专利名称：模型膜系统的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及向模型和生物膜系统锚定分子，涉及锚定分子在测定分子间相互作用和改变生物反应中的用途。一方面，本发明为筛选可影响分子间相互作用的药物和其他试剂的新方法提供基础。另一方面，本发明提供一种改变生物和/或合成膜和脂质体的性质的方法，目的在于当用作疫苗时改变免疫性，或者当体内施用时向特定细胞或组织导向药物和其他试剂，用于治疗目的或改变生理反应或功能。
在生物系统如细胞、细菌或病毒中，表面生物分子或受体通常作为由两种或两种以上的称作亚基的分子成分组成的分子结构存在；这些亚基可以是相同的，或是分子不同的。原初配体分子与受体亚基的结合可诱导这些受体成分的非共价聚集或寡聚。寡聚事件通常是受体传导跨膜信号的机制的一个必要部分，用于引发配体分子对生物反应的诱导。另外，某些受体或其成分自发聚集的能力可影响它们与配体相互作用的能力。配体分子可以是生长因子、细胞因子、激素、蛋白质、糖蛋白、多糖或细胞的任何暴露表面或亚细胞成分、病毒或亚病毒颗粒，或其他传染物，它们能与受体结合。
根据经受多聚相互作用的能力，寡聚受体通常具有与低结合亲和力的配体稳定作用的潜力。然而，对于许多受体，自结合或与配体相互作用的亲和力不足以用常规结合技术检测，常规结合技术通常需要共价标记、用去污剂溶解，或向光学生物传感器的固体传感表面上固定受体或配体。这些方法适于研究相对较高亲和力的相互作用，通常依赖分子在溶液中相互作用或在细胞破裂后保持稳定相互作用的能力。由于相对于二维细胞表面(分子能寡聚或聚簇并且与其他分子通过多聚作用稳定作用)，溶液中的有效受体/配体浓度降低，这些方法在检测低亲和力相互作用的能力上有限。
原子力显微镜术(也称作扫描探针显微镜术)可以对原子大小到微米大小的结构进行三维成像和测量，并且在分辨前所未见的结构的能力上是革命性的(1)。光学生物传感器的发展允许实时监测大分子之间的相互作用(2)。迄今为止，这两种技术都使用与固体表面共价结合或固定于其上的受体或配体分子(1-4)。
最近描述了一种技术，其中利用重组六组氨酸标记的蛋白质与次氮基三乙酸的连接将六组氨酸标记的蛋白质可逆地固定于BIAcore表面胞质团共振生物传感器的固体传感表面上(5)。杂合十八烷硫醇/磷脂膜在BIAcore传感表面上的形成也已经有描述(6)，使得能分析链霉亲和素与双层中的生物素化磷脂酰乙醇胺的结合。另外，组氨酸标记的生物分子通过螯合脂(如NTA-双十八胺)在双层膜上的固定已经通过表面荧光显微镜术和薄膜平衡技术证明(7-8)。这些现有技术不能分析受体域在模拟允许受体侧向运动，并且提供研究受体寡聚作用和与配体多聚作用的可能性的细胞或亚细胞膜条件下的相互作用。此外，这些现有技术不能筛选可影响这些分子相互作用的药物或其他试剂。
因此，需要发展将分子锚定于膜材料上的新技术，以用于例如药物筛选装置、疫苗制剂中，作为治疗剂，作为改变免疫应答和导向药物输送系统的试剂。
一方面，本发明提供一种将受体域锚定于在层上排列有两亲性分子的平面支持膜上的方法，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合修饰，使得某些金属螯合基团朝向该膜的外表面；该方法包括下列步骤在足以使多肽尾(polypeptide tag)通过该膜的面向外金属螯合残基与膜结合的条件下，使与多肽尾共价结合的受体域与该膜相互作用一定时间，使得受体域能侧向运动、二聚化或寡聚化，并与配体分子相互作用。
另一方面，本发明提供一种将受体域锚定于脂膜上，使受体域能够侧向运动的方法，该方法包括(i)通过下列任一方法，在合适的平面支持物上形成膜(a)使支持物与两亲性分子在有机溶剂中的溶液接触并温育一段时间，其中一部分分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后通过加入水或水性缓冲液形成膜；或者(b)由两亲性分子形成微团(例如脂质体)悬液，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后在足以形成膜层的条件下使该微团(例如脂质体)悬液与合适的平面支持物相互作用一段时间，其中与该微团(例如脂质体)悬液的两亲性分子结合的某些金属螯合残基朝向膜的外表面；和(ii)在足以使多肽尾通过金属螯合键与膜的面向外的金属螯合残基结合的条件下，使与多肽尾共价结合的将要锚定的受体域与该膜相互作用一段时间。
另一方面，本发明涉及一种将受体域锚定于脂膜上，使得该受体域能够侧向运动，以促进与膜中生物分子相互作用的方法，该方法包括(i)通过下列任一方法，在合适的平面支持物上形成膜(a)使支持物与两亲性分子在有机溶剂中的溶液接触并温育一段时间，其中一部分分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后通过加入水或水性缓冲液形成膜；或者(b)由第一种磷脂和第二种磷脂形成微团(例如脂质体)悬液，其中第二种磷脂已经通过次氮基三乙酸(NTA)的共价结合而修饰，然后在足以形成磷脂膜层的条件下使该微团(例如脂质体)悬液与合适的平面支持物相互作用一段时间，其中与该微团(例如脂质体)悬液的第二种磷脂结合的某些NTA残基朝向膜的外表面；和(ii)在足以使多肽尾通过NTA-金属螯合键与膜的面向外NTA残基结合的条件下，使与多肽尾共价结合的将要锚定的受体域与该膜相互作用一段时间。
本发明的再另一方面提供一种测定受体与配体相互作用的方法，包括下列步骤(A)通过下列方法将一种受体锚定于脂膜上(i)通过下列任一方法，在合适的平面支持物上形成膜(a)使支持物与两亲性分子在有机溶剂中的溶液接触并温育一段时间，其中一部分分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后通过加入水或水性缓冲液形成膜；或者(b)由两亲性分子形成微团(例如脂质体)悬液，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后在足以形成膜层的条件下使该微团(例如脂质体)悬液与合适的平面支持物相互作用一段时间，其中与该微团(例如脂质体)悬液的两亲性分子结合的某些金属螯合残基朝向膜的外表面；和(ii)在足以使多肽尾通过金属螯合键与膜的面向外的金属螯合残基结合的条件下，使与多肽尾共价结合的将要锚定的受体域与该膜相互作用一段时间；(B)使这些受体分子在膜上相互作用和/或寡聚；和(C)在足以发生结合的条件下，使该锚定受体与有效浓度的配体接触一段时间，并检测这种结合。
本发明的再另一方面涉及一种测定受体与配体相互作用的方法，包括下列步骤(A)通过下列方法将一种受体锚定于脂膜上(i)通过下列任一方法，在合适的平面支持物上形成膜(a)使支持物与两亲性分子在有机溶剂中的溶液接触并温育一段时间，其中一部分分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后通过加入水或水性缓冲液形成膜；或者
(b)由第一种磷脂和第二种磷脂形成囊泡悬液，其中第二种磷脂已经通过金属螯合基团如次氮基三乙酸(NTA)的共价结合而修饰，然后在足以在支持物上形成烃磷脂膜层的条件下，使该微团(例如脂质体)悬液与合适的平面支持物(如玻璃或云母)相互作用一段时间，其中与该微团(例如脂质体)悬液的第二种磷脂结合的某些NTA残基朝向膜的外表面；和(ii)在足以使多肽尾通过NTA-金属螯合键与膜的面向外的NTA残基结合的条件下，使与多肽尾共价结合的将要锚定的受体域与该膜相互作用一段时间；(B)使这些受体分子在膜上相互作用和/或寡聚；和(C)在足以发生结合的条件下，使该锚定受体与有效浓度的配体接触一段时间，并检测这种结合。
本发明的再另一方面提供一种将分子移至脂质体上的方法，该方法包括(i)制备掺有螯合脂的脂质体悬液，含或不含包封的药物或试剂；(ii)将该脂质体与含有合适的金属亲和尾(tag)的重组蛋白或靶分子温育；和(iii)必要时，通过洗涤、过滤或其他洗涤方法除去过量的蛋白质，并将其悬浮于合适的溶液中。
本发明的另一方面，提供了一种将重组分子直接“粘合”于生物膜上的方法，该方法包括(i)制备螯合脂或含螯合脂的脂质体的悬液；(ii)将细胞或生物膜结构悬液与螯合脂悬液一起温育；(iii)洗去过量的或未掺入的脂；(iv)将该膜结构与含有合适的金属亲和尾的重组蛋白或靶分子溶液一起温育；和(v)洗去过量的或未结合的可溶蛋白，并将该结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
本发明的另一方面涉及一种改变靶细胞或其膜成分的免疫原性的方法，该方法包括通过下列步骤将一种分子锚定于该靶细胞的膜上(i)制备螯合脂或含螯合脂的脂质体的悬液；(ii)将细胞或膜结构悬液与螯合脂悬液一起温育；(iii)洗去过量的或未掺入的脂；(iv)将该膜结构与将要锚定的分子的溶液一起温育；和(v)洗去过量的或未结合的可溶蛋白，并将该结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
本发明的另一方面涉及一种将脂质体或膜结构导向特定细胞或组织的方法，该方法包括通过下列步骤将一种具有结合配偶体的分子锚定或移至欲导向的特定细胞或组织上(i)制备螯合脂或含螯合脂的脂质体的悬液；(ii)将细胞或膜结构悬液与螯合脂悬液一起温育，以掺入脂；(iii)洗去过量的或未掺入的脂；(iv)将该膜结构与将要锚定的分子的溶液一起温育；和(v)洗去过量的或未结合的可溶蛋白，并将该结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
本发明的另一方面涉及一种治疗方法，该方法包括对患者施用有效量的脂质体制剂或膜物质，其含有活性物质，和任选的具有结合配偶体或靶组织的锚定或移入的分子。
本发明的另一方面提供一种疫苗组合物，其包含细胞、脂质体、囊泡或膜物质，其中移入了能改变对施用疫苗的患者的免疫应答的分子，该疫苗还包含一种或多种药学载体和/或稀释剂。
图2(a)和2(b)是迹线图，显示如用IAsys生物传感器监测的，由于分子结合，折射系数随时间的改变。
图3是一张生物传感器迹线图，显示在杯的传感表面与微团(例如脂质体)悬液反应形成层后，由于加入IAsys生物传感器杯中引起的折射系数的改变。
图4是六组氨酸标记的分子能移至细胞膜或其他膜结构上的方式的图示。该图显示带有六组氨酸尾的重组受体如何移至生物膜如细胞质膜或亚细胞膜结构和人工囊泡或脂质体表面上。重组蛋白质通过蛋白质上的六组氨酸标记与已经掺入磷脂膜中的螯合脂上的NTA金属螯合首基(称为NT-DTDA；也可称为di-C14-NTA)结合而移至膜结构上。
图5是通过荧光激活细胞分选确定的P815细胞的荧光图，该细胞与生物素化和六组氨酸标记的CD40和B7.1分子结合，然后用链霉亲和素-FITC染色。
图6是一张图示，显示在从接种含移入共刺激分子的肿瘤细胞的小鼠中分离的T淋巴细胞中，肿瘤特异性细胞毒性的诱导。同系DBA/2小鼠用PBS或1×105γ-照射的P815细胞皮下免疫，该细胞中移入下列重组蛋白EPOR-6H、B7.1-6H和B7.1-6H加CD40-6H。免疫14天后从小鼠中取出脾脏，分离T淋巴细胞(效应T细胞)，悬浮于温育培养基中，并以1×105细胞/孔的浓度等分至24孔平底板中，然后与1×105γ-照射的原初P815细胞共培养。在5％CO2存在下37℃共培养5天后，以指定的E∶T比，将细胞与51Cr标记的原初P815细胞靶标37℃温育6小时，之后收集上清液，测定特异裂解释放的51Cr的量。结果表示为百分比裂解±SEM，如材料与方法中所述计算。
图7(a)和(b)是显示通过用移入重组共刺激分子的P815肿瘤细胞免疫诱导肿瘤免疫的图示。如述，通过注射PBS或1×105γ-照射的P815细胞免疫小鼠，该细胞移入了包括EPOR-6H、B7.1-6H和B7.1-6H加CD40-6H的重组蛋白。注射2周后，通过皮下注射用1×105原初P815细胞攻击每组小鼠，然后监测肿瘤生长和存活率。(A)中的每个点代表前5周中每组小鼠随时间改变的平均肿瘤直径。(B)中的数据显示动物随时间改变的百分存活率。
图8是一张图示，显示荧光标记的脂质体与D10细胞(鼠CD4+T细胞)的结合在脂质体与共刺激分子CD40或B7.1任一个结合时比与对照蛋白质EPOR结合时显著提高。(注意D10细胞表达B7.1和CD40的配体，而不表达EPOR的配体)。由脂类PC∶NTA-DTDA∶FITC-PE(10∶1∶0.1摩尔比)组成的脂质体中移入带有六组氨酸尾的一种或多种重组蛋白(表示为EPOR、B7.1和CD40)。每种条件下细胞的荧光图(反映脂质体与细胞的结合程度)通过荧光激活细胞分选确定；显示细胞(标为“细胞”)的背景荧光用于对比。结果表明，移入合适的重组蛋白的脂质体的结合对于移入蛋白质的类型是特异的，因此，带有移入重组蛋白的脂质体能被导向表达合适的同源受体的细胞。
图9是一张图示，显示移入共刺激分子B7.1和CD40的合成脂质体能特异刺激D10细胞(鼠CD4+T细胞)与培养皿的粘附。培养的D10细胞悬浮于完全生长培养基(RPMI 1640加10％v/v FCS、50U/ml IL-2、抗生素和50μMβ-巯基乙醇)中。重组蛋白EPOR、CD40和B7.1(每一个均含有六组氨酸尾)与可溶形式(表示为sEPOR、sB7.1和sCD40)或移至由PC和NTA-DTDA(10∶1)组成的脂质体上的细胞混合(表示为NTA-DTDA-EPOR、NTA-DTDA-B7.1和NTA-DTDA-CD40)，之后将细胞转移到12孔Linbro组织培养板的各孔中，并在生长培养基中37℃温育2小时。温育后，用PBS洗涤3次从孔中除去未附着的细胞，用1mM EDTA溶液除去剩余的附着细胞，显微镜计数。数据显示每种条件下附着细胞的比例。结果证明，带有移入共刺激分子(即B7.1和/或CD40)的脂质体能用来改变免疫应答。
优选实施方案详述在一个实施方案中，本发明涉及一种锚定受体的膜外域或跨膜域的方法，以克服现有技术的一种或多种上述缺点。
在另一个实施方案中，本发明提供一种测定膜锚定分子之间和锚定分子与能与之相互作用的分子之间的相互作用的方法。更具体而言，本发明可用于通过将受体域锚定于液体膜系统中，研究受体的膜外或跨膜域之间，和受体域与配体之间的相互作用。受体域也可由蛋白质、糖蛋白或蛋白聚糖、寡糖或其片段或功能相当物组成。
因此，本发明的一个重要用途是，提供筛选可影响诱发的或自发的受体聚集，因此可影响受体功能的试剂或药物的技术。本发明也可用于筛选可破坏受体亚基预先存在的聚集的药物(如以下所述MHC II类分子的通常结合的α和β亚基聚集)。
本发明可用于监测通常不是膜结合的受体或蛋白质片段，在经改造含有六组氨酸尾并锚定于如下对于细胞表面衍生的分子CD4和MHC II类所述的膜上之后，自发或配体诱发的聚集或解聚过程。此外，也能改造受体域或相关蛋白质片段，使之含有自发插入膜层最外小叶中的适当定位的链。该系统的用途包括药物筛选和对新配体种或诱导可影响聚集过程的修饰的生物化学药剂(例如酶)的研究。
因此，本发明涉及将受体域(无论膜外或跨膜)锚定于膜上，使得该受体域能够侧向运动，以促进与膜中生物分子相互作用的方法。
因此，本发明提供一种将受体域锚定于层中排列有两亲性分子的平面支持膜上的方法，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合修饰，使得某些金属螯合基团朝向该膜的外表面；该方法包括下列步骤在足以使多肽尾通过该膜的面向外金属螯合残基与膜结合的条件下，使与多肽尾共价结合的受体域与该膜相互作用一定时间，使得受体域能侧向运动、二聚化或寡聚化，并与配体分子相互作用。
供本发明使用的一种优选的金属螯合基团是次氮基三乙酸(NTA)。
该膜可由两亲性分子的微团(例如脂质体)悬液形成，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合修饰。此外，通过向两亲性分子在有机溶剂中的溶液中加入水或水性缓冲液形成膜。
本发明的另一方面提供一种将受体域锚定于脂膜上使受体域能够侧向运动的方法，该方法包括(i)通过下列任一方法，在合适的平面支持物上形成膜(a)使支持物与两亲性分子在有机溶剂中的溶液接触并温育一段时间，其中一部分分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后通过加入水或水性缓冲液形成膜；或者(b)由两亲性分子形成微团(例如脂质体)悬液，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后在足以形成膜层的条件下使该微团(例如脂质体)悬液与合适的平面支持物相互作用一段时间，其中与该微团(例如脂质体)悬液的两亲性分子结合的某些金属螯合残基朝向膜的外表面；和(ii)在足以使多肽尾通过金属螯合键与膜的面向外的金属螯合残基结合的条件下，使与多肽尾共价结合的将要锚定的受体域与该膜相互作用一段时间。
两亲性分子通常是含有亲水“头”部分和一个或多个疏水“尾”的表面活性剂。表面活性剂可以是任何已知类型的，即，阳离子的(例如季铵盐)、阴离子的(例如有机磺酸盐)、两性离子的(例如磷脂磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺)、跨膜脂或非离子的(例如聚醚物质)。
膜可以由一种以上的两亲性分子组成。在一个优选实施方案中，膜由第一种磷脂和第二种磷脂构成。
因此，一种优选形式，本发明涉及一种将受体域锚定于脂膜上，使得该受体域能够侧向运动，以促进与膜中生物分子相互作用的方法，该方法包括(i)通过下列任一方法，在合适的平面支持物上形成膜(a)使支持物与两亲性分子在有机溶剂中的溶液接触并温育一段时间，其中一部分分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后通过加入水或水性缓冲液形成膜；或者
(b)由第一种磷脂和第二种磷脂形成微团(例如脂质体)悬液，其中第二种磷脂已经通过次氮基三乙酸(NTA)的共价结合而修饰，然后在足以形成磷脂膜层的条件下使该微团(例如脂质体)悬液与合适的平面支持物相互作用一段时间，其中与该微团(例如脂质体)悬液的第二种磷脂结合的某些NTA残基朝向膜的外表面；和(ii)在足以使多肽尾通过NTA-金属螯合键与膜的面向外的NTA残基结合的条件下，使与多肽尾共价结合的将要锚定的受体域与该膜相互作用一段时间。
本发明该方面的方法特别可用于锚定膜外或跨膜受体域。
一种更优选的形式是，第一种磷脂是磷脂酰胆碱(PC)，第二种脂是磷脂酰乙醇胺-NTA(PE-NTA)，PC∶PE-NTA之比(w/v)约为10∶1。然而，第一种磷脂可以是能形成脂层的任何磷脂或碳氢化合物；第二种磷脂可以是含有金属螯合首基的任何脂类，它能用来利用该域上适当改造的尾锚定受体域。另外，第一种与第二种磷脂的比例可因膜层上将要达到的受体域分子的希望的密度而不同。
本发明的一种形式，支持物是一种光学生物传感器杯的玻璃样传感表面，或适于用原子力显微镜术分析的云母表面。优选地，支持物是平面玻璃或云母表面，但也可以是能形成支持平面脂膜层的底层的任何表面(6，9，10)。
另一种形式，表面可以是玻璃、金或任何材料层，它们能与含烃化合物(例如十八烷基三氯硅烷和十八烷硫醇)溶液反应，能使烃链与该表面结合(6，11)，使得烃链定向于远离该支持物表面，形成能与磷脂微团(例如脂质体)悬液反应的脂单层或疏水表面，形成平面膜层(6，9，10)。在这些形式中，与该微团(例如脂质体)悬液的第二种磷脂结合的NTA残基朝向膜外表面。这些表面可以是光学生物传感器的传感表面，能监测锚定于膜上的受体域与溶液中的配体分子的相互作用。
优选地，多肽尾含有至少6个氨基酸残基(如六组氨酸分子)的序列，但可以是能通过与含金属螯合基团(如NTA)的脂类的金属螯合成分形成复合体而强烈结合的任何氨基酸序列。在本发明的一个用途中，该分子是一种转录因子分子。在本发明的另一种形式中，该分子是一种受体。更具体而言，受体可以是任何细胞表面受体，如人细胞表面分子CD4或人MHC II类分子，或这些受体的结构域。
因此，另一方面，本发明提供一种测定受体与配体相互作用的方法，包括下列步骤(A)通过下列方法将一种受体锚定于膜上(i)通过下列任一方法，在合适的平面支持物上形成膜(a)使支持物与两亲性分子在有机溶剂中的溶液接触并温育一段时间，其中一部分分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后通过加入水或水性缓冲液形成膜；或者(b)由两亲性分子形成微团(例如脂质体)悬液，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后在足以形成膜层的条件下使该微团(例如脂质体)悬液与合适的平面支持物相互作用一段时间，其中与该微团(例如脂质体)悬液的两亲性分子结合的某些金属螯合残基朝向膜的外表面；和(ii)在足以使多肽尾通过金属螯合键与膜的面向外的金属螯合残基结合的条件下，使与多肽尾共价结合的将要锚定的受体域与该膜相互作用一段时间；(B)使这些受体分子在膜上相互作用和/或寡聚；和(C)在足以发生结合的条件下，使该锚定受体与有效浓度的配体接触一段时间，并检测这种结合。
在一个实施方案中，本发明涉及一种测定受体与配体相互作用的方法，包括下列步骤(A)通过下列方法将一种受体锚定于脂层上(i)通过下列任一方法，在合适的平面支持物上形成膜(a)使支持物与两亲性分子在有机溶剂中的溶液接触并温育一段时间，其中一部分分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后通过加入水或水性缓冲液形成膜；或者(b)由第一种磷脂和第二种磷脂形成囊泡悬液，其中第二种磷脂已经通过次氮基三乙酸(NTA)的共价结合而修饰，然后在足以在支持物上形成烃磷脂膜层的条件下，使该微团(例如脂质体)悬液与合适的平面支持物(如玻璃或云母)相互作用一段时间，其中与该微团(例如脂质体)悬液的第二种磷脂结合的某些NTA残基朝向膜的外表面；和(ii)在足以使多肽尾通过NTA-金属螯合键与膜的面向外的NTA残基结合的条件下，使与多肽尾共价结合的将要锚定的受体域与该膜相互作用一段时间；(B)使这些受体分子在膜上相互作用和/或寡聚；和(C)在足以发生结合的条件下，使该锚定受体与有效浓度的配体接触一段时间，并检测这种结合。
在固体支持物(例如金)可能不适于直接由囊泡悬液形成层的情况中，在上述步骤(i)到(iii)之前可以添加在固体支持物上形成单层或疏水表面的步骤。实现方法是，将固体支持物与能使烃链与表面结合的含烃化合物溶液反应，使得烃链方向远离支持物表面，形成脂单层或疏水表面。然后在形成膜层所必需的条件下，使该表面与磷脂两亲性分子微团(例如脂质体)悬液，优选地[如以上步骤(i)-(ii)中的]微团(例如脂质体)悬液反应一段时间。与两亲性分子(如第二种磷脂)结合的金属螯合残基，优选地NTA残基，朝向该膜的外表面，并且可用来锚定含六组氨酸尾的分子[如以上(iii)所述]。这些表面可以是光学生物传感器的传感表面，能监测锚定于膜上的受体域与溶液中配体分子的相互作用。
优选地，通过原子力显微镜术或光学生物传感器技术检测受体的寡聚或自缔合及与配体的结合。
本发明因此可用于受体域、蛋白质、糖蛋白和多糖向云母、玻璃、金或其他任何合适的表面上形成的脂层上的锚定，使分子能侧向扩散并相互作用。该技术在用光学生物传感器和原子力显微镜技术研究膜系统中受体域之间和受体域与配体之间的相互作用的优选实施方案中是理想的。
能用标准重组DNA技术构造受体域，使之含有六组氨酸COOH-尾，或NH2-尾。六组氨酸尾也可通过化学方法与多糖和其他分子共价结合。
本发明中使用的光学生物传感器测量由于可溶性大分子与固定于固体传感表面上的分子结合引起的反射系数的改变，并且能用来测量相互作用的分子的结合亲和力。IAsys生物传感器使用一种具有共振镜作为传感表面的样品杯。对于与微团(例如脂质体)悬液反应，在传感表面上形成膜层，IAsys生物传感器的玻璃样传感表面是理想的。
本发明也可使用BIAcore表面胞质团共振生物传感器，其利用一种金传感表面。金首先与十八烷硫醇反应，形成十八烷单层，然后与微团(例如脂质体)悬液反应，形成膜层。
原子力显微镜能用于对含有有限数量的分子种的模型膜层上的分子结构作图。这些层能通过与微团(例如脂质体)悬液温育直接在云母或玻璃表面形成。疏水单层也能通过用合适的试剂处理在玻璃或金表面上形成，杂合膜层的形成是通过单层表面与两亲性分子组成的微团(例如脂质体)悬液，优选地PC与PE-NTA的适当混合物反应，形成层。
六组氨酸标记的受体向本发明的模型膜系统上的锚定也可用于向脂质体或囊泡上锚定或移入受体和其他分子，当体内施用脂质体时，它们能通过移入分子的特异性向特定细胞型或组织中导向和输送能被包封于脂质体中的药物、DNA/RNA或任何治疗剂。
重组分子也能移至合成脂质体或囊泡上，用于发展产生特异生物或治疗作用的疫苗。
根据本发明的这一方面，提供了一种将分子移至脂质体上的方法，该方法包括(i)制备掺有螯合脂、含或不合包封药物或试剂的脂质体悬液；(ii)将该脂质体与含有合适的金属亲和尾的重组蛋白或靶分子温育；和(iii)必要时，通过洗涤、过滤或其他洗涤方法除去过量的蛋白质，并将其悬浮于合适的溶液中。
在一个优选实施方案中，分子可通过下列方法锚定或移至脂质体上
(i)在水性溶液如含有浓度约等于NTA-DTDA的Ni2+和Zn2+的PBS(磷酸缓冲盐溶液)中，以约0.5mM的浓度，由螯合脂如二-十四烷胺次氮基三乙酸(NTA-DTDA)和1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰胆碱(POPC)的适当混合物制备脂质体悬液。脂质体能通过在高于Tm的温度下超声处理该混合物5-10分钟产生。此外，脂质体也能如下产生，将脂在乙醇溶液中溶解，然后在水性缓冲液中分散，或通过适当孔径的聚碳酸酯或类似滤膜挤出脂的水性悬液。NTA-DTDA∶POPC之比一般可为5∶1，但也可以是不同的；(ii)通过沉淀(在4℃下以～95000×g离心30分钟)，并弃除上清液，或通过过滤技术，洗涤脂质体，然后将脂质体悬浮于适当体积的缓冲溶液中，以利于与标记蛋白质的温育；(iii)将脂质体与重组蛋白(例如人六组氨酸标记的VEGF、血管内皮生长因子)或不同重组蛋白的组合一起温育，它们都含有六组氨酸或其他合适的金属亲和尾，使之能锚定于脂质体上；和(iv)如以上步骤(ii)所述，通过洗涤脂质体去除过量的可溶性或未结合的蛋白质，然后将其悬浮于PBS或其他适于体内施用的缓冲液中。
其他组合和不同脂类也能与螯合脂一起使用，以得到脂质体特异的性质。例如，(以上步骤(i)中的)混合物能含有神经节苷脂GM1或衍生物聚乙二醇，以产生具有“隐密”性质的脂质体(12)，避免当用作体内疫苗时被巨噬细胞或被肝脏或脾脏吸收。另外，步骤(i)也能在药物、DNA或其他治疗剂存在下进行，目的是包封该物质，并在体内施用时使之能输送到移入分子的特异性所限定的特定细胞或组织中。例如，含有移入VEGF(血管内皮生长因子)的脂质体能用来导向已知表达VEGF受体并且是肿瘤生长所需的生血管上皮。因此，含有移入VEGF的脂质体能用来输送能阻断肿瘤生长所需新血管生长的细胞毒性药物或试剂。细胞毒性药物或试剂被包封于脂质体中。
修饰用作疫苗的细胞表面以改变对疾病的免疫性(例如对肿瘤的免疫应答——见下文)的现有方法通常需要对肿瘤细胞的转染或遗传操作，以诱导它们在其表面表达—种或多种特异蛋白质(13-15)。例如，在动物和人类肿瘤模型中，有证据表明，用诱导它们在表面上表达T细胞共刺激分子如B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40和ICAM-1的基因转染肿瘤细胞，可能是制备在接种中用来提高荷肿瘤宿主中肿瘤免疫的细胞的有用方法(16-22)。遗憾的是，在临床状况如人体癌症治疗中，用这些基因转染肿瘤细胞可能是耗时且不便的。因此，转染频率通常较低，用多种基因成功转染(诱导多种蛋白质在肿瘤细胞表面表达)可能难以实现。此外，转染技术，甚至在利用表面上似乎无害的病毒载体施行时，可能与由于难以精确控制基因表达或其向基因组中的整合引起的患者的危险相关。
本发明还提供一种更方便且安全的方法，用于将共刺激分子和其他分子直接移至细胞(如肿瘤细胞)表面和其他膜结构上(无论生物的或合成的)，它们能用作疫苗，以提高或改变对人类肿瘤和其他疾病的免疫。
将受体锚定于模型膜系统上以测定分子间相互作用和药物筛选的方法能用来在螯合脂(例如NTA-DTDA)掺入膜内后，将分子直接锚定或“移至”生物膜(例如细胞或亚细胞颗粒的膜)上，从而提供一种将具有六组氨酸或其他合适的金属亲和尾的重组分子直接移至膜表面上的方便方法。
在本发明该方面，提供了一种将重组分子直接锚定或移至生物膜上的方法，该方法包括(i)制备螯合脂或含螯合脂的脂质体的悬液；(ii)将细胞或生物膜结构悬液与螯合脂悬液一起温育；(iii)洗去过量的或未掺入的脂；(iv)将该膜结构与含有合适的金属亲和尾的重组蛋白或靶分子溶液一起温育；和(v)洗去过量的或未结合的可溶蛋白，并将该结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
在一个优选实施方案中，本发明允许用下列方法将分子移至细胞和其他膜结构上(i)用PBS或其他水性缓冲液洗涤细胞或膜结构悬液，以除去过量的可溶性和/或松散结合的蛋白质。这可如下进行通过适当离心(例如，对于鼠和人细胞，200-500×g离心5分钟)沉淀该结构，然后将其重悬浮于PBS中；根据结构，可通过过滤或其他洗涤方法除去过量的可溶性或松散结合的蛋白质；(ii)通过在PBS溶液中超声处理适量的脂5-10分钟，在含有大约相等浓度的Zn2+或Ni2+的PBS中制备螯合脂悬液(例如NTA-DTDA，浓度为～0.1mM)。其他脂类或磷脂(例如POPC)或其他试剂也能与螯合脂一起存在，以促进脂质体向膜结构中的融合和掺入；(iii)将细胞或膜结构与螯合脂(例如0.1mM NTA-DTDA)在PBS中的悬液，在使悬液中的某些脂类能融合和/或掺入结构中的适当时间内和温度下(例如30分钟，37℃)，一起温育。注意可改变使用的温育条件，来适应使用的螯合脂和将要掺入脂类的特定膜结构的性质；另外，在含有添加剂如聚乙二醇的缓冲液中的温育或洗涤步骤能用来促进脂类融合和掺入；(iv)通过如以上步骤(i)的沉淀和洗涤，用PBS洗涤膜结构，从混合物中除去未结合的脂；(v)将洗涤过的含掺入螯合脂的结构与重组蛋白溶液或不同重组蛋白混合物溶液一起温育，这些重组蛋白均含有六组氨酸或其他任何合适的金属亲和尾；和(vi)用PBS洗涤细胞或结构(如以上步骤(i))，除去过量的或未结合的可溶重组蛋白。
能用一种类似的方法将标记蛋白质移至任何细胞或亚细胞膜成分中。这样处理的结构将含有由于移入的蛋白质而修饰的表面，并能在接种中用来改变体内免疫应答。当在体内施用时，这些结构也能用来导向体内的特定细胞型或组织，从而改变这些细胞的功能。例如，含已知可结合树突细胞上受体的分子的肿瘤细胞的移入能用来将移入的肿瘤细胞导向树突细胞，以增强肿瘤抗原递呈，从而增强对肿瘤的免疫应答。
在该形式中，本发明涉及一种将重组受体和其他分子直接锚定或移至生物膜如细胞膜上，于是改变这些膜的性质的方法。特别是，本发明为修饰能掺入螯合脂的细胞(例如肿瘤细胞)、任何细胞或亚细胞膜成分、传染剂或颗粒(例如细菌)，以及任何生物或合成膜(包括合成囊泡或脂质体)的表面的方便策略提供基础。在所有这些情况中，通过蛋白质上的肽尾与掺入膜结构中的螯合脂上的NTA首基之间形成金属螯合键，移入重组蛋白。生物膜通过锚定具有合适的尾的任何重组蛋白、糖蛋白和其他任何分子结构而修饰，并且在作为疫苗或试剂在体内施用，用于将这些生物膜导向特定细胞和组织中时，用来增强对疾病的免疫。
根据本发明此方面的合适的分子的例子包括治疗分子、药物化合物和核酸分子，如RNA和DNA。一种特别有用的分子是VEGF或其同源物。VEGF及其同源物也可用于将脂质体导向携带VEGF受体的细胞。因此，本发明此方面涉及的分子包括在靶组织上具有结合配偶体的分子。优选地，这些分子移入、锚定或包封于脂质体内。
本发明另一方面用于改变靶细胞的免疫原性。这可通过导入外源多肽、多糖、糖蛋白、受体、配体和其他分子容易地实现。改变细胞如肿瘤细胞的免疫原性是增强对肿瘤细胞免疫应答的一种有用的方法。
因此，本发明另一方面涉及一种改变靶细胞或其膜成分的免疫原性的方法，该方法包括通过下列步骤将一种分子锚定于该靶细胞的膜上(i)制备螯合脂或含螯合脂的脂质体的悬液；(ii)将细胞或膜结构悬液与螯合脂悬液一起温育；(iii)洗去过量的或未掺入的脂；(iv)将该膜结构与将要锚定的分子的溶液一起温育；和(v)洗去过量的或未结合的可溶蛋白，并将该结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
在一个更特别的实施方案中，本发明涉及一种将脂质体或膜结构导向特定细胞型或组织的方法，该方法包括通过下列步骤将一种具有结合配偶体的分子锚定或移至所定向的特定细胞或组织上(i)制备螯合脂或含螯合脂的脂质体的悬液；(ii)将细胞或膜结构悬液与螯合脂悬液一起温育；(iii)洗去过量的或未掺入的脂；(iv)将该膜结构与将要锚定的分子的溶液一起温育；和
(v)洗去过量的或未结合的可溶蛋白，并将该结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
如上所述，本发明的方法提供改变细胞免疫原性的方法。因此，本发明提供一种治疗方法，该方法包括对患者施用有效量的脂质体制剂或膜物质，其含有活性物质，和任选的具有结合配偶体或靶组织的锚定或移入的分子。
活性物质的例子包括但不限于重组多肽、共刺激分子、治疗药物或核酸分子。在一个实施例中，VEGF掺入脂质体中，导向细胞毒性药物，以阻断肿瘤生长所需的新血管的生长。
本发明另一方面提供一种含有细胞或膜物质疫苗组合物，其中已经移入了能改变对施用疫苗的患者的免疫应答的分子，该疫苗还含有一种或多种药学载体和/或稀释剂。优选地，移入细胞或膜物质的分子是共刺激分子。此外，该疫苗优选地通过下列步骤产生(i)将细胞或膜物质与螯合脂如NTA-DTDA一起温育，使脂掺入细胞或膜中；(ii)通过离心或过滤，并将这些结构重悬浮于合适的溶液或缓冲液中，洗去任何未掺入的脂；(iii)将掺有螯合脂的膜结构与将要移入的分子温育；(iv)洗去未掺入的分子物质。
因此，本发明能向肿瘤细胞膜中掺入螯合脂如NTA-DTDA，随后移入含有合适的尾的重组共刺激和/或其他分子(或分子的组合)，这可能是发展基于细胞的疫苗来增强肿瘤免疫的一种方便方法。类似于得到证明的其改变肿瘤免疫的能力，预期该技术也能提供一种方便的方法，用于将特定共刺激和/或其他细胞表面分子(或这些分子的组合)移至其他细胞型包括T细胞、B细胞和树突细胞上，来观察这些分子在调节免疫功能中起什么作用。因此，除了其在癌症免疫治疗中的潜在用途之外，此处所述的技术在显著提高我们对免疫功能的理解方面具有用途。
本发明还提供含有移入、包封和/或锚定的试剂的膜系统在生产用于改变动物免疫应答的药物中的用途。
根据本发明的优选动物是人、灵长类动物、家畜、实验动物和捕获的野生动物。
术语如“锚定”和“移入”在本说明书中可交替使用。术语“移入(engrafting)”也包括术语“移植(grafting)”。术语“膜”和“脂膜”包括生物和合成的膜以及脂层。术语“层”或其复数包括单层和多层如双层。“螯合脂”可以是任何合适的螯合脂，例如但不限于NTA-DTDA。
以下的材料与方法涉及下列某些实施例。试剂在所有实验中使用分析级试剂。低聚甲醛获自BDH Chemicals。ZnSO4用于向所有缓冲液和生长培养基中添加Zn2+。RPMI 1640和EMEM(Eagles基本必需培养基)都获自Gibco(Life Technologies，Melbourne，澳大利亚)。胎牛血清(FCS)获自Trace Scientific(Noble Park，Vic.澳大利亚)。磺基-NHS-LC-生物素获自Pierce(Rockford，IL)。Na51CrO4、[3H]-胸苷和异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的链霉亲和素(链霉亲和素-FITC)获自Amersham(UK)。二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、α-棕榈酰-β油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、二肉豆蔻酰-磷脂酰胆碱(DMPC)、Isopaque、ficoll、没食子酸丙酯和聚乙二醇(PEG)制剂PEG400、PEG600、PEG900和PEG1500全部获自Sigma-Aldrich Pty Ltd(Castle Hill，NSW，澳大利亚)。供TopcountNXT微量板闪烁计数仪使用的MicroScint闪烁液和其他物品如滤片和96孔板封盖获自Canberra Packard(Canberra，ACT，澳大利亚)。小鼠和细胞系雌性或雄性DBA/2J小鼠(H-2d)用于为了T细胞增殖分离淋巴组织(脾脏)，测定T细胞毒性，接种和监测体内肿瘤生长。C57BL/6J小鼠(H-2b)在实验中用于估测T细胞增殖的异体刺激。小鼠在6-8周龄时使用，获自Animal Breeding Establishment，John Curtin School of MedicalResearch(JCSMR)，澳大利亚国立大学(ANU)，堪培拉。鼠细胞系P815[鼠DBA/2(H-2d)肥大细胞瘤]和EL4[鼠C57BL/6(H-2b)]T细胞淋巴瘤分别从P.Waring(免疫学与细胞生物学室，JCSMR)和H.O’Neill(生物化学与分子生物学室)博士，ANU处获得。这两种细胞系都在由含10％v/v FCS的EMEM组成的完全培养基中培养。NTA-DTDA的合成由次氮基三乙酸(NTA)首基与双十四烷胺(DTDA)共价连接组成的螯合脂次氮基三乙酸双十四烷胺(NTA-DTDA)，由C.Easton博士(ReserchSchool of Chemistry，ANU)按照类似于以前所述的方法(25)合成。简言之，DTDA由溴十四烷和氨合成。DTDA然后用琥珀酸酐N-琥珀酰化，产生N-琥珀酰-DTDA(DTDA-suc)，它与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应，产生N-[(羟基琥珀酰亚胺酰)琥珀酰]-DTDA(DTDA-suc-NHS)。DTDA-suc-NHS的琥珀酸亚胺基被替换为Nα-叔丁氧基羰基-赖氨酸(N-Bos-lys)基，除去丁氧基羰基(Boc)，产生Nε-[(DTDA)琥珀酰]-L-赖氨酸(DTDA-suc-Lys)。DTDA-suc-Lys最后与溴乙酸反应，产生Nα，Nε-双[羰基甲基]-Nε-[(DTDA)suc]-L-赖氨酸，它被称为NTA-DTDA。每种产物的纯度通过薄层层析测定，终产物的身份通过核磁共振光谱法、傅立叶红外光谱法和质谱法证实。终产物的纯度估计超过99％。NTA-DTDA脂质体悬液的制备为了向细胞中掺入NTA-DTDA，通过用TOSCO 100W超声波破碎机以最大振幅超声处理2分钟，将干燥的NTA-DTDA悬浮于含0.5mM Zn2+的PBS中至浓度0.5mM。用相同步骤产生DMPC悬液，和NTA-DTDA和DMPC、POPC或DPOE的混合液。脂类的贮存悬液保存于-20℃下，并在用于实验之前再次超声处理并稀释为指定浓度。单克隆抗体单克隆抗体(mAb)及其来源如下鼠抗-CD40(克隆3/23，大鼠IgG2a)和鼠抗-CD3(克隆145-2C11，美洲仓鼠IgG)mAb都获自Pharmingen；鼠抗-B7.1(克隆16-10A1，美洲仓鼠IgG)mAb由K.Shortman博士，WEHI，Melbourne惠赠。指明时，如以前所述(26)通过与磺基-LC-生物素(Pierce)反应将mAb生物素化。重组蛋白重组形式的鼠T细胞共刺激分子B7.1(CD80)和CD40胞外区，人促红细胞生成素受体(EPOR)的胞外区，均带有六组氨酸(6His)尾，分别命名为B7.1-6H、CD40-6H和EPOR-6H，用杆状病毒表达系统产生。简言之，编码鼠B7.1、CD40和EPOR胞外区的基因通过聚合酶链反应(PCR)扩增，用含有尾序列的引物经PCR将6His尾序列掺入每种基因的末端(对应于蛋白质的羧基端)。然后将构建体分别连接于pVL1393质粒杆状病毒转移载体中，用来转化大肠杆菌。筛选合适的转化子，来自这些转化子的重组pVL1393质粒与杆状病毒AcMNPV共转染SF9昆虫细胞。通过噬斑测定法筛选病毒基因组中掺有pVL1393质粒的病毒所感染的细胞，进一步扩增，并用这些病毒原种感染Express-5培养基中生长的High-5昆虫细胞。通过Ni2+-NTA亲和层析(使用Ni2+-NTA Superflow，来自QIAGENPty Ltd，Cifton Hill，Victoria，澳大利亚)，随后用Superdex-75 HR10/30柱经FPLC(Pharmacia Biotech，Upsalla，瑞典)大小排阻凝胶过滤，从重组病毒感染的High-5细胞上清液中纯化重组蛋白；经SDS-PAGE分析判断，每种蛋白质的终纯度均＞95％。对于某些实验，如以前所述(26)通过与磺基-LC-生物素(Pierce)反应将重组蛋白生物素化。蛋白质通常以0.2-0.6mg/ml的浓度在-20℃下贮存于PBS中，在用于每次实验之前，37℃融解并轻轻振荡。NTA-DTDA的掺入和掺入的优化培养的P815肿瘤细胞用PBS洗涤两次，从培养基中除去蛋白质，并以1×107细胞/ml浓度悬浮于PBS中。然后将细胞以1.8×105细胞/孔等分于96孔V底Serocluster平板(Costar，Corning，NY)中，并与溶于含125μM Zn2+的PBS中的125μM NTA-DTDA(单独或作为与所述其他脂类的混合物)或125μM DMPC(对照)一起37℃温育40分钟。温育后，用含0.1％v/v BSA的PBS(PBS-0.1％v/v BSA)洗涤3次除去未掺入的脂。通常在将细胞与生物素化的6His肽(B-6His)(0.2μg/ml)4℃温育30分钟，用PBS-0.1％v/v BSA洗涤两次，并用链霉亲和素-FITC染色后，通过FACS分析(见下文)估计掺入的NTA-DTDA的相对水平。细胞与溶于含0.1％v/v BSA的PBS(PBS-0.1％v/v BSA)中的链霉亲和素-FITC(33μg/ml)一起4℃温育30分钟，用PBS-0.1％v/v BSA洗涤三次，用2％v/v低聚甲醛PBS溶液固定，然后通过FACS分析FITC-荧光。
为了促进NTA-DTDA脂质体的融合，和NTA-DTDA向细胞膜中的掺入，检测了以前报道可加强细胞和囊泡与脂层融合的大量试剂。如上所述被等分于96孔V底Serocluster平板中的P815细胞与125μM NTA-DTDA、DMPC、POPC或DOPE，或与125μM NTA-DTDA加DMPC、POPC或DOPE(以指定的摩尔比)在含125μM Zn2+的PBS中37℃温育40分钟。对于某些实验，细胞在温育后用PEG处理沉淀细胞，悬浮于15％ PEG400中，与无血清EMEM混合并稀释10×，然后用含血清EMEM洗涤一次，用PBS-0.1％v/v BSA洗涤两次，之后向细胞中移入生物素化的重组蛋白(见下文)，并如以上对于FACS分析所述用链霉亲和素-FITC染色。向细胞上转移重组蛋白含掺入NTA-DTDA的细胞与单独(每一种为50μg/ml)或组合(100μg/ml总蛋白质，B7.1-6H∶CD40-6H摩尔比为4∶1)的纯化B7.1-6H和CD40-6H(或其生物素化形式)在96孔V底Serocluster平板中4℃温育1小时。然后用PBS-0.1％v/v BSA洗涤两次，除去未结合的蛋白质，之后用含有移入蛋白质的细胞进行免疫或用于T细胞增殖实验。对于通过FACS分析测定结合蛋白质水平的实验，细胞用链霉亲和素-FITC染色(用于含有移入生物素化蛋白质的细胞)，或首先与适当生物素化的mAb(B-mAb)温育(4℃ 30分钟)，用PBS-0.1％v/v BSA洗涤两次，然后用链霉亲和素-FITC染色。时程含有掺入NTA-DTDA和DMPC、含或不含移入CD40-6H的细胞，悬浮于含10％v/v FCS和添加50μM Zn2+的EMEM中，在12孔平底组织培养板(Linbro，ICN Biomedicals Inc，Aurora，OH)中37℃温育约2分钟(时间0)或4小时或24小时。经过指定的温育时间后，从12孔平底平板中收集细胞，转移到96孔V底Serocluster平板中，用PBS-0.1％v/v BSA洗涤两次，之后用链霉亲和素-FITC染色(用于含有NTA-DTDA和移入B-CD40-6H的细胞)，或首先与CD40-6H温育，然后用PBS-0.1％v/v BSA洗涤，并用链霉亲和素-FITC染色(用于只含NTA-DTDA的细胞)。流式细胞术荧光素激活细胞分选仪(FACS)分析用来定量在与B-6His结合后掺入细胞膜中的NTA-DTDA的相对水平，和通过掺入的NTA-DTDA锚定于细胞表面的生物素化重组蛋白的水平。流式细胞分析用装配有15mW氩离子激光器的FACSort流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行。根据前向光散射(FSC)、侧向光散射(SSC)和FITC-荧光分析细胞；高于背景的荧光强度相对偏移得到NTA-DTDA掺入水平和细胞表面上肽或重组蛋白水平的半定量测量。一般而言，对于每一条件用对数放大器收集10000个细胞的荧光信息，数据用CELLQuest(Becton Dickinson)软件处理。数据如下分析，用FSC对SSC点图判断，开启(gating)活细胞，并将荧光图绘成直方图。用对照样品作为背景，通过测定从峰到峰的荧光强度偏移，确定高于背景的荧光强度的增加倍数。独立实验的结果表示为平均值±平均数标准误(SEM)。聚焦显微镜术通过激光扫描聚焦显微镜术研究P815细胞表面上NTA-DTDA的分布，其中使用掺有与生物素化CD40-6H结合的NTA-DTDA的细胞，并用链霉亲和素-FITC染色。简言之，将细胞悬浮于包埋培养基(2％没食子酸丙酯溶于87％v/v甘油)中，沉淀到用具孔Scotch 465转移胶带形成的显微镜玻片上的0.05mm深小室中，然后用盖玻片密封小室。用MRC-500激光扫描聚焦成像系统(BioRad)检测细胞在520nm的荧光，该系统由Nikon聚焦荧光显微镜(×60 Nikon物镜)和BioRad UV-激光扫描仪和产生氩离子激光的Ion Laser Technology激光头(5425型，BioRad)组成。通过对10次连续激光扫描的Kalman平均获得图像，储存，并用图像处理计算机(BioRad)分析，用NIH Image 1.61软件处理。T细胞增殖试验如述(27)从异体或同系小鼠的脾脏中分离纯化供T细胞增殖试验中使用的T细胞。简言之，将脾脏破碎成单细胞悬液，应用Isopaque-Ficoll梯度通过密度梯度离心去除死亡细胞和红细胞。离心(400×g 20分钟)后，从梯度顶层收集活细胞，主要是淋巴细胞，悬浮于含10％v/v FCS、5×10-5M 2-β-巯基乙醇、100i.u./ml青霉素、100μg/ml新霉素、IL-2和10mM HEPES的RPMI 1640中。T细胞用平衡尼龙毛柱纯化(28)。然后将纯化的T细胞以2×104细胞/50μl/孔的浓度悬浮于96孔平底板(Cell Wells，Corning，NY)中的生长培养基中，以在5％CO2空气中37℃培养。
T细胞增殖试验如述进行(28)。同系淋巴细胞或应答细胞与γ-照射(5000rad)的刺激细胞以2×104细胞/50μl/孔的浓度共培养。刺激细胞包括原初P815肿瘤细胞，在其表面上掺有NTA-DTDA的P815细胞，和含有移入重组蛋白的P815细胞，如示。37℃共培养4天后，细胞用每孔1μCi[3H]-胸苷脉冲6小时。然后用Filtermate 196细胞收集器(Packard)收集细胞，并用MicroScint闪烁和应用Topcount软件的Topcount NXT微量滴定板闪烁计数器(Packard)估计[3H]-胸苷掺入。细胞毒性测定体内肿瘤特异性CTL的测定通过类似于Chen等人(29)所述的方法进行。同系DBA/2小鼠用PBS(对照)或1×105γ-照射(5000rad)的与移入重组蛋白的P815细胞皮下免疫。免疫14天后从小鼠中取出脾脏，如上所述，使用Isopaque-Ficoll和尼龙毛分级分离，通过密度梯度离心分离T淋巴细胞(效应T细胞)。然后将效应T细胞悬浮于温育培养基中，以1×105细胞/孔的浓度等分到24孔平底板中，与1×105γ-照射(5000rad)的原初P815细胞共培养。共培养5天后，如述(29)用标准51Cr释放试验估计效应细胞的溶细胞活性。简言之，2×106原初P815细胞用250μCi51Cr(Na51CrO4)标记90分钟。标记的靶细胞洗涤3次，并重悬浮于培养基中。效应和靶细胞与效应细胞以所示的不同效靶比37℃共温育6小时。收集上清液，用应用Topcount软件(Packard)的Topcount NXT微量滴定板闪烁计数器(Packard)估计51Cr释放。百分比裂解如下计算 动物的免疫和体内肿瘤攻击小鼠用类似于所述的方法(29)免疫。简言之，如示的PBS(对照)或1×105γ-照射的含移入重组蛋白的P815细胞，悬浮于0.2ml体积的PBS中，并用25规格针头和1ml注射器注射右背剃毛的同系DBA/2小鼠。14天后，小鼠在使用从小鼠脾脏分离的T细胞的细胞毒性测定中使用，或用1×105原初P815细胞通过皮下注射剃毛的左背攻击。为了监测肿瘤生长，通过用卡尺以毫米为单位测量两个垂直直径，每周一次对小鼠的肿瘤大小评分(29)。存活数据代表在评分时仍然存活的动物；濒死的动物在评分后实施安乐死，并且认为死于肿瘤。每种实验条件显示了一组总共10或12只小鼠的数据。
实施例1能用IAsys生物传感器研究锚定于脂层上的六组氨酸标记蛋白质的相互作用在IAsys生物传感器杯的传感表面上形成由PC和PE-NTA组成的平面膜层。图2(a)显示由形成层引起的折射系数的改变(标为Memb)；用TBS(如标记的)洗涤两次后没有信号，表明形成了稳定的层。随后，生物传感器在加入BSA后不显示折射率改变(见图2(b))，表明低水平的非特异结合。然而，加入含六组氨酸尾(在图2(b)中称为HH)的13kDa转录因子产生强信号，表明该蛋白质与膜中的NTA-PE通过NTA螯合键结合。锚定的蛋白质在用TBS洗涤并温育后不被去除，但用已知可打断螯合键的200mM咪唑(称为Imid+TBS)可去除。此外，其他分子与该蛋白质的相互作用也能容易地检测到。结果显示，六组氨酸标记的蛋白质能稳定并有效地锚定于层上，用于研究分子与生物传感器的相互作用。
实施例2锚定于脂层上的分子能侧向扩散并相互作用显微镜玻片与十八烷基三氯硅烷反应，形成十八烷单层(如上所述)。然后通过将一滴微团(例如脂质体)悬液(PC和biot-PE，10∶1)置于其上并温育2小时在单层上形成磷脂层。洗涤后，层表面用荧光素化链霉亲和素染色，与Biot-BSA在4℃下温育，然后检测荧光素荧光。初步研究显示，在这些条件下，在表面上均匀地看到荧光。但是，玻片在37℃下温育30-60分钟后，只能不连续地看到荧光区域，表明荧光素化链霉亲和素与biot-BSA形成聚集。这表明，根据温度，层上的分子能侧向扩散并相互作用。
实施例3利用本发明的技术解决当前理解CD4-MHC II类相互作用的困难此处所述的本发明的一个用途在于研究CD4与主要组织相容性复合物(MHC)II类分子的相互作用，两种主要分子参与了白细胞对免疫应答的起始。抗原特异性免疫应答起始的关键是CD4与MHC II类分子上恒定区的相互作用，这产生粘附，并稳定T细胞受体与递呈抗原之间的相互作用。尽管细胞免疫学实验强烈提示，这种相互作用对于有效的T细胞激活和免疫应答的引发是关键的，但迄今为止还没有获得这种相互作用或其如何发生的直接证据。
最近对人MHC II类(HLA-DR1)分子胞外部分三维结构的X线结晶学研究显示，该分子结晶为非共价结合的杂二聚体的二聚物。这提示MHC II类二聚化的能力也许使得对CD4受体的活性提高。人可溶性CD4的晶体结构显示CD4的D1-D2和D3-D4区以多聚体的形式结晶；但由于在溶液中不形成多聚体，自结合的亲和力必定很低。有人提出，晶体中极端浓度的可溶性CD4可显示寡聚化的自然倾向。有趣的是，生物化学证据表明，某些CD4从绵羊淋巴细胞裂解物中免疫沉淀为二硫化物连接的同型二聚体。最近，在转染子中使用CD4嵌合体，并通过化学交联细胞表面上相邻的CD4分子，也获得了人CD4能寡聚化的证据。但是，这些发现不能阐明寡聚化是否是提高CD4-MHC II类相互作用的亲合力所必需的。如下所述的技术的应用将提供纠正这一缺陷的方法。
实施例4本实施例的目的在于确定当锚定于允许侧向CD4运动的膜层上时小鼠和人CD4的胞外区是否能寡聚化。
能用原子力显微镜研究锚定于脂层上的CD4的寡聚。由90％PC和10％PE-NTA构成的磷脂层能在新切开的云母原子平表面上形成，使原子力显微镜术具有高分辨率。其过程与在生物传感器表面形成层的过程(见上)相同。此外，玻璃样材料的表面，或利用溅射技术覆盖金单层(400-1000A厚)的表面，能用化合物如分别用十八烷基三氯硅烷和十八烷硫醇适当处理，形成烃链疏水单层，它与表面共价结合，并且能与微团(例如脂质体)悬液反应，产生由结合的十八烷烃链单层和PC/PE-NTA构成的磷脂层组成的杂合层。
利用NTA螯合键能将含六组氨酸尾的CD4的重组胞外区锚定于在玻璃或云母表面形成的层上，供原子力显微镜使用。能选择一定链长度的特定PC用来产生PC/PE-NTA膜层，使膜的转变温度约为23℃(例如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)。然后开始用保持于10℃的系统进行原子力测定，以防止CD4侧向运动，并对含单体状态CD4的原子力结构作图。然后可将温度升高到37℃30-60分钟，使CD4侧向扩散并相互作用，之后再次将系统冷却到10℃，对结构作图。不同条件下CD4分子的三维原子力图应当能确定鼠CD4是否能寡聚。
IAsys生物传感器能用来测定10℃和37℃时CD4-MHC II类相互作用的结合亲和力(缔合与解离常数)，其中使用锚定于在生物传感器杯传感表面上形成的层上的CD4。在经受高于膜转变温度的温度之后，CD4与MHC II类相互作用具有更高结合亲和力的发现进一步提供了CD4胞外区已经寡聚化的证据。这些实验最初可用鼠CD4和含及不含结合肽的MHC II类进行。类似的实验也能用锚定的人CD4和可溶性人MHC II类进行。在预计以寡聚形式存在的条件下，也能在结合可溶性MHC II类之后对锚定于层上的CD4的原子力结构作图，如果相互作用稳定得可以进行分析，用以观察MHC II类结合是否能诱导结构的改变。
实施例5本实施例的目的在于确定小鼠和人MHC II类的胞外区当锚定于使MHC II类能侧向运动的层上时是否寡聚。
类似于上述对于CD4的研究，当锚定于层上时，鼠MHC II类的原子力结构能用保持于10℃的系统作图，并与37℃暴露后所观察到的相比较，来观察是否发生寡聚。这些研究也能在存在和不存在与MHC II类沟槽结合的肽的情况下进行(用于小鼠系统)，以确定结合的肽对MHCII类寡聚是否有影响。也能在结合可溶鼠CD4后对原子力结构作图，来观察这是否能诱发原子力结构的改变，和/或促进MHC II类寡聚化。生物传感器能使用膜锚定的MHC II类，在MHC II类预计以单体或寡聚体形式存在的情况下，测定与可溶性CD4相互作用的结合亲和力。在系统经受高于膜熔解温度的温度后，MHC II类对可溶性CD4具有更高结合亲和力的发现可提供MHC II类能寡聚化的另一证据。
实施例6本实施例的目的在于检验CD4的寡聚和MHC II类的寡聚均为CD4-MHC II类相互作用所必需的这一假说。
在上述实验中不能检测单体或寡聚体CD4与可溶性MHC II类的结合，和单体或寡聚体MHC II类与可溶性CD4结合，这表明CD4和MHC II类的寡聚都是稳定相互作用所必需的。如果CD4和MHC II类能显示在膜系统中寡聚，则能通过检测CD4和MHC II类在预计以寡聚形式存在的条件下是否能相互作用来检验这种可能性。其实现方法是，利用NTA螯合键将六组氨酸标记的MHC II类锚定于单层囊泡上，使囊泡暴露于37℃，使MHC II类寡聚，并用IAsys生物传感器研究这些囊泡与寡聚的CD4相互作用的能力。这可在小鼠和人体系统中进行，但由于在沟槽中含及不含肽的小鼠MHC II类可以获得，小鼠MHC在结合肽存在下可能是实现相互作用所需的正确分子证实所必需的。
该方法的可行性最近已经通过研究证明，表明生物素-PE和含PC的囊泡与锚定于在IAsys生物传感器表面形成的脂层上的链霉亲和素相互作用。图3是一张生物传感器迹线图，显示在杯的传感表面与由PC和biot-PE组成的囊泡悬液反应后，由加入IAsys生物传感器杯中引起的折射系数的改变。随后，该杯用Tris缓冲液洗涤。待平衡后，加入BSA(标为BSA)不引起折射系数的改变，表明低水平的非特异结合。加入链霉亲和素(标为Strep)引起折射率改变，而在用Tris缓冲液(标为Tris)洗涤后不改变。加入由PC(标为PC)制成的囊泡悬液不能与膜结合，但加入由PC和biot-PC制成的囊泡可与膜相互作用，反映含biot-PE的囊泡与锚定于膜上的链霉亲和素结合。
实施例7由于上述实施例使用重组形式的受体分子胞外区，因此寡聚只有当起因于通过分子胞外区的相互作用时才能检测到。对于许多受体，不可能存在困难，因为跨膜和胞内区都较短，且不可能参与寡聚。当然，对于上述CD4和MHC II类，X线结晶研究也支持这种观点，这些研究显示分子的胞外域都能在无其他分子(例如细胞质中的分子)的情况下自发地二聚/寡聚。然而，该技术的其他用途也包括受体分子的细胞质或跨膜域向模型膜上的锚定，用以研究其在寡聚中和/或在与参与信号转导的其他膜相关或细胞质分子相互作用中的参与。
该技术的另一个有用的用途是研究CD2与其配体的相互作用。因此，多聚结合技术的应用已经确定糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的分子CD59是人CD2的备选配体，但生物传感器研究不能证实CD2与单体可溶性CD59的相互作用。这表明这种相互作用有低亲和力，CD59的寡聚可能是与CD2形成稳定相互作用所需要的。显然，类似于以上用于研究CD4-MHC相互作用的技术，CD59向与生物传感器和原子力分析偶联的脂层上的锚定尤其可用于确定CD59的寡聚是否是与CD2的相互作用所必需的。该技术也特别适合于研究其他GPI-锚定受体分子相互作用。这些受体分子能如下被锚定于膜上，直接通过天然GPI锚，或通过构造六组氨酸尾替换天然GPI部分，并利用六组氨酸-NTA螯合键将受体锚定于膜上。
此处所述实施例证实，与上述技术结合的技术尤其可用于分析其他低亲和力分子相互作用。该技术也能用来在结合合适的六组氨酸尾并将分子锚定于层膜系统上之后，测定受体域、蛋白质、糖蛋白、多糖或其片段之间的相互作用或聚集事件。这提供了一种筛选可影响这些受体相互作用的试剂或药物的方法。因此本发明为筛选可影响受体相互作用、因此影响受体转导膜信号和/或引发生物系统反应的药物或其他试剂的新方法提供了基础。
实施例8利用本发明将六组氨酸标记的分子锚定或移至细胞表面和其他生物和合成膜上(参见图4)，用于疫苗的研发和药物导向。
图5的直方图显示鼠肥大细胞瘤P815细胞的荧光激活细胞分选(FASC)图，这些细胞携带移入的重组六组氨酸标记鼠B7.1和CD40。P815细胞与对照脂二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC；也称为di-C14-PC；对照)或螯合脂NTA-DTDA的悬液(0.1mM)37℃预温育30分钟，之后用PBS洗涤，并与六组氨酸标记的B7.1和CD40(每一种为～20mg/ml)的混合物温育。然后再次用PBS洗涤细胞，并通过与所述生物素化16-10A1或生物素化B-3/23单克隆抗体(即生物素化抗-B7.1或抗-CD40)温育(4℃30分钟)，随后与FITC-结合的链霉亲和素温育染色。与DMPC和重组蛋白温育的细胞在用任一种单克隆抗体染色后显示低水平荧光(对照)。与NTA-DTDA预温育的P815细胞的荧光比与DMPC预温育的细胞(对照)高10-100倍。每一结果都代表一式两份进行的两次实验。结果显示螯合脂(在该情况下为NTA-DTDA)能掺入这些细胞膜中，掺入的脂类能用来将六组氨酸标记的B7.1和CD40通过NTA-DTDA直接锚定或移至P815细胞表面。在其他研究中，我们显示，携带六组氨酸尾的重组鼠B7.1和CD40能被移至测试的所有不同细胞系表面；其包括鼠P815和EL4肿瘤细胞、人白血病Jurkat细胞和酵母细胞。
实施例9本实施例涉及修饰肿瘤细胞表面，以增强肿瘤免疫。
最近的研究表明，B7-1和B7-2的跨膜和细胞质区不是T细胞共刺激所必需的(23)，当B7-1在肿瘤细胞表面以GPI锚定形式表达时也发生T细胞共刺激(24)。此外，也能产生任何细胞表面受体分子(如鼠T细胞共刺激分子B7.1和CD40)的胞外区，使之在羧基端含有六组氨酸或其他合适的肽尾。以这种形式，本发明提供一种将这些共刺激分子以正确方向直接锚定于细胞表面的方法，从而模拟抗原递呈细胞表面上这些分子的共刺激功能。因此本发明可通过提供一种更方便、安全的转染备选方法，用于使肿瘤细胞上的共刺激和/或其他相关分子在免疫中用于增强对肿瘤的免疫，用于肿瘤疫苗研发。
利用移入分子的生存力能通过测定取决于结合分子的功能反应来检测。因此，携带移入六组氨酸标记B7.1和/或CD40的鼠P815肥大细胞瘤(DBA/2，H-2d)细胞在异体系统中刺激T细胞增殖反应的能力，用从C578l/6(H-2b)小鼠分离的脾细胞检测，该脾细胞与适量的γ-照射的P815细胞(作为对照)或移入六组氨酸标记的B7.1和/或CD40的P815细胞共培养。用3H胸苷掺入测定T细胞增殖的预实验显示，携带移入的六组氨酸标记的B7.1和/或CD40的P815细胞能在混合细胞反应中刺激水平提高的T细胞增殖。这些结果与可用于修饰细胞以在接种中用来增强抗肿瘤反应的发明一致。
实施例10为了测试携带移入的共刺激分子的P815细胞诱导体内抗肿瘤反应的能力，用携带移入分子的P815细胞免疫小鼠，观察这是否能在同系动物中刺激CTL活性和/或影响肿瘤生长。各组DBA/2小鼠用PBS或γ-照射的携带移入的EPOR-6H、B7.1-6H或B7.1-6H加CD40-6H的P815细胞免疫。免疫两周后，从小鼠中取出脾脏，分离脾T细胞，并在标准51Cr释放试验中估计其杀伤原初P815细胞的能力。图6的数据显示，以指定的所有效应靶细胞比(0.5∶1，1∶1，5∶1)，来自PBS免疫小鼠(对照)的T细胞只诱导低水平(2-5％)的裂解。来自P815-EPOR(作为对照蛋白质)免疫小鼠的T细胞的裂解活性也较低，为7-16％。有趣的是，对于测试的所有效应细胞∶靶细胞比，在效应T细胞来源于携带一种或多种移入共刺激分子的P815细胞免疫的小鼠的条件下，肿瘤细胞比裂解的水平较高(见图6)。在5∶1的效应细胞靶细胞比时观察到最高细胞裂解活性，从携带移入B7.1的P815细胞、含移入B7.1和CD40的P815细胞免疫的小鼠获得的T细胞诱导的特异细胞裂解分别比从移入对照蛋白质的P815细胞免疫的小鼠获得的T细胞高3倍和5倍(见图6)。使用原初EL4细胞代替P815细胞的平行实验只显示背景水平的裂解，表明细胞裂解反应对于作为靶标的P815细胞特异。结果表明，能在用携带移入B7/CD40的P815细胞免疫的小鼠中产生针对P815细胞的CTL反应。
为了确定用携带移入共刺激分子的P815细胞免疫小鼠能否诱导肿瘤免疫，也监测用γ-照射的携带移入蛋白质的细胞免疫的小鼠组，监测其肿瘤生长和用原初P815细胞攻击后的存活率。这些结果表明，与用携带对照蛋白质的细胞免疫的小鼠相比，用携带移入共刺激分子的P815细胞免疫的小鼠有较低的肿瘤生长率。因此，在肿瘤攻击后第5周，用携带移入B7.1-6H和B7.1-6H加CD40-6H的P815细胞免疫的小鼠，平均肿瘤直径分别为3.36±1.0mm和1.1±0.9mm；用PBS和移入EPOR-6H的P815细胞免疫的小鼠，分别为10.7±2.5mm和8.3±2.7mm。只显示攻击后前5周的平均肿瘤直径所反映的肿瘤生长数据，因为此后某些动物死于肿瘤。肿瘤攻击后第14周，对照小鼠的存活率为～17％，移入B7.1的P815细胞免疫的小鼠为～30％，移入B7.1和CD40的P815细胞免疫的小鼠为～60％(见图7(a)和(b))。与观察到的CTL活性的升高一致，结果表明用携带移入共刺激分子的P815细胞免疫同系动物能抑制肿瘤生长，并在原初P815肿瘤攻击后延长动物的存活期。
实施例11血管内皮生长因子(VEGF)是～40kDa的同型二聚糖蛋白激素，也是最有力的生血管有丝分裂原之一，是一种主要的血管生成调节剂(30)。有相当多的证据表明，VEGF由肿瘤细胞和缺氧的其他细胞分泌，VEGF是实体瘤发展中的一种主要的生血管因子(31)。除了有力的生血管活性外，VEGF还可提高血管通透性，促进内皮细胞通过血管外基质的迁移，肿瘤血管生成、肿瘤扩散和转移所必需的过程(32)。人VEGF已知可通过结合高亲和力VEGF受体如激酶域受体(人KDR，或鼠flk-1)和Fms样酪氨酸激酶-1(Flt-1)刺激内皮细胞生长和分化。这些受体只在增殖的血管内皮细胞上表达，已知其表达通常由肿瘤产生的大量因子增强(30-33)。VEGF及其受体对于肿瘤生长是重要的，利用抗体(34)或重组可溶性受体域(35)中和VEGF显示出作为能抑制肿瘤生长和体内转移的制剂的治疗潜力这一事实证明了这一点。
VEGF受体基本上只是在增殖的内皮细胞上的表达表明，VEGF受体能在针对肿瘤血管形成的治疗策略中用作导向分子。能避免被免疫系统(例如肝和脾中的网状内皮系统)的吞噬细胞消灭的空间稳定的或“隐密”的脂质体(SL)的发展，最近为癌症化学治疗中的脂质体药物施用提供了较大进展(36-38)。与体内施用后被快速从血液中清除(通常在数分钟内)的常规脂质体不同，SL在几天后仍存在于血液循环中。大量研究证明了含有包封的细胞毒性药物如阿霉素的SL在治疗AIDS相关卡波西肉瘤和特征在于渗漏脉管系统的其他损伤中的治疗优点(38)。最近的研究也描述了SL向特异肿瘤的导向，导向主要利用“免疫脂质体”或含有与脂质体表面共价结合的特异抗体(或F(ab’)2片段)的脂质体实现(39)。在包封阿霉素的SL上固定导向蛋白质如抗体不改变其隐密样特征，但能赋予脂质体特异导向性质(40-43)。
在出现本发明以前，靶分子与脂质体的偶联是困难的，有可能诱导对使用的抗体的不希望的抗独特性应答。根据本发明的一个方面，两种螯合脂，次氮基三乙酸二-四-癸基胺(NTA-DTDA)和次氮基三乙酸聚乙二醇(2000)磷脂酰乙醇胺(NTA-PEG2000-PE)与重组形式的VEGF一起使用，来发展含有包封的阿霉素的SL，它们将在体内针对并特异破坏增殖的血管内皮细胞，从而阻断新血管形成和肿瘤生长。
VEGF是一种特别有吸引力的导向分子，因为VEGF受体基本上只在生血管内皮上表达。根据本发明，提议产生一种含有包封阿霉素和通过NTA脂类如NTA-DTDA锚定的表面VEGF的“隐密”脂质体。根据本发明提出，当体内施用时，该制剂将针对并破坏增殖的内皮细胞，并将抑制肿瘤发生和肿瘤转移。
主要由常规脂类如卵黄磷脂酰胆碱(PC)和胆固醇(Chol)和小比例(～10％)空间“稳定”脂类如神经节苷脂GM1(35)或与聚乙二醇(2000)结合的磷脂酰乙醇胺(PEG2000-PE)组成的脂质体(36，37)，据报道显示提高的稳定性和在血液中延长的循环时间，大多数能避免被网状内皮系统消灭。SL的这些性质已经归因于存在含有不带电首基的脂类，它们能增强与水的相互作用，但抑制与可能存在于血浆中蛋白质和细胞上的带电或疏水结构的相互作用(35，36)。有证据表明，含有与SL表面上PEG链远端结合的抗体分子的SL(或免疫脂质体)，比含有直接结合于SL表面上的抗体的脂质体更有效地与其靶标结合。这已经用PEG链在这些条件下空间干扰抗体与抗原相互作用的能力来解释(40)。因此，用神经节苷脂GM1或有较短PEG链长的PEG-脂类(例如PEG750-PE，而不是PEG2000-PE)制成的SL，可能更适于6His-VEGF与脂质体表面上NTA-DTDA的直接结合，并用于移入的VEGF与靶细胞上VEGF受体的最佳结合。神经节苷脂GM1和PEG750-PE都可购得(来自Avanti Polar Lipids)，均用由PC、Chol和NTA-DTDA构成的脂质体检测。为了进一步减少可能的空间作用，发明者生产了一种新型脂类，即NTA-PEG2000-PE，它由与PE上PEG链远端结合的NTA基团组成。该化合物与PEG2000-PE结合使用，生产允许方便地移入导向6His-蛋白质(如6His-VEGF)的SL，而消除空间阻碍的可能性。这一研究大大促进了SL在需要导向特定细胞和/或组织的治疗用途中的应用。
生产了重组6His-VEGF。SL由包括PC、Chol、NTA-DTDA和“隐密”脂类如神经节苷脂GM1、PEG2000-PE和NTA-PEG2000-PE在内的脂类混合物产生。SL中移入6His-VEGF(VEGF-SL)，然后估计其导向内皮细胞的能力。相对于脂质体与缺乏VEGF受体的细胞的结合，优化与培养中的增殖内皮细胞特异结合的条件。包封阿霉素的VEGF-SL的特异细胞毒性将用人血管内皮细胞体外估计。向小鼠中静脉施用荧光染料和/或放射性示踪剂标记的VEGF-SL，确定其随时间在不同组织中的分布。改变用于生产SL的每种稳定脂类的比例，来优化脂质体的“隐密”性质，这根据肝脏、脾脏和其他主要器官与血管化肿瘤相比吸收脂质体的比例减少来判断。由于VEGF受体在结合配体后被胞吞，含有包囊的阿霉素的VEGF-SL被增殖的血管内皮细胞吸收，致使其被破坏。通过检查脂质体抑制肿瘤生长和/或消灭体内建立的肿瘤的能力，测试该方法的能力。该研究因此提供一种抗血管生成癌症治疗的新方法。
实施例12用来向膜上锚定蛋白质的方法也用来将重组受体移至细胞上，当使用时，疫苗能改变体内免疫应答。
这被下列事实证明，移入共刺激分子B7.1和CD40的P815细胞能用作疫苗来增强肿瘤免疫。类似地，这些或其他任何重组蛋白或分子(具有合适的尾)可被移至其他任何生物膜结构上(例如来源于细胞和/或亚细胞成分的膜结构，如质膜囊泡等)。移入的结构然后能用作疫苗，来增强肿瘤免疫和/或为了治疗目的改变体内免疫应答。优选方法包括(i)将细胞或膜物质与螯合脂如NTA-DTDA一起温育，使脂掺入细胞或膜中；(ii)通过离心或过滤，并将这些结构重悬浮于合适的溶液或缓冲液中，洗去任何未掺入的脂；
(iii)将掺有螯合脂的膜结构与具有适当亲和尾的适当重组蛋白温育；和(iv)洗去未掺入的蛋白质物质。
然后用修饰的结构作为可体内施用的疫苗，用于治疗目的，如改变体内免疫应答。
本方法也能使用合成膜结构(即由任何磷脂(例如PC或PE)与NTA-DTDA的混合物组成的合成脂质体或囊泡)。合成结构中能掺入NTA-DTDA，因此，只需要以上的步骤(iii)-(v)。
实施例13初步实验表明，移入适当重组受体蛋白的合成脂质体(由所述PC和NTA-DTDA以10∶1的比例组成)能用来特异地导向带有同源受体或配体的靶细胞(见图8)。这些脂质体也能用来改变生物应答(见图9)。本发明因此提供一种将重组蛋白移至脂质体上的方法，以在治疗用途中用来向体内细胞或组织中输送包封的药物或其他治疗剂。这些脂质体用来改变生物反应，用于疾病的治疗，或定向细胞毒性药物或试剂向特定细胞(例如肿瘤细胞)的输送，以为了治疗目的破坏这些细胞。
本领域技术人员应当理解，此处所述的本发明可以具有特定描述之外的变化和修改。应当理解，本发明包括所有这些变化和修改。本发明也包括单个或组合的本说明书中提及或指出的所有步骤、特点、组合物和化合物，以及任两种或多种所述步骤或特征中的任一个和全部组合。
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权利要求
1.一种将受体域锚定于在层上排列有两亲性分子的平面支持膜上的方法，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合修饰，使得某些金属螯合基团朝向该膜的外表面；该方法包括下列步骤在足以使多肽尾通过该膜的面向外金属螯合残基与膜结合的条件下，使与多肽尾共价结合的受体域与该膜相互作用一定时间，使得受体域能侧向运动、二聚化或寡聚化，并与配体分子相互作用。
2.根据权利要求1的方法，其中金属螯合基团是次氮基三乙酸(NTA)。
3.根据权利要求2的方法，其中膜由两亲性分子的微团或脂质体悬液形成。
4.根据权利要求2的方法，其中通过向两亲性分子在有机溶剂中的溶液中加入水或水性缓冲液形成膜。
5.根据权利要求3或4的方法，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合修饰。
6.一种将受体域锚定于脂膜上，使受体域能够侧向运动的方法，该方法包括(i)通过下列任一方法，在合适的平面支持物上形成膜(a)使支持物与两亲性分子在有机溶剂中的溶液接触并温育一段时间，其中一部分分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后通过加入水或水性缓冲液形成膜；或者(b)由两亲性分子形成微团(例如脂质体)悬液，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后在足以形成膜层的条件下使该微团(例如脂质体)悬液与合适的平面支持物相互作用一段时间，其中与该微团(例如脂质体)悬液的两亲性分子结合的某些金属螯合残基朝向膜的外表面；和(ii)在足以使多肽尾通过金属螯合键与膜的面向外的金属螯合残基结合的条件下，使与多肽尾共价结合的将要锚定的受体域与该膜相互作用一段时间。
7.根据权利要求1或6的方法，其中两亲性分子通常是含有亲水“头”部分和一个或多个疏水“尾”的表面活性剂。
8.一种将受体域锚定于脂膜上，使得该受体域能够侧向运动，以促进与膜中生物分子相互作用的方法，该方法包括(i)通过下列任一方法，在合适的平面支持物上形成膜(a)使支持物与两亲性分子在有机溶剂中的溶液接触并温育一段时间，其中一部分分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后通过加入水或水性缓冲液形成膜；或者(b)由第一种磷脂和第二种磷脂形成微团(例如脂质体)悬液，其中第二种磷脂已经通过次氮基三乙酸(NTA)的共价结合而修饰，然后在足以形成磷脂膜层的条件下使该微团(例如脂质体)悬液与合适的平面支持物相互作用一段时间，其中与该微团(例如脂质体)悬液的第二种磷脂结合的某些NTA残基朝向膜的外表面；和(ii)在足以使多肽尾通过NTA-金属螯合键与膜的面向外的NTA残基结合的条件下，使与多肽尾共价结合的将要锚定的受体域与该膜相互作用一段时间。
9.根据权利要求8的方法，其中第一种磷脂是磷脂酰胆碱(PC)，第二种脂是磷脂酰乙醇胺-NTA(PE-NTA)，PC∶PE-NTA之比(w/v)约为10∶1。
10.根据上述任一权利要求的方法，其中支持物是一种光学生物传感器的传感表面，或适于用原子力显微镜术分析的云母表面。
11.根据上述任一权利要求的方法，其中多肽尾含有至少6个氨基酸残基的序列。
12.根据权利要求11的方法，其中六氨基酸残基是六组氨酸。
13.一种测定受体与配体相互作用的方法，包括下列步骤(A)通过下列方法将一种受体锚定于膜上(i)通过下列任一方法，在合适的平面支持物上形成膜(a)使支持物与两亲性分子在有机溶剂中的溶液接触并温育一段时间，其中一部分分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后通过加入水或水性缓冲液形成膜；或者(b)由两亲性分子形成微团(例如脂质体)悬液，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰，然后在足以形成膜层的条件下使该微团(例如脂质体)悬液与合适的平面支持物相互作用一段时间，其中与该微团(例如脂质体)悬液的两亲性分子结合的某些金属螯合残基朝向膜的外表面；和(ii)在足以使多肽尾通过金属螯合键与膜的面向外的金属螯合残基结合的条件下，使与多肽尾共价结合的将要锚定的受体域与该膜相互作用一段时间；(B)使这些受体分子在膜上相互作用和/或寡聚；和(C)在足以发生结合的条件下，使该锚定受体与有效浓度的配体接触一段时间，并检测这种结合。
14.根据权利要求13的方法，其中受体的相互作用和/或寡聚和/或与配体的结合通过原子力显微镜术或光学生物传感器技术检测，用于测定分子间相互作用、受体二聚/寡聚，或在筛选可影响这些过程的药物的装置中使用。
15.一种将分子移至或锚定于脂质体上的方法，该方法包括(i)制备掺有螯合脂的脂质体悬液，含或不含包封的药物或试剂；(ii)将该脂质体与含有合适的金属亲和尾的重组蛋白或靶分子温育；和(iii)必要时，通过洗涤、过滤或其他洗涤方法除去过量的蛋白质，并将其悬浮于合适的溶液中。
16.根据权利要求15的方法，其中移入、锚定或包封于脂质体内的分子是治疗性分子、药用化合物、DNA和/或RNA。
17.根据权利要求16的方法，其中移入或锚定于脂质体表面的分子是VEGF或其同源物。
18.根据权利要求17的方法，其中脂质体包封有细胞毒性药物或制剂以及移入的VEGF或其同源物，以阻断肿瘤生长所需的新血管的生长。
19.根据权利要求16的方法，其中脂质体含有一种免疫原性制剂以及一种可将脂质体导向体内不同细胞型包括免疫细胞和肿瘤细胞的制剂，以改变免疫原性或免疫应答。
20.一种将重组分子直接锚定于生物膜上的方法，该方法包括(i)制备螯合脂或含螯合脂的脂质体的悬液；(ii)将细胞或生物膜结构悬液与螯合脂悬液一起温育，以允许螯合脂掺入结构中；(iii)洗去过量的或未掺入的脂；(iv)将该膜结构与含有合适的金属亲和尾的重组蛋白或靶分子溶液一起温育；和(v)洗去过量的或未结合的可溶蛋白，并将该结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
21.根据权利要求20的方法，其中重组分子是一种共刺激分子。
22.根据权利要求20或21的方法，其中生物膜来源于一种肿瘤细胞。
23.根据权利要求20或21或22的方法，用于增强或改变对肿瘤或其他疾病的免疫。
24.根据权利要求20的方法，其中重组分子是一种受体或配体。
25.根据权利要求24的方法，其中重组分子是体内特定细胞型上的受体的一种配体，或作为疾病后果而产生的细胞如肿瘤细胞上的受体的一种配体。
26.一种改变靶细胞或其膜成分的免疫原性的方法，该方法包括通过下列步骤将一种分子锚定于该靶细胞的膜上(i)制备螯合脂或含螯合脂的脂质体的悬液；(ii)将细胞或膜结构悬液与螯合脂悬液一起温育；(iii)洗去过量的或未掺入的脂；(iv)将该膜结构与将要锚定的分子的溶液一起温育；和(v)洗去过量的或未结合的可溶蛋白，并将该结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
27.根据权利要求26的方法，其中靶细胞是一种肿瘤细胞。
28.根据权利要求26或27的方法，其中分子是一种配体、受体、重组蛋白、多糖、糖蛋白或抗原。
29.一种将脂质体或生物膜结构导向特定细胞或组织的方法，该方法包括通过下列步骤将一种具有结合配偶体的分子锚定或移至欲导向的特定细胞或组织上(i)制备螯合脂或含螯合脂的脂质体的悬液；(ii)将细胞或生物膜结构悬液与螯合脂悬液一起温育；(iii)洗去过量的或未掺入的脂；(iv)将该脂质体或膜结构与将要锚定的分子的溶液一起温育；和(v)洗去过量的或未结合的可溶分子，并将该结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
30.一种治疗方法，该方法包括对患者施用有效量的脂质体制剂或膜物质，其含有活性物质，和任选的具有结合配偶体或靶组织的锚定或移入的分子。
31.根据权利要求30的方法，其中活性物质是移至脂质体或膜物质表面或包封于其中的重组多肽、共刺激分子、治疗药物或核酸分子。
32.根据权利要求30或31的方法，其中锚定或移入的分子是一种受体、配体、糖蛋白、多糖或重组多肽。
33.根据权利要求32的方法，其中锚定分子是VEGF。
34.根据权利要求30-33任一项的方法，其用来增强对特定肿瘤或疾病的免疫。
35.根据权利要求31的方法，其中共刺激分子是CD40或B7.1。
36.一种包含细胞或膜物质的疫苗组合物，其中移入了能改变对施用疫苗的患者之免疫应答的分子，该疫苗还包含一种或多种药学载体和/或稀释剂。
37.根据权利要求36的疫苗，其中移至细胞或膜物质的分子是共刺激分子。
38.通过下列步骤制备的根据权利要求36或37的疫苗(i)将脂质体细胞或膜物质与螯合脂如NTA-DTDA一起温育，使脂掺入细胞或膜中；(ii)通过离心或过滤，并将这些脂质体、细胞或膜结构重悬浮于合适的溶液或缓冲液中，洗去任何未掺入的脂；(iii)将带有掺入的螯合脂的膜结构、脂质体、细胞与将要移入的分子温育；和(iv)洗去未掺入的分子物质。
全文摘要
本发明一般地涉及向模型和生物膜系统锚定分子,涉及锚定分子在测定分子间相互作用和改变生物反应中的用途。一种形式,本发明为筛选可影响分子间相互作用的药物和其他试剂的新方法提供基础。另一种形式,本发明提供一种改变生物和/或合成膜和脂质体的性质的方法,目的在于当用作疫苗时改变免疫性,或者当体内施用时向特定细胞或组织导向药物和其他试剂,用于治疗目的或改变生理反应或功能。
文档编号A61K31/7088GK1356910SQ00809174
公开日2002年7月3日 申请日期2000年4月28日 优先权日1999年4月28日
发明者J·奥尔廷, C·R·帕里什 申请人:澳大利亚国立大学