通过il－13和il－13受体链的拮抗作用治疗纤维化的制作方法

专利名称：通过il－13和il－13受体链的拮抗作用治疗纤维化的制作方法
技术领域：
本发明是1997年提交的序列号No.08/841,751申请的部分继续申请，序列号No.08/841,751申请是1996年提交的序列号No.08/609,572申请的分案申请。本发明的领域本发明涉及通过IL-13与其受体和受体组份相互作用的拮抗作用治疗和抑制纤维化。
本发明的背景多种调节分子，如细胞因子，包括白细胞介素-13(IL-13)已被确定。IL-13的多种蛋白质形式以及IL-13活性的DNA编码多种形式在McKenzie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA903735(1993)；Minty等人，自然362248(1993)；以及Aversa等人WO94/04680中作了描述。因此，“IL-13”包括具有这些文献中所描述的序列和/或活性的蛋白质，不论其是通过遗传工程重组技术制备的；或从自然地或通过用其他因子诱导产生因子的细胞源提纯的；或通过化学方法合成的；或通过前述技术的组合获得的。
IL-13是一种涉及产生几种生物活性的细胞因子，活性包括诱导IgG4和IgE转换，包括在人类未成熟B细胞(Punnonen等人，免疫学期刊1521094(1994))；诱导正常人类B细胞中种系IgE重链(∈)转录和CD23表达(Punnonen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA903730(1993))；以及在存在CD40L或抗-CD40mAb的情况下诱导B细胞增殖(Cock等人，免疫学期刊5657(1993))。尽管IL-13的多种活性与IL-4的活性相同，与IL-4不同的是，IL-13对活化T细胞或T细胞克隆体没有生长促进作用(Zurawski等人，EMBO J 122663(1993))。
同大多数细胞因子一样，IL-13通过在靶细胞表面上与IL-13受体(“IL-13R”)相互作用表现出某些生物活性。IL-13R和IL-4受体(“IL-4R”)具有共同的组分，其是受体活化作用所需的；然而，IL-13不与用130kD IL-4R转染过的细胞结合(Zurawski等人，如上述)。因此，IL-13R必须含有至少一条其他的配体结合链。细胞因子受体通常包含两条或三条链。对IL-13的一条配体结合链的克隆目前已有报道(Hilton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.93497-501)。
因此需要确定并克隆IL-13R的任何其他IL-13结合链的序列，以便为多种用途制备IL-13R蛋白质，包括制备治疗试剂及筛查IL-13结合受体的抑制剂和受体信号。
本发明的概述依据本发明，公开了编码白细胞介素-13受体IL-13结合链的多核苷酸，没有限制地包括从鼠科动物和人类受体获得的多核苷酸。在某些实施方案中，本发明提供了包含从下列组中选取的核苷酸序列的分离多核苷酸(a)从核苷酸256到核苷酸1404的SEQ ID NO1的核苷酸序列；
(b)从核苷酸103到核苷酸1242的SEQ ID NO3的核苷酸序列；(c)由于遗传密码的简并从(a)和(b)中限定的核苷酸序列的序列中变化出来的核苷酸序列；(d)在严格条件下能与(a)和(b)中限定的核苷酸杂交的核苷酸序列；(e)编码(a)和(b)中限定序列的同源物种的核苷酸序列；和(f)(a)和(b)中限定核苷酸序列的等位基因变体。
较好地，核苷酸序列编码具有人类IL-13受体生物活性的蛋白质。核苷酸序列可以可操作地与表达控制序列结合。在较好的实施方案中，多核苷酸包括从核苷酸256到核苷酸1404的SEQID NO1的核苷酸序列；从核苷酸319到核苷酸1257的SEQ IDNO1的核苷酸序列；从核苷酸1324到核苷酸1404的SEQ IDNO1的核苷酸序列；从核苷酸103到核苷酸1242的SEQ IDNO3的核苷酸序列；从核苷酸178到核苷酸1125的SEQ IDNO3的核苷酸序列；从核苷酸1189到核苷酸1242的SEQ IDNO3的核苷酸序列。
本发明还提供了包含编码含有从下列组中选取的氨基酸序列的肽或蛋白质的核苷酸序列的分离多核苷酸(a)氨基酸序列SEQ ID NO2；(b)从氨基酸22到334的氨基酸序列SEQ ID NO2；
(c)从氨基酸357到383的氨基酸序列SEQ ID NO2；(d)氨基酸序列SEQ ID NO4；(e)从氨基酸26到341的氨基酸序列SEQ ID NO4；(f)从氨基酸363到380的氨基酸序列SEQ ID NO4；和(g)具有IL-13受体结合链生物活性的(a)和(f)的片段。
其他较好的实施方案编码从氨基酸1到331的SEQ ID NO2氨基酸序列和从氨基酸26到331的SEQ ID NO2氨基酸序列。
还提供了用多核苷酸转染过的宿主细胞，较好地是哺乳动物细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了制备IL-13bc蛋白质的方法。方法包括(a)在适当的培养介质中培养本发明的宿主细胞的培养物；(b)从培养物中提纯人类IL-13bc蛋白质。
本发明还提供了包含从下列组中选取的氨基酸序列的分离IL-13bc蛋白质(a)氨基酸序列SEQ ID NO2；(b)从氨基酸22到氨基酸334的氨基酸序列SEQ ID NO2；(c)从氨基酸357到氨基酸383的氨基酸序列SEQ ID NO2；
(d)氨基酸序列SEQ ID NO4；(e)从氨基酸26到氨基酸341的氨基酸序列SEQ ID NO4；(f)从氨基酸363到氨基酸380的氨基酸序列SEQ ID NO4；和(g)具有IL-13受体结合链生物活性的(a)和(f)的片段。
较好地，蛋白质包括氨基酸序列SEQ ID NO2；从氨基酸22到氨基酸334的氨基酸序列SEQ ID NO2；氨基酸序列SEQID NO4；从氨基酸26到氨基酸341的氨基酸序列SEQ ID NO4。在其他较好的实施方案中，限定的氨基酸序列是部分融合蛋白质(带有不是从IL-13bc衍生的其他氨基酸序列)。较好的融合蛋白质包括抗体片段，如Fc片段。特别推荐的较好实施方案包括从氨基酸1到331的氨基酸序列SEQ ID NO2和从氨基酸26到331的氨基酸序列SEQ ID NO2。
本发明还提供了包含本发明的蛋白质和药物可接受的载体的药物组合物。
本发明进一步提供了包含特异地与本发明的蛋白质反应的抗体的组合物。
本发明还提供了鉴别抑制IL-13与IL-13bc或IL-13受体结合的抑制剂的方法。这些方法包括(a)将IL-13bc蛋白质或其片段与IL-13或起片段结合，所述的结合形成第一结合混合物；
(b)测定第一结合混合物中蛋白质与IL-13或片段之间的结合量；(c)将化合物与蛋白质和IL-13或片段结合形成第二结合混合物；(d)测定第二结合混合物中的结合量；(e)将第二结合混合物中的结合量与第一结合混合物中的结合量比较；其中，当第二结合混合物的结合量下降时，化合物能抑制IL-13与IL-13bc蛋白质或IL-13受体的结合。本发明还提供了通过这些方法鉴别的IL-13R的抑制剂和含有抑制剂药物组合物。
本发明还公开了在哺乳动物受试体内抑制IL-13与IL-13bc蛋白质或IL-13受体结合的方法，其包括服用治疗上有效量的含有IL-13bc蛋白质，IL-13bc或IL-13R抑制剂或IL-13bc蛋白质的抗体的组合物。
本发明还提供了增强IL-13活性的方法，其包括将具有IL-13活性的蛋白质与本发明的蛋白质结合，将这种结合物与表达除IL-13外至少一条IL-13R链的细胞接触。较好地，接触步骤通过给哺乳动物受试体服用治疗上有效量的这种结合物。
还提供了在受试体内治疗与IL-13相关的病况的其他方法，所述方法包括服用治疗上有效量的含有IL-13拮抗剂和药物可接受的载体的组合物。提供了在哺乳动物受试体内抑制IL-13与IL-13bc蛋白质相互作用的其他方法，包括服用治疗上有效量的含有IL-13拮抗剂和药物可接受的载体的组合物。较好地，拮抗剂是从下列组中选取的，包括IL-13bc蛋白质，可溶形式的IL-13Rα1，IL-13的或其IL-13结合片段的抗体，IL-13bc的或其IL-13bc-结合片段的抗体，IL-13Rα1的或其IL-13Rα1结合片段的抗体，IL-4的IL-13R结合突变体，能抑制IL-13与IL-13bc相互作用的小分子以及能抑制IL-13与IL-13Rα1相互作用的小分子。
在其他实施方案中，本发明提供了一种治疗哺乳动物受试体内组织纤维化的方法。方法包括服用治疗上有效量的含有蛋白质和药物可接受的载体的药物组合物，其中蛋白质包括从下列组中选取的氨基酸序列(a)氨基酸序列SEQ ID NO2；(b)从氨基酸22到334的氨基酸序列SEQ ID NO2；(c)从氨基酸357到383的氨基酸序列SEQ ID NO2；(d)氨基酸序列SEQ ID NO4；(e)从氨基酸26到341的氨基酸序列SEQ ID NO4；(f)从氨基酸363到380的氨基酸序列SEQ ID NO4；和(g)具有IL-13受体结合链生物活性的(a)和(f)的片段。
本发明还提供了一种在哺乳动物受试体内抑制组织纤维化形成的方法。方法包括服用治疗上有效量的含有蛋白质和药物可接受的载体的药物组合物，其中蛋白质包括从下列组中选取的氨基酸序列
(a)氨基酸序列SEQ ID NO2；(b)从氨基酸22到334的氨基酸序列SEQ ID NO2；(c)从氨基酸357到383的氨基酸序列SEQ ID NO2；(d)氨基酸序列SEQ ID NO4；(e)从氨基酸26到341的氨基酸序列SEQ ID NO4；(f)从氨基酸363到380的氨基酸序列SEQ ID NO4；和(g)具有IL-13受体结合链生物活性的(a)和(f)的片段。
本发明的其他实施方案提供了一种在哺乳动物受试体内治疗或抑制组织纤维化的方法。方法包括服用治疗上有效量的含有(a)从包括IL-13拮抗剂和IL-4拮抗剂中选取的分子和(b)药物可接受的载体的组合物。
在实施使用拮抗剂治疗或抑制纤维化的这些方法时，较好地，组织纤维化影响从下列组中选取的组织，包括肝脏，皮肤表皮，皮肤内皮，肌肉，腱，软骨，心脏组织，胰腺组织，肺组织，子宫组织，神经组织，睾丸，卵巢，肾上腺，动脉，静脉，结肠，小肠，胆管和肠子；最好的是，肝脏组织(包括被血吸虫感染的组织)。在某些实施方案中，纤维化是由伤口(包括外科手术切口)愈合造成的。
在实施使用拮抗剂治疗或抑制纤维化的这些方法时，较好地，这种拮抗剂是从下列组中选取的，包括IL-13bc蛋白质，可溶形式的IL-13Rα1，IL-13的或其IL-13结合片段的抗体，IL-13bc的或其IL-13bc-结合片段的抗体，IL-13Rα1的或其IL-13Rα1结合片段的抗体，IL-4的IL-13R结合突变体，能抑制IL-13与IL-13bc相互作用的小分子以及能抑制IL-13与IL-13Rα1相互作用的小分子。在特别推荐的实施方案中，拮抗剂是含有从下列组中选取的氨基酸序列的IL-13bc蛋白质，包括(a)氨基酸序列SEQ ID NO2；(b)从氨基酸22到334的氨基酸序列SEQ ID NO2；(c)从氨基酸357到383的氨基酸序列SEQ ID NO2；(d)氨基酸序列SEQ ID NO4；(e)从氨基酸26到341的氨基酸序列SEQ ID NO4；(f)从氨基酸363到380的氨基酸序列SEQ ID NO4；和(g)具有IL-13受体结合链生物活性的(a)和(f)的片段。
在其他较好的实施使用拮抗剂的方法中，拮抗剂是从下列组中选取的，包括可溶形式的IL-4R，IL-4的或其IL-4结合片段的抗体，IL-4R的或其IL-4R结合片段的抗体，能抑制IL-4与IL-4R相互作用的小分子。
本发明的示图简述

图1该图显示了如下面实施例4中所描述的暴露给IL-13bc-Fc后IL-13，IL-4，IL-11和模拟转染COS细胞的照片。
图2在血吸虫病致病机理中IL-4和IL-13起的作用。将C57BL/6WT及IL-4缺损(4KO)鼠用25只尾蚴(Schistosomamansoni)感染，然后在感染八周后将鼠处死，评定肝脏肉芽肿(试验组A)，组织嗜曙红细胞过多现象(试验组B)，肝纤维化(试验组C)。将隔离组的鼠用对照物-Fc或sIL-13Rα2-Fc治疗，如在方法部分中所描述的。显示数据是个体鼠测量结果，线表示为每组的平均值。通过学生-测试(试验组A和B)以及通过分析协方差(试验组)获得统计比较结果。显著的比较结果和它们的p值在图中标出。所有数据在其他试验中可重现。
图3在用sIL-13Rα2-Fc-治疗的/感染的鼠中肝脏胶原质减少。在感染攻击后8周制备肝脏切片。将从用Fc-治疗的(试验组A和B)和用sIL-13 Rα2-Fc-治疗的WT感染鼠中获得的、含有几乎相同的组织egg burdens的切片用picrosirius红染色(试验组A和C)，并使用偏振光照射以突出富含胶原质的区域(试验组B和D)。双折射性区域显示正胶原质染色，显示的区域表示每个肝脏(放大，×40)。与对照动物相比，从sIL-13Rα2-Fc-治疗的鼠获得的切片仅显示出非常微小的肉芽肿及与入口管有关的胶原质。
图4Th1/Th2类细胞因子分布没有受到sIL-13Rα2-Fc-治疗的影响。将C57BL/6WT及IL-4缺损(4KO)鼠用25只尾蚴(Schistosoma mansoni)感染，将隔离组的鼠用对照物-Fc或sIL-13Rα2-Fc治疗，如在方法部分中所描述的。将肠系膜淋巴节细胞从个体鼠中分离，并制备单个细胞悬浮液(在24个培养皿板中，3×106细胞/培养皿)，仅用介质刺激(方形)，用20μg/毫升SEA(园形)，或用SEA和50μg/毫升的抗-CD4mAb(三角形)。如在方法部分所描述的，在刺激后72小时，通过ELISA测试培养物上清液中的所有细胞因子。符号表示个体鼠的值，条形图表示每组内的平均值。
图5Th2-类细胞因子mRNA表达在感染的IL-4缺损鼠的肝脏中减少，但没有受到IL-13阻断的影响。将C57BL/6WT及IL-4缺损(4KO)鼠用25只尾蚴(Schistosoma mansoni)感染，将隔离组的鼠用对照物-Fc或sIL-13Rα2-Fc治疗，如在方法部分中所描述的。在感染后8周将所有动物处死，并制备肝脏样品进行RT-PCR分析，如在方法部分所描述的。显示的数据是每组9到10只动物的个体值，条形图表示每组内的平均值。*符号表示数据显著地区别于通过学生测试所确定的WT对照物-Fc组(p＜.05)。对于每种细胞因子，五只未感染的WT鼠(黑色园形)和五只未感染的IL-4缺损鼠(空园)的平均值在Y-轴上显示。所有数据在其他试验中重现。
图6在用sIL-13Rα2-Fc-治疗的鼠的肝脏中胶原质I和胶原质IIImRNA表达减少，但没有受到IL-4缺损的影响。将C57BL/6WT及IL-4缺损(4KO)鼠用25只尾蚴(Schistosomamansoni)感染，将隔离组的鼠用对照物-Fc或sIL-13Rα2-Fc治疗，如在方法部分中所描述的。在感染后8周将所有动物处死，并制备肝脏样品进行RT-PCR分析，如在方法部分所描述的。显示的数据是每组9到10只动物的个体值，条形图表示每组内的平均值。*符号表示数据显著地区别于通过学生测试所确定的WT对照物-Fc组(p＜.05)。对于每种细胞因子，五只未感染的WT鼠(黑色园形)和五只未感染的IL-4缺损鼠(空园)的平均值在Y-轴上显示。所有数据在其他试验中重现。
图7在鼠科动物3T3成纤维细胞中IL-13诱导I类胶原质合成。用介质(1道)，1000单位/毫升的rIL-4(2道)或20ng/毫升rIL-13(3道和4道，分别从R&D，系统和遗传学研究院获得)刺激细胞48小时。将全部细胞裂解物在还原条件下在6％SDS-PAGE上分离，并转移到硝化纤维膜上用兔IgG抗-鼠I类胶原质探测。上部双峰和下部的带(箭头)对应在5道中分离的提纯田鼠胶原质I类(试验组A)。下部图(试验组B)是以光密度计的值(任意象素单位)。
本发明较好实施方案的详细描述本申请的发明者首次确定并提供编码IL-13R的IL-13结合链的多核苷酸(本文后面用“IL-13bc”)，没有限制地包括编码鼠科动物和人类IL-13bc的多核苷酸。
SEQ ID NO1提供了编码鼠科动物IL-13bc的cDNA的核苷酸序列。SEQ ID NO2提供了受体链的预定的氨基酸序列，包括从氨基酸1-21推定的信号序列。相信认为，成熟鼠科动物IL-13bc具有SEQ ID NO2的氨基酸22-383的序列。成熟鼠科动物受体链具有至少三个不同的域胞外域(包括SEQ IDNO2的约22-334氨基酸)，跨膜域(包括SEQ ID NO2的约335-356氨基酸)和胞内域(包括SEQ ID NO2的约357-383氨基酸)。
SEQ ID NO3提供了编码人类IL-13bc的cDNA的核苷酸序列。SEQ ID NO4提供了受体链的预定的氨基酸序列，包括从氨基酸1-25推定的信号序列。相信认为，成熟人类IL-13bc具有SEQ ID NO4的氨基酸26-380的序列。成熟人类受体链具有至少三个不同的域胞外域(包括SEQ ID NO4的约26-341氨基酸)，跨膜域(包括SEQ ID NO4的约342-362氨基酸)和胞内域(包括SEQ ID NO4的约363-380氨基酸)。
人类IL-13bc序列的前81个氨基酸与确定为“yg99f10.r1Homo sapiens cDNA克隆体416485”的表达序列标记(EST)的翻译序列相同，并指定数据库登记号为R52795.gb-est2。在会使此领域中的技术人员鉴别编码的蛋白质为细胞因子受体的这个EST序列中没有同源体或序列基元。对应这个数据库登录的cDNA克隆体是公众可从L.M.A.G.E.联盟获得的。在本申请的优先权日后，这种克隆体由申请人定购并测序。这种克隆体的序列确定为申请人以前公开的序列，本文中的SEQ ID NO3。
也可制备可溶形式的IL-3bc蛋白质。这种可溶形式没有限制地包括含有1-334氨基酸或22-334氨基酸的SEQ ID NO2的蛋白质或含有1-341氨基酸或26-341氨基酸的SEQ IDNO4的蛋白质。IL-13bc可溶形式的特点进一步在于在水溶液中是可溶的，较好地在室温下。也可制备仅包括胞内域或部分胞内域的IL-13bc蛋白质。少于全长的任何形式的IL-13bc都包括在本发明的范围内，并在本文中与全长和成熟形式集体地称为“IL-13bc”或“IL-13bc蛋白质”。少于全长的IL-13bc蛋白质可通过表达编码全长IL-13bc蛋白质的多核苷酸的对应片段来制备(SEQ ID NO1或SEQ ID NO3)。这些对应多核苷酸片段也包括在本发明中。如上面所描述的修饰多核苷酸可通过标准分子生物学技术来制备，包括构建适当的所需缺失突变体，定点诱变法或通过使用适当寡核苷酸引物的聚合酶链反应法。
对本发明来说，如果蛋白质具有下列一种或多种特性，则其具有“IL-13受体结合链的生物活性”(1)能结合IL-13或其片段(较好地是其生物活性片段)；和/或(2)能与IL-13R的第二条非IL-13结合链相互作用产生IL-13与IL-13R结合的信号特点。较好地，蛋白质所具有的生物活性是能结合IL-13或其片段，更好的是KD约为0.1到约100nM。确定一种具体蛋白质或肽是否具有这种活性的方法没有限制地包括本文所提供的实施例中所描述的方法。
IL-13bc或其活性片段(IL-13bc蛋白质)可与载体分子融合，如免疫球蛋白。如，可溶形式的IL-13bc可通过“接头”序列与免疫球蛋白的Fc部分融合。其他融合蛋白，如与GST，Lex-A或MBP的融合蛋白也可使用。
本发明还包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所列核苷酸序列的等位基因变体，即也编码IL-13c蛋白质的自然产生的可替换形式的SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的分离多核苷酸，较好地是具有IL-13bc生物活性的蛋白质。同样包括在本发明中的还有在高度严格条件下(如，0.1×SSC，65℃)与SEQ IDNO1或SEQ ID NO3所列核苷酸序列杂交的分离多核苷酸。编码IL-13bc蛋白质但由于遗传密码的简并与在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中所列的核苷酸序列不同的分离多核苷酸也包括在本发明中。由于点突变或通过诱导修饰产生的SEQ IDNO1或SEQ ID NO3中所列的核苷酸序列的变体也包括这本发明中。
本发明还提供了从其他动物物种编码鼠科动物和人类IL-13bc的同源物的多核苷酸，特别是其他哺乳动物物种。物种同源物可通过从本文所公开的鼠科动物或人类序列制备探针或引物来筛查适当物种的文库，如从相关物种的PBMC，胸腺或睾丸构建的文库来鉴别及分离。
为了重组制备IL-13bc蛋白质，本发明的分离多核苷酸可以可操作地与表达控制序列如pMT2或Kaufman等人在核酸研究19，4485-4490(1991)中公开的pED表达载体连接。许多适当的表达控制序列在此领域中是已知的。表达重组蛋白质的常用方法也是已知的，并在R.Kaufman的酶学方法，185，537-566(1990)中示例。如本文所定义的，“可操作地连接”意指酶学上或化学上连接以在本发明的分离多核苷酸和表达控制序列之间形成共价键，以这种方式，IL-13bc蛋白质被已用连接的多核苷酸/表达控制序列转化的(转染的)宿主细胞表达。
有多种类型的细胞可作为表达IL-13bc蛋白质的适用宿主细胞。任何能功能表达IL-13bc蛋白质的细胞种类都可使用。适当的哺乳动物宿主细胞包括，如猴子COS细胞，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，人类肾脏293细胞，人类表皮A431细胞，人类Colo205细胞，3T3细胞，CV-1细胞，其他转化的灵长类细胞系，正常双倍染色体细胞，从灵长类组织，灵长类外植体的体外培养物中衍生的细胞种系，HeLa细胞，鼠L细胞，BHK，HL-60，U937，HaK，Rat2，BaF3，32D，FDCP-1，PC12，M1x或C2C12细胞。
IL-13bc蛋白质也可通过可操作地将本发明的多核苷酸与适当的控制序列在一种或多种昆虫表达载体中连接，并使用昆虫表达系统来制备。用在杆状病毒/昆虫细胞病毒系统中的物料和方法可以试剂盒形式购到，如从Invitrogen，San Diego，加里弗尼亚州，美国(MaxBac试剂盒)，并且这种方法在此领域中也是众所周知的，如在Summers和Smith，德克萨斯州农业试验站公告No.1555(1987)中所描述的，该篇参考收入本文。如上面所描述的，可溶形式的IL-13bc蛋白质也可使用适当的分离多核苷酸在昆虫细胞中制备。
可替换地，IL-13bc蛋白质也可低等真核生物中制备，如酵母或在原核生物中制备，如细菌。适当的酵母菌株包括酵母(Saccharomyces cerevisiae)，人体酵母菌(Schizosaccharomycespombe)，科普属菌株(Kluyveromyces)，假丝酵母(Candida)，或任何能表达异种蛋白质的酵母菌株。适当的细菌菌株包括埃希氏杆菌属大肠杆菌(Escherichia coli)，杆状菌(Bacillussubtilis)，沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，或任何能表达异种蛋白质的细菌菌株。
在细菌中表达会导致形成掺入重组蛋白质的包含体。因此，为了制备活性或更具活性的物料需要重折叠重组蛋白质。从细菌包含体中获得准确重叠的异种蛋白质的多种方法在此领域中是已知的。这些方法通常包括从包含体中溶解出蛋白质，然后完全使用离液剂变性蛋白质。当在蛋白质的初级氨基酸序列中存在半胱氨酸残基时，常常需要在允许准确形成二硫键的环境中实施重折叠(氧化还原系统)。重折叠的常用方法在Kohno，酶学方法，185187-195(1990)中公开。EP0433225和共同待审申请USSN08/163,877中描述了其他适当的方法。
本发明的IL-13bc蛋白质也可表达为转基因动物的产品，如特点在于体细胞或种系细胞含有编码IL-13bc蛋白质的多核苷酸序列的转基因牛，山羊，猪或绵羊的奶的组成。
本发明的IL-13bc蛋白质也可通过在需要表达所需蛋白质的培养条件下培养转化宿主细胞培养物来制备。然后将产物表达蛋白质从培养介质或细胞提取物中提纯。本发明可溶形式的IL-13bc蛋白质也可从条件培养介质中提纯。本发明的膜结合形式IL-13bc蛋白质可通过从表达细胞中制备完全膜组分并用非离子清洁剂如TritonX-10提取膜来提纯。
IL-13bc蛋白质也可使用此领域中的技术人员已知的方法来提纯。如，本发明的IL-13bc蛋白质可使用购得的蛋白质浓缩过滤器，如Amicon或Millipore Pellicon超过滤单元来浓缩。在浓缩步骤后，浓缩物可加在提纯基质上，如凝胶过滤介质。可替换地，可使用阴离子交换树脂，如含有侧二乙氨乙基(DEAE)或聚乙烯亚胺(PEI)基团的基质或底物。基质可以是丙烯酰胺，琼脂糖，右旋糖苷，纤维素或其他常使用在蛋白质提纯中的基质种类。可替换地，也可使用阳离子交换步骤。适当的阳离子交换剂包括多种含有磺丙基或羧甲基基团的不溶基质。较好的是磺丙基基团(如S-琼脂糖柱)。从培养物上清液中提纯IL-13bc蛋白质也可包括一个或多个柱的步骤，经亲和柱如伴刀豆球蛋白-A-琼脂糖，肝磷脂-toyopearl或Cibacromblue 3GA琼脂糖；或使用树脂如苯基醚，丁基醚，或丙基醚的疏水作用层析；或通过免疫亲和层析。最后，使用疏水RP-HPLC介质，如含侧甲基或其他脂肪族基团的硅胶的一个或多个反相高效液相层析(RP-HPLC)步骤，也可用来进一步提纯IL-13bc蛋白质。依据已知方法，包含IL-13或其片段或包含IL-13bc蛋白质抗体的亲和柱也可使用在提纯中。一些或全部前述提纯步骤，以不同的组合或与其他已知方法一起，也都能用来提供基本上提纯的分离重组蛋白质。较好地，分离IL-13bc蛋白质是纯的，其基本上不含其他哺乳动物蛋白质。
本发明的IL-13bc蛋白质也可用来筛查能结合IL-13bc或IL-13R的试剂，或干扰IL-13与IL-13或IL-13bc结合的(胞外或胞内)并因此可作为正常结合及细胞因子作用的抑制剂(“IL-13R抑制剂”)的试剂。使用所需结合蛋白质的结合测试法，固定的或不固定的，在此领域中是众所周知的，并可使用本发明的IL-13bc蛋白质用作这种用途。基于提纯细胞的或基于提纯蛋白质的(不含细胞)的筛查测试可用来鉴别这样的试剂。如IL-13蛋白质可以提纯的形式固定在载体上，在存在或不存在潜在抑制试剂的情况下可测定与提纯IL-13bc蛋白质的结合。在适当的结合测试法中可替换地使用本发明可溶形式的IL-13bc。其中抑制剂可被筛查的系统的另一个实施例在下面的实施例2中描述。
在这种筛查测试中，通过将IL-13或其片段与IL-13bc蛋白质混合形成第一结合混合物，测定第一结合混合物(B0)中结合的量。通过将IL-13或其片段，IL-13bc蛋白质，和要进行筛查的化合物或试剂混合形成第二结合混合物，测定第二结合混合物(B)中的结合量。通过实施计算B/B0的比率，比较第一和第二结合混合物中的结合量。与第一结合混合物比较，如果在第二结合混合物中观察到结合减少，那么化合物或试剂就可认为能抑制结合。任意地，IL-13R的第二条链可加入到一种或两种结合混合物中。结合混合物的配制和优化在此领域中技术范围内。这样的结合混合物也可含有需要增强或优化结合的缓冲液和盐，其他控制测试也可包括在本发明的筛查测试法中。
发现减少IL-13bc蛋白质与IL-13或其片段结合活性到任何程度的化合物，较好地至少约10％，更好地大于约50％或更大，可以因此确定，然后可以在其他结合测试中和体内测试中辅助筛查。通过这些方法，可能适用作为治疗试剂的具有抑制IL-13bc结合活性的化合物可被鉴别出来。
IL-13bc蛋白质，和编码它们的多核苷酸，也可用作为诊断试剂，来检测IL-13bc，IL-13R，IL-13的存在或表达，或表达IL-13bc，IL-13R或IL-13的细胞。蛋白质或多核苷酸可在标准方法中用作这种用途，使用这些类型的物料进行诊断测试。适用的方法对此领域中的技术人员是众所周知的。
如本文所使用的，“IL-13R”是指IL-13bc和/或称为“IL-13Rα1”或“NR4”的第二条IL-13受体链(参看鼠科动物受体链，Hilton等人，Proc.Natl.Acad，Sci.USA1996，93497-501；人类受体链，Aman等人，生物化学期刊，1996，27129265-70，和Gauchat等人，欧洲免疫学期刊，1997，27971-8)。
IL-13bc可作为IL-13已知生物活性的中介体。因此，IL-13bc蛋白质(具体地，可溶IL-13bc蛋白质)，IL-13R抑制剂(即IL-13与IL-13R相互作用的拮抗剂(如，IL-13R的抗体(特别是IL-13bc或IL-13Rα1的抗体)和其片段，IL-13的抗体和其片段，可溶IL-13Rα1蛋白质，和IL-13与IL-13R之间相互作用的小分子和其他抑制剂))可用在治疗或调节与IL-13有关的或受到(或缺少)IL-13活性影响的多种医学病况(总称“与IL-13相关病况”)中。与IL-13R结合的IL-4的突变形式也可用作为IL-13拮抗剂(参看如，在Shanafelt等人，Proc，Natl.Acad.Sci.USA1998，959454-8；Aversa等人，试验医学期刊1993，1782213-8；和Grunewald等人，免疫学期刊1998，1604004-9中的公开内容)。
与IL-13有关病况没有限制地包括Ig介导病况和疾病，具体地是IgE介导病况[没有限制地包括遗传性过敏，过敏病况，哮喘，免疫复合疾病(如狼疮，肾病侯症，肾炎，血管球性肾炎，甲状腺炎，和Grave症)]；肺的炎性病况；造血祖细胞特异缺损，免疫缺损，或与其相关的病变；癌症和其他疾病。这样的病理状况也可能产生于疾病，暴露于放射或药物，包括如，白血球减少症，细菌或病毒感染，贫血，B细胞或T细胞缺损如骨髓移植后的免疫细胞或造血细胞缺损。由于IL-13抑制巨噬细胞活化作用，IL-13bc蛋白质也可用来增强巨噬细胞活化作用(即，疫苗接种，治疗分枝杆菌或胞内微生物，或寄生物感染)。
IL-13bc蛋白质也可用来增强IL-13在体内和体外的作用。如，IL-13bc蛋白质可与具有IL-13活性的蛋白质结合(较好地是IL-13)，产生的结合物可与表达除了IL-13bc外至少一条IL-13R链的细胞接触(较好地，除了IL-13bcIL-13R的所有链，如IL-13Rα1)。较好地，接触步骤通过给哺乳动物受试体体内服用治疗上有效量的这种结合物。预先建立的IL-13蛋白质与IL-13bc蛋白质的联系会协助形成特有信号需要的完全IL-13/IL-13R复合物。参看如Econlmides等人描述的方法，科学2701351(1995)。
IL-13bc蛋白质和IL-13R抑制剂，从细胞提纯的或重组制备的，当与药物可接受的载体结合时可用作为药物组合物。除了IL-13bc或抑制剂和载体外，这样的药物组合物可包括多种稀释剂，填充剂，盐，缓冲液，稳定剂，溶剂，和其他此领域中众所周知的物料。“药物可接受的”意指不干扰活性成分的生物活性效力的无毒性物质。载体的特点取决于服用途径。
本发明的药物组合物也可含有细胞因子，淋巴因子，或其他造血因子如M-CSF，GM-CSF，白细胞介素(如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4....IL-24，IL-25)，G-CSF，干细胞因子，和促红细胞生成素。药物组合物还可包括抗-细胞因子抗体。药物组合物进一步可包括其他抗-炎性试剂。这些其他因子和/或试剂可包含在药物组合物中以与分离IL-13bc蛋白质或IL-13抑制剂一起产生配合效用，或减少由分离IL-13bc或IL-13抑制剂产生的副作用。相反地，分离的IL-13bc或IL-13bc抑制剂可包含在特别细胞因子，淋巴因子，其他造血因子，溶血栓因子或抗血栓形成因子，或抗炎性试剂的配方中，以降低细胞因子，淋巴因子，其他造血因子，溶血栓因子或抗血栓形成因子，或抗炎性试剂的副作用。
本发明的药物组合物可以是脂质体形成的，其中除了其他药物可接受的载体外，分离的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂与两性分子试剂如脂质结合，两性分子以集合形式如微团，不溶单层，液晶，或在水溶液中的薄片层存在。适于脂质体配方的脂质包括，没有限制地，单酸甘油酯，甘油二酯，硫脂，溶血卵磷脂，磷脂，皂角苷，胆酸等等。制备这种脂质体配方在此领域的技术范围内，如在美国专利No.4,235,871；美国专利No.4,505,729；美国专利No.4,837,028；和美国专利No.4,737,323中所公开的，这些文献的全部内容都通过在此引述而收入本篇。
如本文所使用的“治疗上有效量的”意指足以显示显著患者受益的，如改善病况症状，治愈病况，或加快治愈病况的药物组合物或方法中的每种活性成分的总量。当使用在个体活性成分单独服用情况时，术语是指单独的成分。当使用在组合情况时，不论是连续地或同时组合服用，术语是指产生治疗效果的活性成分的组合量。
在实施本发明的治疗或应用方法中，给哺乳动物服用治疗上有效量的分离IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂。依据本发明的方法，分离IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂可单独服用或与其他治疗试剂如使用细胞因子，淋巴因子或其他造血因子的治疗物一起服用。当与一种或多种细胞因子，淋巴因子或其他造血因子一起服用时，IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂可与细胞因子，淋巴因子，其他造血因子，溶血栓因子或抗血栓形成因子同时服用，或顺序服用。如果顺序服用，主治医生会决定服用IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂以及细胞因子，淋巴因子，其他造血因子，溶血栓因子或抗血栓形成因子的适当顺序。
服用使用在药物组合物中的或用来实施本发明的方法的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂可通过多种传统方式实施，如口服摄入，吸入，或经皮肤，皮下注射，或静脉内注射。较好的是给患者静脉内服药。
当治疗上有效量的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂口服用药时，IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂可以是片剂，胶囊，粉末，溶液或西也剂形式的。当以片剂形式服用时，本发明的药物组合物可额外含有固体载体如凝胶或辅剂。片剂，胶囊，和粉末含有从约5到95％的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂，较好地，含有从约25到95％的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂。当以液体形式服用时，可加入液体载体如水，石油，动物或植物油如花生油，矿物油，豆油，或芝麻油，或合成油。液体形式的药物组合物可进一步含有生理盐水溶液，葡萄糖或其他糖类溶液，或乙二醇类如乙二醇，丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式服用时，药物组合物含有从约0.5到90％重量比的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂，较好地含有从约1到50％的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂。
当治疗上有效量的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂通过静脉内，皮肤或皮下注射用药时，IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂是不含热原质的，注射可接受的水溶液形式的。制备这种注射可接受的蛋白质溶液，具有适当的PH，等张性，稳定性等，在此领域的技术范围内。静脉内，皮肤，或皮下注射用的较好的药物组合物应含有，除了IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂外，等张载体如氯化钠注射液，Ringer注射液，葡萄糖注射液，葡萄糖和氯化钠注射液，乳酸盐Ringer注射液，或其他此领域中已知载体。本发明的药物组合物也可以包括稳定剂，防腐剂，缓冲液，抗氧化剂，或其他此领域中的技术人员已知的添加剂。
在本发明的药物组合物中的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂的量取决于要治疗的病况的性质和严重性，取决于患者已进行的预先治疗的性质。最终，主治医生会决定治疗每位个体患者使用的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂的量。起初，主治医生给患者服用少量IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂，并观察患者反应。较大剂量的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂可给患者服用直到患者获得最佳治疗效果，在这个点上剂量就不再增加了。考虑认为，用来实施本发明的方法的多种药物组合物应含有约0.1μg到约100毫克(较好的约20μg到约50μg)每公斤体重的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂。
使用本发明的药物组合物进行静脉治疗的持续时间将取决于要治疗疾病和病况的严重性和每个个体患者的潜在特殊反应。考虑认为，IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂每次应用的持续时间在连续静脉用药的12到24小时范围内。最终，主治医生决定使用本发明的药物组合物进行静脉治疗的适当持续时间。
本发明的IL-13bc蛋白质也可用来免疫接种动物以获得与IL-13bc蛋白质特异反应的及可能抑制IL-13或其片段与受体结合的多克隆和单克隆抗体。这些抗体可使用完整的IL-13bc作为免疫原获得，或通过使用IL-13bc片段，如溶解的成熟IL-13bc来获得。较小片段的IL-13bc也可用来免疫接种动物。肽免疫原可额外地在羧基末端含有一个半胱氨酸残基，并与半抗原如匙孔戚血蓝蛋白(KLH)缀合。其他肽免疫原可通过用硫酸化酪氨酸残基替换酪氨酸残基来制备。合成这些肽的方法在此领域中是已知的，如参看，R.P.Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85，2149-2154(1963)；J.L.Krstenansky等人，FEBS Lett.211，10(1987)。
与IL-13bc蛋白质结合的中和抗体或非中和抗体(较好的是单克隆抗体)也可作某些肿瘤的治疗试剂，并使用上述病况的治疗中。这些中和单克隆抗体能阻断IL-13与IL-13bc结合。
本发明的实施例实施例1分离IL-13bc cDNA分离鼠科动物IL-13受体链从6-8周大的C3H/HeJ鼠的胸腺制备5ug polyA+RNA。依据制造商指示使用Stratagene cDNA合成试剂盒制备双链，半甲基化的cDNA。简单地，第一条链用寡T-Xho引物诱导，在第二条链合成后，加入EcoRI衔接子，将cDNA用XhoI消化，并提纯。依据制造商的指示，将cDNA连接到Zap表达(Stratagene)λ载体的XhoI-EcoRI位点上，并使用Gigapak IIGold包装提取物(Stratagene)包装。依据制造商的指示，将1.5×106产物重组噬菌体的文库扩增。如描述的(分子生物学的当前技术，Ausubel等人，编辑，John Wiley and Sons，1995，6.4.3部分)，使用标准TMAC杂交条件用序列KSRCTCCABKCRCTCCA(SEQ ID NO5)(K＝G+T；S＝C+G；R＝A+G；B＝C+G+T)的简并17mer寡核苷酸探针筛查文库。由于克隆体A25与17mer探针杂交，但不与从已知的血红细胞生成素衍生的探针杂交，所以其被鉴别出。依据制造商指示将这种克隆体从Zap表达载体中分离成质粒形式，确定DNA序列。DNA序列编码血红细胞生成素受体家族新成员。
1996年2月22日，将含有具有SEQ ID NO1序列的多核苷酸的克隆体A25保藏在ATCC为pA25Pbkcmv，保藏号69997。分离人类IL-13受体链使用从鼠科动物序列衍生的寡核苷酸通过PCR分离鼠科动物受体的人类同源物的部分片段。从Clontech获得的人类睾丸polyA+RNA制备cDNA。在含有1.5mM氯化镁的1×Taq缓冲液中，经30个周期温育(94℃×1分钟，42℃1分钟，72℃1分钟)，使用AmpliTaq聚合酶(Promega)，使用下列寡核苷酸，通过PCR从cDNA扩增274个碱基对的DNA片段ATAGTTAAACCATTGCCACC(SEQ ID NO6)和CTTCCATTCGCTCCAAATTCC(SEQ ID NO7)。确定这个片段的DNA序列，用下列序列从这个片段的中间部分制备两个寡核苷酸AGTCTATCTTACTTTTACTCG(SEQ ID NO8)和CATCTGAGCAATAAATATTCAC(SEQ ID NO9)。将这些寡核苷酸用作探针来筛查从CLONTECH购得的人类睾丸cDNA文库(目录#HL1161)。使用标准5XSSC杂交条件在52℃进行滤膜杂交，并在52℃在2×SSC中冲洗。在筛查的400,000个克隆体中分离出与两个寡核苷酸都杂交的22个克隆体。从4个cDNA克隆体中确定DNA序列，所有都编码相同的新型血红细胞生成素受体。全长人类受体链的预计DNA序列如SEQ IDNO3所示。
1996年2月22日，将人类克隆体保藏在ATCC为pA25pDR2，保藏号69998。
实施例2表达可溶IL-13bc蛋白质并测试活性制备并提纯可溶IL-13bc-Ig通过PCR，将编码鼠科动物IL-13bc的胞外域的氨基酸1-331的DNA与编码gly-ser-gly的间隔序列融合，并与编码COS-1表达载体pED.Fc的人类IgG1的铰链区域CH2CH3的序列连接在框内。IL-13bc-Ig从DEAE-右旋糖苷转染的COS-1细胞中制备，并通过蛋白质A琼脂糖层析提纯(Pharmacia)。B9增殖测试通过将3H-胸腺嘧啶掺入到DNA中测定IL-13或IL-4对B细胞增殖的刺激作用(Aarden等人，欧洲免疫学期刊1987，171411-1416)。在存在或不存在1μg/毫升的IL-13bc-Ig的情况下，将细胞(5×103细胞/培养皿)接种在96培养皿板上的含有不同浓度生长因子的介质中。温育三天后，加入1μCi/培养皿3H-胸腺嘧啶，再将细胞温育4小时。使用LKB1205板读取仪确定掺入放射活性。
IL-13，IL-4或IL-6刺激B9细胞增殖。仅仅对IL-13的反应受到可溶IL-13-bc-Ig的抑制，说明这种受体特异结合IL-13，不结合IL-4或IL-6。表格表示cpm。演示了两个不同试验。
表I
表II
实施例3通过表面胞质团共振(Biacore分析)测定可溶IL-13bc与IL-13的直接结合Biacore生物感应器用来测定IL-13与提纯的IL-13bc-Ig的直接特异结合(Pharmacia，Johnsson等人，1991)。依据制造商的推荐，在感应器芯片上约10,000到17,000共振单位(RU)的提纯的IL-13bc-Ig，人类IgG1或不相关受体每种共价固定在不同的流式细胞上。(RU是结合感应器芯片表面蛋白质的量的反映)。在存在或不存在过分提纯的IL-13bc-Ig的情况下，将提纯的IL-13以5ul/分钟经10分钟注射穿过流式细胞。根据样品注射前和后RU的不同定量结合作用。仅对固定的IL-13bc-Ig观察到481.9RU的特异IL-13结合，而共注射IL-13加IL-13bc-Ig没有发生与固定IL-13bc-Ig的结合(4RU)。对于固定IgG或IL-11R-Ig没有观察到IL-13结合(分别为5.4和3.7RU)。
实施例4在COS细胞中表达的IL-13与标记IL-13bc-Ig融合蛋白质结合用IL-13bc-Fc进行IL-13的COS原位检测通过DEAE-右旋糖苷方法在重复试验板上将IL-13，IL-4，IL-11的表达载体或空载体转染到COS-1细胞中。两天后，将转染细胞在磷酸缓冲液盐水(PBS)中冲洗两遍，在4℃用甲醇将转染细胞固定在培养物碟中10分钟。接着，用PBS冲洗两遍固定细胞，然后用结合缓冲液(PBS，1％(w/v)牛血清清蛋白，1％(w/v)叠氮化钠)漂洗，在4℃在结合缓冲液中与10μg/毫升的IL-13bc-Fc或与相关的抗-细胞因子抗血清一起温育2小时。用PBS冲洗细胞两遍，并在4℃在释比为1∶500的碱性磷酸酶标记兔F(ab)2’抗人类IgG的结合缓冲液(用作融合检测)中或兔F(ab)2’抗田鼠IgG(用作抗细胞因子检测)中摇动温育。将细胞再次在PBS中冲洗两遍。使用硝基蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸视觉观察碱性磷酸酶活性。
在显微镜下观察特异结合。仅用IL-13转染的细胞表现出与IL-13bc-Ig的特异结合。(参看转染细胞的照片，图)。
实施例5确定IL-13bc蛋白质生物活性的其他系统其他系统也可用来确定是否特异IL-13bc蛋白质表现出如本文所描述的IL-13bc的“生物活性”。下列为这种系统的实施例。测试IL-13结合IL-13bc蛋白质与IL-13或其片段结合的能力可通过任何能检测这种结合的测试法确定。一些适当的实施例如下。
IL-13与IL-13bc蛋白质的胞外域的结合会在受体蛋白质上特异产生磷酸酪氨酸的快速诱导。如下描述通过测量诱导磷酸化作用测试配体结合活性。
可替换地，制备IL-13bc蛋白质(如，胞外域的可溶形式)并用来检测IL-13结合。如，制备DNA构建，其中胞外域(在预定的跨膜区域之前截短，较好的是之前立即截短)在框内与编码人类免疫球蛋白(IgG)γ1的铰链CH2和CH3区域的DNA连接。这种构建产生在COS细胞的适当表达载体中，如pEDΔC或pMT2。将质粒瞬间转染到COS细胞中。将分泌的IL-13bc-Ig融合蛋白质收集到条件介质中并通过蛋白质A层析提纯。
在很多应用中提纯的IL-13bc-Ig融合蛋白质用来演示IL-13结合。IL-13可覆盖在酶联免疫吸附测定(ELISA)板的表面上，然后使用标准ELISA缓冲液用牛血清清蛋白或酪蛋白阻断额外的结合位点。然后将IL-13bc-Ig融合蛋白质与固相IL-13结合，用与山葵过氧化酶缀合的次级山羊抗人类Ig检测结合。特异结合酶的活性可用比色底物如四甲基对二氨基联苯和吸光度读取仪测定。
IL-13也可表达在细胞表面，如通过提供跨膜域或糖基磷脂酰肌醇(GPI)键。使用IL-13bc-Ig融合蛋白质可检测表达膜结合IL-13的细胞。可溶形式的IL-13bc-Ig融合蛋白质结合在这些细胞的表面，并用与荧光染料如异硫氰酸荧光素缀合的山羊抗人类Ig和流式细胞计量仪来检测。相互作用阱酵母遗传选取法，“相互作用阱”[Gyuris等人，细胞75791-803，1993]，可用来确定是否IL-13bc蛋白质具有如本文所描述的IL-13bc的生物活性。在这个系统中，LexAop-Leu2和LexAop-LacZ的受体基因表达依赖于饵蛋白质，如在这种情况下是与人类IL-13bc相互作用的物种，和被捕获者，如在这种情况下是人类IL-13bc蛋白质，之间的相互作用。因此，可通过Leu2或LacZ表达的量来测定相互作用的强度。最简单的方法是测定LacZ编码蛋白质，β-牛乳糖的活性。这种活性可通过含介质或填充剂的X-Gal上的蓝色度来判断。对于定量测定β-牛乳糖的活性，标准测试法可在“酵母遗传学方法”中找到，冷泉港，纽约，1990(Rose，M.D.，Winston，F.，和Hieter，P.)。
在这些方法中，如果想确定IL-13bc蛋白质是否与具体物种(如，在体内结合IL-13bc的胞内域的胞质蛋白)相互作用，在与要进行检测的用作为“被捕获者”的IL-13bc蛋白质的相互作用阱中，这种物种可用作为“饵”，或反过来。
实施例6使用可溶IL-13R抑制纤维化纤维性组织的发展是受伤后正常愈合过程中的一个部分。然而，在一些情况中，存在影响受损组织正常功能的过量胶原质的破坏性集聚。确实，胶原质合成及组织结疤是多种慢性和衰弱疾病，包括一些自身免疫性，过敏性，和感染疾病1-7的主要病理表现。然而涉及疤痕组织形成的过程有大量的机理信息，在我们了解启动纤维化过程中炎性细胞和细胞因子的作用方面仍有很大的差距。
如本文所使用的，“纤维化”包括涉及纤维性组织形成(无论这样的形成是需要的还是不需要的)的任何病况。这种病况没有限制地包括，纤维瘤(瘤样纤维组织增生)，纤维发生(包括肺部纤维发生)，纤维弹性组织增生(包括心内纤维弹性组织增生)的形成，纤维肌瘤，纤维性僵硬的形成，纤维瘤的形成，纤维性瘤的形成，纤维粘液瘤的形成，和fibrocystotitis(包括囊性纤维化)。
IL-13受体复合物由至少三个不同的成分组成，包括IL-4受体，低亲和力IL-13Rα1链，和高亲和力结合链，IL-13Rα235，42-44。目前，已制备可溶IL-13Rα2-Fc融合蛋白并已成功地用来在体内30，39-41和体外35中和IL-13。由于融合蛋白以高亲和力结合IL-13，但不中和IL-4，蛋白质提供了出色的工具来确定IL-13的特异作用。在目前的研究中，为了仔细研究鼠科动物血吸虫病中IL-13和IL-4在肝纤维化发展中的作用，我们在野生型和IL-4缺损鼠中使用IL-13拮抗剂。在这些研究中，详细地测定肉芽肿的形成，集中注意在噬曙红细胞和肥大细胞募集上，更重要的是，使用生物化学，组织学，和分子技术定性虫卵-诱导纤维化的发展。我们还检测了IL-4和IL-13对在体外，在肠系膜淋巴节培养物中和在体内，在肉芽肿肝中调节Th1/Th2类细胞因子反应的作用。这项研究的结果显示，IL-13和IL-4在血吸虫病发病机理中表现出一些丰余的活性，两种细胞因子的不同功能也清楚地阐明了。可能最重要和新鲜的发现是，观察到在受感染的鼠中IL-13是促使I类和III类胶原质mRNA产生及肝纤维化的主要Th2类细胞因子，而不是IL-4。因此，我们的发现确立了IL-13抑制剂/拮抗剂，如sIL-13Rα2-Fc，在预防纤维化如，涉及慢性感染性疾病的纤维化方面可起到治疗作用。结论比较在血吸虫病发病机理中IL-4，IL-13或IL-4/IL-13双重缺损的影响sIL-13Rα2-Fc治疗显著地减少S.mansoni感染的鼠中的肝纤维化为了比较IL4和IL-13在血吸虫病发病机理中的调节作用，我们用25个S.mansoni经皮感染了C57/BL/6WT和IL-4缺损鼠。如在物料和方法中所描述的，隔离组动物用sIL-13Rα2-Fc或用对照物-Fc治疗。治疗开始于第5周，开始产卵时，感染8周后将所有动物处死，测定几种寄生学和免疫学参数。如在表III中所示，所有四组鼠带有相同虫含量，每对虫产生的组织虫卵在组中没有变化。在感染后8周，组织反应峰值的时间45，WT鼠没有显示由于IL-13阻断肉芽肿大小的显著变化(图2A)。有趣的是，对照物-Fc治疗的IL-4缺损鼠也没有显示减轻的肉芽肿反应，而实际上，在这些鼠中肉芽肿显著地增大了。与这些观察结果显著不同，当IL-13受到抑制时，IL-4缺损鼠表现出显著减轻的肉芽肿反应(如2A，最右边)。确实，当与用对照物或用sIL-13Rα2-Fc治疗的WT动物比较时，双重IL-4缺损/sIL-13Rα2-Fc治疗的鼠表现出肉芽肿体积平均减小40到50％，当与用对照物-Fc治疗的IL-4缺损鼠比较时，肉芽肿体积减小多于75％。
如在表III中所示，在Giemsa-染色的肝脏切片中也评定了损伤的细胞组合物，IL-4缺损鼠表现出与肉芽肿有关的肥大细胞的显著减少。相反，仅有IL-13的抑制作用没有肥大细胞数量上的改变，IL-13阻断没有额外地影响IL-4缺损鼠中已经大量减少的肥大细胞数量。有些相同的是，当评定与肉芽肿有关的噬曙红细胞时仍然观察到明显不同的发现(图2B)。这里，由于IL-13阻断WT鼠中噬曙红细胞的数量从46％增加到64％，而由于IL-4缺损WT鼠中噬曙红细胞显著地减少了(28％)。尽管在组织噬曙红细胞中IL-13和IL-4有明显相反的作用，当用IL-13抑制剂治疗IL-4缺损鼠时，观察到了甚至更显著的组合抑制作用。在这些鼠中，肉芽肿噬曙红细胞的平均数量降低10％。最后，与IL-4缺损鼠相比，WT鼠中实质的或与虫卵有关的肝脏坏死的程度没有改变，而sIL-13Rα2-Fc治疗的WT和IL-4缺损组显示出全面实质坏死的显著下降。
也许最重要的是，仅用sIL-13Rα2-Fc治疗就可显著地减少WT鼠中肝脏肉芽肿的胶原质含量，如在用picrosirius红染色的组织切片中测定的(表III和图3)。相反，通过显微镜分析，感染的IL-4缺损鼠没有显示出可检测的肉芽肿胶原质沉积方面的变化。有趣的是，由于sIL-13Rα2-Fc治疗的WT和IL-4缺损鼠之间没有显著的区别，在这个参数上IL-13和IL-4似乎没有组合的或协同的作用(表III)。图3显示，虽然在对照物和sIL-13Rα2-Fc治疗的WT鼠中发现相似的虫数量，组织虫卵含量，和肉芽肿大小，但IL-13阻断对肝脏内胶原质沉积有显著的抑制作用。最后，通过测定羟基脯氨酸的量测定了肝脏纤维化的程度(图2C)，其比上面描述的组织学技术更具定量性。仅可溶IL-13拮抗剂就可显著地降低肝脏羟基脯氨酸的量，而IL-4缺损仅产生较小的显著性降低。双重IL-4/IL-13缺损也没有将羟基脯氨酸的量降低到低于在sIL-13Rα2-Fc治疗的WT鼠中已观察到的量(图2C)，尽管在另一次研究中有了些许倾向(不显著)。总之，这些数据说明，在鼠科动物血吸虫病中IL-13是对肝脏纤维化发展起作用的支配性Th2相关细胞因子。
在IL-4缺损鼠中Th2类细胞因子的产生减少，但没有受到IL-13抑制作用的影响虽然，众所周知IL-4是促使CD4+Th2细胞发育的主要细胞因子21，22，但IL-13在产生及维持Th2类反应中的作用一直在争论，并可能受到实施研究的宿主遗传学和感染性疾病模式的影响30，34，38。因此，为了确定在肝脏病理学中sIL-13Rα2-Fc诱导的变化是否由Th1/Th2细胞因子平衡的改变而产生的，我们从感染鼠中制备出分离的肠系膜淋巴节和脾脏，制备单细胞悬浮液，并在体外用寄生抗原重新刺激培养物。其他细胞培养物在存在抗-CD4mAb的情况下暴露给寄生抗原，以确定细胞因子产生是否依赖于CD4+T细胞反应。通过ELISA分析培养物上清液的IL-4，IL-13，IL-5，IL-10和IFN-γ。如可预计的15，从WT鼠制备来的肠系膜(图5)和脾脏培养物(数据未显示)显示出高度极化的Th1-类细胞因子反应。应SEA刺激，它们产生高含量的IL-4，IL-5，IL-10，和IL-13，和很少或没有IFN-γ。相反，IL-4缺损鼠显示出更混杂的Th1/Th2类分布。确实，在IL-4缺损鼠中检测到显著的SEA-特异IFN-γ反应，这与预先的研究一致23，24。尽管当与WT鼠相比时，这些细胞因子的量显著地减少了，但IL-13，IL-10，和较小量的IL-5还能在这些动物中检测到。重要的是，保持弱的但显著与IL-4无关的IL-13反应可能能解释在不存在IL-4时保持的显著的肉芽肿反应(图2)。令人惊异地，尽管sIL-13Rα2-Fc对肝脏纤维化有显著的抑制作用，但在WT或IL-4缺损鼠中它对Th1或Th2类细胞因子反应没有显著的影响。还应注意的是，在所有情况中，细胞因子产生高度依赖于CD4+T细胞反应，因为在任何抗-CD4mAb治疗的SEA-刺激培养物中只有很少或没有细胞因子表达可检测到。
IL-4缺损鼠和sIL-13Rα2-Fc治疗的鼠的肉芽肿肝脏中Th1/Th2类细胞因子mRNA表达的变化为了确定相似模式的细胞因子表达是否能在体内肉芽肿形成部位观察到，我们在感染后8周从不同组的鼠中分离肝脏mRNA，并实施定量RT-PCR。如图5中所示，感染的WT鼠表现出强烈的Th2类细胞因子mRNA分布，显示IL-4，IL-13，IL-5和IL-10mRNA显著增加。WT鼠还显示IFN-γmRNA表达的适度增加，这与以前的观察结果一致19。与这些发现不同的是，在IL-4缺损鼠中IL-13和IL-15mRNA的量非常低，而IL-10和TNF-αmRNA显著增加，IFN-γmRNA表达没有变化。再有，与从肠系膜淋巴节和脾脏细胞培养物获得体外结果相同，IL-13阻断没有显著地影响WT或IL-4缺损鼠中细胞因子mRNA表达的模式。然而，在用sIL-13Rα2-Fc治疗的IL-4缺损鼠中IL-10mRNA有适度的增加，尽管这不可能来解释纤维化的降低，因为与IL-4缺损鼠相比在sIL-13Rα2-Fc治疗的WT鼠中检测到高度不同量的IL-10，仍检测到相同的纤维化下降。在肉芽肿组织中还检测到TGF-β1和TGF-β2mRNA表达，然而在感染的IL-4缺损鼠或用sIL-13Rα2-Fc治疗的动物中没有检测到显著的不同(数据未显示)。
在sIL-13Rα2-Fc治疗的鼠的肝脏中胶原质I和胶原质IIImRNA量减少，但没有受到IL-4缺损的影响上述体内和体外细胞因子的研究表明sIL-13Rα2-Fc的抗-纤维化作用不可能用Th1或Th2类细胞因子表达的变化来解释。因此，在随后的试验中，我们研究了胶原质I(Col I)和胶原质III(Col III)mRNA表达，确定sIL-13Rα2-Fc诱导纤维化减少是否是通过直接改变这两种重要的胶原质产生基因的表达来实施19。如图6所示，在WT和IL-4缺损鼠中，IL-13阻断显著地减少了Col I和Col III mRNA表达。IL-4缺损鼠中感染诱导的Col I和Col III mRNA没有改变，当与sIL-13Rα2-Fc治疗的WT鼠相比时，在同样治疗的IL-4缺损鼠中没有进一步的减少。
在鼠3T3成纤维细胞中IL-13刺激胶原质的产生已显示，在感染的WT和IL-4缺损鼠的肝脏中，IL-13阻断作用在体内显著地减少了Col I和Col III mRNA的表达，为了确定IL-13是否会直接刺激成纤维细胞中胶原质的合成，为了解决这个问题，通过Western印迹法检测鼠科动物3T3成纤维细胞中胶原质I的诱导。如图7所示，刺激作用后48小时IL-13诱导胶原质合成。在未刺激的细胞中(图7，1道)或在较早期时间点上在细胞因子活化的培养物中(数据未显示)检测到最小量的胶原质I类。IL-4也诱导胶原质I的合成(2道)，在从细胞因子刺激的培养物(数据未显示)获得的上清液中可容易地测到大量的分泌的胶原质。反应的特异性通过使用提纯的胶原质I类(5道)证实，细菌胶原酶治疗显示抗体对胶原质特异(数据未显示)。讨论在用S.mansoni感染的鼠中CD4+Th2类细胞因子模式支配着免疫反应12，13。然而，以前使用IL-4缺损鼠的IL-4缺损研究和试验没有显示在血吸虫病发病机理中这种细胞因子的不可缺少的作用15，23，24。确实，在一些研究中观察到纤维化的部分减少15，在完全不存在IL-4的情况下虫卵诱导肉芽肿形成可以进行23，24。与这些观察结果不同的是，在Stat6缺损的鼠中肉芽肿形成和肝脏纤维化发展被严重地削弱了16，其表现出在几种Th2-相关细胞因子的产生方面的主要缺陷46。IL-4和IL-13都通过Stat6发信号，因此在感染的IL-4缺损鼠和Stat6-缺损鼠之间观察到的病理学上的显著不同可能由IL-13解释。然而，IL-4和IL-13在疾病发展中的不同作用仅从Stat6或IL-4缺损鼠试验中不能解释清楚。在这项研究中，在感染的WT鼠和IL-4缺损鼠中使用了IL-13的有效抑制剂，显示在血吸虫病的发病机理中IL-13和IL-4表现出丰余，并独特的作用。
一些研究已显示，在体内不存在IL-4或IL-4受体的情况下，Th2类细胞因子反应能发展，这与我们的发现是一致的，因为在感染的IL-4缺损鼠的肝脏(图5)和肠系膜淋巴节(图4)中检测到减少的但显著的IL-13，IL-10，和IL-5的表达。它们的产生也高度依赖于CD4+T细胞反应(图4)，进一步说明常规的Th2类反应建立。这些发现提供证明，虽然最大的IL-13表达依赖于IL-4，但连续产生IL-13可能能解释在不存在IL-4的情况下显著肉芽肿反应的保持23-25。确实，虽然在WT鼠中仅IL-13对肉芽肿大小没有影响，但在IL-4缺损鼠中抑制残留的IL-13导致肉芽肿体积显著并高度显著减小(图2A)。这些发现说明IL-4和IL-13都足以调节肉芽肿的发展，并可正式地解释在IL-4缺损鼠中产生肉芽肿而在Stat6-缺损鼠中几乎完全缺少肉芽肿16，24。这些发现也支持在肺部虫卵肉芽肿模式中当前的发现30。因为肉芽肿通过阻挡由虫卵释放的致命的肝毒素而起到重要的宿主保护性作用，为了确保有益的宿主-寄生物关系，宿主可能已发展了肉芽肿形成的丰余的机理。
当这些观察结果清楚地说明了IL-4和IL-13积极地参与了肉芽肿形成，在肥大细胞募集，组织噬曙红细胞中，最重要的是在肝脏纤维化形成中两种细胞因子的独特作用这些研究中也被揭示了。从感染鼠获得的肝脏切片的组织学检测显示，IL-13不是肥大细胞(表III)或噬曙红细胞(图2B)分化及募集所需的，因为sIL-13Rα2-Fc治疗的WT鼠的肉芽肿显示两种细胞类型都没有减少。事实上，在IL-13抑制的WT鼠的伤痕中噬曙红细胞数量显著地增加了(图2B)，说明IL-13可能部分地拮抗这种作用。相反，在IL-4缺损鼠中肥大细胞几乎完全不存在，噬曙红细胞减少了超过50％。有趣的是，在IL-4缺损鼠中IL-3显示部分支持减少的但显著的虫卵诱导组织噬曙红细胞过多，因为在IL-4缺损/sIL-13Rα2-Fc治疗的动物中噬曙红细胞减少到低于10％。然而，这些数据说明在肉芽肿内对于噬曙红细胞和肥大细胞的发展，IL-4是支配细胞因子。
可能这些研究获得的最重要的先进性是，发现肝脏纤维化可受到sIL-13Rα2-Fc的阻断。确实，显微镜技术(表III)，生物化学技术(图2C)，和分子技术(图6)都显示，是IL-13，不是IL-4，在虫卵诱导的肝脏纤维化发展中起到关键作用。以前的研究显示，Th1/Th2细胞因子平衡能显著地影响S.mansoni感染的鼠的组织纤维化程度19。然而，这项研究表明，sIL-13Rα2-Fc的作用不是通过扭曲Th细胞细胞因子反应来调节的。阻断IL-13对肠系膜淋巴节(图4)或脾脏细胞体外产生IFN-γ，IL-4，IL-5，IL-10或IL-13没有显著影响，在伤痕形成部位上(图5)体内细胞因子mRNA表达也没有改变。与这些观察结果不同的是，IL-4缺损鼠显示在排出淋巴节中IFN-γ反应增加(图4)，在淋巴节(图4)和肝脏(图5)中IL-5和IL-13表达减少。因此，通过羟基脯氨酸分析在IL-4缺损鼠中检测到纤维化少许减少(图2C)可能是由于IL-13产生减少。IL-4产生不受IL-13阻断的影响，在这些动物中纤维化仍最大量地减少，这个事实强调了IL-13所起的重要作用。确实，用sIL-13Rα2-Fc治疗的IL-4缺损鼠比起来在相同治疗的WT鼠中观察到的，显示出了羟基脯氨酸量的额外的少许减少(图2C)，但在胶原质I或III mRNA表达方面没有不同(图6)。当与WT动物相比时，对照物Fc-治疗的IL-4缺损鼠中胶原质I或III mRNA表达也没有改变，进一步强调了IL-4的作用。并且，在用3T3细胞进行的体外研究第一次显示IL-13能刺激成纤维细胞中的胶原质产生(图7)，因此IL-13对纤维化的影响可以更直接，并且不依赖于Th1/Th2细胞因子反应的调制。为了支持这个结论，最近的研究显示IL-13受体在成纤维细胞上表达32，并且IL-13增加了人类肺成纤维细胞中粘着分子和炎性细胞因子的表达48。最后，尽管IL-13(图7)和IL-449都能促进成纤维细胞中的胶原质产生，培养的淋巴节产生IL-13几乎比IL-4多100倍(图4)，这个事实只能强调在这个过程中IL-13潜在的重要作用。确实，在肺部肉芽肿模式中的研究表明，IL-4 mRNA表达更紧密地在伤痕形成部位受到调节，而IL-13 mRNA的诱导持续更长的时间。然而，我们还没有在感染动物中检测到IL-4和IL-13 mRNA表达的动力学，所以我们还不能说在肉芽肿肝脏中是否保持着相同的模式。
IL-13最近也显示出在抵抗肠线虫方面的重要性27，37-39。在对IL-4和IL-13缺损鼠的研究中37，38显示，不同与IL-4，IL-13在排除N.brasiliensis和T.muris中起到必不可少的作用。然而排除虫的特异机理一直不了解，尽管在上皮细胞中和肠子生理学方面IL-4和IL-13所诱导的变化已认为是可能的原因，但在鼠科动物哮喘模型中IL-13还是起到了关键作用。在这些研究中，发现IL-13对表现过敏性哮喘是必要的及充分的40，41。上皮下的纤维化和呼吸道平滑肌肥大是慢性严重哮喘的共同特点5，慢性肺部纤维化与在疾病的早期和晚期阶段分别产生III类和I类胶原质有关。因此在我们研究中揭示的IL-13与纤维化的联系阐明了几种重要的人类疾病的病因学，并提供了更有效的方式治疗纤维化疾病。
我们以前的研究显示虫卵特异IL-12诱导Th1记忆反应能有效地减少随后感染的鼠的肝脏纤维化19。病况的减少伴随着常规Th2反应向由Th1类细胞因子支配的反应的转换。当前研究得到的发现显示这种基于IL-12疫苗接种方案的抗病作用可由IL-13的抑制作用解释。有趣的是，使用不同方案的另一个研究显示，在肉芽肿发展的Th2-支配期期间，在6到8周重复γIL-12注射，对阻断肉芽肿形成和纤维化几乎完全没有效果52。相关的研究已显示，IL-12缺少调制已建立的Th2类反应的能力53，这可能能解释在后来的研究中不能调制病况52。与这些发现不同的是，在减少肝脏纤维化方面sIL-13Rα2-Fc特别有效，甚至仅在感染后期服用。这些发现说明，在致病Th2类免疫反应已建立的情况下，IL-13拮抗作用是减少纤维化的非常有效的治疗方法。总之，我们的发现提供了IL-13抑制剂，如sIL-13Rα2-Fc在预防与慢性感染疾病有关的纤维化方面有治疗益处的证据，并说明了在血吸虫病的发病机理中IL-13重要并且不多余的作用。方法动物，寄生物和Ag制备品6-8周大的雌性C57BL/6和IL-4缺损鼠(C57BL/6背景，10th回交)从Taconic Farms有限公司(Germantown，纽约州)获得。所有鼠养在国立卫生研究院(American Association for theAccreditation of Laboratory Animal Care-approved animalfacility)的灭菌filter-top笼子中，并饲以灭菌水。S.mansoni的波多黎各菌株的尾蚴(NMRI)从感染的Biomphalaria glabrata蜗牛(生物医学研究院，Rockville，MD)获得的，可溶虫卵抗原(SEA)从均质化的虫卵中提纯，如上面所描述的15。
试剂可溶IL-13受体α2-Fc融合蛋白(sIL-13Rα2-Fc)如上描述制备35并由MA，剑桥遗传研究院提供。内毒素污染物＜2EU/毫克，如用Cape Cod协会LAL测试法确定的(Limulus阿米巴样细胞裂解物，Woods Hole，MA)。如在B9增殖测试中通过能中和3ng/毫升鼠科动物IL-13确定的，体外ID50约为10ng/毫升。人类IgG(对照物-Fc)，其用作sIL-13Rα2-Fc的对照物，通过重组蛋白质A-琼脂糖层析法亲和提纯，如对sIL-13Rα2-Fc所描述的35。如前面所描述的，在感染的鼠中对照物-Fc没有可检测到的对发病或细胞因子表达的影响。
感染和治疗通过在含有20到25个尾蚴的水中经皮攻击尾部皮肤40分钟将鼠感染。在开始产卵后(5周)每隔一天腹腔内注射对照物-Fc或sIL-13Rα2-Fc的0.5毫升PBS溶液来治疗动物。根据动力学测试及在敏感/静脉内注射虫卵的鼠中的剂量反应试验，选取体内使用的最优浓度(200μg/鼠/天)30。在杀死动物当天从鼠收集血清。所有动物通过在第八周腹腔内服用戊巴比妥钠(18毫克/鼠，Sigma，St.Louis，MO)杀死，并灌注柠檬酸盐盐水以评定虫含量15。在任何治疗的动物组中没有观察到死亡。
组织病理学和纤维化测定为了测定肉芽肿，将约半个肝脏用Bouin-Hollande固定剂固定并如上所述进行处理15。在用Wright Giemsa染色剂(美国组织病理学，Clinton，MD)染色的组织切片中确定肝脏肉芽肿大小。用目镜测微尺测定含有单个有生命力的虫卵的每个肉芽肿直径，并假定为球形计算每个肉芽肿体积。使用最大直径和和与其正交的直径的平均值。在相同的切片中评定噬曙红细胞，肥大细胞和其他细胞类型的百分比。在范围0-4评定实质坏死，0是最小范围坏死4是最大程度坏死。肥大细胞的频率也计作相似数值范围，使用范围0-4。在肝脏和肠中的血吸虫卵的数量和肝脏中的胶原质含量，确定为羟基脯氨酸，如上所述测定。使用用picrosirius红染色的切片对纤维化进行组织学上的评定。Picrosirius试剂特异地染色胶原质，当切片在偏振光下观察时，胶原质沉积的明亮区域会被照亮。对在每个切片中的肉芽肿进行picrosirius红“密度”评定，范围1-4，使用同样的范围确定“涉及面积”的另一次测定。对于每个肉芽肿，通过乘以密度和面积来确定总的纤维化评分(即，16分应是最大的)。每只鼠在所有分析中包括平均30个肉芽肿。为了控制一致性，相同的个体评定所有组织学特性并且不知道试验设计。
分离及提纯RNA将来自每只动物的两部分肝组合并放置在1毫升的RNA-STAT60(Tel-Test)中，在干冰上冷冻并保持-70℃直到使用。使用组织polytron(Omni国际有限公司，Waterbury，CT)均质组织，依据制造商的建议提取总RNA。将RNA重新悬浮在DEPC-处理的水中并通过分光光度法定量。
细胞因子mRNA的RT-PCR检测使用RT-PCR法确定IL-4，IL-5，IL-10，IL-13，IFN-γ，胶原质I，胶原质III，TGFβ1，TGFβ2和HPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)的mRNA的相对量。如所描述的在逆转录1μgRNA后获得cDNA14。所有基因的引物和探针都已公开14，19，54。每种细胞因子使用的PCR循环如下IL-1(33)，IL-5(31)，IFN-γ(29)，胶原质I(26)，胶原质III(26)，TGFβ1(34)，TGFβ2(34)，和HPRT(23)。
对PCR产物的分析及量化如以前所描述的，使用非放射性细胞因子特异探针，通过电泳，Southern印迹和杂交来分析扩增的DNA14。使用ECL检测系统(Amersham)检测PCR产物。使用平床扫描仪量化化学发光信号(Microtek 600ZS型，Torrance，CA)。通过比较个体样品的细胞因子-特异信号密度与HPRT-特异信号密度的比率来确定PCR产物的量。个体样品的任意光密度单位随后乘以系数100。
体外培养物从鼠提取肠系膜淋巴节(MLN)细胞和脾脏，制备单细胞悬浮液。通过用ACK裂解缓冲液(Biofluid有限公司，Rockville，MD)渗透处理裂解血红细胞。在37℃5％二氧化碳中将细胞放置在补加10％FCS，2mM谷氨酰胺，100U/毫升青霉素，100μg/毫升链霉素，25mM HEPES，1mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸，和50μM 2-ME的RPMI1640介质中。将细胞放置在24-培养皿板中(3×610/毫升，1毫升)并用SEA刺激(20μg/毫升)，72小时后收集上清液，测定IL-4，IL-5，IL-10，IL-13，IFN-γ的量。其它SEA-刺激的培养物再用50ug/毫升的抗-CD4mAb(GK1.5)处理。当与在介质对照物培养物观察到的(数据未显示)比较时，仅用抗-CD4mAb处理过的培养物没有显示细胞因子表达的变化。使用特异夹层ELISA法测定IL-5，IL-10，IFN-γ15。使用鼠科动物IL-13ELISA试剂盒(R&D系统，Minneapolis，MN)测定IL-13的量。从用重组细胞因子制成的曲线计算细胞因子的量。使用IL-4敏感细胞系CT.4S测定IL-4。通过(3H)TdR掺入量化这些细胞的增殖，通过与已知重组IL-4的量比较确定细胞因子的量。
胶原质I的Western印迹检测在37℃5％二氧化碳中将3T3成纤维细胞培养在补加10％FCS，2mM谷氨酰胺，100U/毫升青霉素，100μg/毫升链霉素，25mM HEPES，1mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸，和50μM2-ME的RPMI1640介质中。将铺满细胞放置在24-培养皿板中(500,000细胞/毫升)，并用IL-4(1000U/毫升)或rIL-13(R&D系统，Minneapolis，MN)(20ng/毫升)刺激。6，24，和48小时。收集培养物的上清液分析分泌的胶原质I。将细胞用磷酸缓冲液盐水冲洗一次，并用SDS-PAGE样品缓冲液裂解。使用还原条件，将细胞裂解物和培养物上清液在6％Tris-糖胶凝胶(新型试验技术，San Diego，CA)中电泳分离，并转移到硝基纤维素膜上(Schleicher&schuell，Keene，NH)。用兔IgG抗-鼠I类胶原质(Biodesign International，Kennenbunk，ME)和过氧化酶标记的抗-兔IgG(Amersham Pharmacia生物技术有限公司，Piscataway，NJ)探测印迹。使用Western印迹化学发光试剂(NEN生命科学产品，Boston，MA)视觉观察带。为了证实胶原质带的特性，在37℃，将细胞用补加1mM氯化钙，和％FCS的0.5毫克/毫升的胶原酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的PBS溶液处理1小时。提纯的田鼠胶原质I制备品也用作对照物。
统计使用Student’s two-tailed t试验比较血吸虫虫和虫卵数量，细胞因子mRNA中的变化和分泌的细胞因子蛋白质的数值。通过分析协方差比较肝脏纤维化，将，总肝脏虫卵的对数作为协变及每个虫卵的羟基脯氨酸的对数。P＜0.05认为是显著的。
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以上列出通过引述而并入本文的所有专利和参考文献。
序列表(1)总体信息(i)申请人Wynn，ThomasChiaramonte，MonicaCollins，MaryDonaldson，DebraFitz，LoriNeben，TamlynWhitters，MatthewWood，Clive(ii)发明名称通过IL-13和IL-13受体链的拮抗作用治疗纤维化(iii)序列数量9(iv)通讯地址(A)收信人Genetics Institute，Inc.
(B)街道87 CambridgePark Drive(C)城市Cambridge(D)州Massachusetts(E)国家USA(F)邮编02140(v)计算机存储形式(A)存盘形式软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)工作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)当前申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)名称Brown，Scott A.
(B)注册号32,724(C)案卷号GI5268A2(ix)通讯信息(A)电话(617)498-8224(B)传真(617)876-5851(2)关于SEQ ID NO1(i)序列特征(A)长度1525碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设没有(ix)特点(A)名称/KEYCDS(B)位置256..1404(xi)序列描述SEQ ID NO1GAATTCGGCA CGAGGGAGAG GAGGAGGGAA AGATAGAAAG AGAGAGAGAA AGATTGCTTG 60CTACCCCTGA ACAGTGACCT CTCTCAAGAC AGTGCTTTGC TCTTCACGTA TAAGGAAGGA 120AAACAGTAGA GATTCAATTT AGTGTCTAAT GTGGAAAGGA GGACAAAGAG GTCTTGTGAT 180AACTGCCTGT GATAATACAT TTCTTGAGAA ACCATATTAT TGAGTAGAGC TTTCAGCACA 240CTAAATCCTG GAGAA ATG GCT TTT GTG CAT ATC AGA TGC TTG TGT TTC ATT 291Met Ala Phe Val His Ile Arg Cys Leu Cys Phe Ile1 5 10CTT CTT TGT ACA ATA ACT GGC TAT TCT TTG GAG ATA AAA GTT AAT CCT 339Leu Leu Cys Thr Ile Thr Gly Tyr Ser Leu Glu Ile Lys Val Asn Pro15 20 25CCT CAG GAT TTT GAA ATA TTG GAT CCT GGA TTA CTT GGT TAT CTC TAT 387Pro Gln Asp Phe Glu Ile Leu Asp Pro Gly Leu Leu Gly Tyr Leu Tyr30 35 40TTG CAA TGG AAA CCT CCT GTG GTT ATA GAA AAA TTT AAG GGC TGT ACA 435Leu Gln Trp Lys Pro Pro Val Val Ile Glu Lys Phe Lys Gly Cys Thr45 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Leu Arg Lys Pro Asn Thr Tyr Pro Lys Met360 365 370ATT CCA GAA TTT TTC TGT GAT ACA TGA AGACTTTCCA TATCAAGAGA1265Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr375 380CATGGTATTG ACTCAACAGT TTCCAGTCAT GGCCAAATGT TCAATATGAG TCTCAATAAA1325CTGAATTTTT CTTGCGAAAA AAAAAAAAAA AAATCCGCGG ATCC 1369(2)关于SEQ ID NO4(i)序列特征(A)长度380氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile1 5 10 15Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val20 25 30Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr35 40 45Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu50 55 60Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr65 70 75 80Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp85 90 95Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln100 105 110Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr115 120 125Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp130 135 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Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr355 360 365Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr *370 375 380(2)关于SEQ ID NO5(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5KSRCTCCABK CRCTCCA(2)关于SEQ ID NO6(i)序列特征(A)长度20氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6ATAGTTAAAC CATTGCCACC 20(2)关于SEQ ID NO7(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7CTCCATTCGC TCCAAATTCC 20(2)关于SEQ ID NO8(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8AGTCTATCTT ACTTTTACTC G 21(2)关于SEQ ID NO9(i)序列特征(A)长度22碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO9CATCTGAGCA ATAAATATTC AC 2权利要求
1.一种治疗哺乳动物受试体组织纤维化的方法，所述方法包括服用治疗上有效量的含有蛋白质和药物可接受的载体的药物组合物，其中所述蛋白质包括从下列组中选取的氨基酸序列(a)氨基酸序列SEQ ID NO2；(b)从氨基酸22到334的氨基酸序列SEQ ID NO2；(c)从氨基酸357到383的氨基酸序列SEQ ID NO2；(d)氨基酸序列SEQ ID NO4；(e)从氨基酸26到341的氨基酸序列SEQ ID NO4；(f)从氨基酸363到380的氨基酸序列SEQ ID NO4；和(g)具有IL-13受体结合链生物活性的(a)和(f)的片段。
2.依据权利要求1的方法，其中所述组织纤维化影响从下列组中选取的组织，包括肝脏，皮肤表皮，皮肤内皮，肌肉，腱，软骨，心脏组织，胰腺组织，肺组织，子宫组织，神经组织，睾丸，卵巢，肾上腺，动脉，静脉，结肠，小肠，胆管和肠子。
3.依据权利要求2的方法，其中所述组织是肝脏。
4.依据权利要求2的方法，其中所述纤维化是产生于血吸虫的感染。
5.依据权利要求1的方法，其中所述纤维化产生于伤口的愈合。
6.一种抑制哺乳动物受试体组织纤维化形成的方法，所述方法包括服用治疗上有效量的含有蛋白质和药物可接受的载体的药物组合物，其中所述蛋白质包括从下列组中选取的氨基酸序列(a)氨基酸序列SEQ ID NO2；(b)从氨基酸22到334的氨基酸序列SEQ ID NO2；(c)从氨基酸357到383的氨基酸序列SEQ ID NO2；(d)氨基酸序列SEQ ID NO4；(e)从氨基酸26到341的氨基酸序列SEQ ID NO4；(f)从氨基酸363到380的氨基酸序列SEQ ID NO4；和(g)具有IL-13受体结合链生物活性的(a)和(f)的片段。
7.依据权利要求6的方法，其中所述组织纤维化影响从下列组中选取的组织，包括肝脏，皮肤表皮，皮肤内皮，肌肉，腱，软骨，心脏组织，胰腺组织，肺组织，子宫组织，神经组织，睾丸，卵巢，肾上腺，动脉，静脉，结肠，小肠，胆管和肠子。
8.依据权利要求7的方法，其中所述组织是肝脏。
9.依据权利要求7的方法，其中所述纤维化是产生于血吸虫的感染。
10.依据权利要求6的方法，其中所述纤维化产生于伤口的愈合。
11.依据权利要求10的方法，其中所述伤口是外科手术切口。
12.依据权利要求5的方法，其中所述伤口是外科手术切口。
13.一种治疗哺乳动物受试体组织纤维化的方法，所述方法包括服用治疗上有效量的含有(a)从包括IL-13拮抗剂和IL-4拮抗剂的组中选取的分子，和(b)药物可接受的载体的组合物。
14.依据权利要求13的方法，其中所述拮抗剂是从下列组中选取的，包括IL-13bc蛋白质，可溶形式的IL-13Rα1，IL-13的或其IL-13结合片段的抗体，IL-13bc的或其IL-13bc-结合片段的抗体，IL-13Rα1的或其IL-13Rα1结合片段的抗体，IL-4的IL-13R结合突变体，能抑制IL-13与IL-13bc相互作用的小分子以及能抑制IL-13与IL-13Rα1相互作用的小分子。
15.依据权利要求14的方法，其中所述IL-13bc蛋白质是包括从下列组中选取的氨基酸序列的蛋白质(a)氨基酸序列SEQ ID NO2；(b)从氨基酸22到334的氨基酸序列SEQ ID NO2；(c)从氨基酸357到383的氨基酸序列SEQ ID NO2；(d)氨基酸序列SEQ ID NO4；(e)从氨基酸26到341的氨基酸序列SEQ ID NO4；(f)从氨基酸363到380的氨基酸序列SEQ ID NO4；和(g)具有IL-13受体结合链生物活性的(a)和(f)的片段。
16.依据权利要求13的方法，其中所述组织纤维化影响从下列组中选取的组织，包括肝脏，皮肤表皮，皮肤内皮，肌肉，腱，软骨，心脏组织，胰腺组织，肺组织，子宫组织，神经组织，睾丸，卵巢，肾上腺，动脉，静脉，结肠，小肠，胆管和肠子。
17.依据权利要求16的方法，其中所述组织是肝脏。
18.依据权利要求17的方法，其中所述纤维化是产生于血吸虫的感染。
19.依据权利要求13的方法，其中所述纤维化产生于伤口的愈合。
20.依据权利要求19的方法，其中所述伤口是外科手术切口。
21.一种抑制哺乳动物受试体组织纤维化的方法，所述方法包括服用治疗上有效量的含有(a)从包括IL-13拮抗剂和IL-4拮抗剂的组中选取的分子，和(b)药物可接受的载体的组合物。
22.依据权利要求21的方法，其中所述拮抗剂是从下列组中选取的，包括IL-13bc蛋白质，可溶形式的IL-13Rα1，IL-13的或其IL-13结合片段的抗体，IL-13bc的或其IL-13bc-结合片段的抗体，IL-13Rα1的或其IL-13Rα1结合片段的抗体，IL-4的IL-13R结合突变体，能抑制IL-13与IL-13bc相互作用的小分子以及能抑制IL-13与IL-13Rα1相互作用的小分子。
23.依据权利要求22的方法，其中所述IL-13bc蛋白质是包括从下列组中选取的氨基酸序列的蛋白质(a)氨基酸序列SEQ ID NO2；(b)从氨基酸22到334的氨基酸序列SEQ ID NO2；(c)从氨基酸357到383的氨基酸序列SEQ ID NO2；(d)氨基酸序列SEQ ID NO4；(e)从氨基酸26到341的氨基酸序列SEQ ID NO4；(f)从氨基酸363到380的氨基酸序列SEQ ID NO4；和(g)具有IL-13受体结合链生物活性的(a)和(f)的片段。
24.依据权利要求21的方法，其中所述组织纤维化影响从下列组中选取的组织，包括肝脏，皮肤表皮，皮肤内皮，肌肉，腱，软骨，心脏组织，胰腺组织，肺组织，子宫组织，神经组织，睾丸，卵巢，肾上腺，动脉，静脉，结肠，小肠，胆管和肠子。
25.依据权利要求24的方法，其中所述组织是肝脏。
26.依据权利要求25的方法，其中所述纤维化是产生于血吸虫的感染。
27.依据权利要求21的方法，其中所述纤维化产生于伤口的愈合。
28.依据权利要求27的方法，其中所述伤口是外科手术切口。
29.依据权利要求21的方法，其中所述拮抗剂是从下列组中选取的，包括可溶形式的IL-4R，IL-4的或其IL-4结合片段的抗体，IL-4R的或其IL-4R-结合片段的抗体，能抑制IL-4与IL-4R相互作用的小分子。
30.依据权利要求13的方法，其中所述拮抗剂是从下列组中选取的，包括可溶形式的IL-4R，IL-4的或其IL-4结合片段的抗体，IL-4R的或其IL-4R-结合片段的抗体，能抑制IL-4与IL-4R相互作用的小分子。
全文摘要
本文提供了使用IL－13拮抗剂,包括IL－13受体无限制的可溶形式来治疗或抑制组织纤维化形成的方法。
文档编号A61K39/395GK1348465SQ00806772
公开日2002年5月8日 申请日期2000年4月28日 优先权日1999年4月28日
发明者托马斯·A·韦恩, 蒙妮卡·G·切艾拉蒙蒂, 玛丽·柯林斯, 戴布拉·唐纳德森, 洛里·菲茨, 泰姆林恩·尼本, 马修·J·怀特尔斯, 克莱夫·伍德 申请人:遗传学研究所公司