专利名称：一种人白细胞介素28b的生产方法及重组il－28b工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说涉及一种人白细胞介素的生产方法及其重组工程菌。
背景技术：
人白细胞介素28B(IL-28B)是由一些病毒或双链RNA(dsRNA)活化人的多种细胞如外周血单核细胞(PMBC)、树突状细胞(DC)和HeLa细胞等产生的细胞因子(Sheppard，P et al，2003，NatureImmunology，4(1)63-68)。IL-28B的主要功能可能包括抗病毒，抗细胞增殖和免疫调节。IL-28B同干扰素类似，通过诱导细胞产生多种细胞内蛋白，这些蛋白质介导其生物学活性，而且能选择性地作用不同类型的靶细胞。IL-28B可作为IFN的替代品，用于肿瘤、病毒性疾病等的治疗，在临床应用上有潜在的应用前景。但是目前对于IL-28B的生产普遍存在产物生物活性低、表达量小等问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有IL-28B生产方法普遍存在产物生物活性低、表达量小的问题，提供一种人白细胞介素(IL)-28B的生产方法，利用该方法可以高效表达IL-28B，所得产物IL-28B多肽活性高、表达量大。
本发明的另一目的在于提供一种重组IL-28B工程菌。
本发明的技术方案如下本发明采用基因工程方法生产人白细胞介素(IL)-28B，具体方法包括如下步骤(1)合成PCR引物，在合成的引物中导入LIC粘性末端，IL-28B上、下游引物的序列分别为上游引物5-GACGACGACAAGATTCCTGTCGCCAGGCTC-3下游引物3-GAGGAGAAGCCCGGTTTAGACACACAGGTCCCCGCT-5；(2)PCR扩增以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28B质粒为模板，通过PCR基因扩增，获得IL-28B基因片段；(3)将上述PCR扩增得到的IL-28B基因片段与pET-44Ek/LIC载体连接，构建重组载体pET-44Ek/LIC-IL-28B；(4)将重组载体pET-44 Ek/LIC-IL-28B转化细菌，构建重组IL-28B工程菌；(5)培养构建的重组IL-28B工程菌，诱导其表达生产IL-28B。
其中，pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28B质粒的获得见李明才，何韶衡.人白细胞介素(IL)-28和IL-29基因的克隆及序列分析.细胞与分子免疫学杂志，2004，20(5)635-637。在上述步骤(3)中可将PCR方法扩增得到的IL-28B基因片段的终止密码子TGA转换成大肠杆菌偏爱的密码子TAA，然后和pET-44Ek/LIC载体连接，构建重组载体pET-44Ek/LIC-IL-28B；接着将载体pET-44Ek/LIC-IL-28B转化大肠杆菌，构建重组IL-28B工程菌，再用IPTG诱导其表达生产IL-28B。
上述PCR扩增的反应条件为①95℃变性15min；②94℃45s，72℃30s，退火温度每循环降低1.0℃，72℃45s，5个循环；③94℃45s，设置退火温度梯度从68℃到70℃30s，72℃45s，30个循环；④72℃延伸10min。
在上述生产人白细胞介素(IL)-28B的方法中，本发明构建了一种重组IL-28B的工程菌，其特征在于由如下步骤构建而成(1)合成PCR引物，并在合成的引物中导入LIC粘性末端，上游引物5-GACGACGACAAGATTCCTGTCGCCAGGCTC-3下游引物3-GAGGAGAAGCCCGGTTTAGACACACAGGTCCCCGCT-5；(2)PCR扩增以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28B质粒为模板，通过PCR基因扩增，获得IL-28B基因片段；(3)将上述PCR扩增得到的IL-28B基因片段和pET-44Ek/LIC载体连接，构建重组载体pET-44Ek/LIC-IL-28B；(4)将重组载体pET-44 Ek/LIC-IL-28B转化细菌，构建重组IL-28B工程菌；其中，在上述步骤(3)中可将PCR方法扩增得到的IL-28B基因片段的终止密码子TGA转换成大肠杆菌偏爱的密码子TAA，然后和pET-44Ek/LIC载体连接，构建重组载体pET-44Ek/LIC-IL-28B；接着将载体pET-44Ek/LIC-IL-28B转化大肠杆菌，构建重组IL-28B工程菌。
上述所构建重组IL-28B工程菌的培养基为(1)LB液体培养基1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，PH7.0；(2)LB固体培养基在上述LB液体培养基加1.5％(W/V)的琼脂粉。
本发明的有益效果(1)采用含有不依赖连接反应的引物，准确获得IL-28B基因的成熟肽cDNA片段，并克隆到IPTG诱导的pET载体上；(2)使用大肠杆菌偏爱的终止密码子，提高表达效率；(3)扩大培养后的菌体产量高；(4)由于表达量可溶性成分高，用S蛋白亲和柱使得一步纯化即可获得很纯的产品。
图1为重组质粒pET-44-IL-28B构建图谱；图2为克隆和转化后的质粒酶切图谱图3为IL-28B表达量SDS-PAGE图谱；图4为纯化后IL-28B的SDS-PAGE图谱；其中，图2中，1为DNA标准，3为Xho I酶切IL-28B质粒；图3中，M蛋白标准分子量，1为破菌后上清总蛋白，2为未诱导细菌总蛋白，3为诱导后细菌总蛋白，4为破菌后细菌沉淀总蛋白；图4中，M为蛋白标准分子量，1为纯化后的IL-28B，2为破菌后细菌沉淀总蛋白，3为破菌后上清总蛋白。
具体实施例方式
实施例
(1)合成PCR引物根据GenBank中人白细胞介素(IL)-28BcDNA基因序列和pET-44Ek/LIC载体上的LIC位点序列(见Novagen公司的说明书Cat 711433)，采用Omiga 2.0软件设计如下引物上游引物5-GACGACGACAAGATTCCTGTCGCCAGGCTC-3下游引物3-GAGGAGAAGCCCGGTTTAGACACACAGGTCCCCGCT-5；(2)PCR扩增在MJ Research PTC-200梯度PCR扩增仪上，采用热启动(hot-start)PCR扩增。以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28B质粒为模板。设置退火温度梯度，循环条件为①95℃变性15min；②94℃45s，72℃30s，退火温度每循环降低1.0℃，72℃45s，5个循环；③94℃45s，设置退火温度梯度从68℃到70℃30s，72℃45s，30个循环；④72℃延伸10min。1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。上述pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28B质粒的获得见李明才，何韶衡.人白细胞介素(IL)-28和IL-29基因的克隆及序列分析。细胞与分子免疫学杂志，2004，20(5)635-637。
(3)PCR产物与pET-44 Ek/LIC载体连接将上述PCR方法扩增得到的IL-28B基因片段和pET-44Ek/LIC载体连接，构成重组载体pET-44Ek/LIC-IL-28B，连接在0.5ml塑料离心管中进行，具体方法见pET-44Ek/LIC载体的说明书(Novagen Cat 711433，可从商业渠道购得)。重组载体pET-44Ek/LIC-IL-28B的构建图谱如图1所示。
(4)连接产物转化NovaBlue感受态菌上述连接产物混匀后，加到感受态的大肠杆菌NovaBlue中，放在冰浴中5分钟，再于42℃水浴30秒，冰上放置2分钟，加入250μl SOC培养液(不含抗菌素)，37℃保温1小时，涂布于含有LB固体培养基(内含氨苄青霉素)，37℃培养过夜，取阳性克隆的大肠杆菌菌落，进行菌落PCR、酶切鉴定和基因测序，结果与文献报道的一致。克隆和转化后的质粒酶切图谱如图2所示。
(5)转化BL21(DE3)感受态菌提取鉴定正确的阳性克隆质粒，采用以上同样方法转化入感受态的大肠杆菌BL21(DE3)中，经抗性培养基筛选，得阳性克隆的大肠杆菌即为工程菌。
(6)化学诱导表达经筛选后的大肠杆菌接种于含有氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中，37℃震荡培养过夜。次日按1.5％的比例扩大培养，37℃震荡培养2～3小时，至OD600达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，22℃剧烈(210转/分)震荡培养6小时，收集菌体。
(7)SDS电泳超声破细菌细胞，离心得到细胞上清，进行SDS-PAGE测定表明，IL-28B蛋白占菌体可溶蛋白的30％以上，占包含体蛋白的50％以上。IL-28B表达量的SDS-PAGE图谱如图3所示。
(8)表达产物的分离纯化具体方法见S-Tag ThrombinPurification Kit的说明书(Novagen Cat 692323，可从商业渠道购得)。按Novagen公司的S蛋白柱纯化，可得含量98％以上的IL-28B蛋白。纯化后IL-28B表达量的SDS-PAGE图谱如图4所示。
权利要求
1.一种人白细胞介素(IL)-28B的生产方法，其特征在于采用基因工程方法生产。
2.如权利要求1所述的人白细胞介素(IL)-28B的生产方法，其特征在于所述基因工程方法包括如下步骤(1)合成PCR引物，并在合成的引物中导入LIC粘性末端，上游引物5-GACGACGACAAGATTCCTGTCGCCAGGCTC-3下游引物3-GAGGAGAAGCCCGGTTTAGACACACAGGTCCCCGCT-5(2)PCR扩增以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28B质粒为模板，通过PCR基因扩增，获得IL-28B基因片段；(3)将上述PCR扩增得到的IL-28B基因片段与pET-44 Ek/LIC载体连接，构建重组载体pET-44 Ek/LIC-IL-28B；(4)将重组载体pET-44 Ek/LIC-IL-28B转化细菌，构建重组IL-28B工程菌；(5)培养构建的重组IL-28B工程菌，诱导其表达生产IL-28B。
3.如权利要求2所述的人白细胞介素IL-28B的生产方法，其特征在于所述基因工程方法包括如下步骤(1)合成PCR引物，并在合成的引物中导入LIC粘性末端，上游引物5-GACGACGACAAGATTCCTGTCGCCAGGCTC-3下游引物3-GAGGAGAAGCCCGGTTTAGACACACAGGTCCCCGCT-5；(2)PCR扩增以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28B质粒为模板，通过PCR基因扩增，获得IL-28B基因片段；(3)将上述PCR方法扩增得到的IL-28B基因片段的终止密码子TGA转换成TAA，然后和pET-44 Ek/LIC载体连接，构建重组载体pET-44 Ek/LIC-IL-28B；(4)将重组载体pET-44 Ek/LIC-IL-28B转化大肠杆菌，构建重组IL-28B工程菌；(5)培养构建的重组IL-28B工程菌，诱导其表达生产IL-28B。
4.如权利要求2或3所述的人白细胞介素(IL)-28B的生产方法，其特征在于步骤(2)所述PCR扩增的反应条件为①95℃变性15min；②94℃ 45s，72℃ 30s，退火温度每循环降低1.0℃，72℃ 45s，5个循环；③94℃ 45s，设置退火温度梯度从68℃到70℃ 30s，72℃45s，30个循环；④72℃延伸10min。
5.如权利要求2或3所述的人白细胞介素(IL)-28B的生产方法，其特征在于步骤(5)是采用IPTG诱导重组IL-28B工程菌表达生产的。
6.一种重组IL-28B的工程菌，其特征在于由如下步骤构建而成(1)合成PCR引物，并在合成的引物中导入LIC粘性末端，上游引物5-GACGACGACAAGATTCCTGTCGCCAGGCTC-3下游引物3-GAGGAGAAGCCCGGTTTAGACACACAGGTCCCCGCT-5；(2)PCR扩增以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28B质粒为模板，通过PCR基因扩增，获得IL-28B基因片段；(3)将上述PCR扩增得到的IL-28B基因片段和pET-44 Ek/LIC载体连接，构建重组载体pET-44 Ek/LIC-IL-28B；(4)将重组载体pET-44 Ek/LIC-IL-28B转化细菌，构建重组IL-28B工程菌；
7.如权利要求6所述的重组IL-28B的工程菌，其特征在于由如下步骤构建而成(1)合成PCR引物，并在合成的引物中导入LIC粘性末端，上游引物5-GACGACGACAAGATTCCTGTCGCCAGGCTC-3下游引物3-GAGGAGAAGCCCGGTTTAGACACACAGGTCCCCGCT-5；(2)PCR扩增以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28B质粒为模板，通过PCR基因扩增，获得IL-28B基因片段；(3)将上述PCR方法扩增得到的IL-28B基因片段的终止密码子TGA转换成TAA，然后和pET-44 Ek/LIC载体连接，构建重组载体pET-44 Ek/LIC-IL-28B；(4)将重组载体pET-44 Ek/LIC-IL-28B转化大肠杆菌，构建重组IL-28B工程菌。
全文摘要
本发明公开了一种人白细胞介素28B的生产方法及重组IL－28B工程菌。本发明包括人工合成引物；PCR扩增IL－28B成熟肽编码区；IL－28B原核表达载体pET44－IL－28B的构建；转化入大肠杆菌构建重组IL－28B工程菌；培养工程菌高效表达IL－28B；IL－28B的纯化。本发明由于采用不依赖连接反应的克隆方法(LIC)，准确、快速获得IL－28B基因的成熟肽编码区；使用大肠杆菌偏爱的终止密码子提高表达效率，表达量高，用S蛋白亲和层析柱一步纯化即可获得很纯的产品。IL－28B的制备，对临床用于治疗和预防感染性疾病及非感染性疾病具有重要的前景。
文档编号C12N15/70GK1614016SQ20041005229
公开日2005年5月11日 申请日期2004年11月19日 优先权日2004年11月19日
发明者何韶衡, 李明才 申请人:汕头大学医学院