专利名称：抗真菌药物增效剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特指一种抗真菌药物增效剂及其制备方法和应用，可应用于抗真菌药物助剂和相关真菌病的辅助防治。
目前，市场上还没有一种理想、安全、高效的抗真菌药物。其主要原因之一是真菌属于真核生物，与人和动物的细胞结构接近。因此，在选择作用靶位上，最为安全的是真菌的细胞壁，然而，真菌细胞壁的结构远比属于原核类的细菌复杂的多，这样，真菌细胞壁合成抑制剂在抑制真菌生长的过程中，受到的影响要比细菌多很多。例如几丁质合成酶抑制剂polyoxin，nikkomycin属于一种竞争性较强的真菌细胞壁合成抑制剂，但当某些二肽或寡肽存在时，其抑菌活力明显下降，甚至无抑菌活性；此外，在真菌细胞壁合成抑制剂运输到真菌细胞膜内的过程中，由于通道对真菌细胞壁合成抑制剂的亲和力有选择，使得真菌细胞壁合成抑制剂的效力不能在细胞内中充分发挥等等。这些均阻碍了抗真菌抗生素药物的开发与应用。
众所周知，乳链菌肽是一种分子量为3500道尔顿的天然肽类化合物，其抗细菌的作用机理是在细菌细胞膜钻孔，使胞内的物质泄漏，因此具有直接抗细菌的活性，由于乳链菌肽具有安全、无毒等特点而被广泛应用于不同食品的防腐剂。然而，乳链菌肽却没有直接抗真菌活性，因此，乳链菌肽在抗真菌的辅助作用一直未被人们所了解。
本发明的目的在于提供一种抗真菌药物增效剂及其制备方法和应用，将乳链菌肽与赖氨酸及二价盐按适当的配比混合制成增效剂，配合抗真菌药物使用，达到抗真菌增效的目的。
本发明的目的是这样实现的一种抗真菌药物增效剂，其特征在于由乳链菌肽与赖氨酸及二价盐组成的复合组成物，其克分子配比为乳链菌肽0.01-10mMol，赖氨酸0.01-0.03mMol，二价盐0.1-1.0mMol；该复合组成物的克分子配比为乳链菌肽0.05-5mMol，赖氨酸0.015-0.02mMol，二价盐0.15-0.6mMol；该二价盐包括镁盐和/或钴盐；该镁盐优选自MgCl2；该钴盐优选自CoCl2；一种抗真菌药物增效剂的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤首先选择如下克分子配比的原料乳链菌肽0.01-10mMol，赖氨酸0.01-0.03mMol，二价盐0.1-1.0mMol；将上述原料混合均匀，用物理方法除菌，粉碎至10μ以下，干燥至含水5％以下，制成本发明的抗真药物增效剂；本发明的抗真菌药物增效剂的剂型包括针剂、胶囊剂、片剂或水溶性的针剂或口服液；一种抗真菌药物增效剂的应用，该抗真菌药物增效剂适用于与抗真菌药物配合使用；该抗真菌药物包括抗真菌细胞壁合成抑制剂；该抗真菌药物优选自尼柯霉素。
本发明的主要优点是乳链菌肽是目前国际上公认的最安全的抗细菌活性物质，在国内外广泛应用于食品的防腐剂，特别是乳制品的防腐剂，但仅限于抗细菌方面的应用。本发明采用乳链菌肽与赖氨酸和二价盐复合，制成抗真药物增效剂，配合抗真菌细胞壁合成抑制剂(属于抗抗生素)使用，以达到抗真菌增效作用，扩大了乳链菌肽的范围应用，这不仅保留了乳链菌肽原有的安全、无毒等优点，而且为将来开发研制高效、低毒、安全的抗真菌药物开创了一条新途径；并通过大量的试验证明本发明的抗真菌药物增效剂提高了抗真菌细胞壁合成抑制剂的抗真菌功效。
下面结合较佳实施例和动物实验效果对本发明的技术方案详细说明。
实施例1本发明的抗真菌药物增效剂主要由乳链菌肽与赖氨酸及二价盐组成的复合组成物，其克分子配比为乳链菌肽0.01-10mMol，赖氨酸0.01-0.03mMol，二价盐0.1-1.0mMol；
其中该二价盐包括镁盐和/或钴盐；该镁盐优选自MgCl2，钴盐优选CoCl2本发明的抗真菌药物增效剂的制备方法包括如下步骤首先选择如下克分子配比的原料乳链菌肽0.01-10mMol，赖氨酸0.01-0.03mMol，二价盐0.1-1.0mMol；将上述原料混合均匀，用物理方法除菌，粉碎至10μ以下，干燥至含水5％以下，制成本发明的抗真药物增效剂；本发明的抗真菌药物增效剂的剂型包括针剂、胶囊剂、片剂或水溶性的针剂或口服液；其中该二价盐包括镁盐和/或钴盐；该镁盐优选自MgCl2，钴盐优选自CoCl2。
其制造方法同实施例1，故不重述。
通过大量的动物试验充分证明本发明的抗真菌药物增效剂与抗真菌药物配合使用，具有显著的增加疗效作用，从而开创了提高抗真菌药物的治疗效果的新途径。
具体试验方法如下(一)、试剂配制1.配制乳链菌肽溶液定量称取乳链菌肽105毫克一10.5克，加入0.01-0.02N的HCl 3毫升，充分溶解后，加入无菌蒸馏水3ml稀释，试剂浓度为5-50mMol，过滤除菌后，备用，简称为试剂A；2.配制盐溶液定量称取MgCl24.06克，CoCl22.38克，分别溶解于100ml无菌蒸馏水中，试剂浓度分别为200mMol，100mMol，过滤除菌后备用，简称试剂B；
3.配制赖氨酸溶液定量称取赖氨酸292毫克，溶解于100ml无菌蒸馏水中，试剂浓度为20mMol，过滤除菌备用，简称为试剂C；4.配制抗真菌药物尼柯霉素溶液定量称取尼柯霉素(Nikkomycin)试剂10-20毫克，溶解于无菌蒸馏水10ml(pH3.5-5.5)，试剂浓度为1000-2000微克/ml，简称为试剂D；5.配制测定培养基本发明使用的测定培养基分为如下两钟A、马铃薯浸汁测定培养基(PDA)其配方为20％马铃薯浸汁100毫升、葡萄糖1克及琼脂粉1克；B、酵母菌测定培养基(1/2YPG)其配方为酵母浸膏(或粉)0.15克、多聚蛋白胨0.5克、葡萄糖1.0克及蒸馏水100ml，pH5.5；上述两种测定培养基具有大体相同的功效。(二)试验试验组将测定培养基在约100C熔化后，待温度降至50-70℃，分别加入试剂A、B、C和D，使终浓度分别为乳链菌肽0.01-5mMol；MgCl2的浓度为0.1-0.5mMol；CoCl2的浓度为0.1-0.5mMol；赖氨酸的浓度为0.02-0.03mMol；Nikkomycin为2-10μg/ml；快速分装到试管中摆成斜面，或倒入双碟铺成平板；接入真菌；置入22-27℃恒温箱中培养，定时观察；对照组1不加试剂A、B、C和D，以观察正常生长情况；对照组2不加试剂D，加试剂A、B、C，使乳链菌肽终浓度达到0.01-5mMol，MgCl2的浓度为0.1-0.5mMol；CoCl2终浓度各为0.1-0.5mMol；赖氨酸的浓度为0.02-0.03mMol，以观察乳链菌肽等因子在没有抗真菌抗生素存在时对真菌生长影响情况；对照组3只加试剂D，使终浓度达到2-10μg/ml，不加试剂A、B、C，以观察不合乳链菌肽等因子时抗真菌抗生素对真菌生长的影响；上述四组试验同时同剂量进行，实验结果如下1、对照组1接种的真菌正常生长；
2、对照组2的真菌能够像对照组1一样正常生长，这表明，乳链菌肽等复合组成物在没有抗真菌抗生素存在时，对真菌生长没有什么抑制作用；3、对照组3对接种的真菌有一定的抑制作用，但不能完全有效的抑制针菌正常生长；4、试验组在抗真菌抗生素存在时，加入0.01-10mMol乳链菌肽的复合组合物，可延长抑菌作用10-90小时。
按照上述方法改变试剂A、B、C和D的用量及使用不同的抗真菌抗生素做了反复试验，充分证明本发明的抗真菌药物组合物与抗真菌药物配合使用，具有显著的增加疗效作用。试验结果参阅表一表一
其中选用的抗真菌药物除了尼柯霉素(Nikkomycin)外，还包括其它抗真菌细胞壁合成抑制剂本发明人用上述抗真菌细胞壁合成抑制剂分别作了数百次试验，其试验方法是称取抗真菌细胞壁合成抑制剂2-10毫克，溶解于10毫升的无菌蒸馏水中，配成水溶液，其他试剂的配制方法及测定操作方法同上，故不重述。其中各药剂用量及增效的效果仅举几例如下，见表二表二
实施例中还使用了如下多种抗真菌细胞壁指示菌Aleurisma keratinophilumAltenaria longipesAspergillus flavusAspergillus fumigatuAspergillus nidulansAspergilluss nigerAspergillus oryzaeBeanveria sp.Botrytis pyramidalisBlastomyces dermatitidisCandida albicansCordyceps militarisCryptococcus neoformansClaviceps sp.Eupenicillium abidjanumFusarium ventricosumMucor rouxianusNeurospora crassaPaecilomyces fumosaParacoccidioides brasiliensisPenicillium sclerotiorumRhizopus oligosporaRhodotorula glutinisSaccharomyces cerevisiaeSaccharomyces monoica由于试验方法及增效作用大体相同，故不重述。
实施例4动物药效学试验。
试验组试验对象为小白鼠，每组8只，感染真菌半小时后，开始给药，给药方式为口服；给药周期为6天，给药剂量乳链菌肽100毫克-700毫克/公斤、MgCl23-4毫克/公斤、CoCl25-7毫克/公斤、赖氨酸10-12毫克/公斤及尼柯霉素8-50毫克/公斤；对照组1未感染真菌组；
对照组2感染真菌后，只给生理盐水，不给药；对照组3给药为试剂A、试剂B、试剂C；对照组4给药为试剂D；对照组与试验组同时进行，实验周期为14天，统计各组动物的存活率。对小白鼠存活的观察结果如下
注其中“/”表示8只小白鼠全部存活。试验结果表明1、喂给本发明的增效剂及抗真菌药物的试验组，到第10天才有1只小鼠死亡，剩下7只小鼠，到第14天共有7只小鼠死亡，剩下1只小鼠存活；2、对照组1因没有感染真菌，所以全部存活；3、对照组2因没有给药，只给生理盐水，到第7天就有3只小鼠死亡，剩下5只小鼠，到第12天全部死亡；4、对照组3只给本发明的药物，到第7天就有3只小鼠死亡，剩下5只小鼠，到第12天全部死亡，说明本发明的药物单独使用，没有杀灭真菌的功效；5、对照组4只给抗真菌的药物，到第8天就有2只小鼠死亡，剩下6只小鼠，到第14天全部死亡，说明没有本发明的增效剂的抗真菌药物，其杀灭真菌的功效不够理想。
通过计算配合使用本发明的抗真菌增效剂药物可提高存活率为12.5％(对只给抗真菌药物)。
对于给药方法，我们对比作了口服、静脉注射及皮下注射，试验证明静脉或皮下注射本发明的乳链菌肽复合剂及抗真菌药物可提高Nikkomycin对小鼠的存活率41-80％；比口服效果较佳。见表三。表三
按照上述方法改变试剂A、B、C和D的用量做了反复试验，证明本发明的抗真菌药物增效剂与抗真菌药物配合使用，具有显著提高小白鼠的存活率。实验结果参阅表四。表四
从上述试验可以看出本发明的抗真菌药物增效剂配合抗真菌药物尼柯霉素(Nikkomycin)，或真菌细胞壁合成抑制剂，可极大地提高其抗真菌的功效。
试验证明用静脉注射或皮下注射，具有同样的功效，故不重述。
权利要求
1.一种抗真菌药物增效剂，其特征在于由乳链菌肽与赖氨酸及二价盐组成的复合组成物，其克分子配比为乳链菌肽0.01-10mMol，赖氨酸0.01-0.03mMol，二价盐0.1-1.0mMol。
2.如权利要求1所述的抗真菌药物增效剂，其特征在于该复合组成物的克分子配比为乳链菌肽0.05-5mMol，赖氨酸0.01-0.02mMol，二价盐0.15-0.60mMol。
3.如权利要求1或2所述的抗真菌药物增效剂，其特征在于该二价盐包括镁盐和钴盐。
4.如权利要求3所述的抗真菌药物增效剂，其特征在于该镁盐优选自MgCl2。
5.如权利要求3所述的抗真菌药物增效剂，其特征在于该钴盐优选自CoCl2。
6.一种抗真菌药物增效剂的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下骤首先选择如下克分子配比的原料乳链菌肽0.01-10mMol，赖氨酸0.01-0.03mMol，二价盐0.1-1.0mMol；将上述原料混合均匀，用物理方法除菌，粉碎至10μ以下，干燥至含水5％以下，制成本发明的抗真药物增效剂；
7.如权利要求6所述的抗真菌药物增效剂的制备方法，其特征在于该抗真菌药物增效剂的剂型包括针剂、胶囊剂、片剂或水溶性的针剂或口服液。
8.一种抗真菌药物增效剂的应用，其特征在于该抗真菌药物增效剂适用于与抗真菌药物配合使用。
9.如权利要求8所述的抗真菌药物增效剂的应用，其特征在于该抗真菌药物包括抗真菌细胞壁合成抑制剂。
10.如权利要求8所述的抗真菌药物增效剂的应用，其特征在于该抗真菌药物优选自尼柯霉素。
全文摘要
一种抗真菌药物增效剂及其制备方法和应用,包括首先选择如下克分子配比的原料:乳链菌肽0.01—10mM0l,赖氨酸0.01—0.03mMol,二价盐0.1—1.0mMol;将上述原料混合均匀,用物理方法除菌,粉碎至10μ以下,干燥至含水5%以下,制成本发明的抗真药物增效剂;本发明的抗真菌药物增效剂的剂型包括针剂、胶囊剂、片剂或水溶性的针剂或口服液。其配合抗真菌细胞壁合成抑制剂使用,具有增加抗真菌治疗效果的功效。
文档编号A61K47/42GK1335181SQ00121370
公开日2002年2月13日 申请日期2000年7月24日 优先权日2000年7月24日
发明者骆爱群, 还连栋, 陈秀珠, 孙彤 申请人:中国科学院微生物研究所