使用含有非肠道病原体抗原的植物产品的口服免疫的制作方法

专利名称：使用含有非肠道病原体抗原的植物产品的口服免疫的制作方法
众所周知，在哺乳动物中，致病微生物并不引起保护性的肠道免疫应答(非肠道病原体)。直到现在，据认为通过口服免疫不能获得对由该非肠道病原体引起的感染进行保护，尤其是当来自该病原体的抗原用于抵抗完全活的或减毒的病原体的时候。
这些病原微生物经常是通过非肠道途径侵染，尤其是通过皮肤上刺破的小口，磨损，切口，或其它的裂口，例如，通过输血等等。
通过非肠道病原体所致疾病有以下这些乙型肝炎，丙型肝炎，丁型肝炎，黄热病，拉沙热，登革热，狂犬病，破伤风，金色葡萄球菌感染，雅司病，回归热，鼠咬热，腺鼠疫，伤寒热及斑疹热。
作为上述实例之一，乙型肝炎病毒(HBV)是导致致病率及死亡率据高不下的重要的致病病毒，尽管已有许多有效的肠胃外疫苗。据估计在1996年，大约有115百万人感染了乙肝病毒。由此导致的死亡人数据估计每年有100万例。在发达国家例如美国，对乙肝病毒的免疫率依然是低于已定的目标，且每年有超过30万的新的病例发生，由乙肝病毒感染引起的死亡人数每年有5000人。此外，在一份对美国自1976年至1994年间对乙肝病毒感染流行的回顾中可以看出，在此期间，尽管使用了乙肝疫苗，乙肝病毒感染率并没有明显下降。这样在发达国家中，仍然有必要对现行的胃肠外疫苗的替代措施及途径加以改进和完善。随着越来越多的疫苗成为儿童免疫的一部分，这一点尤为重要，因为我们一定要考虑怎样安全有效地使用儿科免疫计划中的众多的抗原。
另外一个值得注意的是，全球乙肝发病率及死亡率占的很大比例出于乙肝病毒蔓延的发展中国家。例如，在马拉维的乡下，医院产妇中72％有明显的HBV感染，13％是慢性携带者。在这些地方，因为疫苗需要冷冻保存及高额的疫苗价格，现存的胃肠外疫苗的供应非常有限。尽管已经发起了一些重要的向发展中国家提供乙肝疫苗的活动，但是仍然需要有替代途径。尽管在发达国家免疫率在不断增加，在缺少有效的全球乙肝免疫计划的情况下，乙肝由发展中国家进入发达国家仍将持续。
作为一种抗某些疾病的胃肠外免疫的替代途径是可以通过口服给药的疫苗。如前所讨论的那样，口服疫苗对于非肠道病原体通常是无效的。
已提出了口服免疫的一种特定的途径，即在转基因植物组织中表达抗原，然后摄入。这种技术，可能同时提供简单的生产方式及适于口服免疫的存在于某种基质形式的抗原。此外，植物组织如马铃薯块茎有明显的优势，因为蔬菜，甚至在未加工状态下，在市场中都有很长的安全期。最后，表达口服抗原的转基因植物组织可以有同时刺激体液及粘膜免疫的额外优点，结果是其比胃肠外免疫方式更为有效地保护了粘膜表面。直到现在，并没有发现表达非肠道病原体抗原物质的转基因植物组织作为口腔疫苗会比直接通过口腔摄取该种纯化的抗原更为有效。
表达乙肝表面抗原(HBsAg)的植物实际上已经被开发，但是同时令人失望的是通过哺乳动物摄取该植物仅产生少量的或不能接受的低免疫应答，而从植物中分离的HBsAg已经发现通过肠外给药可以刺激免疫应答。在整个本说明书中，HBsAg是举例性的，且代表已知的当通过胃肠外给药时产生免疫反应的其它非肠道病原体抗原。
已开发了表达乙肝表面抗原的转基因植物如马铃薯，该抗原是一种已知通过胃肠外给药对乙肝产生免疫应答的抗原。不幸的是，当植物例如马铃薯仅被简单的用于喂养动物时，这样的免疫应答并未被刺激到可以接受的水平。
然而，现在意外地发现当动物对HBsAg为免疫感受态(immunoreceptive)时，用植物材料中的抗原喂养动物时可获得对非肠道病原体抗原如乙肝表面抗原(HBsAg)的免疫应答。现在已经发现，可以通过共同施用含抗原的植物材料和适当的佐剂使得动物对非肠道病原体抗原如HBsAg呈免疫感受态。动物也可以是由于在先免疫例如初次免疫而为免疫敏感的，在这种情况下，通过给动物喂养含有抗原的植物材料，可在动物中加强对该非肠道抗原如HBsAg的免疫应答。这种情况下发现并不需要免疫佐剂。但是可以使用免疫佐剂以达到获得更高的免疫应答的目的。例如，动物如人如果先前对初次抗乙肝免疫有阳性反应，可以通过喂养含有该抗原的植物材料加强其对HBsAg的免疫应答。这些植物材料是含有来自于植物的生理学上可接受的植物材料的物质(如果汁，果肉，树叶，茎，根，水果种子，植物体一部分或其整体)，特别是马铃薯，其中它们含有乙肝表面抗原(HBsAg)。这些植物中的HBsAg来自于经过遗传改变植物所表达的HBsAg。
″非肠道病原体抗原″(NEPA)指经过胃肠外途径可刺激机体对非肠道病原体的免疫应答的抗原。
所使用的HBsAg指乙肝表面抗原，并在这里用作非肠道病原体抗原的一个实例。
目标植物材料的来源植物可以是任何植物，只要它含有非肠道病体抗原如HBsAg。植物可以通过转基因改造而表达HBsAg及其它非肠道病原体抗原。几乎任何可以被摄取的植物都可以被改造来表达HBsAg及其它非肠道病原体抗原，但最优选的植物是食用植物，如产生果实、谷物及蔬菜的植物，如香蕉、马铃薯及番茄。特别优选的植物材料是不含有大量酸的植物材料，如块茎类植物象马铃薯，因为某些植物材料如番茄或柑橘类的果实中的酸可以导致HBsAg降解。另外，含有大量蛋白酶的植物材料如番木瓜可能也不理想，因为这些酶也可以降解HBsAg。这里所用的“大量”指可以使得抗原降解到免疫应答明显减少程度的数量。
本领域技术人员已知使得烟草类植物表达HBsAg及其它抗原的遗传改造方法，如Mason等人所述″转基因植物中乙肝表面抗原的表达″，Proc.Natl.Acad.Sci USA,Vol.89,pp.11749,1992年12月。这篇文章作为背景技术加以引用。遗憾的是烟草不宜摄取，从而不是生理上可接受的。根据本发明，类似的方法可用于遗传改造其它植物使其表达HBsAg及其它非肠道病原体抗原。适宜的植物尤其为茄科植物，特别是马铃薯。下文将详细描述关于马铃薯的遗传改变过程。
本发明所使用的植物至少应含有每克要消化的植物产品5μg，优选是7μg至15μg HBsAg。动物如人应该摄取足够量的植物材料以提供每千克体重约10～约100微克的乙肝表面抗原。动物例如人通常应该摄取足够量的植物材料以提供每千克体重约2～5克的植物材料。
如果系列间隔地摄取植物材料可以提高免疫应答，例如，2次或3次的系列摄取，每次应至少间隔5天，优选是至少间隔7～14天。
本发明的植物材料如果缺少本发明要求的方法步骤时口服使用并不产生明显的免疫应答，也就是来自免疫应答的保护能力。按照本发明，含有HBsAg或其它非肠道病原体抗原的植物材料必需，或者给先前已例如通过胃肠外注射初次免疫的个体口服使用，或者与可以有效地使得HBsAg或者非肠道病原体抗原产生保护性免疫反应的免疫佐剂联合口服使用。在本发明以前，不可能预测针对NEPA如HBsAg的免疫应答可以通过含有NEPA的植物材料被先前已有初次免疫的个体摄取或者与免疫佐剂联合摄取而产生。
可能有效的佐剂包括细菌质粒DNA，抗HB抗体，含有免疫刺激剂CpG的寡脱氧核苷酸分子，修饰的霍乱毒素(CT)，修饰的大肠杆菌热稳定性淋巴毒素，胞壁酰基二肽的亲脂衍生物(MDP-Lys(L18))，磷酸铝或者硫酸铝，细胞因子，或者丙肝核心蛋白。大量的已接受抗乙肝免疫的受治个体当用本发明的方法进行治疗时显示出免疫增强反应，例如，有60％甚至更多的受治对象。但是，应该认识到还有一部分因不明原因而不产生可测的免疫增强反应的受治个体。其中可能的原因有这些受治个体尽管先前已经接受过初次免疫治疗，但事实上并未产生强的初次免疫反应或因为初次免疫后时间太长受治个体中的记忆细胞太少。类似的结果也发生在已有疫苗中，不管以什么样的方式使用，换句话说，有的受治个体根本不产生反应。
本发明可以用下述实施例来证明。
给动物喂养表达且含有HBsAg的马铃薯，所产生的抗乙肝免疫应答可以用酶联免疫方法来测定。
之所以用马铃薯作为本发明可用植物的优选实例是基于下列几点考虑的。首先是因为与其它的植物材料尤其是某些果实相比较，马铃薯相对为中性；另外，已有大量的关于马铃薯的遗传特性或者可能的转基因修饰的研究；更为重要的是，马铃薯是人类主要的食物，据估计全球每人每年消费1到100千克的马铃薯，美国人均年消费据估计已达到36千克。此外，在美国，马铃薯作为一种蔬菜原料被列入联邦法规[21 CFR 101.44(b)]的20种最常用蔬菜原料之一。用于生产当前通用的HBV-EPV转基因植物的马铃薯的具体的栽培变种，按照本发明具体的实施例，同样可以生产表达其它抗原的转基因植物。这些植物的未加工或者已经削皮的马铃薯与来自于同一马铃薯亲本的未转化的马铃薯一样安全，且在其它表达的肠道抗原的Ⅰ期临床试验中耐受良好。
转化植物以表达HBsAg及其它抗原的方法对本领域技术人员是已知的，例如美国专利5,484,719；5,914,123及5,612,487所描述的那样，这些专利在这里列为本发明的背景技术。
HBsAg先前已经在转基因烟草植物(茄科(马铃薯)成员之一)中表达。在这个体系中，HBsAg的表达率占总可溶叶蛋白的0.01％。与那些源于重组酵母的衍生HBsAg相应的HBsAg颗粒物在叶组织的抽提物中被发现。当该材料与完全弗氏佐剂(CFA)一起经腹膜内(i.p.)给予小鼠时，其产生抗HBS，并未有明显的副反应发生。
选择用于这些实施例的表达HBsAg的马铃薯是来自S.tuberosumL.c.v.Frito-Lay 1607 HB-7的转化系。这些转化系被命名为FL-1607 HB-7及HB114-16。为了获取这些转化系，来自于一个HBV中国adr分离株的pMT-SA克隆的HBsAg基因被插入到转化质粒载体(pHB-7及pHB114)中，其被运载到根癌土壤杆菌(LBA4404)中，然后用其转化Solanum tuberosum L cv.″Frito-Lay 1607″。用于构造这些实施例中所用马铃薯系pHB-7及pHB114-16的质粒载体都含有表达新霉素磷酸转移酶(NPTII，也称为APH(3’)II)的基因。该基因同样可以被整合到马铃薯基因组中并在马铃薯细胞中进行表达。大肠杆菌衍生的NPTII已被证明有与植物表达的NPTII同样的生化特性。大肠杆菌衍生自的NPTII在模拟哺乳动物消化系统的条件下迅速降解，并且在喂养给小鼠纯化的蛋白至5g/kg体重的情况下并未有任何有害作用。转化的FL-1607用根癌土壤杆菌处理，并进行无性繁殖，根据其高水平的HBsAg表达能力选择了FL-1607 HB-7及HB114-16系。FL-1607转化系的抽提物通过ELISA技术来测试HBsAg浓度，HB-7平均每克块茎重1100ngHBsAg,HB114-16平均每克块茎重8500ng±2100ngHBsAg。
此外，抽提的HBsAg自发形成病毒样颗粒(VLP)，其与来自于酵母的HBsAgVLP在同样的密度沉降。电泳迁移及Western印迹分析都显示出块茎表达的抗原与来自酵母的抗原无法区别。
通过细胞系无性繁殖成倍增加该植株的数量，并通过土壤盆栽以获取实施例中所要用的块茎。转化系通过体外无性繁殖来保持。
未转化的亲本马铃薯系FL-1607通过无性繁殖来保持，并以盆栽形式来生产对照组所使用的块茎。来自这些块茎的组织并不表达任何与检测HBsAg的试剂反应的蛋白。
实施例1给BALB/c小鼠喂养或者削皮的HB-7马铃薯切片或者对照未转化的马铃薯。在第0,7,14天分别给予5g的马铃薯来喂养每组小鼠。霍乱毒素(CT)的B亚单位(Sigma)被用作口服佐剂。10μg佐剂被放置在马铃薯切片上(在试验组及对照组)并与抗原一起为动物所食用。这样喂养HB-7的动物获得平均每次给食5.5μg的HBsAg，或者在所提供的三次给食中接受16.5μg HBsAg的平均总量。
喂养HB-7的小鼠形成HBsAg特异的血清IgM及IgG应答，而喂养未转化马铃薯的对照组并未产生任何抗体。经过第三次喂养可以观察到免疫应答在70mIU/ml左右达到顶峰。经过单次腹膜内接种明矾中的0.5μg酵母衍生的重组HBsAg(rHBsAg)(正常亚免疫剂量)后可以观察到在1700mIU/ml达到顶峰的再次应答。该应答的主要免疫球蛋白是IgG。但在喂养未转化马铃薯及CT的对照组并未发现有初次、再次应答发生。没有口服佐剂则不产生对HBsAg的明显应答。
实施例2下一步实验使用Frito-Lay 1607HB114-16细胞系，在这个细胞系中的表达由35S启动子驱动，这些试验所用的块茎表达平均为8.37μgHBsAg/每克块茎湿重。
给BALB/c小鼠(5只/组)喂养或者HB114-16或者对照非转基因马铃薯。在这两组中马铃薯中都加入了10μg CT。一周和两周后重复喂养。在3周期间，给每一小鼠转基因马铃薯HBsAg的平均剂量为125.5μg。然后，在经第一次喂养后70天，或者经初次免疫反应后3-6周后回到基线，经过皮下注射以铝剂作为佐剂给予对小鼠亚免疫剂量(0.5μg)的rHBsAg(Merck)进行免疫。
在这些剂量水平，经过二次给食后往往能立即出现起始免疫反应。这些免疫反应持续升高且在6周左右达到100mIU/ml的顶峰。现在得到许可的可注射乙肝疫苗在经过三次给药的人体中出现仅10mIU/ml的滴度就被认为已成功免疫。这些免疫反应在13周后回到基线，16周时给予动物rHBsAg增强剂量。这将导致免疫滴度迅速升高至大于3000mIU/ml，在试验的剩余时间内其将保持在超过1000mIU/ml的水平(40周)。这证明在初次免疫过程中产生的抗原特异性免疫记忆细胞，可以在二次免疫(加强)时被迅猛地激活。
给予非转化马铃薯+CT的本试验对照组动物并未产生针对HBsAg的免疫反应和在亚免疫剂量的二次攻击(如上所述)过程中并未产生再次应答，证明所述结果的特异性。没有CT而仅给予转基因马铃薯的对照组动物仅产生低水平的如10mIU/ml滴度的初次免疫反应，且在一周后就回到基线。在如上所述的亚免疫剂量的二次攻击过程中仅产生50mIU/ml的再次免疫反应且仅在两周后就回到10mIU/ml的水平。
实施例3转基因马铃薯还被用于加强小鼠先前已存在的亚免疫剂量的rHBsAg。在本试验中，BALB/c小鼠(5只/组)用亚免疫剂量的rHBsAg(Merck)以明矾作为佐剂来进行皮下免疫。5周后，每一小鼠或用HB114-16或用对照非转基因马铃薯喂养。在这两组中在马铃薯中都加入了10μgCT。一周和两周后重复喂养，每一小鼠的总平均剂量在三周期内为125.55μg。
在第三次喂养时开始出现再次免疫反应且其在初次致敏免疫后11周且尚未下降时升高到约1000mIU/ml的水平。在对照组中喂养非转基因马铃薯没有出现免疫反应。
实施例442个自愿者经测试没有HIV并且先前接受过商业乙肝疫苗的初次免疫，并经过了一段时间其抗HBsAg滴度低于115mIU/ml。在一个随机双盲研究中，给这些自愿者食用含有HBsAg的马铃薯及在对照组中给其食用不含HBsAg的马铃薯。解开密码后确定组1为对照组，接受100克非转基因马铃薯FL-1607的三种剂量。组2接受100克转基因马铃薯FL-1607HB114-16的两种剂量及非转基因马铃薯-FL-1607的一种剂量。组3接受100克转基因马铃薯FL-1607HB114-16的三种剂量。
现有的临床前数据表明，(1)以重量计，小鼠自由消耗多至其体重的25％的马铃薯不产生任何毒性作用；及(2)在约15克马铃薯中共16μg剂量的HBsAg与口服佐剂一起在初次免疫实验中有免疫原性。来自其它马铃薯疫苗的现有临床数据表明，(1)消耗100克未加工的马铃薯一般耐受良好；及(2)以重量计，一个体重70公斤的人消耗100克相当于其体重的0.14％。这个数量比在临床前试验中小鼠所消耗的量少了约178倍(重量)。
这样，对于该人体试验，每次给自愿者食用100到110克马铃薯。本研究计划使用的临床材料每克马铃薯含有8.5±2.1μg HBsAg。在整个28天内，接受两个100克剂量转基因马铃薯的受治个体接受总剂量1,280至2,120μg的HBsAg；接受三个剂量的受治个体接受总共1,920至3,180ug的HBsAg。
给药的每一天(第0,14及28天)，配药人员用清洁技术给每组(试验组及对照组)分别取一定数目的马铃薯并加工以给每人分配100到110克的剂量。简单来说，洗干净所选择的马铃薯，并将其削皮、切片并放置于冰水混合物水浴中。马铃薯削皮是为了去除含有生物碱-茄碱的马铃薯皮，因为该生物碱可能导致腹部不适或恶心且有一定的苦味。经过削皮及切片，按照所划分的组别及受治个体的识别号码(SID)给每个研究个体称取100到110克剂量的马铃薯。收集马铃薯皮及未用的部分并将其处理掉。将用于每一受治个体的马铃薯在水中保存以防止其在切片后至为受治个体食用期间氧化变色。将用于每组每次给食的处理后的马铃薯样品的一部分保留下来冷冻用于进一步处理以验证抗原含量。
在表1、2、3所显示的天数对受治个体进行抗-HBsAg的滴度测试。结果清楚显示了食用遗传转化的马铃薯导致对所给HBsAg NEPA抗原的免疫反应提高。有超过60％的接受三个剂量含HBSAg NEPA抗原的马铃薯的受治个体显示免疫反应有显著的增强。表中清楚地显示，在许多情况下，摄取含有遗传表达的HBsAg NEPA的植物材料可以有效地加强初次乙肝免疫。对照组中接受三组剂量的非转基因马铃薯的受治个体没有一例在整个检测过程中抗体滴度发生任何变化。
表1第一组(接受三个剂量的非转基因马铃薯块茎)滴度(1m/ml)
表2第二组(接受两个剂量的转基因马铃薯块茎及一个剂量的非转基因马铃薯块茎)滴度(1m/ml)
表3第三组(接受三个剂量的转基因马铃薯块茎)滴度(1m/ml)
权利要求
1．一种在对非肠道病原体抗原(NEPA)为免疫感受态的动物中产生对NEPA免疫应答的方法，其特征在于用包含含NEPA的生理学上可接受的植物材料的物质喂养该动物。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于NEPA为乙肝表面抗原(HBsAg)。
3．如权利要求1所述的方法，其特征在于通过用所述物质和使动物对NEPA免疫感受的佐剂一起喂养该动物使得所述动物对NEPA为免疫感受态。
4．如权利要求3所述的方法，其特征在于NEPA为HBsAg。
5．如权利要求1所述的方法，其特征在于所述动物是人。
6．如权利要求5所述的方法，其特征在于植物材料来自于经遗传改造表达所述抗原的植物。
7．如权利要求6所述的方法，其特征在于人体摄取足够量的植物材料以获得每千克人体体重大约10至100微克的NEPA。
8．如权利要求7所述的方法，其特征在于人体摄取足够量的植物材料以获得每千克人体体重大约2至5克的植物材料。
9．如权利要求8所述的方法，其特征在于人体多次摄取所述植物材料，所述各次彼此间隔至少5天。
10．如权利要求9所述的方法，其特征在于所述多次为3次。
11．如权利要求10所述的方法，其特征在于植物材料是来自于茄科植物的材料。
12．如权利要求11所述的方法，该植物为马铃薯。
全文摘要
一种通过给对NEPA为免疫感受态的动物喂养包含于植物材料中的抗原获得对诸如乙肝表面抗原的非肠道病原体抗原(NEPA)的免疫应答的方法。现发现可以通过给予含NEPA的该植物材料和适当的佐剂使动物对NEPA为免疫感受态。该植物材料是一种含有生理学上可接受的植物材料的物质,尤其是马铃薯,其中含有NEPA,如乙肝表面抗原。植物中的NEPA如乙肝表面抗原来自该植物经过遗传改造表达的NEPA。
文档编号A61P37/04GK1302662SQ0013714
公开日2001年7月11日 申请日期2000年10月13日 优先权日1999年10月13日
发明者Y·塞纳瓦拉, C·J·阿恩茨恩 申请人:健康研究公司, 博伊斯汤普森植物研究所公司