专利名称：含有诱导产生il－6的物质的减肥组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有减肥活性物质的化妆组合物。
在化妆组合物中的这些活性物质选自下面称之NPY的Y神经肽受体的拮抗剂，α2受体的拮抗剂和产生下面称之IL-6的白细胞间素-6的诱导剂。
NPY拮抗剂、α2拮抗剂或产生IL-6的诱导剂可以是一种非肽化合物、肽、动物或植物源细胞或组织的提取物或采用如细菌或食用伞菌微生物发酵所得到的产物。
这种减肥组合物Am1在皮下脂肪组织中起作用，并且控制释放脂肪细胞中储存的脂肪。
在阻断α2和NPY受体时，组合物Am1能够疏通过度生长的脂肪细胞，还能够避免任何新的过度储存脂肪细胞，同时能够表达β受体，该受体的前解脂活性可被皮下脂肪组织中严重过剩的α2和NPY抗解脂受体正常掩蔽。组合物Am1因此能够有效地对脂肪细胞中储存的脂肪酸消散起作用。
本发明的这些组合物保持了这种活性，但它们通过下述两种作用完成其发明的一种作用延缓脂肪酸进入，这种作用是在产生LPL，负责脂肪酸进入细胞的酶时通过还原作用所施加的，另一种作用延缓脂肪细胞过度增生。使用能诱导脂肪细胞产生IL-6的物质可以达到这种完全意料之外的作用。这种物质是用在巴斯德研究所的C.N.C.M.保藏，登记号为I 1844的微生物产生的。这种活性物质在下面称之物质C。
长久以来由于只是考虑它们的能量储备作用，所以近些年来才证明脂肪细胞的内分泌和分泌细胞作用(Ailhaud G等人，《药物/科学》(Médecine/Science)1998，14，858-864)。莱普亭(leptine)完全说明了脂肪细胞的这种新分泌作用。这种蛋白质是由成熟脂肪细胞以特定方式产生的。控制食饱感时涉及这种蛋白质，在调节脂肪沉积时也涉及这种蛋白质。脂肪细胞因此保证产生能调节脂肪组织生理学的内分泌和副分泌活性因子。特别地，最近已证明两种特定的介质运用了脂肪细胞的内分泌作用-溶血磷脂酸(LPA)，一种类脂因子，活化α2受体可缓和产生这种因子，该因子的作用在于补充新的脂肪细胞(Valet P.等人《J.Clin.Invest.》1998，10(7)，1431-1438)。
-IL-6，它是多功能的细胞活素。
物质C作为用角质化细胞产生IL-6的诱导剂是已知的。在国际专利申请WO 99/40896中描述过它的制备方法。它对皮肤老化起作用。但有关(微生物I 1844产生的)这种物质对脂肪细胞的双重作用什么都没有提及过。
近来研究表明，脂肪细胞能够产生IL-6，它在脂肪细胞中的作用是抑制LPL，即负责脂肪酸进入脂肪细胞的酶的合成(Greenberg A.S.等人，《癌研究》(Cancer Research)，1992，52，4113-4116)。
皮下脂肪组织细胞产生IL-6与肥胖指数增加为正相关(MohamedAli V.等人，《J.Clin.Endocrinol.Metab.》1997，82，4196-4200)，但随脂肪组织来源不同也有不同。
因此，在肥胖的研究对象中，从网膜部位取出的深层脂肪细胞释放IL-6比皮下脂肪细胞高2-3倍(Fried S.K.等人，《J.Clin.Endocrinol.Metab.》1998，83，847-860)。
最后，除了IL-6降低由脂肪细胞产生LPL的能力外，IL-6还能够通过抑制作用对脂肪细胞的前体细胞的分化起作用(Hauner H.等人，《第8届国际肥胖会议》(8thInternational Congress onObesity)，1999，47-53)。
IL-6因此作为一种细胞活素出现，该细胞活素以自分泌(对LPL)和副分泌(对前脂肪细胞)方式起作用，减缓皮下脂肪组织的发育。
但是，作为任何的细胞活素，IL-6是一种多效性的糖蛋白，即该糖蛋白随产生它的细胞不同而具有不同的作用。因此，在脂肪细胞内，IL-6应具有已经知道角化细胞所具有的所有其他性质的作用。
特别地，在脂肪细胞中，由该细胞合成的IL-6使其含量降低，因此也调节了保证脂肪进入的酶活性。
因此，本发明的组合物能够控制脂肪细胞沉积和肥大的脂肪酸进入和出去的现象。它还能对脂肪细胞增生起作用。
人们知道，在整个人的生命中，人体中都在生成新的脂肪细胞。因此，从老年人身体上都可分离出“睡眠的”脂肪细胞，无论它们的性别如何(Alihaud G.等人，《J.Obes.Relat.Metab.Disord.》，1992，16(2)，517-521；Spiegelman B.等人，《细胞》(Cell)，1996，87，377-389；Hauner等人，《J.Clin.Invest.》，1989，84，1663-1670)。
脂肪组织的发育导致脂肪酸过量积累续发的脂肪细胞尺寸增加，同时还导致募集新脂肪细胞，而这些新脂肪细胞来源于脂肪细胞的前体细胞，前-脂肪细胞的扩增和分化(ValetP.等人，《J.Clin.Invest.》，101(7)，1431-1438)。
这种募集新的脂肪细胞会受到肥大脂肪细胞产生的溶解因子的破坏；特别地，通过α2受体的刺激作用受到LPA破坏，以及通过IL-6对前-脂肪细胞分化的控制能力受到IL-6破坏。
阻断α2受体因此在本质上能获得脂解方面的好处，同时还能抑制LPA释放，其有利之处是抑制募集新的脂肪细胞。
IL-6限制前-脂肪细胞突变成分化的脂肪细胞。用IL-6诱导体的脂肪细胞刺激产生这种细胞活素增强了这种性质。
曾进行许多研究，证明用微生物I 1844得到的活性物质，即物质C对成熟脂肪细胞和对脂肪细胞的分化都具有活性。
根据本发明，现在制备一种减肥化妆组合物，它们含有物质A、B和C，在下面它们称之Am2。
Am2的减肥作用构成临床研究的课题。
用3T3-L1鼠的细胞系研究了物质C的活体外生物学作用。这种前-脂肪细胞的细胞系在含有10％牛胎血清的DMEM培养基(Dubelco′s最少基本培养基)中进行常规培养后，在如胰岛素和消炎痛之类的诱导剂存在下，具有分化成成熟脂肪细胞的性质(Slieker L.《J.Bi ochem.Biophys.Res.Com.》，1998，251，225-229)。在诱导分化后八至十天，3T3-L1细胞具有成熟脂肪细胞的特性。采用形态学方法，在显微镜下出现可见的胞质内类脂沉积泡，或采用生化检测法，测量产生的莱普亭，成熟脂肪细胞独特产生的(食)饱满感激素，可以评价从未成熟细胞阶段到功能脂肪细胞阶段这个过程。
在两个水平上研究了物质C对脂肪细胞活性的影响。一方面测量这种调制产生脂肪细胞IL-6的活性的能力，另一方面评价它对分化成成熟脂肪细胞的影响。
1-物质C对3T3-L1成熟脂肪细胞产生的IL-6的影响用以体积/体积计1％物质C刺激3T3-L1成熟脂肪细胞(用胰岛素(5微克/毫升)和消炎痛(125微摩尔)配合诱导分化10天后得到的)24小时。然后抽取培养上清液，再根据供应商的规定(R & D系统，Abingdon，英国)，采用ELISA(酶连接的ummunosorbent Assay)测量其IL-6的含量。其分泌的IL-6量，与只是用物质C的溶剂(乙醇/水(50/50)混合物，在培养基中稀释到1/100)处理的对照培养物和用50纳克/毫升(ng/ml)参比的IL-6诱导剂，α-TNF刺激的培养物分泌的IL-6量进行比较(Fried S.K.《J.Clin.Endocrinol.Metab.》，1998，83，847-860)。
图1表明，与用溶剂对照培养物比较，物质C刺激3T3-L1脂肪细胞产生IL-6的因子为约5(分别为9皮克/毫升(pg/ml)对43皮克/毫升)，即参比诱导剂所达到效果的83％(52皮克/毫升)。
得到的结果表明，一方面物质C可识别脂肪细胞作为诱导靶，另一方面在物质C的作用下，脂肪细胞产生的IL-6碱增加因子为5，即使用正对照所达到的最大效果的83％。
考虑到IL-6的已知性质，这样一种增加首先能够希望降低负责脂肪酸进入酶，LPL，的合成，然后后续降低脂肪酸的进入。
2-物质C对脂肪细胞分化的影响这第二项研究的目的是研究物质C对生成新脂肪细胞的影响。
一方面通过评价莱普亭激素的合成，该激素是脂肪细胞分化的标记物，另一方面用显微镜观察除功能转化为成熟脂肪细胞的对照物外的胞质内类脂泡的生成，可以研究物质C对3T3-L1前-脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的影响。在所有情况下，在分化过程开始(如前面一样诱导)，加入培养物中的物质C为以体积/体积计1％，并且保持直到结束。整两天都通过ELISA测量(R & D系统，Abingdon，英国)评价莱普亭的合成。
图2表明在物质C存在下，在10天实验时间内，产生的莱普亭都停留在极低的水平，大大低于(≤200皮克/毫升)在对照培养物中所观察的结果，如所预料的，可看到根据分化的诱导作用，从第2天开始对照培养物的莱普亭含量增加，并且增加直到从第6天开始达到最大平台1200-1400皮克/毫升。物质C抑制合成莱普亭构成阻断脂肪细胞分化过程的第一个论据。
图3所显示的实验提供了第二个论据，该图显示在分化10天后，对照细胞发育成一种成熟脂肪细胞的形态，其中含有很大的类脂泡，它们占据了几乎全部的(细)胞质空间(A)，而用物质C处理的同样细胞仍处于非常不成熟的阶段，尺寸小得多的泡有稀疏几个(B)。
使用在文献中为利用脂肪细胞功能而通常采用的3T3-L1模式时，曾证明物质C具有双重性质，一种性质是在成熟脂肪细胞中刺激产生IL-6，一种性质是在前体细胞中抑制转化为成熟脂肪细胞。物质C因此在上游在脂肪细胞成熟之前起作用，在下游在成熟脂肪细胞中刺激产生细胞活素起作用，而细胞活素在限制储存脂肪酸中起作用。
这些结果证明了用脂肪细胞诱导产生IL-6的这种物质的独特性质，所述脂肪细胞的自分泌(对产生的细胞)和副分泌(对在产生细胞相邻的细胞)功能，通过停止前-脂肪细胞(pré-adipocyte)分化同时施加到脂肪酸进入成熟脂肪细胞和募集新脂肪细胞上。
曾使用本发明的减肥组合物进行了初步临床研究，该组合物含有3种活性物质(下面称之组合物Am2)。
使用组合物Am2进行了两项临床研究。
第一项研究涉及测量皮下脂肪组织的厚度，而第二项研究运用了厘米测量。
1)测量皮下脂肪组织的厚度这项研究的目的是评价含有3种活性物质的新组合物Am2的临床效率。
使用的方案如下。
研究对象数61位健康女性自愿者，分成两组(31位使用含有3种活性物质的减肥组合物Am2，30位使用减肥组合物Am1)。
在整个大腿上用环形按摩每天涂敷这些产品两次，待产品完全渗透后就停止环形按摩。
在两个月的时间内于T0、T28天、T56天测量皮下脂肪组织的厚度，可以确定评价效率。使用的方法是超声回波扫描法。
采用皮肤标记和采用探针定位在一定高度上以确定测量部位。
为了便于垂直定位，为了避免测量时组织的任何移动或压缩，超声回波扫描探测器放置在稳定的，高度可调节的，与实验员不相干的设备上。
在标记处相继地拍摄三次图像。每个底片进行3次厚度测量。于是总共得到6次测量结果能够达到±1毫米的精度。
这些测量还配备检测试验者的体重，其中包括在试验中的体重，以及自动-评价分析。
采用Student检验t评价这些成对组结果的意义。该t检验应用于原值以及应用于这些参数随试验时间的变化(与T0相比的值)。
无论该研究组如何，平均重量在整个试验期间都是稳定不变的，因此不可能是大腿皮下脂肪组织厚度测量变化的根源。
预定的研究条件不能证实组合物Am1很好的减肥效果在涂敷1个月后，观察到皮下脂肪组织减少0.8％，在2个月观察减少2.6％。
组合物Am2从涂敷第28天起就能够达到非常好的减肥效果(p＜10-5)用组合物Am2观察到的皮下组织降低在1个月为-2.2％，在涂敷2个月为-4.3％。
2)厘米测量(Mesure centimétrique)使用的方案如下。
研究对象数39位女性自愿者，分成两组，20位使用组合物Am1，19位使用组合物Am2。
在2个月内每天涂敷这些产品两次。
在左侧和右侧大腿(在臀弯下面3厘米处)于T0、T28天、T56天采用厘米法评价减肥的效率。
无论该研究组如何，在整个研究期间平均重量基本是恒重的，因此不可能是不同的研究部位皮下脂肪组织厚度测量变化的根源。
表1列出采用厘米法得到的有意义的结果。
表1采用厘米法得到的结果
组合物Am2在T0的减肥活性优于组合物Am1，从涂敷一个月起也是如此。
这两项研究后得到的结果进行比较能够得出组合物Am2明显优于其安慰剂，也说明了与组合物Am1相比，组合物Am2性能更好。
因此，尽管通过物质A+B分摊了一部分作用方式及其脂解效率，但借助物质C对脂肪酸进入脂肪细胞的作用，增强了使用新配方Am2所获得的利益强度。
由募集的新脂肪细胞活性所支持的这些作用之组合能够减少大量存在的脂肪组织，并防止其发展。
在制备本发明组合物时，如此构成的提取物与含水溶剂或非水溶剂和通常的稀释剂混合，而这些稀释剂与局部应用以及与组合物本身的活性组分是相容的。合适的溶剂和/或稀释剂应根据运送本发明提取活性组分到皮下脂肪层中的能力进行选择。
这些组合物一般含有赋形剂或添加剂，根据设计的特定配方需要，它们选自在用于局部涂敷的组合物中通常使用的组分。
例如，它们可以含有增稠剂、软化剂、润肤剂、稳定剂、防腐剂、消泡剂、表面活性剂、抗氧化剂、染色剂和/或颜料、香料。
它们还可以含有其他活性组分，这些组分或者具有同类的作用，例如用于调节脂解/脂肪生成的产品，或这类局部组合物中的有效产品，例如胶原质合成的刺激剂，胶原酶或弹性蛋白酶的抑制剂，血管保护剂。
本发明的化妆组合物含有以该组合物总重量计0.00001％-5％物质A、B或C，它们与在制备涂敷在皮肤上的化妆配方时通常使用的赋形剂混合在一起。
所述的百分数可以随该组合物中包括的组分固有活性不同而在前面指出的范围内改变。优选地，组分A、B或C是0.0001％-2％。
本发明组合物有利的形式是借助粘合剂载体局部涂敷的流体，后面称之“药膏”，这种药膏能控制活性组分扩散。
本发明的组合物具有良好的稳定性，并且在温度0-60℃下可以保持使用所必需的时间，而不会出现组分沉积或相分离，也不会降低活性，使其使用受到影响。
这些组合物的耐受性非常好，它们没有任何的光毒性，在皮肤上长期使用它们没有任何的副作用。
从开始涂敷起，皮肤表面光滑，皮肤变得更加健康坚实。在涂敷一个月后，皮肤有减肥效果，目视观察《橘黄色皮肤》外观改善，形态苗条。
具体实施方案实施例1呈喷洒药膏形式的减肥组合物
实施例2呈喷洒药膏形式的减肥组合物
实施例3呈凝胶形式的减肥组合物
实施例4呈乳状液形式的减肥组合物
实施例5呈凝胶乳状液形式的减肥组合物
权利要求
1.减肥化妆组合物，该组合物含有至少一种由诱导脂肪细胞产生IL-6的组分，该组分与用于化妆制剂的赋形剂混合。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于由诱导脂肪细胞产生IL-6的组分选自非肽合成化合物、肽、动物或植物源细胞或组织的提取物和来自微生物发酵的产物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于由诱导脂肪细胞产生IL-6的组分是由选自细菌或食用伞菌的微生物发酵所得到的产物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于由诱导脂肪细胞产生IL-6的组分是能通过Rhodotorula sp菌株发酵得到的组分。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于由诱导脂肪细胞产生IL-6的组分是能通过Rhodotorula sp菌株或其产生的突变体发酵得到的组分，所述菌株在巴斯德研究所的C.N.C.M.保藏，登记号为I1844。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的组合物，其特征在于它还含有α2-拮抗剂和NPY拮抗剂组分。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于所述的α2-拮抗剂或NPY拮抗剂组分选自非肽合成产物、动物或植物源组织细胞的提取物和来自微生物发酵的产物。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于α2-拮抗剂或NPY拮抗剂组分是能通过选自细菌或食用伞菌的微生物发酵得到的。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于α2-拮抗剂组分是能通过Bacillus licheniformis菌株或其产生的其中一种突变体发酵得到的，所述菌株在巴斯德研究所的C.N.C.M.保藏，登记号为I1778。
10.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于NPY拮抗剂组分是能通过Streptomyces sp菌株或其产生的其中一种突变体发酵得到的，所述菌株在巴斯德研究所的C.N.C.M.保藏，登记号为I1132。
11.局部涂敷用的减肥化妆组合物，该组合物含有NPY-拮抗剂、α2-拮抗剂和由脂肪细胞产生IL-6的诱导剂，与化妆上可接受的赋形剂相结合。
12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于NPY-拮抗剂、α2-拮抗剂和产生IL-6的诱导剂是分别使用在巴斯德研究所的C.N.C.M.分别保藏的I 1132、I 1778和I 1844菌株发酵得到的。
13.根据权利要求12所述的减肥组合物在调节皮肤脂解/脂肪生成中的应用。
全文摘要
本发明涉及减肥化妆组合物，该组合物含有至少一种诱导脂肪细胞产生IL－6的化合物，该化合物与NPY－拮抗剂和/或α
文档编号A61K8/98GK1420759SQ0081818
公开日2003年5月28日 申请日期2000年11月2日 优先权日1999年11月5日
发明者P·卡塞尔拉斯, J·M·德罗克, J·格斯尼特 申请人:圣诺菲-合成实验室公司