由原核核酸结合蛋白介导的分子物质转移法的制作方法

专利名称：由原核核酸结合蛋白介导的分子物质转移法的制作方法
技术领域：
和现有技术状况转染是指，为了实现基因在细胞中的表达，引入核酸，如核苷酸、反义RNA、核酶、尤其是以质粒、染色体或染色体片段形式存在的DNA的过程。在此所用，术语转移是与之类似的，而在通常语言惯用法中，术语转染专门用于描述基因转移。除了核酸转移以外，附加活性物质如蛋白、肽、治疗药物和其他分子物质的定向有效转化也很重要。转移过程在生物医学基础研究和生物技术制药工业领域均具有重要意义。一些蛋白，其中含有治疗相关蛋白，只有在真核细胞中生产时，才能正确加工，因为甚至在翻译后也能对蛋白进行修饰的修饰机器在原核生物中多半不存在或者显著不同。相反，其它蛋白则利于在原核宿主细胞中生产，因为在原核宿主细胞中，可以经济方便地生产大量蛋白。此外，特定基因的转染和定向表达是一种在细胞和分子生物学中对生物过程进行定性描述和分析的重要手段。谈及产生具有新特性和含有新成分的植物(转基因植物)或抗除草剂植物，细胞转染是植物技术中一种重要方法。最后，在生物医学研究领域，定时用单链核酸(单链DNA或单链RNA)，或核酸衍生物[例如，肽核酸(peptide nucleic acids，PNAs)]转染细胞，这些物质作为效应子发生细胞内效应，例如通过所谓反义核酸技术专一性抑制蛋白合成。对于所有这些过程和方法中，相关核酸的特定转移是重要工序。
同样地，可以直接地将蛋白或肽运输进细胞的方法也是有关联的；此方法最重要的应用在治疗领域。例如，细胞内的抗体可被用来识别细胞内特定病原体并抑制它们。实现这一目的的一种方法是大分子物质进入靶细胞的电穿孔法；但是这种方法只能在体内应用，效率低并对细胞存在相对高的浪费(参见E.J.Verspohl，I.Kaiserling-Buddemeier，A.Wienecke，将特异抗体导入电渗透细胞是一种去除细胞特定功能的重要方法，Cell.Biochem.Funct.Vol.15，127-134，1997)。
根据目前技术水平，对于将核酸转移进细胞而言，已有几种方法。其中有，如同前面提及的蛋白转移方法一样的物理方法，例如电穿孔法，其中通过与电场接触，细胞膜被穿孔，从而使大分子物质可以透过。然而，对于敏感细胞而言，电穿孔法常常存在困难，并且伴随低的细胞存活率。就真核细胞来说，根据现有技术水平，最常使用化学法，例如磷酸钙与DNA共沉淀法、高分子复合物形成法，如从DEAE-(二乙氨乙基-)葡聚糖法和DNA(参见Y.W.Yang & J.C.Yang，DEAE-葡聚糖介导的基因转移研究，Biotechnol.Appl.Biochem.1997，Vol.25，47-51)或带有DNA的树状体形成法(参见J.F.Kukowska-Latallo，A.U.Bielinska，J.Johnson，R.Spindler，D.A.Tomalia，& J.R.BakerJr.，利用Starburst聚酰胺型胺类树状体法将遗传物质高效转移进哺乳动物细胞，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996，Vol.93，4897-4902)。这些转染试剂的作用机制是首先，将长的具有一定机械强度的线状核酸分子进行压缩；在多数情况下，这种压缩是核酸成功吸收进入细胞的重要先决条件。偶尔，可以利用多聚阳离子例如纯的或修饰的多聚赖氨酸介导转移(例如，参见专利WO 98/06869)。
在医药应用中，优选以阳离子脂类物质为基础的脂质体系统进行转移；该系统具有高效的优点。于是，出现了用不同来源和成分的的阳离子脂质体包合核酸的包合物(参见商业产品，如Invitrogen公司的PerFect，Roche公司的FuGene，Life Technologies公司的Lipofectamine，Biontex公司的PolyFectin，及Stratagene公司的LipoTaxi)。有关此方面的全面、最新的综述可以参见文献R.J.Lee&L.Huang，进行基因转移的脂类载体系统，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.1997，Vol.14，173-206。相当大量国际专利主要区别就在于所用脂质体的配方不同。
然而，这些所述的技术和试剂分别具有不同的缺点。一方面，现存系统(除了基于脂质体的系统)效率相当低，产量只占被转染细胞的几个百分点。另一方面，有效试剂(基于脂质体的)往往会增加毒性，尤其对敏感真核细胞。其他的不良特点也已被描述；例如用DEAE-葡聚糖法转染依附的真核细胞时，微弱附着的细胞会从细胞培养皿的底部产生脱落。而且，没有立即表现细胞毒性的转染试剂可能具有影响转染后细胞的特性。另外，现有的新一代转染试剂如树状体(Superfect产品，Qiagen公司生产)虽然在一定的应用中仅具有微弱的毒性，但是制作相当复杂，所以很昂贵。最后，迄今为止，很多转染方法要求使用者进行大量操作，所以使用中表现出复杂和繁琐的特点；这也可能对转染分析的再现性负面影响。为达到最大转染量，必须分别针对每种细胞类型对制造商要求的转染标准方法进行修改，并且每次进行最优化实验。这些试剂大多仅适于双链DNA的运输，极少适用于单链核酸的运输，特别不适用于其他分子物质如蛋白或肽。最后一点但不是最不重要的，目前常用的转染试剂各自的组成仅为一种或少数几种分子，因而，它们的应用范围受到局限。
发明的任务就在于消除或减少上面列举的根据现有技术水平所存在的的缺点。因此，根据本发明，提供了一种如权利要求1所述的用于将核酸和/或核酸类似物、和/或多种核酸和/或多种核酸类似物和/或含氨基酸物质转移进原核或真核细胞的方法，其中●用于转移的核酸或核酸类似物，或多种核酸或多种核酸类似物，或含氨基酸物质与原核核酸结合蛋白接触，从而产生核酸、核酸类似物或多种核酸或多种核酸类似物或含氨基酸物质与此种原核核酸结合蛋白的复合物。和●随之，通过这种核酸、核酸类似物和/或多种核酸或多种核酸类似物及含氨基酸物质与原核核酸结合蛋白形成的复合物与原核或真核靶细胞接触，以便实现将复合物转移进细胞。
本发明的有利应用形式来自于本发明说明部分的次要权利要求。
发明概述本发明涉及一种用于将核酸、核酸类似物、和/或多种核酸和/或核酸类似物、和/或含氨基酸物质，尤其是核酸例如以质粒形式存在的DNA，转移进入原核或真核细胞的方法。
为了达到这一目的，通过一种原核核酸结合蛋白，在适宜的温育条件下与被转移物质的共价结合，或与被转移核酸的非共价缔合形成复合物，然后将复合体加入靶细胞中。这种原核核酸结合蛋白所具有的浓缩DNA的特性在这里特别有利于以DNA为基础活性物质的转移。对于控制吸收和增加效率而言，原核核酸结合蛋白能表现出另外的特点，例如，附加融合的形式。细胞可分别吸收蛋白和活性物质的复合体，蛋白和核酸的复合体。不同形试图示于

图1中。
本转移方法中用到了原核核酸结合蛋白，优选地来自耐热生物，更优选地来自极端嗜热生物。当核酸用作转移物质时，原核核酸结合蛋白与核酸形成可逆复合体；原核核酸结合蛋白浓缩并压缩核酸。这样，复合物可以被保护不会受到令人不快的效应的作用，例如，核酸酶的降解效应。在分别温育之后，用这种方法浓缩的核酸分子可以通过真核细胞膜或原核细胞壁被吸收进入细胞，不论是被动还是主动过程。如果一个编码基因以相应的DNA(例如，质粒)形式被用作转移核酸，这个基因则可以随后在靶细胞中表达。另一方面，如果一种蛋白或肽用作被运输的分子物质，则被转移蛋白或肽在基因技术水平上与转移蛋白之间的融合是有利的。为了提高转移效率，核酸结合蛋白可以与基于蛋白或肽的基础上的效应物结合(融合)。此外，使用在其序列中存在核酸易位的典型信号的蛋白质也是有益的。
此外，就转移效率提高和复合体生物性质而言，利用脂类物质、聚乙二醇、或其他分子来包裹复合体也是有益的。
核酸转移的一个重要要素是其浓缩程度。这种核酸分子通常具有长的不可弯曲结构，其在溶液中柔韧性很小。因为基因的总编码长度，DNA分子可以很长，就会表现出不利于转染的物理特性。本发明中，浓缩是指通过DNA线或环状质粒凝聚成致密结构，即，体积变小，以便降低DNA分子的不利的长径比。最佳的浓缩情况通过发展出几乎球形的结构而将其显现出来。核酸浓缩预示了浓缩剂的存在；在这里，浓缩剂的一个通常功能就是补偿DNA和其他核酸分子的多磷酸骨架上的负电荷。
根据本发明的条件，有利的原核核酸结合蛋白源于一种极端嗜热生物，该生物存在于75℃以上的环境中。源于此种生物的蛋白质的优点之一在于以下事实中，即，由于其特殊的稳定性特性，它们可以被方便地予以处理，例如在纯化和保存中对试剂无需冷却。而且，来源于这些生物的蛋白质易于生产和纯化，并且重组在大肠杆菌中具有高表达量。因而，这些蛋白质对抗变性的高稳定性可被用于在颇严谨的条件下进行纯化，这样就可避免制备中的可能存在的污染，例如，也包括将来自细菌脂多糖(内毒素)、脱氧核糖核酸酶、蛋白酶、核糖核酸酶等的污染限制在低于常用检测方法的检出限以下的最小量。在这一点上，优选用于本发明的TmHU蛋白(海栖热袍菌HU-蛋白)在260至300纳米波长范围内具有光谱透明特性也是有用的；这就可以很容易地从核酸和其他蛋白中快速而灵敏的分光分析污染物。根据本发明，转移试剂的纯化制剂是优选使用，以利于核酸、核酸类似物和含氨基酸物质的再现率和高效转移率，因为污染物，特别是来自细菌内毒素但也来自蛋白酶、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶可以损害转移结果。本发明方法尤其适合应用于各种敏感细胞，其他方法转化效率较低。
组蛋白是一种存在于真核细胞细胞核内的蛋白，它与核酸主要结合或完全地非专一性的结合，其目的主要在于压缩(浓缩)DNA，例如，源于蛋白质的电荷中和及疏水效应。通过这种作用，就可以降低DNA在细胞核内的有效空间需求。根据现有知识，在结构更加简单(没有细胞核)的原核生物中，组蛋白类似蛋白行使了类似的功能。例如，源于极端嗜热生物海栖热袍菌的DNA结合蛋白(组蛋白类似蛋白)，不仅在结构稳定性上优于源于真核细胞的组蛋白，而且更易于控制且结构较为简单。举例而言，真核细胞的组蛋白是由多达8个的不同蛋白亚基组成的缔合体，其中所有亚基必须分别合成，且与DNA装配形成一个复合体；此过程在体外是复杂而微妙的。在本发明中所使用的原核组蛋白类似蛋白，优选自来源于极端嗜热生物海栖热袍菌的HU蛋白。
发明者所做的试验另人惊奇的表明，这种源自极端嗜热真细菌海栖热孢菌(thermotogales种)的、具有DNA结合作用的原核组蛋白类似蛋白HU，后面称之为TmHU，不仅具有结合、保护、浓缩核酸的作用，而且还能够非常有效的将核酸运输不同的细胞类型中。此外，随后的基因表达水平高于没有任何可辨别的细胞毒性迹象的可比较的常规试剂这种转移方法简单、高效、而且在转移过程中节省时间。
以一种相同的方式，还可以将融合在TmHU上的含有氨基酸的物质，例如蛋白或肽，尤其是将蛋白，经由TmHU吸收效应被吸收进靶细胞。
另外，事实已经证明这种组蛋白类似蛋白可以在细菌，即大肠杆菌中高产重组表达，并以分光纯化方式简单、经济地分离。例如，因为源于极端嗜热生物，所以无需在冷却条件下制备和储存该蛋白。并且，最初的清洗步骤，即从大肠杆菌宿主蛋白混合物中进行HU蛋白的分离，仅为一个简单的热沉淀步骤，其中几乎只有热稳定TmHU蛋白留在溶液中。
TmHU蛋白在细胞转染上显示杰出的性能。该蛋白将核酸压缩(浓缩)为稳定的复合物，这样就能很好地保护核酸不被核酸酶降解。所形成的复合物能够有效地被吸收进细胞。
除此之外，还可以通过基因技术方式将肽或蛋白结构域与TmHU蛋白融合，这种做法可以使复合物具有修饰的特性。所以，修饰的TmHU蛋白可以增加吸收效率或增加细胞的定向吸收。对于修饰，举例而言，考虑到肽与细胞表面结构的结合；现在已知带有基序精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD序列)的肽优选地与细胞表面经常出现的αvβ3或αvβ5型整连蛋白结合。对于另外一些肽基序，已知由于它们的两性分子结构特性，它们插入到真核细胞的细胞膜中，使细胞对分子的吸收成为可能。最后，通过使用作为效应物与细胞表面受体结合的蛋白或蛋白结构域，也可以达到提高吸收效率和增加细胞类型专一性的目的。与此有关一个例子就是表皮生长因子(EGF)，其可以高度特异性地结合在表皮生长因子(EGF)受体上(在一些肿瘤细胞类型上过量表达)。这样，TmHU/EGF-DNA复合物就可以被专一性地吸收进入这类肿瘤细胞中。但是甚至在复合物被吸收进入细胞之后，粘附的功能结构域可以有助于转染效率的提高。例如，影响核内体释放的蛋白及通过核定位信号序列(NLS序列)将肽靶向吸收进入真核细胞细胞核内可被列举出来如果可行，为了提高转染效率，可将蛋白/核酸复合物进行包裹以使其与外部环境进一步分离，该包裹过程可以通过脂质体膜实现。基于现有技术水平，脂质体很容易生产；因而，可以将蛋白/核酸复合物被动包裹于脂质体中。这样的结构在使用于生物体内时具有变低的免疫原活性。另外，通过脂质体外鞘与细胞膜的融合过程，会发生细胞吸收的增加。蛋白/核酸复合物的衣壳化也可以通过其他分子物质来实现，如分子量为2000道尔顿的聚乙二醇(PEG2000)。根据现有技术水平，已经证明聚乙二醇包裹导致体内应用中免疫反应的明显降低(参见综述，M.D.Scott & K.L.Murad，细胞伪装使用聚合物蒙蔽免疫系统，Curr.Pharm.Des.1998，Vol.4，423-438)。
将核酸、核酸类似物和(或)含有氨基酸的物质转移进细胞是以转移用于转染的报告基因的编码DNA序列和转移蛋白质(GFP)进入靶细胞表现在下面每个实施例中。这里采用了已被证明适用于所述方法的原核蛋白，即源于海栖热孢菌的HU蛋白。与根据文献Robbins，Dilworth，Laskey和Dingwall，细胞杂志(Cell)，第64卷，615-623所述的转运序列RPAATKKAGQAKKK比较，此蛋白含有两个用于将蛋白转移进真核细胞的典型的核转运信号；这样，蛋白质和与之缔合的分子物质(DNA、蛋白质)的核转运被确保具有超过95％的可能性(结果由据现有技术使用的计算机软件PSORTII分析确证)。核转运对于本方法的巨大效率具有意义，尤其对于将DNA转移进细胞。但是，随后的实施例8明确显示这种蛋白不仅具有将DNA转移进细胞的能力，而且还能转移附着在TmHU上的蛋白。因而，这种蛋白也具有能够透过真核细胞膜的优点。
通过附加受体结合分子如EGF(参见，后面的实施例6)，也可以实现定向吸收进入细胞。
TmHU蛋白的一个特有优点是，在下面列举的实施例中缺乏毒性以及在转染过程中，附着细胞不会从细胞培养容器上脱落下来。这一特性使该蛋白和其他转染试剂如脂质体、合成化合物(树状聚合体)显著区分开来。同时，TmHU作为一种源自极端嗜热生物的蛋白，构成本系统使用中的特殊优点。于是，重组生产非常简单，可以确保蛋白制剂的高纯度。蛋白所具有的极高热稳定性使得即使在非常不利的环境下的长期稳定保存成为可能。尤其是，这使得形成高温转染所需的蛋白/核酸复合物成为可能。如果把DNA与TmHU蛋白以适当质量比进行混合，然后放到高温(90℃左右)环境中经过约0.5至10分钟短时间处理后会形成优良的DNA与TmHU沉淀物，该沉淀物尤其适用于高效率的转染。只有采用极度耐热的核酸结合蛋白，才使得这种处理方法成为可能。核酸与TmHU蛋白可以在通常的室温下温育0.5至180分钟，其中60分钟的温育时间往往就足够了。对于利用TmHU进行的核酸转移，已经证明在形成复合体的过程中，向TmHU/DNA混合物中加入钙是有利的，钙可以加速复合物的形成。室温下或高温下形成的沉淀物与靶细胞的温育时间取决于细胞类型和应用情形，其范围从30秒到几天。
特别适用于本发明的是源自嗜热生物，特别是极端嗜热生物的核酸结合蛋白及其衍生蛋白物。好的候选生物来自古细菌领域，尤其是以Crenarchaeota(极端嗜热古细菌)为代表，其它还有分类群Pyrodictiales、硫化叶菌目(Sulfolobales)、热变形菌目，以及还没有分类的Crenarchaeota例如Aeropyrum、Caldococcus、Cenarchaeum、Igneococcus、Pyrolobus、Sulfophobococcs、热盘菌属和Thermosphaera中的代表。在euryarchaeota中特别来自分类级热球菌目和热原体目(Thermoplasmales)的蛋白是相关的。但是，嗜热和极端嗜热的真细菌中也天然存在可在本发明所述应用框架中使用的核酸结合蛋白；例如，这些包括分类级thermosulfo-bacteria的代表、Aquificales、栖热袍菌目(Thermotogales)或属栖热菌属/异常球菌属的菌类。
除了源于极端嗜热生物和嗜热生物的蛋白以外，源于其他原核生物的蛋白也可用于进行成功的转染，如下面实施例8(使用源于大肠杆菌的HU蛋白)所表明的情况。在此，发生了核酸转染必须的原核蛋白复合物的有效形成，优选地通过在混合物中加入适当数量的钙；在此，产生良好沉淀物的加热步骤必须去除。所以，这些蛋白可以从嗜温生物中分离或形成天然蛋白的修饰结构，其中嗜温生物来自古细菌或真细菌界。作为古细菌的代表，可以指出分类群Corarcheota和Euryarchaeota。后者包括古生球菌目、盐杆菌属、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷微菌目、Methanopyrales、甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)、热球菌目和热原体属。对真细菌分类群，主要包括非嗜热和非极端嗜热生物，下述群特别适合此处Aquificales、衣原体目/疣微菌属、粪热杆菌属、蓝细菌属、噬纤维菌目/绿硫杆菌(green sulfur bacteria)、丝状杆菌/酸杆菌属、厚壁菌门、Flexitipesk、梭杆菌、全噬菌属、硝化螺菌属、浮霉状菌目(Planctomycetales)、变形杆菌(Proteobacteria)、螺旋体目(Spirochaetales)、互养菌属。
当在所述技术技术中使用原核生物作为靶细胞时，如果采用一种源自嗜热生物或极端嗜热生物的蛋白，则通过短时间加热TmHU/DNA混合物形成良好的沉淀物提供转染效率的提高。不同于简单地将TmHU/DNA复合物与原核细胞一起温育的转染方式，根据目前的技术水平，借助TmHU/DNA复合物成功进行电穿孔。所以，DNA受到了TmHU的保护并在结构上得以稳定。通过后面实施例1，证实了即使在很高的浓度下，TmHU也不会对大肠杆菌造成毒性。相似地，可以成功地将蛋白或其他分子物质转移进原核细胞。
同时，TmHU蛋白在体内可以起到保护核酸不被酶所降解的作用。在细菌细胞内重组产生的蛋白会与其中存在的核酸结合，例如质粒。以此为基础，可以生产一种系统，该系统可以在经济的条件下生产大量高纯度的核酸，并且不存在被核酸酶降解的危险。
对分子物质转移进细胞来说，特别重要的一个应用领域是使用植物细胞作为靶细胞。由于植物细胞具有的重要特点就是坚固的几乎不能透过的细胞壁，因而，当前几乎没有任何已知手段将分子物质诸如DNA或蛋白质运输进植物细胞。但是，极其稳定的TmHU/DNA复合物则可以做到这一点，使用现有技术的常规方法，例如化学转染法、电穿孔法或者甚至仅需要将TmHU/DNA复合物与之进行简单的温育就可以完转移进植物细胞的过程。所以，再次强调，TmHU中存在的核转运序列在本发明所述方法可达到的高效率方面扮演了一个重要的角色。
例如，植物的基因技术修饰可以通过培育具有较好形状的高产品种对保证世界粮食供应做出了根本性的贡献。由于植物疾病、害虫和杂草，西欧的粮食损失至少达20％。所以，本发明的一个重要应用也是植物细胞的转染。但是，迄今为止已知用于植物细胞转染的基因转移方法只有很少几种，而且都很复杂、转移不够充分且很昂贵。就这一方面而言，最常用的方法是使用一种叫做根癌土壤杆菌的能在根颈形成肿瘤的细菌，以便将DNA带入细胞。但是，这种细菌只攻击双子叶植物；而单子叶植物(其中含有重要的作物)则不受感染。其它迄今为止仍不十分有效并且特别复杂的基因转移可能方式是电穿孔和显微注射另外，还用粒子轰击(魔术子弹)法，往往可以成功但却相当昂贵。在效率和费用方面，TmHU及某种分子物质的使用可以显著优于这些转染方法。所以，特别使用了蛋白质修饰法，其中，举例来说，通过与TmHU融合的酶，在局部限制水平降解植物细胞的不易穿透的细胞壁，从而为TmHU/DNA复合物提供了适合的吸收途径。一个应用方面特别存在于产量增加领域，如通过开发较高产量和从营养生理学的角度来说更有价值的品种的(改变或增加成份含量诸如蛋白、脂肪酸、香料和淀粉)；通过避免虫害袭击(引入抗虫基因，其基因产物对相应害虫有毒性)；通过避免植物疾病和抑制杂草生长(使用抗除草剂基因)和通过引入外源基因在植物体内表达活性成份。这种应用可以通过应用本发明所述的原核核酸结合蛋白来实现，该蛋白可以将质粒DNA引入植物体中。
对于医疗应用中要进行运输的分子物质(有治疗作用的)，例如，DNA可被用来编码细胞内或细胞外作用蛋白。因而，这种具有治疗作用的DNA是以单链或双链形式导入细胞的。同样地，参考原核蛋白与具有治疗作用的单链DNA分子杂交形成特异复合物的过程，也可以想到序列特异性寡核苷酸与原核蛋白进行偶联；这将用特异性结合代替上述非特异性核酸结合。用于治疗活性物质转移的另一个出发点是与核酶形成复合物，核酶具有用于病理条件相关RNA的特异识别序列。通过与核酶结合，RNA被酶解失活。
作为一种不用核酸的另一方案，治疗也可通过将蛋白或肽类分子导入细胞进行。例如，一种免疫缺陷性病毒(HIV)的治疗方法是基于根据本发明导入的转显性(修饰的)蛋白，该蛋白然后将与细胞中的天然HIV蛋白竞争，从而抑制其功能。同样地，肽或人工合成的修饰肽可以抑制某种HIV蛋白的作用，例如，HIV蛋白酶的作用。另外，蛋白或肽可以与原核蛋白以这种方式直接融合，以致HIV蛋白酶的序列或细胞内蛋白酶的识别序列位于治疗活性物质和原核转运蛋白之间，从而在细胞内(如果可能，在感染细胞中也有特异性)将此蛋白或肽予以释放。这就可以起到特异(治疗)作用确定的施加于某种细胞类型，其中所用的原核蛋白将仅仅表现为穿过细胞的运输工具。
本发明的另一种应用是在恶性肿瘤疾病中使用抗肿瘤活性物质。要实现这一作用，形成的复合物中必须有保证活性物质进入肿瘤组织的成分。根据不同的肿瘤类型，举例来说，可以利用构建在活性物质/蛋白复合物中的抗体来实现，该抗体能与只在肿瘤细胞上存在或尽可能只在肿瘤细胞上存在的肿瘤抗原结合。实体瘤需要充足的血液供应，因而分泌具有促进肿瘤组织中新血管形成作用的生长因子。新生血管上皮细胞不断增强质膜结合整连蛋白的表达。这些受体专一性识别RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列，引起对含有RGD序列配体的受体介导胞吞作用。这种特性可以通过利用含有暴露RGD序列的肽与原核转运蛋白的融合用于定位肿瘤细胞和与其联系的上皮组织，从而引起治疗物质被吸收进入肿瘤组织。其他肿瘤在细胞表面显示出明显较高的自然EGF受体。在这样情况下，提议本身表明通过如后面实施例6所述那样将EGF结构域与原核转运蛋白融合，就可以实现对本发明所述的复合体的专一性吸收。不同受体结合特性的结合，除了提高组织专一性以外，还实现了一种治疗方案，该方案同时袭击肿瘤的几个方面并且降低了肿瘤细胞对活性物质的耐受性的形成。对于活性物质，可以使用包括单链和双链DNA或RNA的核酸。例如，它们所编码的蛋白可以通过参与细胞信号传导级联的个别时间点从而诱发细胞调亡。为扩大肿瘤专一性因而产生更大的确定性，可以使用优先在在肿瘤细胞中具有活性的转录起动子。使用同样方法，抑制基质金属蛋白酶活性的肽可被用作欲运输的分子物质。一些短肽序列对于MMP-2和MMO-9的抑制作用尤为明显。
原则上，此处所述发明还可应用于矫正先天性遗传缺陷，例如腺苷脱氨酶-缺陷症，血友病，假肥大型肌营养不良和囊肿性纤维化。这些疾病是单因性疾病，即，由单个基因缺陷造成。通常，导入该基因的正确形式足以消除或减轻这种疾病的症状。对于这些应用，必须通过稳定的染色体外载体或者通过整合到细胞内染色体上的治疗性DNA实现稳定的基因表达。对于这种情况，被转移核酸可以包含有利于整合作用的核酸序列。例如，可以使用其尾部带有腺病毒末端反向重复序列(ITR)的单链DNA，该序列在染色体整合中起作用。并且，除了治疗性的DNA或RNA以外，还可以将蛋白一起运输进细胞该蛋白可以积极地作为整合的催化剂发挥作用，例如HIV整合酶或腺病毒的Rep78和Rep68。
理想状态下，修正基因的表达是在自然启动子的控制下发生，以便同时确保合适的调控。所以，DNA和原核核酸结合蛋白复合物的细胞类型专一性靶向指向在大多情况下是不必要的。例如，对于血友病患者而言，血液凝固级联中缺乏的因子可以在肌肉组织中合成，其中这些因子是与合适的信号序列融合的，从而引起它们从细胞中被分泌出来，并到达它们的活性部位，即血流。
除了上述实施例中讨论的核酸以外，激发调亡或坏死的蛋白质或肽也可以被转移例如，细菌毒素(如，白喉毒素、霍乱毒素、肉毒杆菌毒素等)的催化活性结构域是合适的，该结构域具有高效抑制细胞内蛋白生物合成的作用，因而会激发坏死过程。所以，这种方法具有只需很少几种分子就可以杀死细胞的优势。另一种治疗性的出发点是将单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶转运进肿瘤细胞。此酶可以将核苷酸模块磷酸化，因而表现出对细胞激酶的降低的底物专一性，也使人工核苷酸例如9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌啉被磷酸化。在DNA复制出新合成的DNA链的过程中，磷酸化9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌啉也会整合进去，从而导致DNA复制终止，而复制终止反过来阻止了细胞分裂。
在实际应用的多种情形中，转运物质在细胞内的有效释放是必须的，即，物质必须成功地通过内体膜。在下面列举的实施例中，，内体释放是非限制因素，因为基因表达或蛋白转运(参见实施例7，采用绿色荧光蛋白(GFP)作为标志蛋白)是高效进行的。如果经由被吸收复合物的内体包含物则会发生限制，那么这一功能可以通过导入被转移复合体的溶血素，特别是巯基激活溶细胞素，细菌毒素的转运结构域，或某种病毒蛋白例如如腺病毒亚单位蛋白来实现。此外，这种功能也可以通过在复合物上结合的化学物质，如多聚阳离子或树状体来承担。
通常，在体内应用中，有必要尽可能地降低被吸收复合物的免疫原性。复合物本身的体液免疫源性及巨噬细胞的识别和消除作用可以通过如下面的实施例9所示的聚乙二醇掩蔽或脂双层包装来实现。例如，聚乙烯可以被化学修饰使其与特定巯基共价结合。通过与含有35至40个GA(甘氨酸-丙氨酸)的重复序列的融合，可以降低治疗性活性物质的免疫源性，即直接导入的蛋白或转录和/或翻译的蛋白。富GA序列自然存在于人埃-巴二氏病毒(EB病毒)的EBNA1蛋白中，保护该病毒蛋白不被细胞细胞蛋白酶体降解和不在主要组织相容性复合物受体上呈递。这种保护机制适用于本发明涉及的多种蛋白质和肽。
除了核酸、蛋白质和肽以外，其他分子种类也适用于本发明所述的将分子物质转移进细胞的方法。所以，肽衍生物，肽类抗生素，具有修饰侧链的蛋白如进行了荧光标记、脂环基化、乙酰化的蛋白，与糖、核酸或脂类成分偶联的肽或蛋白和类似变体均可以用同样方式整合进复合物。同样地，除了通常使用的编码(双链)质粒以外，单链DNA、单链或双链RNA、染色体DNA或染色体片段、反意RNA、核酶、催化活性RNA、核苷酸、人工合成核酸，如肽核酸(PNA)或其杂交分子也可以与原核转运蛋白结合，该结合是通过与该蛋白的核酸结合部位的相互作用或或化学方式实现。它们均适合于高效地被吸收进入。同样地，欲运输的非核酸样物质，特别是蛋白质，例如抗体、抗体类似物、蛋白结构域、糖蛋白、酶、肽、肽激素、基于氨基酸的药物活性成分、脂蛋白以及结构蛋白均在本发明的应用领域内。
被转运物质与原核转运蛋白的化合物可以看作具有不同的物理相互作用。因而，疏水作用是形成复合物的主要作用力。但是其他形式的相互作用对化合物的形成也均有贡献，例如离子相互作用、离子偶极相互作用、偶极-偶极相互作用、氢键、范德华力、色散力。最后，除了列举的非共价化合物的实施例以外，被转运物质和原核转化蛋白的共价化合物也可被产生。由此，或者进行基因水平的融合或者在作用成分的两个原子间形成化学性质上稳定的原子键。
总之，本发明所述的转移方法与目前的技术水平相比表现出如下优点●与现有方法相比具有明显更高的效率；●没有或仅有极微弱毒性；●体内应用时，没有或仅有很小的免疫原性；●生产和保存都有成本效益；●使用方法不复杂且快速；●可以转移任意化学形式的核酸；●可以转移其他通过共价或非共价结合的含氨基酸的物质，如蛋白质或肽；●很大程度上对靶细胞没有限制(例如，本方法同样适用于真核动物细胞、真核植物细胞和原核细胞)
●存在采用多种组成成份和另外粘附(融合)效应物的可能性或者存在整合更多便于细胞吸收的有益特性的包装及辅助可能性。
下面的实施例用于说明本发明的应用，但是，它们并非局限本发明的保护范围。
说明书和实施例均参考以下附图。
图1、是本发明，即核酸转运，的可能应用方法的概要图示。TmHU-蛋白(Y)指引了线性或环状核酸的浓缩。形成的蛋白/核酸复合物随后被细胞吸收(左图)。对于另外形式，例如，由受体指引的吸收(中图)或包装蛋白/核酸复合物可以发生(右图)。图2、显示用SDS-PAGE对在大肠杆菌中重组生产的TmHU蛋白的纯化分析结果。泳道1上样为大肠杆菌的细胞提取物中的可溶性部分。泳道2上样为热沉淀后的上清。泳道3上样为分子量标准(分子大小在图左侧标出)；泳道4上样为经阳离子交换柱纯化后的洗脱物。本蛋白经过不是很复杂的少数几个纯化步骤即可达到很高的纯度。图3、显示结果为天然及纯化后TmHU蛋白的分光特性。蛋白(浓度为0.5mg/ml)在280或260纳米处没有紫外吸收说明没有异源蛋白或核酸的污染；因而说明制剂非常纯净。该蛋白没有酪氨酸和色氨酸残基，因而在特定的紫外区是透光的。和预测一致，该蛋白亚基中的3个苯丙氨酸残基在257纳米处有弱吸收。图4、显示用表面等离子共振法检测TmHU蛋白与不同大小的DNA片段的结合。(●)，56bp双链DNA片段，(一)当解离常数KD为73nM，希尔(Hill)系数为7.6时，希尔方程的计算值。(○)，23bp双链DNA片段，(---)当解离常数KD为73nM，希尔系数为1.3时，希尔方程的计算值。蛋白与DNA的结合相当地强烈，对于通常大小的DNA片段(＞＞23bp)表现出高度的协作性。图5、显示典型DNA分子在受到核酸酶降解前的保护情况。使用了多种浓度的不同浓缩剂。泳道1，分子量标准；泳道2-4，TmHU(0.3，3，和15μg)；泳道5-7，组蛋白(0.3，3，30μg)；泳道8，分子量标准；泳道9-11，CTAB(5，10，100μM)；泳道12-14，亚精胺(10，100，2000μM)。在非常严格的条件下，未保护的DNA完全被降解，CTAB和亚精胺因此几乎没有提供防止降解的任何保护作用。组蛋白提供了略好的保护作用，而TmHU在本比较中提供了防止降解的最佳保护效果。图6、显示TmHU法与标准方法(DEAE-葡聚糖转染法)对比在不同细胞系中的转染效率。左侧，TmHU法转染人293T细胞；转染效率约50％。中间，TmHU法转染鼠NIH3T3细胞；转染效率约30％。右侧，用DEAE-葡聚糖法转染鼠NIH3T3细胞，转染效率达到约10％。图7、显示采用实施例5所述方法，TmHU对NIH3T3细胞的转染效率。据此形成的一个细胞培养孔的两个不同部分显示于此；显微镜的放大倍数为20。转染事件的产量经计算约为每微克所用DNA产生2500个阳性细胞。图8、显示证明将TmHU-EGF融合蛋白吸收进细胞表面表达作为肿瘤标志的EGF受体的人A431细胞的蛋白质印迹实验(Western Blot)结果。左图温育并吸收了TmHU-EGF融合蛋白的细胞裂解产物中的蛋白质Western Blot检测结果。泳道1，用TmHU-EGF进行转染；泳道2，用TmHU-EGF/DNA复合物转染；泳道3，作为抗EGF抗体的专一性的检测对照的未转染A431细胞的裂解产物；泳道4，TmHU-EGF融合蛋白(标准品)；泳道5，分子量标准的记号。右图在转染过程中，细胞上清液中TmHU-EGF消失的时间进程；用Western Blot证明。泳道1-7转染中加入DNA保温；泳道A至G转染中不加入DNA保温。泳道1，TmHU-EGF对比标准；泳道2，，0分钟；泳道3，，30分钟；泳道4，，60分钟；泳道5，，90分钟；泳道6，，120分钟；泳道7，，七小时，泳道A，，0分钟；泳道B，30分钟；泳道C，60分钟；泳道D，90分钟；泳道E，120分钟；泳道F，七小时。可以很清楚的观察到TmHU被吸收进入细胞，其中通过形成TmHU-EGF/DNA复合物产生比没有形成此复合物更加有效的吸收过程。图9、显示NIT 3T3细胞的转染培养皿的一部分的相差图象(上)和荧光条件下的显微图形(下)。细胞在培养基中温育五小时后用PBS洗涤。发出绿色荧光的细胞包含通过TmHU吸收机制已经吸收进细胞的TmHU-GFP融合蛋白。图10、用实施例的方式显示已用脂质体包裹的TmHU/DNA复合物转染的NIT 3T3细胞的两种细胞培养物。在两种沉积物中，可记录到大量的阳性转化细胞，该细胞表达报告基因，从而在检测实验中表现蓝色。
实施例1、源于海栖热袍菌的HU蛋白的克隆、在大肠杆菌中重组表达和纯化根据现有技术水平，已知克隆化DNA序列可以在原核宿主细胞中异源表达。采用标准技术(参见，Sambrook等，分子克隆实验指南(Molecular CloningALaboratory Manual)，1989，冷泉港实验室出版社)，使用寡核苷酸引物TmHU-N 5’-GGG GGT CAT ATG AAC AAA AAA GAA CTG ATC GAC AGG GTGG-3’TmHU-C 5’-TTC CGG ATC CCT ATC ACT TGA CCT TCT CTT TGA GGG C-3’以来自生物海栖热袍菌的基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增得到300bp的片段并克隆进原核表达载体pETlla(Novagen公司产品)。用质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene公司产品)并用抗青霉素LB琼脂平板筛选后，用单菌落接种预备的、含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基，于37℃摇床培养过夜。摇好的菌液按比例1∶100稀释接种于含有同样基质类型的主培养基中。主培养物在37℃摇床中继续培养，直到细菌悬浊液的光吸收值在600nm达到1.0。然后向培养液中加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导海栖热袍菌的HU基因(TmHU)的表达。随后继续培养90分钟，离心(6000g，15分钟，4℃)收集菌体后用重悬缓冲液(配方组成50mM磷酸钠；pH7.5；300mM氯化纳；5mM EDTA；1mM PMSF)重悬细胞，然后高压均浆破碎细胞。TmHU蛋白完全存在于细胞裂解液的可溶相中。加入Benzonase(Merk公司产品)后，于室温将此细胞裂解液温育1小时，使源于宿主生物的令人厌恶的核酸(DNA和RNA)被酶解除去。
离心(50000g，1小时，4℃)将可溶相从不溶成分中分离出来，上清80℃加热20分钟。这样处理后，宿主蛋白大部分将会热变性并在随后冷却过程中形成不溶性沉淀被去除。再次经50 000g离心，热稳定的TmHU蛋白被进一步富集、纯化于上清(图2)。
在最后一次离心之后，上清通过Poros HS型号(Perseptive Biosystems产品)的阳离子交换色谱柱进一步纯化。在重悬缓冲液条件下，TmHU蛋白可以和阳离子交换柱牢固结合。通过改变氯化纳盐离子浓度从300mM至2000mM进行线性梯度洗脱，TmHU蛋白可从色谱柱上被单独洗脱下来，而杂质仍然保留在交换柱上。图2通过18％SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析显示了各步骤的纯化效果。采用如上所述方法，可以得到在天然状态下保持二聚体的TmHU蛋白的光谱分析纯形式(纯度高于95％，如图3)，收率为大约(简单培养法)每升大肠杆菌培养液20mg。实施例2、TmHU蛋白的核酸结合特性的证据通过两对偶联生物素的引物，用PCR扩增出两长度分别为56bp和23bp的DNA片段，并将获得的双链DNA固定在链霉亲和素芯片上。使用BIACore设备(Amersham Pharmacia Biotech公司产品)确定的表面等离子共振值(SPR)，可以直接检测TmHU蛋白与各自固定化DNA的结合(图4)。
因而，不同浓度的、存在于包含50mM磷酸钠，pH7.5和100mM氯化纳的缓冲液中的TmHU蛋白加至DNA芯片的流动池中，记录SPR信号。信号的平稳值正比于与TmHU蛋白结合的数量。根据希尔方程，将SPR信号对所用TmHU蛋白的浓度作图，就可以得到一个S形曲线(图4)，其中，在使用56bp片段的情形中，表现出相对较高的相互结合作用。所以，两条曲线的转变中点，定义为解离常数KD，在两种情况下均在TmHU蛋白浓度为73nM处。实施例3、保护核酸不被核酸酶降解将1μg的环状质粒DNA(pEGFP-N1，Clontech公司产品)溶于120μl样品缓冲液(20mM HEPES，pH7.2，100mM NaCl，5％甘油，10mM MgCl2)，再与TmHU蛋白、人组蛋白(Sigma公司产品)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，Amresco公司产品)及亚精胺(Sigma公司产品)混合，其中每种物质均有三种不同浓度。在室温中温育1小时随，随后加入5单位Benzonase(Merk公司产品)。在室温中温育30分钟后，样品中再加入终浓度为0.5％的SDS、20mM的EDTA，然后用酚/氯仿抽提核酸，再用乙醇从水相中沉淀核酸。随后，在用1％琼脂糖凝胶介导将DNA用敏感染料SYBR Gold(Molecular Probes公司产品)标记后，对核酸不被核酸酶降解的保护情况进行分析(图5)。在本实施例中，TmHU保护DNA不被核酸酶酶解的能力相当明显。而低分子物质(CTAB和亚精胺)仅对核酸酶降解起到微弱的保护作用；如果使用了真核组蛋白，这种保护作用会明显提高(图5)。然而，在其他实验条件相同的情况下，只有使用原核TmHU蛋白时，才实现了防止核酸不被核酸酶降解的明显保护。没有保护的DNA将会在实验条件下被完全降解。
保护核酸不被核酸酶降解对于最优化转移效率至关重要，因为在含有血清的培养基以及部分地在靶细胞中，核酸会招致核酸酶的降解。本实施例进一步解释这种原核蛋白比真核组蛋白在这一方面具有明显的优点，其原因大概是真核生物的特点，即核酸组蛋白缺少重复结构所致，因为这有利于结合部位的裂解。这种防止降解的保护机制是本发明所述方法的一个非常有利的特性。因而，这种保护也可以用于体内质粒生产，以便达到较高产量，例如，在细菌体内。实施例4、真核细胞的转染将300μl的TmHU蛋白溶液(0.5mg/ml)和6μl质粒DNA(24μg编码标记蛋白β-半乳糖苷酶的pCMV-β)一起于室温下温育1小时。随后，将混合物加入具有半汇合鼠NIH 3T3细胞或人293T细胞的培养基中(60mm的细胞培养皿内)。将培养皿在37℃含5％CO2的培养箱中微摇培养两天，这段时间不补入新的培养基。这样，蛋白与核酸在附着细胞上就会形成沉淀。并且，在这段时间里，蛋白/核酸复合物被细胞吸收。48小时后，使用β-半乳糖苷酶的底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)来标记转化细胞，确定标记细胞(转染细胞)对未标记细胞(未转染细胞)的比例。通过二者的比例，可以计算出转染效率。
并且，为了达到效果，进行了对照转染，其中在转染混合物中，依次或是缺乏核酸或是TmHU蛋白(阴性对照)。为了对比决定有效性，按照厂商的使用说明，使用DEAE-葡聚糖(Stratagene公司的哺乳动物转染试剂盒)平行地进行最适条件转染(阳性对照)。与预期一致，每种情况下，阴性对照显示没有标记细胞，所以，没有发生转染。对于阳性对照(DEAE-葡聚糖转染)，培养皿中最多有10％的细胞被标记(参见图6)；这在文献报道的、本方法转染效率的大小范围之内。用DEAE-葡聚糖法进行人293T细胞转染没有成功，因为这种方法使仅仅只有弱附着的细胞会脱落。与此相反，用TmHU蛋白对两种细胞系的转染均没有遇到问题；没有观察到293T细胞的脱落。在基于TmHU的转染中，每种情况的转染效率分别达到30％(鼠NIH 3T3细胞)，50％(人293T细胞)。因而，与标准系统相比，可观察到细胞转染效率的明显提高(参见图6)。通过最优化，似乎可能进一步提高转染产量。直到固定细胞(致死的)进行X-Gal标记为止，也没有观察到TmHU转染对细胞存活和生长的负面影响；；因而，TmHU不具有细胞毒性。实施例5、另一种真核细胞转染方法将100μl用pH7.0的磷酸盐缓冲液溶解的TmHU溶液(0.5mg/ml)和1μl质粒DNA(4μg编码标记蛋白β-半乳糖苷酶的pCMV-β)溶液及10μl 20mM的CaCl2溶液混合，于95℃保温40分钟。冷却至室温后温育20分钟，随后加入350μl含10％FBS的DMEM培养液，然后加入12孔板的小孔中。每个孔提前16小时接种50000个NIH 3T3细胞，并在加入上述培养基之前去除细胞。轻轻摇晃之后，培养皿于37℃含50％CO2的培养箱中培养12小时。然后，用1ml新鲜的完全培养液(含有10％FBS的DMEM)改换培养基，细胞继续培养36小时。此时如实施例4所述进行β-半乳糖苷酶的表达测试，并借助目镜网格计数细胞。典型情况下，使用这种方法每孔可以获得10000个阳性细胞(参见，图7中的实施例)。如果不在转染混合物中加入TmHU蛋白而进行所述方法(作为标准磷酸钙转染方法的效率对照组参与比较)，产量大概是10个转化细胞，产量降低因子是103。本实施例转染事件的产量为每微克DNA约得到2500个阳性细胞，其效率大概比DEAE-葡聚糖转染法约(每微克DNA产生约300至400个转染事件)高5至10倍。实施例6、用TmHU-EGF说明修饰蛋白的应用TmHU-EGF是一种来自TmHU和人表皮生长因子(EGF)的融合蛋白，其中人表皮生长因子(EGF)将有利于复合物被表面带有EGF受体的靶细胞的吸收，如这里所用的人A431细胞(参见，E.J.Meuillet等，在表皮样癌细胞系A431中，通过转染唾液酸酶基因提高表皮生长因子受体的活性，癌症研究(Cancer Res.)1999，Vol.59，234-240)。依照实施例1所述的标准方法，融合蛋白是通过SacI限制位点克隆进实施例1指定的表达载体pETlla中后产生的。100μl的TmHU-EGF蛋白溶液(0.5mg/ml)和8μgpCMV-β质粒温育1小时，根据实施例4中的说明，将形成的TmHU-EGF/DNA复合物加入半汇合鼠NIH 3T3细胞的培养基中。作为对照，将100μl未加DNA的TmHU-EGF溶液直接加入同样处理的细胞中。并且，在阴性对照中，准备未加TmHU-EGF的半汇合细胞培养皿。
将每种细胞在冰上培养2小时，用预冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)洗涤后，在37℃培养45分钟。将细胞上的培养液去除，加入用于分离未内部化的复合体和附着细胞的胰蛋白酶/EDTA溶液。胰蛋白酶的消化作用通过加入含有牛胎儿血清(FCS)的培养液而终止，重悬细胞用预冷的PBS缓冲液洗涤三次。最后一次洗涤后，以100μl的PBS缓冲液重悬细胞，再与100μl的4％SDS和2mM PMSF混合，剧烈混匀后立即于95℃保温10分钟。这样获得的细胞裂解液可上样于15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上及并用蛋白印迹电泳分析(第一抗体兔抗EGF多克隆抗体，Santa Cruz公司产品；第二抗体偶联辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG抗体，BioRad公司产品)。
在特异性的蛋白印迹中(图8，左图)，该蛋白作为裂解液组中特异带而被证实，其中该裂解液已同TmHU-EGF嵌合体蛋白温育过；在未与TmHU-EGF温育的细胞裂解液组中则检测不到这些带。这表明TmHU-EGF蛋白可以进入A431细胞，并且这一吸收过程可以通过特异的蛋白印迹予以证实。在本实验中，这种吸收与是否存在DNA无关，但是存在DNA时，可使这种吸收更为有效；这一结论受到了与上述转染实验类似的第二个实验的支持(图8，右图)。这里，TmHU-EGF嵌合体蛋白进入A431靶细胞的吸收量是通过检测细胞上的培养基中TmHU数量降低来进行的。这里同样明确表明，含有DNA的TmHU-EGF比不含DNA的对照实验组从细胞残余物中减少的更快。实施例7、用TmHU-GFP说明修饰蛋白的应用TmHU-GFP是一种由TmHU与深海水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白(GFP)形成的融合蛋白，这种荧光蛋白具有不要辅助因子就可发出荧光的显著特性，即，，仅凭自身的三级结构就可发出荧光。带有GFP的融合结构常常保持该天然蛋白的荧光。本实施例中，GFP通过接头肽与TmHU的C末端融合。这种融合是在DNA水平进行的；采用基因技术的标准方法，从Clontech公司pEGFP-N1载体上切下GFP基因及相接的接头，把它插入TmHU基因的3’端。TmHU-GFP蛋白的纯化与实施例1中的TmHU的纯化类似，通过阳离子交换色谱法进行。融合蛋白可以溶液形式高效纯化。
TmHU-GFP蛋白可发出带绿色的荧光，仅是GFP部分本身发出的。同样地，DNA与此融合蛋白结合后仍然具有此完整功能，若将高分子DNA加入该蛋白溶液，随后离心，TmHU-GFP蛋白与DNA就会共沉淀，表现为带绿色的荧光复合物。因而，可以知道融合结构的两个部在功能上完整无缺。这再次确证了这样的事实，即，本系统可以很容易在基因水平上进行修改，且TmHU的结构是一种适合以融合结构的形式形成多种变体的稳定结构。对于本变体TmHU-GFP，现在就可以在真核细胞内进行吸收研究了，而不需固定细胞。为达到效果，用PBS缓冲液洗涤培养NIH 3T3细胞的2cm培养皿，然后加入50μl用PBS缓冲液配制的TmHU-GFP溶液(0.1mg/ml)。短时摇动后，将培养皿于37℃、5％CO2的培养箱中培养5小时。随后，经PBS缓冲液洗涤3次后，用荧光显微镜和数码相机照相拍摄GFP荧光照片。在图9中，人们可以清楚的看到荧光条件下细胞的轮廓(下图)和作为对比的同一部分的相差曝光照片(上图)。这些结果表明了这一事实，即这种融合结构可以被高效地吸收进细胞，以至于没有出现个体小泡如溶酶体的聚集和积累，而是这种融合蛋白充满了整个胞质溶胶。
由文献已知，这种细胞吸收作用不是由GFP引起的；因而，这种作用归功于融合结构中的TmHU部分。
所以，这个实施例说明了原核生物的组蛋白类似蛋白，如TmHU蛋白，可以高效地被吸收进细胞，因而并不在溶酶体中积累而是分散于胞质溶胶中。这种吸收特性可以解释TmHU蛋白的高基因转移率。因而，细胞的有效吸收和从内体和其他细胞区室中释放的潜能能促成较高转染效率。另外，本实施例还说明吸附或融合了TmHU的蛋白质(例如，也是治疗相关蛋白)将会通过TmHU被高效导入真核细胞。所以，TmHU蛋白作为融合蛋白穿过细胞膜的运输工具而起作用。实施例8、利用源于大肠杆菌的HU蛋白(EcoHU)进行转染100μl的EcoHU蛋白(源于大肠杆菌的HU蛋白)溶液，0.5mg/ml和1μl质粒溶液(4mg/ml，编码β-半乳糖苷酶)混合，于95℃保温40分钟，然后在室温温育20分钟。混合物用350μl含10％FBS及1％PS的DMEM培养液淘洗后用于NIH 3T3细胞(12孔板的每个孔含有50000个细胞)。培养两天后，检测细胞培养物的β-半乳糖苷酶的表达。在此条件下，104个细胞显示表达了β-半乳糖苷酶。这是一个比类似条件下使用TmHU蛋白(约600个阳性转化细胞)显著要底的产量。此实施例说明对本发明所设定条件下的转染原则上也可以使用其他细菌的组蛋白类似蛋白，本例中使用了嗜常温细菌。实施例9、用脂质体包裹TmHU-DNA复合物并用这种脂质体-TmHU-DNA复合物进行转染一种比较新的真核细胞基因转移方法包括将DNA包裹入阳离子脂质体泡囊的过程，该结构然后与细胞膜融合，并以这种方式将DNA导入细胞。然而，这种方法导致了比最初设想较低的产量，因为在有效吸收进细胞后，这些脂质体泡囊通常积累在内体中，而不能产生把DNA转移进细胞质以及进一步运输进细胞核。在本实施例中，研究了是否可将脂质体指引转染与TmHU指引转染可被结合起来产生协同作用。
首先，按照厂商使用说明，使用Tfx-50试剂(Promega公司产品)作转染。这里，阳性电荷(脂质体)与阴性电荷(DNA)的电荷比为2∶1时，效率最高(按照厂商说明书进行最优化)。利用这种方法，将80％的汇合接种NIH 3T3细胞用1μg质粒DNA(pCMV-β)，3μl的Tfx-50试剂和200μl的DMEM进行转染。在温育1小时后加入1ml完全培养基(含10％FBS的DMEM)。每微克DNA平均可获得3 300个阳性(转化)细胞。这样的转染效率与最优化的TmHU转染法处于同一数量级(参见实施例5)。
然后，将不同量的TmHU蛋白与不同量的脂质体配合进行转染实验。得到最佳转染结果的条件如下，1μg DNA与12.5μl的TmHU蛋白溶液(0.5mg/ml)温育1小时，电荷比为4∶1(为脂质体DNA)，(4.5μl的脂质体悬液、12.5μl的TmHU蛋白溶液和1μg DNA，转染溶液体系为200μl)。每微克所用DNA产生的阳性细胞数两增加到平均16000个转化细胞的水平。所以，，利用TmHU-脂质体结合方法的产量大约比脂质体或TmHU蛋白各自单独使用的最适方法均高出了5至6倍。这种形式转化细胞的两个实施例显示在图10中。
虽然在本实验中不能排除TmHU指引的转染与脂质体指引的转染相互平行发生，但是，在每个情形中，可以观察到明显的协同效应，因为以此达到的效果显著高于各自作用单独相加(尤其是，从脂质体转染法和TmHU转染法的角度来看，对所做实验而言，存在的条件比最适工作条件低)。因而，对高的转染效率的最可能解释在于，形成的TmHU-DNA复合物被包入利用脂质转染试剂形成的脂质体中，或至少部分地被包入。用脂质体膜对TmHU-DNA复合物进行包裹的方法同样与标准方法诸如DEAE-葡聚糖转染比较具有明显更高的效率。
P12603序列序列列表<110>ACGT前基因组公司(ACGT ProGenomics AG)<120>由原核核酸结合蛋白介导的分子物质转移法<130>P12603<140>由原核核酸结合蛋白介导的分子物质转移法<141>2000-11-03<150>PCT/EP00/10875<151>2000-11-03<150>DE 199 52 983.3<151>1999-11-03<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>270<212>DNA<213>海栖热袍菌<220><221>CDS<222>(1)..(270)<223><400>1atg aac aaa aaa gaa ctg atc gac agg gtg gcg aag aaa gca ggt gcg48Met Asn Lys Lys Glu Leu Ile Asp Arg Val Ala Lys Lys Ala Gly Ala1 5 10 15aag aaa aag gat gta aaa ttg att ctc gac acc atc ctt gaa acg atc96Lys Lys Lys Asp Val Lys Leu Ile Leu Asp Thr Ile Leu Glu Thr Ile20 25 30aca gaa gct ctc gca aag ggt gaa aag gtt cag atc gtt gga ttc gga144Thr Glu Ala Leu Ala Lys Gly Glu Lys Val Gln Ile Val Gly Phe Gly35 40 45agc ttc gaa gtg agg aag gcc gct gca aga aaa ggc gtg aat cct cag192Ser Phe Glu Val Arg Lys Ala Ala Ala Arg Lys Gly Val Asn Pro Gln50 55 60aca aga aaa ccc atc acc att ccc gaa aga aag gtc ccg aag ttc aaa240Thr Arg Lys Pro Ile Thr Ile Pro Glu Arg Lys Val Pro Lys Phe Lys65 70 75 80ccc gga aaa gcc ctc 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20 25 30Thr Glu Ser Leu Lys Glu Gly Asp Ala Val Gln Leu Val Gly Phe Gly35 40 45Thr Phe Lys Val Asn His Arg Ala Glu Arg Thr Gly Arg Asn Pro Gln50 55 60Thr Gly Lys Glu Ile Lys Ile Ala Ala Ala Asn Val Pro Ala Phe Val65 70 75 80Ser Gly Lys Ala Leu Lys Asp Ala Val Lys85 90
权利要求
1.一种用于将核酸和/或核酸类似物，和/或多种核酸和/或多种核酸类似物和/或含氨基酸物质转移进入原核或真核细胞的方法，其中●被转移的核酸或核酸类似物，或多种核酸或多种核酸类似物，或含氨基酸物质与原核核酸结合蛋白接触，以便形成核酸，核酸类似物或多种核酸，多种核酸类似物及含氨基酸物质与此种原核核酸结合蛋白的复合物，和●随后，这种由核酸、核酸类似物和/或多种核酸或多种核酸类似物及含氨基酸物质与原核核酸结合蛋白形成的复合物与原核或真核靶细胞接触，以便实现该复合物转移进细胞的过程。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于单链或双链DNA、单链或双链RNA、质粒形式的DNA、染色体片段、反义RNA、核酶、具有催化功能的RNA、核苷酸、染色体DNA或编码的mRNA作为核酸被转移。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于使用带有一个编码序列的DNA作为转移核酸，其在靶细胞中进行表达。
4.根据前述权利要求中的一项或几项所述的方法，其特征在于用于转移的核酸通过与这种原核核酸结合蛋白接触从而被压缩并受保护而不被降解。
5.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于核酸类似物PNA(肽核酸，PeptideNucleic Acid)被用于转移。
6.根据权利要求1至5一项或几项所述的方法，其特征在于这种由核酸、核酸类似物与核酸结合蛋白所形成的复合物是可逆的。
7.根据权利要求1至5一项或几项所述的方法，用于将DNA转移进植物细胞或动物细胞或人细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于蛋白质、肽、肽类激素、酶、蛋白结构域、糖蛋白、基于氨基酸的药物活性化合物或脂蛋白作为含氨基酸物质，用以转移。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于含氨基酸物质与核酸结合蛋白间的复合物形成是通过共价键或非共价键发生的。
10.根据权利要求8或9中所述的方法，其特征在于绿色荧光蛋白(GFP)作为含氨基酸物质用于转移。
11.根据前述权利要求中的一项或几项所述的方法，其特征在于原核核酸结合蛋白源于嗜冷，嗜温，嗜热和极端嗜热生物。
12.根据前述权利要求中的一项或几项所述的方法，其特征在于作为原核核酸结合蛋白使用的蛋白有TmHU(海栖热袍菌HU-蛋白)，Sso7d(源自硫磺矿硫化叶菌和嗜酸热硫化叶菌)，Ssh7(源自希氏硫化叶菌)，Sac7d(源自硫磺矿硫化叶菌和嗜酸热硫化叶菌)，BstHU(源自嗜热脂肪芽孢杆菌)，冷休克蛋白(CSP-cold shock protein)(源自海栖热袍菌)，HU(源自大肠杆菌)，IHF(源自大肠杆菌)，DNA结合蛋白I和II(源自大肠杆菌)，BsuHU(源自枯草芽孢杆菌)，SaHU(源自嗜酸热硫化叶菌)，BbuHU(源自布氏疏螺旋体)，BgaHU(源自嘎氏疏螺旋体)，BafHU(源自阿氏疏螺旋体)，Hcl(源自沙眼衣原体)，AlgP(源自铜绿假单胞菌)，IHF(源自铜绿假单胞菌)，DNA-结合蛋白(衣原体亚种)，nifA，ntrC(源自肺炎克雷氏菌)，Hsa(源自金黄色葡萄球菌)，ORF99(源自鸡败血枝原体)，R1HU(源自豌豆根瘤菌)，HSl(源自浅青紫链霉菌)，HCj(源自空肠弯曲感菌)，HU(源自热溶芽孢杆菌)，HU(源自热坚芽孢感菌)，HU(源自枯草芽孢杆菌)，HCc(源自新月柄杆菌)，DNA-结合蛋白(源自耐放射性异常球菌)，HSa(源自嗜酸热硫化叶菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自格氏链球菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自变异链球菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自酿脓链球菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自唾液链球菌嗜热亚种)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自流感嗜血菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自单核细胞增生利斯特氏菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自粘质沙雷氏菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自鼠伤寒沙门氏菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自水生栖热菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自苜蓿中华根瘤菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自恶臭假单胞菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自结核杆菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自麻风杆菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自运动发酵单胞菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自假结核耶尔森氏菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自牛分枝杆菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自猪肺炎枝原体)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自耻垢分枝杆菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自幽门螺杆菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自aeolicus产液菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自根癌土壤杆菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自铜绿假单胞菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自幽门螺杆菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自野油菜黄单胞菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自解蛋白弧菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自浅青紫链霉菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自普氏立克次氏体)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自天蓝色链球菌)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自山羊枝原体)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自布氏疏螺旋体)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自日本疏螺旋体)，组蛋白类似的DNA结合蛋白(源自andersonii疏螺旋体)，oder HTa(源自嗜酸热原体)
13.根据前述权利要求中的一项或几项所述的方法，其特征在于原核核酸结合蛋白被以某种方法修饰，以致产生了靶细胞吸收效率的提高或改善。
14.根据前述权利要求中的一项或几项所述的方法，其特征在于通过某种方法将原核核酸结合蛋白进行修饰，以致达到了增加转移核酸，核酸类似物或多种核酸，多种核酸类似物及含氨基酸物质从靶细胞的内体中释放的效果。
15.根据前述权利要求中的一项或几项所述的方法，其特征在于通过某种方法将原核核酸结合蛋白进行修饰，以致核酸，核酸类似物或多种核酸，多种核酸类似物或含氨基酸物质与核酸结合蛋白形成的复合物能够与靶细胞表面的受体分子结合。
16.根据前述权利要求的一项或几项所述的方法，其特征在于在将核酸，核酸类似物或多种核酸，多种核酸类似物或含氨基酸物质与核酸结合蛋白的复合物与靶细胞温育之前，发生了使用脂质体膜或聚乙二醇对复合物的包裹过程。
全文摘要
本发明涉及一种将分子物质诸如蛋白质或核酸转移进细胞的方法,假设使用的DNA与可能基因表达相关。本发明采用了一种用于转移的原核核酸结合蛋白,此蛋白优选来源为嗜热生物。当被转移物质是核酸时,该蛋白与核酸形成一种可逆复合物。这种原核蛋白可浓缩和压缩核酸分子。通过适当的温育作用后所述核酸可以被吸收进靶细胞中。
文档编号A61P21/04GK1387575SQ00815315
公开日2002年12月25日 申请日期2000年11月3日 优先权日1999年11月3日
发明者G·伯姆, D·埃塞尔 申请人:Acgt前基因组公司