专利名称：一种拟南芥多聚糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1的抗寒应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说涉及一种拟南芥多聚糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1的应用。
背景技术：
植物对环境变迁及不良环境有足够的适应性和抗抵能力，这种抗逆性既受系统发育的遗传基因所控制，又受个体发育中生理生态所制约。植物抗寒机理的阐明，不仅有着重要的科学理论意义，而且具有重要的应用价值。全球每年因低温寒害造成农作物的损失高达数千亿美元。因此，长期以来，已有多种学科，如植物生理学、形态学、遗传育种学、生物化学、生物物理学、细胞生物学及分子生物学等，从多方面对植物抗寒机理进行了广泛的研究。
Weiser认为植物在适应低温过程中基因表达发生改变。Guy等研究发现冷驯化能诱导和增加一些基因的表达，使多种基因表达发生改变。这些冷诱导基因表达的产物可分为两类，一是调控蛋白，调控寒冷信号传导、抗寒基因表达和抗寒蛋白活性；二是功能蛋白，与植物抗寒性的提高直接相关。随着科学技术的不断发展，人们已成功利用转基因技术将已获得的冷调节基因转入到不抗寒植株中，研究结果证明，冷调节基因确实具有提高植物抗寒力的功能。但同时也存在一些转基因植株抗寒力提高不明显的例子。Claudia等利用农杆菌介导法将菠菜中的CAP160、CAP85基因转入烟草中，结果发现转基因植株的LT50与野生型无明显差别，说明两蛋白对植物抗寒力的提高影响不大。这同时也证明植物抗寒力是由多组基因调控的累积性状，利用单一基因转移技术来提高植物抗寒力，其效果非常有限，只有多个冷调节基因共同协作才能达到增强植物抗寒力的目的。就目前基因转化技术来看，利用多基因转化提高植物抗寒力，仍需待以时日。
人们在研究极地鱼类和昆虫时，发现它们体内有一种抗冻蛋白(AFP)。这种蛋白能够导致热滞并能抑止重结晶，从而提高这些生物对寒冷的耐性。但人们在植物中一直没有找到抗冻蛋白。1998年，Worrall等在胡萝卜中发现抗冻蛋白，它能抑止重结晶，并与多聚半乳糖醛酸酶抑止蛋白(PGIPs)的序列高度同源。PGIPs属于一个蛋白家族——富含亮氨酸的重复结构(Leu-rich repeat，LRR)蛋白家族。LRR的特点是保守序列GxIPxxLGxLxxLxxLxLxxNxLx，它参与激素受体反应、酶的抑制、细胞粘附、细胞运输和哺乳动物细胞早期发育。PGIPs可特异的抑制真菌的多聚半乳糖醛酸酶活性，但不抑制植物的或细菌的，从而引起植物对真菌的防御反应。研究人员致力于寻找能够提高植物抗寒能力的基因，这具有深远的经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟南芥多聚糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1在提高植物抗寒性方面的应用。
本发明的技术方案如下本发明所述抗寒功能的AtPGIP1基因是用BLAST的方法，通过与胡萝卜PGIP序列的比对，从拟南芥信息资源TAIR数据库中得到的；在干旱、冷和盐诱导处理的拟南芥cDNA文库中筛选发现的，其在GenBank中的编号是AT3G55530，该基因的CDS长993bp，5’UTR长23bp，3’UTR长153bp，编码330aa的蛋白。
用SMART程序分析预测AtPGIP1蛋白，该蛋白含有四个LRR结构域和一段信号肽。
AtPGIP1基因序列是用BLAST的方法，通过与胡萝卜PGIP序列的比对，从拟南芥信息资源TAIR数据库中得到的。AtPGIP1基因用如下引物从我们自己构建的拟南芥(生态型Landsberg eracta)的cDNA文库中通过PCR扩增出来5’-CGGGATCCATGGATAAGACAG-3’和5’-CGGGATCCTAGAGAT AAGCTT-3’，然后通过BamHI酶切连入pBluescript构建重组载体pBS-PGIP1，并转入大肠杆菌进行扩增。重组载体pBS-PGIP1经XbaI和SalI酶切，载体pBA002经XbaI和XhoI酶切，SalI和XhoI是同尾酶，酶切后可产生相同的粘性末端，片段和载体连接转入大肠杆菌进行扩增，得到重组载体pBA002-PGIP1。将pBA002-PGIP1转入根癌农杆菌，进行扩大培养，用真空法转化拟南芥。收获的种子经过筛选，并用叶片PCR进行鉴定，得到高表达AtPGIP1的转基因植物。
本发明的有益效果本发明破译了拟南芥多聚糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1的功能，证实了该基因能够提高植物的抗寒能力。该基因的应用可降低全球每年因低温寒害而造成的农作物的损失，有着巨大的经济价值和应用前景。
图1为AtPGIP1和AtPGIP2在基因组上的位置和推测的AtPGIP1的结构域；图2为0℃处理后AtPGIP1和AtPGIP2表达量的northern结果；图3为AtPGIP1转基因植物表达量的Nothern blot结果；图4为低温处理wt、转P35S-PGIP1植物和突变体pgip1植物的结果。
其中，图1中A为AtPGIP1和AtPGIP2在基因组上的位置，箭头部分表示开放读码框，两个基因中间都有内含子；B为推测的AtPGIP1的结构域；AtPGIP1含有四个LRR结构域和一段信号肽。图3中，7.2，8.1，16.2，21.4为转Pubiquitin-PGIP1植物，1，4，5，6，13，17为转P35s-PGIP1植物。
具体实施例方式
用来做野生型(wt)、突变体(mutant)和转基因的拟南芥的生态型是Columbia。种子灭菌后在MS的平板上萌发，4℃春化3天，然后生长在22℃的温室中，每天16小时的光周期。两星期后移入土中，在同样的条件下生长。
实施例1将野生型的植物在0℃处理不同时间，然后进行Northern分析，结果如图2所示，发现AtPGIP1和AtPGIP2的表达量变化有所不同。这说明AtPGIP1可被冷诱导，而AtPGIP2不能被冷诱导，所以AtPGIP1基因是与冷诱导相关的。
实施例2将AtPGIP1基因分别克隆到含有单子叶植物的启动子ubiquitin和双子叶植物的启动子35S的表达载体中，农杆菌介导转入野生型拟南芥，得到转基因的植株。我们总共选了9棵来做Nothern blot分析，结果如图3所示，发现不同植株的AtPGIP1表达量不同，野生型植株中有少量表达，而突变体植株中没有表达。而转Pubiquitin-PGIP1植物的总体表达水平比转P35s-PGIP1植株要高。
实施例3寒冷试验本发明在低温条件下处理wt、转P35S-PGIP1植物和突变体pgip1植物。三种植物在4℃处理两个月，10℃处理半个月，之后在15℃处理两个月。结果如图4所示，转基因植物AtPGIP1的植株最大，而突变体pgip1的植株最小，冷处理对转P35S-PGIP1植物的生长影响最小。该实验说明，PGIP1基因的表达能提高植物对寒冷的耐受性。
实施例4 RNA提取和Northern blot分析用热酚法分别提取约两周大的wt、转P35S-PGIP1植物和pgip1突变体植物的总RNA，进行Northern blot分析。Northern blot的探针用Redi-prime的试剂盒进行制备。Nothern blot结果表明与野生型植株比较，转P35S-PGIP1植株中AtPGIP1的表达量有所增高，而突变体中则没有表达。
一种拟~1.TXTSEQUENCE LISTING<110>中山大学<120>一种拟南芥多聚糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1的抗寒应用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1237<212>DNA<213>拟南芥mouseearcress<220>
<221>CDS<222>(24)..(1013)<400>1catcaaaatt caaaaccaac acc atg gat aag aca gcg aca ttg tgt ctc ttg 53Met Asp Lys Thr Ala Thr Leu Cys Leu Leu1 5 10ttc ttg ttc aca ttc ctc acg acc tgt ttg tct aaa gat ctc tgt aac 101Phe Leu Phe Thr Phe Leu Thr Thr Cys Leu Ser Lys Asp Leu Cys Asn15 20 25caa aat gac aaa aac acc ctc ctc aag atc aag aaa tct cta aac aac 149Gln Asn Asp Lys Asn Thr Leu Leu Lys Ile Lys Lys Ser Leu Asn Asn30 35 40cct tat cac ctc gct tca tgg gac cct caa acc gac tgt tgc tcc tgg 197Pro Tyr His Leu Ala Ser Trp Asp Pro Gln Thr Asp Cys Cys Ser Trp45 50 55tac tgc ctt gag tgc ggc gac gcc acc gtt aac cac cgt gtt acc gcc 245Tyr Cys Leu Glu Cys Gly Asp Ala Thr Val Asn His Arg Val Thr Ala60 65 70tta acc ata ttc tcc ggc cag atc tcc ggt cag atc ccg gct gaa gtc 293Leu Thr Ile Phe Ser Gly Gln Ile Ser Gly Gln Ile Pro Ala Glu Val75 80 85 90ggt gac ttg ccg tat ctt gag acc ctt gtc ttc cgc aaa ctc tct aac 341Gly Asp Leu Pro Tyr Leu Glu Thr Leu Val Phe Arg Lys Leu Ser Asn95 100 105ctc acc ggt aca atc caa ccc acc atc gcc aaa ctc aag aac ctc cga 389Leu Thr Gly Thr Ile Gln Pro Thr Ile Ala Lys Leu Lys Asn Leu Arg110 115 120atg ctc agg ctc agc tgg acg aat ctg aca ggt cca att cct gac ttt 437Met Leu Arg Leu Ser Trp Thr Asn Leu Thr Gly Pro Ile Pro Asp Phe125 130 135ata agt cag ctc aag aat ctc gag ttc tta gaa ctt tcc ttc aat gat 485Ile Ser Gln Leu Lys Asn Leu Glu Phe Leu Glu Leu Ser Phe Asn Asp140 145 150ctc tct ggt tcc att cca agt tct crc tct acg tta cct aaa atc ttg 533Leu Ser Gly Ser Ile Pro Ser Ser Leu Ser Thr Leu Pro Lys Ile Leu155 160 165 170gct ctt gaa ctt agc agg aac aaa ctt aca ggt aaa gaa cga tct ttt 581Ala Leu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Leu Thr Gly Lys Glu Arg Ser Phe175 180 185cct tta tta cat cat tca gtg tct tgt cta aac aac gat ctt tat gtt 629Pro Leu Leu His His Ser Val Ser Cys Leu Asn Asn Asp Leu Tyr Val190 195 200
一种拟~1.TXTgta ggt tcc ata cca gag tca ttt ggg tcg ttt cca gga aca gtc cct 677Val Gly Ser Ile Pro Glu Ser Phe Gly Ser Phe Pro Gly Thr Val Pro205 210 215gac ctt.cgc cta tca cat aac cag ctc tcc ggt cca ata ccc aaa tca 725Asp Leu Arg Leu Ser His Asn Gln Leu Ser Gly Pro Ile Pro Lys Ser220 225 230tta ggc aac atc gac ttt aac cgg atc gat tta tcc cgc aac aag ctc 773Leu Gly Asn Ile Asp Phe Asn Arg Ile Asp Leu Ser Arg Asn Lys Leu235 240 245 250caa ggt gat gct tcg atg ttg ttt ggt tcc aac aaa aca acc tgg tct 821Gln Gly Asp Ala Ser Met Leu Phe Gly Ser Asn Lys Thr Thr Trp Ser255 260 265att gac tta tca aga aac atg ttc cag ttc gat atc tca aag gtt gat 869Ile Asp Leu Ser Arg Ash Met Phe Gln Phe Asp Ile Ser Lys Val Asp270 275 280atc cct aaa aca ctt ggt atc ttg gac ttg aac cac aat ggg atc act 917Ile Pro Lys Thr Leu Gly Ile Leu Asp Leu Asn His Asn Gly Ile Thr285 290 295ggg aat att ccg gtg cag tgg act gaa gct cct ctt cag ttc ttc aat 965Gly Asn Ile Pro Val Gln Trp Thr Glu Ala Pro Leu Gln Phe Phe Asn300 305 310gtt agc tac aac aaa ctg tgt gga cac atc cca act gga ggg aaa ctt 1013Val Ser Tyr Asn Lys Leu Cys Gly His Ile Pro Thr Gly Gly Lys Leu315 320 325 330cagacatttg attcttattc ctattttcac aacaagtgtt tgtgtggtgc tcctcttgaa1073atttgcaagt aaaccaagct tatctctagg attacgaaaa aatatatttg agtcaataat1133atagacaaat atgtaatgtt attcggattg attaataaaa catgaaccaa acctctcatt1193tgatgtattc atagcacatt ttcaaaatgt tttatttgat ggat 1237<210>2<211>330<212>PRT<213>拟南芥mouseearcress<400>2Met Asp Lys Thr Ala Thr Leu Cys Leu Leu Phe Leu Phe Thr Phe Leu1 5 10 15Thr Thr Cys Leu Ser Lys Asp Leu Cys Asn Gln Asn Asp Lys Asn Thr20 25 30Leu Leu Lys Ile Lys Lys Ser Leu Asn Asn Pro Tyr His Leu Ala Ser35 40 45Trp Asp Pro Gln Thr Asp Cys Cys Ser Trp Tyr Cys Leu Glu Cys Gly50 55 60Asp Ala Thr Val Asn His Arg Val Thr Ala Leu Thr Ile Phe Ser Gly65 70 75 80Gln Ile Ser Gly Gln Ile Pro Ala Glu Val Gly Asp Leu Pro Tyr Leu85 90 95Glu Thr Leu Val Phe Arg Lys Leu Ser Asn Leu Thr Gly Thr Ile Gln100 105 110
一种拟~1.TXTPro Thr Ile Ala Lys Leu Lys Asn Leu Arg Met Leu Arg Leu Ser Trp115 120 125Thr Asn Leu Thr Gly Pro Ile Pro Asp Phe Ile Ser Gln Leu Lys Asn130 135 140Leu Glu Phe Leu Glu Leu Ser Phe Asn Asp Leu Ser Gly Ser Ile Pro145 150 155 160Ser Ser Leu Ser Thr Leu Pro Lys Ile Leu Ala Leu Glu Leu Ser Arg165 170 175Asn Lys Leu Thr Gly Lys Glu Arg Ser Phe Pro Leu Leu His His Ser180 185 190Val Ser Cys Leu Asn Asn Asp Leu Tyr Val Val Gly Ser Ile Pro Glu195 200 205Ser Phe Gly Ser Phe Pro Gly Thr Val Pro Asp Leu Arg Leu Ser His210 215 220Asn Gln Leu Ser Gly Pro Ile Pro Lys Ser Leu Gly Asn Ile Asp Phe225 230 235 240Asn Arg Ile Asp Leu Ser Arg Asn Lys Leu Gln Gly Asp Ala Ser Met245 250 255Leu Phe Gly Ser Asn Lys Thr Thr Trp Ser Ile Asp Leu Ser Arg Asn260 265 270Met Phe Gln Phe Asp Ile Ser Lys Val Asp Ile Pro Lys Thr Leu Gly275 280 285Ile Leu Asp Leu Asn His Asn Gly Ile Thr Gly Asn Ile Pro Val Gln290 295 300Trp Thr Glu Ala Pro Leu Gln Phe Phe Asn Val Ser Tyr Asn Lys Leu305 310 315 320Cys Gly His Ile Pro Thr Gly Gly Lys Leu325 330
权利要求
1.一种拟南芥多聚糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1在提高植物抗寒能力上的应用，其特征在于所述基因AtPGIP1来源于拟南芥cDNA文库，其在GenBank中的编号是AT3G55530，核苷酸序列如序列表所示，编码330个氨基酸，氨基酸序列如序列表所示。
全文摘要
本发明公开了一种拟南芥多聚糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1的抗寒应用。本发明所述抗寒功能的AtPGIP1基因是用BLAST的方法，通过与胡萝卜PGIP序列的比对，从拟南芥信息资源TAIR数据库中得到的；在干旱、冷和盐诱导处理的拟南芥cDNA文库中筛选发现的，其在GenBank中的编号是AT3G55530，该AtPGIP1基因的CDS长993bp，5′UTR长23bp，3′UTR长153bp，编码330aa的蛋白。本发明证实了该基因能够提高植物的抗寒能力，对该基因的应用可降低全球每年因低温寒害而造成的农作物的损失，有着巨大的经济价值和应用前景。
文档编号C12N15/29GK1609218SQ20041005229
公开日2005年4月27日 申请日期2004年11月19日 优先权日2004年11月19日
发明者谢旗, 刘媛媛 申请人:中山大学