专利名称：：积雪草总甙的制备新方法及其新用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，是制备积雪草总甙的一种新方法及其治疗抑郁症的新用途。抑郁症是以显著而持久的情绪低落、行为木僵和悲观厌世为主要特征的一组疾病。实际上它很普通，以至被称为精神疾病中的“普通感冒”，同时它还是严重的、威胁生命的疾病，折磨着世界上数以千万计的人。目前用于治疗抑郁症的药物主要有三环类抗抑郁剂、单胺氧化酶抑制剂和5-羟色胺重吸收抑制剂，但是均有不同程度的副作用，如嗜睡、视物模糊、高血压、惊厥和性欲低下等，从而限制了其广泛使用。积雪草Centellaasiatica(L.)Urban为伞形科植物，我国长江以南广大地区均有分布，其提取物积雪草总甙具有促进伤口愈合、减少疤痕疙瘩生成的作用，效果显著。现在已将积雪草总甙制备成外用药(如积雪霜)和口服药(如积雪片)，但是该药仅限于治疗外伤，迄今为止尚未见将积雪草总甙用于治疗抑郁症的报道，经过实验发现积雪草总甙具有较好的抗抑郁作用，是一种较有发展前途的天然抗抑郁剂。已报道的积雪草总甙的制备方法步骤复杂，使用有机溶剂种类和数量较多，易造成环境污染。本发明的目的之一在于提供一种工艺简单、得率高、不易造成环境污染的积雪草总甙制备新方法。本发明另一目的在于对积雪草总甙提供一种治疗抑郁症的新用途。积雪草总甙的制备方法包括提取、纯化、结晶三步骤。本发明提取和结晶过程与原工艺相同，但纯化过程不同。原纯化工艺采用卤化剂(氯仿、二氯甲烷等)萃取积雪草含水醇提取物，弃卤化剂层，用高级醇(正丁醇、仲丁醇等)萃取水层中积雪草总甙，以氢氧化钠水溶液和水溶液洗涤高级醇层提取物，并将其减压浓缩，其缺点是方法复杂，过程繁琐，使用较多的有机溶剂如卤化剂、高级醇，对环境污染严重，也有害于实际操作者的身体健康(制备方法详见专利CN1194154A号)。本发明则将积雪草总甙提取液经皂甙吸附型大孔树脂吸附，用蒸馏水洗脱去除杂质后，以含水醇洗脱积雪草总甙，收集洗脱液并减压浓缩至干，得到粘稠状物，再用含水醇溶解后就可用乙酸乙酯加以结晶。此过程步骤简单，有机溶剂使用的种类及数量明显减少，从而既缩短了工艺流程，又减少了对环境的污染和对操作者身体的危害。本发明制备方法具体步骤如下一、积雪草总甙的提取1、以含水醇浸泡积雪草，得到积雪草总甙提取液；2、冷冻提取液，减压过滤去除沉淀物，得滤液；二、积雪草总甙的纯化1、按常规方法将上述提取液减压浓缩，得到浓缩液；2、减压过滤浓缩液，得到滤液；3、滤液经皂甙吸附型大孔树脂吸附，蒸馏水洗脱去除杂质，再以含醇量5％～95％的甲醇或乙醇水溶液洗脱，得到洗脱液，详见《中药药理研究方法学》(陈奇主编，人民卫生出版社出版，199370)；4、按常规方法将洗脱液减压浓缩至干，得到粘稠状物；5、用含水醇溶解粘稠状物，比例为粘稠状物重量(公斤)∶含水醇的体积(毫升)＝1∶1～200，得到积雪草总甙溶液。三、积雪草总甙的结晶1、将上述积雪草总甙溶液以乙酸乙酯结晶，比例为积雪草总甙溶液的体积(毫升)∶乙酸乙酯的体积(毫升)＝1∶1～200，按常规方法减压浓缩至干，得到粉末状积雪草总甙。用于本发明的含水醇溶液含醇量为5％～95％的甲醇或乙醇。经13C和1H核磁共振检测，检测结果如表1和表2所示，说明得到的积雪草三萜总皂甙类成分主要由积雪草甙和羟基积雪草甙组成，两种成分占该提取物的60％以上。表1提取物样品中积雪草甙和羟基积雪草甙的13C核磁共振化学位移值与标准品比较(溶解于吡啶)碳积雪草积雪草甙羟基积雪羟基积雪草碳积雪草积雪草甙羟基积雪羟基积雪草甙样品标准品草甙样品甙标准品甙样品标准品草甙样品甙标准品148.148.249.949.92723.423.723.723.8268.668.968.869.028176.0176.2176.0179.8378.478.778.378.52917.117.323.524.0443.443.142.943.13021.021.121.021.3547.948.748.248.6葡萄糖619.119.367.367.6195.395.595.595.5732.933.039.139.0275.073.675.173.6839.939.539.439.5377.678.377.678.3948.148.348.348.9470.070.170.070.41038.037.937.838.0576.276.676.276.71124.324.324.525.0669.171.070.771.012125.7126.0126.1126.3葡萄糖’13138.2137.7137.5138.61104.6104.4104.6104.01442.344.242.344.3273.575.073.775.01528.428.728.528.7378.477.678.377.61624.324.524.526.0477.778.378.078.31749.548.448.448.0576.976.376.876.31852.953.353.153.3661.061.461.061.61938.838.037.938.1鼠李糖2039.039.038.839.11102.4102.4102.4102.42130.531.030.531.0272.572.472.572.42236.537.536.637.5372.372.172.372.12366.266.563.766.6473.773.673.573.62414.115.515.815.5570.769.469.169.42517.917.517.117.2617.418.118.318.12618.318.519.018.6表2提取物样品中积雪草甙和羟基积雪草甙的1H核磁共振化学位移值与标准品比较(溶解于吡啶)氢积雪草积雪草甙氢羟基积雪羟基积雪草甙样品标准品草甙样品甙标准品23.70ddd3.67ddd23.70ddd3.71ddd33.36d3.34d33.36d3.38d125.24t5.24t125.24t5.23t182.20d2.24d182.20d2.23d191.36m1.38m191.36m1.36m233.28d，3.51d3.46d，3.26d233.37d3.39d甲基-240.69s0.71s甲基-240.73s0.77s甲基-251.04s1.04s甲基-251.04s1.07s甲基-260.84s0.82s甲基-260.81s0.82s甲基-271.13s1.13s甲基-271.10s1.10s甲基-290.92s0.91d甲基-290.92s0.92s甲基-300.96s1.00s甲基-30095s0.95s葡萄糖葡萄糖15.29d5.29d15.29d5.29d23.33m3.31m23.31m3.31m33.37m3.39m33.39m3.39m43.42m3.42m43.40m3.42m53.48m3.49m53.47m3.49m6a4.06dd4.06dd6a4.06dd4.06dd6b3.76dd3.77dd6b3.76dd3.77dd葡萄糖’葡萄糖’14.37d4.37d14.36d4.37d23.23t3.23t23.23t3.23t33.43t3.45t33.44t3.45t43.51t3.53t43.51t3.53t53.29m3.29m53.29m3.29m6a3.81d3.80d6a3.80d3.80d6b3.65dd3.65dd6b3.65dd3.65dd鼠李糖鼠李糖14.83d4.84d14.84d4.84d23.83dd3.83dd23.81dd3.83dd33.60dd3.62dd33.62dd3.62dd43.39t3.40t43.41t3.40t53.96d3.96d53.97d3.96d甲基1.26d1.27d甲基1.27d1.27d四、积雪草总甙对实验性抑郁症治疗作用的验证强迫游泳实验(forcedswimmingtest)和未预知的长期应激刺激实验(chronicunpredictablestresstest)是验证药物具有抗抑郁作用常用的动物实验，故用其验证积雪草总甙对实验性动物抑郁症的防治作用。1、实验动物SD大鼠，雄性，160～200克，每4只/笼群养，自由觅食和饮水，室温23±2℃，自然光照。2、实验方法(1)强迫游泳实验将大鼠放入水深15厘米，水温25℃的量筒(高为40厘米，直径为18厘米)中游泳，使其产生恐惧心理，15分钟后取出，32℃下将毛烘干。24小时内，分别给实验动物注射或灌胃给药，再将大鼠放入上述环境中，测定大鼠在5分钟内保持游泳不动的时间，以不动时间的长短作为判断药物抗抑郁作用的标准。方法详见《现代药理实验方法》(张均田主编，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社出版，上册19981064)。本实验将大鼠分为5组，每组8只。①空白对照组，给予与药物实验组同剂量的生理盐水；②阳性对照组，给予药物丙咪嗪，剂量为20mg/kg，这是一种应用于临床具有较好治疗作用的抗抑郁药；③实验组，给予药物积雪草总甙，分为低、中、高三个剂量组，剂量分别为30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg，各组给药时间均为大鼠毛烘干后24小时内的相同时间。给药途径分为一次腹腔注射给药和三次灌胃给药。(2)未预知的长期应激刺激实验采用未预知的长期应激刺激能使动物产生抑郁症，亦即实验动物通常接受21天各种不同的刺激，包括电击足底、冷水游泳、热刺激、摇晃、夹尾、禁水、禁食和昼夜颠倒等刺激，就可产生抑郁症。方法详见《现代药理实验方法》(同上)。本实验动物分组为，①空白对照组，正常大鼠不给予任何刺激，给予与药物实验组同剂量蒸馏水；②抑郁症模型组，正常大鼠给予21天刺激但不给予任何药物，观察其产生抑郁症的情况；③阳性对照组；④实验组，第③、④组均为大鼠给药后再予刺激，药物和剂量同强迫游泳实验，观察药物对抑郁症的防治作用。给药途径为灌胃。1)实验前1天和实验开始后第22天，测定大鼠体重和24小时内1％蔗糖溶液的饮用量，比较其体重增加量和蔗糖溶液饮用量的变化。2)敞箱活动性实验分别在实验前1天，实验开始的第7、14和21天，将大鼠置于高40厘米，直径80厘米，周壁为黑色，底面由面积相等的25块格组成的圆柱敞箱内，光照为60瓦特，记录大鼠的行为，以穿越底面格数为水平活动得分，直立次数为垂直运动得分，同时测定理毛时间、等待时间及排便次数，测定时间为3分钟。方法详见《现代药理实验方法》(同上)。3)从病理组织切片观察各组大鼠大脑顶叶皮层和海马神经元形态的变化，比较各组间的差异。方法详见《病理组织切片技术》(高铭都、黄义禄著，南山堂出版社出版，1988124，Nissl染色法制备大鼠脑神经组织病理切片)。4)实验第22天，采用放免法测定大鼠血清中的促肾上腺皮质激素(ACTH)和血浆中的促甲状腺激素(TSH)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、3，3，5-三碘甲状腺原氨酸(rT3)的分泌，观察积雪草总甙对大鼠下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴和下丘脑—垂体—甲状腺轴的功能影响。3、实验结果1)强迫游泳实验结果见表3表3各组大鼠强迫游泳不动时间变化组别腹腔注射给药游泳不动时间灌胃给药游泳不动时间(秒)(秒)空白对照组175.25±9.50153.38±10.17阳性对照组107.50±13.36**41.25±17.68**积雪草总甙低剂量组161.67±16.46124.88±11.64**积雪草总甙中剂量组153.38±21.17*92.63±13.26**积雪草总甙高剂量组152.50±24.64*45.88±9.35**与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01由表3中结果可以看出，一次腹腔注射给药，积雪草总甙中、高剂量组较明显地减少强迫游泳不动时间，低剂量组虽然也减少了强迫游泳不动时间，但不显著。灌胃给药，积雪草总甙不仅显著减少强迫游泳不动时间，且高、中、低剂量组还显示了一定的剂量依赖性关系。表明积雪草总甙具有防治动物抑郁症的作用。2)未预知的长期应激刺激实验结果见表4表4各组大鼠体重增加量及1％蔗糖饮用量变化组别体重增加量1％蔗糖溶液饮用量变化(毫升)(克)实验前1天实验第22天空白对照组122.90±8.5738.63±4.5840.56±3.91**抑郁症模型组46.35±5.7540.50±3.2513.81±3.86阳性对照组99.98±12.31**39.38±2.9731.94±6.57**积雪草总甙低剂量组53.06±9.1339.75±3.2118.63±6.88积雪草总甙中剂量组74.48±10.73**36.38±4.1819.56±8.14积雪草总甙高剂量组86.11±8.71**40.25±4.3623.00±8.38**与抑郁症模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01从表4中可以看出，抑郁症模型组大鼠体重增加量和1％蔗糖溶液饮用量较空白对照组有极其明显的下降，表明我们所采用的模型使大鼠处于抑郁状态；阳性对照组对上述两种改变具有较好的改善作用，说明抗抑郁药丙咪嗪在此模型中显示了明显的治疗作用；积雪草总甙低剂量组对抑郁症动物体重的增加量和蔗糖溶液的饮用量无明显改变，积雪草总甙中、高剂量组较明显的增加了动物的体重和1％蔗糖水溶液饮用量，表明高剂量积雪草总甙对动物抑郁症有防治作用。从敞箱实验可以观察到，抑郁症模型组运动活动性减少，包括大鼠水平活动、垂直运动和理毛时间的减少，等待时间和大便次数的增加，表明我们采用的模型使大鼠处于抑郁状态；阳性对照组显著增加抑郁症大鼠的活动，不仅显示丙咪嗪对抑郁症较好的治疗作用，而且表明其作为阳性对照具有较好的参照性；积雪草总甙低剂量组对动物的抑郁状态没有明显的改善作用，积雪草总甙中、高剂量组则对抑郁大鼠以上5种行为的改变显示了较显著的作用，其中包括1周以后水平活动、垂直运动和理毛时间的逐渐增加，等待时间和大便次数的逐渐减少，表明积雪草总甙中、高剂量对实验动物抑郁症具有较好的治疗作用。3)各组大鼠大脑顶叶皮层和海马神经元形态的变化从大鼠脑病理组织切片Nissl染色结果观察到空白对照组大鼠顶叶皮层神经元尼氏体清晰，神经细胞排列整齐，分层清楚，由外至内可见分子层、外颗粒层、外锥体细胞层、内颗粒层、内锥体细胞层和多层细胞层。海马CA1、CA3及齿状回神经元尼氏体清晰，神经细胞排列整齐，层次较多，神经元形态完整。抑郁症模型组大鼠顶叶皮层神经元尼氏体减少，神经细胞排列紊乱，分层不清楚，尤以外锥体细胞层、内颗粒层、内锥体细胞层细胞变化明显。海马CA1、CA3及齿状回神经元尼氏体不清晰，神经细胞排列杂乱，层次较少，可见较多神经细胞有空泡化和核固缩，部分细胞脱落，与空白组有明显差异。阳性对照组大鼠顶叶皮层神经元尼氏体较清晰，神经细胞排列较整齐，分层较清楚，由外至内可见分子层、外颗粒层、外锥体细胞层、内颗粒层、内锥体细胞层和多层细胞层。海马CA1、CA3及齿状回神经元尼氏体较清晰，神经细胞排列比较整齐，层次较模型组多，神经元形态较完整，有小部分细胞脱落。积雪草总甙各剂量组大鼠顶叶皮层神经元尼氏体较清晰，神经细胞排列较整齐，分层清楚，由外至内可见分子层、外颗粒层、外锥体细胞层、内颗粒层、内锥体细胞层和多层细胞层。海马CA1、CA3及齿状回神经元尼氏体较清晰，神经细胞排列较整齐，神经元形态较完整，神经细胞有空泡化，有小部分细胞脱落，与抑郁症模型组相比有较明显的改善。从切片结果看出积雪草总甙各组改善了抑郁动物大脑皮层、海马和齿状回神经元排列紊乱、核固缩和空洞化等现象，表明积雪草总甙对抑郁大鼠脑组织形态方面的病理变化具有一定的预防作用。4)各组大鼠内分泌变化结果见表5表5各组大鼠内分泌变化组别ACTHTSHT3T4rT3(mg/L)(mU/L)(nmol/L)(nmol/L)(mmol/L)空白对照组0.726±0.094**0.288±0.069**0.96±0.17**84.27±16.58*0.243±0.025**抑郁症模型组0.242±0.0490.078±0.0161.31±0.1852.40±11.550.145±0.019阳性对照组0.594±0.2340.202±0.036**1.00±0.17*77.41±5.31**0.195±0.024*积雪草总甙低剂量组0.411±0.092**0.168±0.025**0.82±0.38*61.18±15.440.159±0.052积雪草总甙中剂量组0.476±0.2100.186±0.022**1.01±0.2373.38±7.08*0.179±0.047积雪草总甙高剂量组0.478±0.152*0.146±0.015**0.96±0.17**82.70±6.31**0.184±0.018**与抑郁症模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01从表5可以看出，与空白对照组大鼠比较，抑郁症模型组大鼠ACTH、TSH、T4和rT34项内分泌指标显著降低，而T3则明显增高，表明我们采用的模型使大鼠内分泌功能紊乱；阳性对照组较好的改善了抑郁症大鼠内分泌紊乱；积雪草总甙各剂量组不同程度的增加了ACTH、TSH、T4和rT3的分泌，减少T3的分泌，表明积雪草总甙较好的改善抑郁症大鼠内分泌的紊乱，具有抗抑郁作用。本发明的优点和积极效果本发明积雪草总甙制备工艺简单，不仅缩短了工艺流程，提高了得率，降低了成本，减少了环境污染，而且将积雪草总甙用于治疗抑郁症，有可能为抑郁症患者提供一种有效的天然药物。权利要求1.一种制备积雪草总甙的方法，包括积雪草总甙的提取、纯化和结晶三个步骤，其特征在于积雪草总甙的纯化采用皂甙吸附型大孔树脂，亦即积雪草总甙提取液通过该树脂吸附提取物，经蒸馏水洗脱去除杂质，以含水醇洗脱得积雪草总甙洗脱液，减压浓缩洗脱液至干，再以含水醇溶解后，用乙酸乙酯结晶。2.积雪草总甙用以治疗抑郁症的用途。全文摘要本发明涉及医药
技术领域：
,是积雪草总甙的一种制备新方法及其治疗抑郁症的新用途。其制备工艺包括提取、纯化、结晶三个步骤。本发明为改进纯化过程,以皂甙吸附型大孔树脂吸附积雪草总甙提取液,经蒸馏水洗脱去除杂质后,以含水醇洗脱积雪草总甙即可,从而不仅简化了纯化步骤,又避免了原纯化工艺中所使用的大量有机溶剂对环境的污染。积雪草总甙对抑郁症的治疗作用有望为抑郁症患者提供一种新的天然药物。文档编号A61K31/70GK1387868SQ0111301公开日2003年1月1日申请日期2001年5月29日优先权日2001年5月29日发明者秦路平,陈瑶,郑汉臣申请人:中国人民解放军第二军医大学