶柔软度和感官质量的方法，其特征在于其中，所述白腐菌T42酶液制备步骤 DPDA综合琼脂培养基的制备按重量百分比进行称量配合马铃薯提取液I. (Γ4. 0%、葡萄糖 20. 0 40· 0%、KH2PO4 I. 0 6· 0%、MgSO4 · 7H20 I. 0 5· 0%、维生素 B1 O. 001 O. 006%、琼脂10. 0 30· 0%、酒石酸氨O. 05 2. 5%，用I. OmoI/L的盐酸调节pH至3. 0 6· 5备用; 2)产酶培养基按重量百分比进行称量配合无水CaCl2O. 05^0. 30%、KH2PO4O. 02 O. 10%、无水MgSO4 O. 05 O. 20%、葡萄糖O. I O. 5%、酒石酸氨O. 10 0· 80%、硝酸氨O. 10^0. 90%、维生素B1 O. ΟΟΓΟ. 008%、微量元素混合液0. 00Γ0. 005%，用醋酸-醋酸钠缓冲液调节PH至3. 5 6. 5备用； 3)白腐菌T42菌株的培养将白腐菌T42菌株接种在PDA综合琼脂培养基上，在温度20^500C，转速15(T600r/min条件下摇床培养5 7d，然后将菌悬液2 7%接种于产酶培养基到发酵罐中，培养8 15d后得到发酵液；在7000 150001·/!^!!下离心5 15min，上清液即为白腐菌T42酶液。
3.根据权利要求2所述的利用白腐菌酶液提高再造烟叶柔软度和感官质量的方法，其特征在于所述步骤2)中，微量元素混合液由MnS04、NaCl、ZnS04、FeS04 ·7Η20,CuSO4 ·5Η20、AlK (SO4) 2 · 12H20、HB03、CoCl2 · 6Η20和NaMoO4 · 2Η20任选一种或几种复配而成，微量元素混合液浓度为0. 1%。
全文摘要
本发明公开了一种利用白腐菌酶液提高再造烟叶柔软度和感官质量的方法，按照现有工艺技术方法完成烟梗原料磨浆阶段前后的工序，在再造烟叶生产过程的烟梗原料磨浆阶段，按照烟梗原料物质干量的1.0~10.0%的比例加入白腐菌T42酶液，在烟梗浆料温度为30~80℃，pH值为2.0~6.0，处理时间为20~90min的条件下降解烟梗浆料中木质素，其中所述的白腐菌T42菌株名为Coriolus versicolor T42，保藏号为CCTCC NO: M 2012252。本发明的方法合理，操作方便，效果显著，能显著提高再造烟叶的柔软度，同时使再造烟叶的感官质量得到提升，木质气减少，刺激性降低。
文档编号A24B15/20GK102823938SQ20121029592
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月17日 优先权日2012年8月17日
发明者毛耀, 刘志昌, 姚元军, 王凤兰, 王亮 申请人:湖北中烟工业有限责任公司, 武汉淡雅香科技发展股份有限公司