专利名称：用于rna干扰研究的表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是用于表达siRNA的质粒载体。
背景技术：
随着分子生物学技术的发展，已有多种技术用于抑制基因表达的研究，如反义寡核苷酸，反义核酸，核酶等。近年来，RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)已成为一种有效的转录后基因调控手段，是基因功能研究的有力工具。研究表明，在哺乳类细胞，甚至人类细胞中导入21～23个核苷酸的小双链RNA(small linterfering RNA，siRNA)可使靶向基因表达出现特异性的强抑制效应。
而进行RNAi研究，需要对候选的siRNA进行筛选和鉴定，以获得有效的siRNA。制备用于RNAi研究的siRNA主要有以下5种方法直接化学合成；体外转录合成；用Dicer酶切双链RNA获得多个siRNA(siRNA pool)；制备siRNA表达框(siRNA ExpressionFrames)以及利用质粒或病毒表达载体在细胞内转录siRNA。利用siRNA表达载体在细胞内转录siRNA，具有表达稳定、持久，抑制效果明显的特点。
进行整体动物水平的RNAi实验研究，利用腺病毒载体介导表达siRNA是一种可行的途径。腺病毒感染效率高，有相当宽的感染宿主谱，既可感染分裂细胞又可感染非分裂细胞(静止细胞)，载体容量大，安全性高，腺病毒不整合进宿主染色体中，不会引起恶性肿瘤的发生，迄今为止未发现其参与人体主要疾病，而且容易制备，因此腺病毒载体在基因治疗和基因功能研究方面得到了广泛应用，在人类疾病基因治疗方面使用也十分广泛。
制备表达siRNA的重组腺病毒，需要构建可表达siRNA的腺病毒穿梭质粒载体。目前，已经有单独商品化的表达siRNA的真核表达载体和腺病毒穿梭质粒载体，但还没有能将以上两种载体联合使用，以实现细胞和整体动物水平的系统的RNAi实验研究。若能将表达有效的siRNA的DNA片段从siRNA的真核表达载体亚克隆到腺病毒穿梭质粒载体上，进而构建表达siRNA的重组腺病毒，将会大大缩短实验周期，提高研究效率。
发明内容
本发明的目的是针对目前RNA干扰研究普遍存在实验周期长、效率低的问题，对表达siRNA的真核表达载体和腺病毒穿梭质粒载体进行启动子改造，使其可以联合使用，用于制备表达siRNA的重组腺病毒质粒载体，以实现细胞和整体动物水平的系统的RNAi实验研究，缩短实验周期和提高效率。
本发明的技术问题是通过如下方案实现的
1、真核表达载体的启动子改造下面以构建pSec-pol载体为例来说明真核表达载体的启动子改造方法。
质粒pSec-Tag2A是美国lnvitrogen公司的产品，货号为V900-20。
本发明的质粒的构建采用了小鼠U6 RNA聚合酶III(PolIII)启动子序列，取代原质粒pSec-Tag2A的CMV启动子，使之具有表达短的发夹状siRNA的特异性。
先制备小鼠U6 PolIII片段及CMV增强子片段序列，用PCR扩增连接法制备CMV增强子-PolIII连接片段，使其5′、3′端分别引入MluI和BamHI识别序列，根据pSec-Tag2A多克隆位点上游CMV增强子和启动子两侧单一的MluI和BamHI识别位点，以定向克隆法将CMV增强子-PolIII片段替换CMV增强子和启动子，构建成pSec-pol载体。
本发明的pSec-pol载体有以下两个特点(1)、包含小鼠U6 RNA聚合酶III(PolIII)启动子序列，能在真核细胞中特异性地表达短(19至30碱基对)的发夹状siRNA，用于RNAi的实验研究；(2)、该载体包含抗Zeocin的基因片段，可利用Zeocin加压培养，筛选建立稳定表达siRNA的重组pSec-pol载体转化细胞株，即进行RNAi研究的细胞模型。
本发明的质粒载体的构建也可以不采用上述商业质粒pSec-Tag2A，而采用直接改建其它真核表达质粒的多克隆位点上游的增强子、启动子序列的方式获得。
本发明的质粒可以制成注射剂。
本发明的质粒可用于基因治疗，并可与其它疾病治疗药物联合应用，包括制成复方制剂。
2.腺病毒穿梭质粒载体的改造下面以构建pAdTrack-pol载体为例来说明腺病毒穿梭质粒载体的改造方法。
质粒pAdTrack-CMV是Howard Hughes医学研究所的商业用质粒。
本发明的质粒的构建采用了小鼠U6 RNA聚合酶III(PolIII)启动子序列，取代原质粒pAdTrack-CMV的CMV启动子，使之具有表达短的发夹状siRNA的特异性。
本发明的pAdTrack-pol质粒具有以下三个特点(1)、包含小鼠U6 RNA聚合酶III(PolIII)启动子序列，能在真核细胞中特异性地表达短(19至30碱基对)的发夹状siRNA，用于RNAi的实验研究；(2)、本发明的质粒还包括单独的绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒，其不与目的基因融合表达，能够与便于用来检测质粒及其携带的目的基因的转染效率，检测腺病毒的滴度；(3)、不能直接将siRNA的模板DNA插入pAdTrack-pol载体，构建siRNA表达载体；可根据pSec-pol和pAdTrack-pol的PolIII启动子上游单一的Spe I和下游的Not I或Xho I或EcoRV识别位点，将插入到pSec-pol上的siRNA的DNA模板片段亚克隆到pAdTrack-pol上，构建相应的重组腺病毒穿梭质粒。
本发明的质粒的构建也可以不采用上述商业质粒pAdTrack-CMV，而采用直接改建其它腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上游的增强子和启动子序列的方式获得。
本发明的穿梭质粒可以制成注射剂。
本发明的穿梭质粒可携带表达siRNA的DNA模板，介导制备表达siRNA的重组腺病毒，进而进行整体动物水平的RNAi研究。
3、真核表达载体和腺病毒穿梭质粒载体的联合使用将表达有效siRNA的DNA片段从siRNA的真核表达载体亚克隆到腺病毒穿梭质粒载体上，进而构建表达siRNA的重组腺病毒质粒载体。
本发明的有益效果本发明将真核表达载体和腺病毒穿梭质粒载体进行启动子的序列改造，使其可以联合使用，进而构建表达siRNA的重组腺病毒质粒载体，实现了细胞和整体动物水平的系统的RNAi实验研究，大大缩短了实验周期，提高了实验效率。
图1为pSec-pol载体构建流程图；图2为pSec-pol载体结构图谱；图3为pAdTrack-pol载体构建流程图；图4为pAdTrack-pol载体结构图谱。
具体实施例方式
下面举出一些实施例来说明本发明的可实施效果，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 PSec-pol质粒的构建根据已知的小鼠U6 RNA聚合酶III(PolIII)启动子序列，设计合成PCR引物上游引物5′-CAATGGGAGTTTGTTTTGTCTAGAACTAGTCGATCCGACGCCGCCATCTCTAG-3′；下游引物5′-GGGGATCCAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG-3′(BamH I)，以小鼠基因组DNA为模板，扩增获得PolIII片段(354bp)，其核苷酸序列如SEQID NO3所示。
根据pSec-Tag2A载体的CMV增强子序列(CMV enhancer)，设计合成PCR引物上游引物5′-GCCAGATATACGCGTT-3′(Mlu I)，下游引物5′-CGTCGGATCGACTAGTTCTAGACAAAACAAACTCCCATTG-3′；以pSec-Tag2A载体为模板，扩增获得CMV enhancer片段(519bp)，其核苷酸序列如SEQ ID NO4所示。
由于CMV enhancer的下游引物和PolIII的上游引物是完全互补序列，因此，用CMV enhancer的上游引物和PolIII的下游引物，以PCR扩增连接法制备CMV enhancer-PolIII连接片段，并使其5′，3′端分别引入Mlu I和BamH I识别序列。根据pSec-Tag2A多克隆位点上游CMV增强子和启动子两侧单一的Mlu I和BamH I识别位点，以定向克隆法将CMV增强子和PolIII片段替换CMV增强子和启动子，构建成pSec-pol。构建流程图如图1所示，pSec-pol载体图谱如图2所示。
DNA测序结果表明，PolIII已整合到重组质粒pSec-pol中。
实施例2 pAdTrack-pol质粒的构建限制性内切酶分析表明，在pAdTrack-CMV载体多克隆位点上、下游分别有单一的限制性内切酶Nde I位点。用PCR突变法将pAdTrack-CMV多克隆位点下游的Nde I(CATATG)位点突变为CATATC，而只保留多克隆位点上游单一的Nde I位点。同时以PCR扩增连接法制备CMV增强子-MLC-2V片段，以定向克隆法将CMV增强子-MLC-2V片段替换原pAdTrack-CMV质粒的CMV增强子和启动子。
具体作法如下根据pAdTrack-CMV载体多克隆位点下游NdeI位点上、下游两侧单一的HindIII和Nhe I位点，设计2对引物分别扩增出对应片段。第1对引物，上游引物P15′-GAGCCTAAGCTTCTAGATAAGA-3′(HindIII)，下游引物P25′-GCGTACTTGGGATATGATACACT-3′(Nde I突变)；第2对引物，上游引物P35′-AGTGTATCATATCCCAAGTACGC-3′(NdeI突变)，下游引物P45′-AACAGCTCCTCGCCCTTGC-3′(NheI在扩增范围内)。由于P2和P3是完全互补序列，因此，用P1和P4为引物，以PCR扩增连接法制备去除Nde I位点的片段，并使其5′，3′端分别引入HindIII和Nhe I识别序列。以定向克隆法将这一无Nde I位点的连接片段替换原有序列。
根据已知的小鼠U6 RNA聚合酶III(PolIII)启动子序列，设计合成PCR引物上游引物5′-CAATGGGAGTTTGTTTTGCGCTCTAGAACTAGTGGATCCGACGCCGCCATCTCTAG-3′；下游引物5′-TGGATATCTTACTCGAGCGGCCGCGTCGAAAACAAGGCTTTCTCCAAGG-3′(EcoRV)，以小鼠基因组DNA为模板，扩增获得PolIII片段(375bp)，其核苷酸序列如SEQ ID NO5所示。
根据pAdTrack-CMV载体的CMV增强子序列(CMV enhancer)，设计合成PCR引物上游引物5′-GTGTATCATATGCCAAGTAC-3′(Nde I)；下游引物5′-CTAGAGATGGCGGCGTCGGATCCACTAGTTCTAGAGCGCAAAACAAACTCCCATTG-3′，以pAdTrack-CMV载体为模板，扩增获得CMV enhancer片段(274bp)，其核苷酸序列如SEQ ID NO6所示。
由于CMV enhancer的下游引物和PolIII的上游引物是完全互补序列，因此，用CMV enhancer的上游引物和PolIII的下游引物，以PCR扩增连接法制备CMV enhancer-PolIII连接片段，并使其5′，3′端分别引入Nde I和BamH I识别序列。根据pAdTrack-CMV多克隆位点上游CMV增强子和启动子两侧单一的Nde I和BamH I识别位点，以定向克隆法将CMV增强子和PolIII片段替换CMV增强子和启动子，构建成pAdTrack-pol。构建流程图如图3所示，pSec-pol载体图谱如图4所示。
DNA测序结果表明，PolIII启动子已整合到重组质粒pAdTrack-pol中。
实施例3 细胞学实验利用Lipofectamine2000试剂，将3ug的pN3-EGFP质粒DNA转化丰度为80％的人胚脐静脉内皮细胞(HUVECs)。用800ug/mL的G418加压培养，观察到所有细胞都表达绿色荧光蛋白(GFP)后，用400ug/mL的G418加压，继续放大培养。
根据已报道的可抑制GFP表达的22-nt的siRNA序列，制备靶向GFP基因片段GCGATGCCACCTACGGCAAGC的siRNA的DNA模板，构建siRNA表达载体pSec-pol-GFP。利用Lipofectamine2000试剂，分别将pSec-pol和pSec-pol-GFP转染表达GFP的HUVECs，转染后48hr，分别用细胞图像分析系统和Real-time定量PCR检测GFP的表达水平。检测结果显示，同对照组相比，pSec-pol-GFP转染的HUVECs中GFP的蛋白和mRNA表达水平显著减低(p＜0.05)。
实验表明，本发明中的pSec-pol可作为siRNA表达载体进行抑制基因表达的研究。
实施例4 表达VEGF siRNA腺病毒的制备及整体动物实验以促血管生成的VEGF基因为靶基因，将表达VEGF siRNA的重组腺病毒感染裸鼠肝癌模型，观察对肝癌的抑制作用。
根据已报道的可抑制VEGF表达的19-nt的siRNA序列，制备靶向VEGF基因片段ACCTCACCAAGGCCAGCAC的siRNA的DNA模板，定向插入pSec-pol的BamH I和Xho I位点间，构建siRNA表达载体pSec-pol-VEGF。根据pSec-pol和pAdTrack-pol的PolIII启动子上下游单一的Spe I和Xho I识别位点，将包含VEGF siRNA的DNA模板的片段亚克隆到pAdTrack-pol，构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-pol-VEGF。利用pAdTrack-pol-VEGF和腺病毒骨架质粒pAdEasy-I制备重组腺病毒质粒pAdEasy-pol-VEGF。用脂质体法将pAdEasy-pol-VEGF导入293细胞，包装、扩增、纯化重组腺病毒rAd-pol-VEGF。
制备裸鼠肝癌模型。将rAd-pol-VEGF和对照腺病毒rAd-pol分别注射肝癌区，2周后测定肝癌大小和血管密度。
实验结果表明，同对照组相比，rAd-pol-VEGF注射组肝癌体积变小(p＜0.05)，血管密度显著降低(p＜0.05)。因此，将本发明的pSec-pol真核表达载体和pAdTrack-pol腺病毒穿梭质粒载体联合起来使用而制备的表达siRNA的重组腺病毒，用于抑制基因表达的研究，大大缩短了实验周期和提高了研究效率。
用于RNA干扰研究的表达载体序列表.ST25SEQUENCE LISTING<110>广东省人民医院<120>用于RNA干扰研究的表达载体<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>5190<212>DNA<213>人工序列<400>1gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg120cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc180ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt240gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata300tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc360cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc420attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt480atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt540atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca600tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg660actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgtctag720aactagtcga tccgacgccg ccatctctag gcccgcgccg gccccctcgc acagacttgt780gggagaagct cggctactcc cctgccccgg ttaatttgca tataatattt cctagtaact840atagaggctt aatgtgcgat aaaagacaga taatctgttc tttttaatac tagctacatt900ttacatgata ggcttggatt tctataagag atacaaatac taaattatta ttttaaaaaa960cagcacaaaa ggaaactcac cctaactgta aagtaattgt gtgttttgag actataaata 1020tcccttggag aaaagccttg tttggatcca ctccagtgtg gtggaattct gcagatatcc 1080agcacagtgg cggccgctcg aggagggccc gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 1140aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat cattgagttt aaacccgctg atcagcctcg 1200actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 1260ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttaa cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt 1320gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 1380attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg 1440aaagaaccag ctggggctct agggggtatc cccacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 1500cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg 1560ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 1620taaatcgggg catcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 1680aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 1740
用于RNA干扰研究的表达载体序列表.ST25ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac1800tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttggggatt tcggcctatt1860ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttaattctgt ggaatgtgtg1920tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca1980tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat2040gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc2100gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat2160ttatgcagag gccgaggccg cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt2220ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct cccgggagct tgtatatcca ttttcggatc2280tgatcagcac gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt ataatacgac2340aaggtgagga actaaaccat ggccaagttg accagtgccg ttccggtgct caccgcgcgc2400gacgtcgccg gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg ggttctcccg ggacttcgtg2460gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc tgttcatcag cgcggtccag2520gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg tgcgcggcct ggacgagctg2580tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg acgcctccgg gccggccatg2640accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc tgcgcgaccc ggccggcaac2700tgcgtgcact tcgtggccga ggagcaggac tgacacgtgc tacgagattt cgattccacc2760gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc2820ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct2880tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca2940ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg3000tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt3060tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt3120gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg3180ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg3240cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg3300cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat3360aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc3420gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc3480tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga3540agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt3600ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg3660taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc3720gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg3780gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc3840ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg3900ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc3960
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用于RNA干扰研究的表达载体序列表.ST25cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt8040gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc8100cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga8160gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga8220gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa8280catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga8340caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag8400cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct8460gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg8520cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga8580gctgtacaag tccggactca gatccaccgg atctagataa ctgatcataa tcagccatac8640cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa8700acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa8760ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg8820tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta acgcgnnntt acgcgctatg agtaacacaa8880aattattcag atttcacttc ctcttattca gttttcccgc gaaaatggcc aaatcttact8940cggttacgcc caaatttact acaacatccg cctaaaaccg cgcgaaaatt gtcacttctg9000tgtacaccgg cgcacaccaa aaacgtcact tttgccacat ccgtcgctta catgtgttcc9060gccacacttg caacatcaca cttccgccac actactacgt cacccgcccc gttcccacgc9120ccgcgccacg tcacaaactc caccccctca ttatcatatt ggcttcaatc caaaaggggc9180agagagctgg aagggannnt taattaannn 9210<210>3<211>354<212>DNA<213>人工序列<400>3caatgggagt ttgttttgtc tagaactagt cgatccgacg ccgccatctc taggcccgcg 60ccggccccct cgcacagact tgtgggagaa gctcggctac tcccctgccc cggttaattt 120gcatataata tttcctagta actatagagg cttaatgtgc gataaaagac agataatctg 180ttctttttaa tactagctac attttacatg ataggcttgg atttctataa gagatacaaa 240tactaaatta ttattttaaa aaacagcaca aaaggaaact caccctaact gtaaagtaat 300tgtgtgtttt gagactataa atatcccttg gagaaaagcc ttgtttggat cccc 354<210>4<211>519<212>DNA<213>人工序列<400>4gccagatata cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg 60tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg 120cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 180
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1.用于RNA干扰研究的真核表达载体，其特征在于是由小鼠U6RNA聚合酶III启动子序列，取代真核表达载体的启动子序列而构建成的真核表达载体。
2.根据权利要求1所述的用于RNA干扰研究的真核表达载体，其特征在于所述用于RNA干扰研究的真核表达载体为pSec-pol，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
3.用于RNA干扰研究的腺病毒穿梭质粒载体，其特征在于是由小鼠U6 RNA聚合酶III启动子序列，取代腺病毒穿梭质粒载体的启动子序列而构建成的腺病毒穿梭质粒载体。
4.根据权利要求3所述的用于RNA干扰研究的腺病毒穿梭质粒载体，其特征在于所述用于RNA干扰研究的腺病毒穿梭质粒载体为pAdTrack-pol，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
5.一种用于RNA干扰研究的重组腺病毒质粒载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)根据目标siRNA序列，制备其对应DNA模板序列；(2)将DNA模板序列定向插入权利要求1所述重组真核表达载体的BamH I和Xho I或Not I或EcoRV位点间，构建siRNA表达载体；(3)根据权利要求1所述重组真核表达载体和权利要求3所述重组腺病毒穿梭质粒载体的PolIII启动子上下游单一的Spe I和XhoI或Not I或EcoRV识别位点，将步骤(2)所构建的siRNA表达载体中包含目标siRNA的DNA模板序列片段亚克隆到权利要求3所述重组腺病毒穿梭质粒载体中，构建重组腺病毒质粒载体。
6.权利要求1所述的重组真核表达载体在RNAi研究中的应用。
7.权利要求3所述的重组腺病毒穿梭质粒载体在RNAi研究中的应用。
8.用权利要求5所述制备方法构建成的重组腺病毒质粒载体在RNAi研究中的应用。
全文摘要
本发明公开了用于RNA干扰研究的表达载体。本发明对真核表达载体和腺病毒穿梭质粒载体进行了启动子的序列改造。经过启动子改造的真核表达载体上有polIII启动子，可以在真核细胞中表达siRNA；经过启动子改造的腺病毒穿梭质粒载体上有一致的polIII启动子及两侧序列，可将构建于经过启动子改造的真核表达载体上的目的序列亚克隆到经过启动子改造的腺病毒穿梭质粒载体上，进而制备可表达siRNA的重组腺病毒质粒载体，在细胞及整体动物水平上进行RNA干扰的实验研究，可以大大缩短实验周期，提高研究效率。
文档编号C12N15/79GK1597966SQ20041005140
公开日2005年3月23日 申请日期2004年9月9日 优先权日2004年9月9日
发明者单志新, 余细勇, 林秋雄 申请人:广东省人民医院