专利名称：二酸(5－雄甾烯－17－酮－3β－羟基)二酯用于制备药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(式I)在制药中的应用。
由于生活水平的提高和医疗保健的不断进步，人均寿命越来越长，使世界人口老龄化的趋势越来越明显。据中国老年协会专家指出，我国老年人口迅速增长，1990年以来，我国老年人口以平均每年3.32％的速度增长，1994年底，全国60岁以上老年人口总数已达到1.1亿，约占人中总数的9.5％。2001年，我国已成为“老年型”国家，随着老年人口增加，对老年性疾病的防治问题也越来越突出。因此，研制开发新的防治常见老年性疾病的新药，已成为当今医药学界的一个研究热点。
心律失常、心肌缺血、脑缺血、免疫功能低下、骨质疏松、肾衰等是常见的老年性疾病，而且许多情况下是多种病症同时出现于同一病人身上。但是，现有的治疗这些疾病的药物普通存在着适用症单一、疗效不尽理想的问题。因此，研究开发一种上述多种老年性疾病具有良好的综合治疗效果的药物，这对方便老年性疾病的防治、保证老年人健康将具有十分重要的意义。
本发明的目的是研究提供二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯在制备用于药物治疗心律失常、心肌缺血、脑缺血、机体免疫功能低下、骨质疏松、肾衰等常见老年性疾病的药物中的应用。
本发明的二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯化合物的结构式如式I所示(以下简称式I化合物)。 式I中R’为 或 n＝2-5，n’＝1-4即式I化合物依R’基团的不同可分为两类，一类为二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(以下简称为式IA类化合物)，具体可以是乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯，或丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯，或丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯，或戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯；另一类为二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(以下简称为式IB类化合物)，具体可以是丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯，或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯，或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯，或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯。
本发明包括式I化合物在制备用于治疗心律失常的药物中的应用；式I化合物在制备用于治疗心肌缺血、脑缺血的药物中的应用；
式I化合物在制备用于增强机体免疫力的药物中的应用；式I化合物在制备用于治疗骨质疏松、肾衰的药物中的应用。
本发明的式I化合物最优选的是丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(式II)。 实验证明，本发明中的式I化合物在治疗心律失常、心肌缺血、脑缺血、免疫功能低下、骨质疏松、肾衰等方面具有显著的效果，由此可知，以式I化合物作为活性成份制备的药物，将对相应的病症具有良好的治疗效果，特别是对心律失常、心肌缺血、脑缺血、免疫功能低下、骨质疏松及肾功能衰竭等常见的老年性疾病具有良好的治疗效果。说明式I化合物可用于制备治疗上述病症的药物。
实验还证明式I化合物具有低毒性和高安全性，适宜作为药物应用。
本发明的式I化合物用于制备药物，可与普通常规的药剂填充剂配合，经常规方法而制得；可根据需要制成适当的剂型，如针剂、输液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂或栓剂等。以式I化合物为活性成份的药物，通常以口服方式使用，当然也可以采用其它给药方式；其每天使用剂量一般为约0.01～1000毫克，成年人常用量为每天0.1～500毫克，最常用剂量为0.3～300毫克。每天一次或分数次服用。
本发明中的式IA类化合物可由5-雄甾烯-17-酮-3-磺酸钠(式III)溶于乙二醇二甲醚中，加入二卤代烷[二碘(或溴)乙(或丙、丁、戊)烷](式IV)，在相转移剂(四正丁基溴化铵)存在下反应而制得。其反应过程示意如下R-OSO3Na (式III)+X(CH2)nX(式IV)↓(C4H9)4NBr ↓ H2OROSO3(CH2)nOSO3R(式IA)X＝I或Br，n＝2～5，R＝C19H27O，式Ⅳ中n与式I中的n相同。
本发明中的式IB类化合物可由3β-羟基-5-雄甾烯-17-酮(式V)与相应的二酰氯(即丙、丁、戊或己二酰氯)(式VI)在四氢呋喃中110℃搅拌反应制得。其反应过程示意如下2R-OH (式V)+XCO(CH2)n’OCX (式VI)四氢呋喃↓110℃，搅拌 R＝C19H27O，n’＝1～4，X＝Cl，Br
以下通过实例对式I化合物的制备方法作进一步详细说明制备实例1称取3.68g5-雄甾烯-17-酮-3β-磺酸钠盐溶于50ml乙二醇二甲醚中，加入1.5gl，2-二碘乙烷及1.6g四正丁基溴化铵和20m水，于60℃搅拌回流反应4小时，得到的混合物冷却后用乙醚萃取三次，合并萃取液，用水洗，再用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，得到6.1g所需产物一乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯。
若分别用1，3-二碘丙烷或1，4-二碘丁烷、1，5-二碘戊烷代替上述实例1中的1，2-二碘乙烷，则最后得到的产物即分别为丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯或丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯或戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯。
制备实例2称取500g3β-羟基5-雄甾烯-17-酮溶于1000ml四氢呋喃溶液中，滴加入50ml丁二酰氯，110℃下搅拌反应，TLC检验反应基本完成后，将反应混合物倾入冰水中，用乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)洗涤三次，得式II化合物粗品，硅胶H柱层析得式II化合物纯品400g。
若分别用丙二酰氯、己二酰氯或戊二酰氯代替上述实例2中的丁二酰氯，则最后得到的产物即分别为丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯、己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯。
下列实验实例将进一步说明本发明的式I化合物的医药用途及其效果。
实验实例1 急性毒性实验一、材料实验样品式I化合物(8种，式LA类，n＝2，3，4，5；式IB类，n’＝1，2，3，4)，由广州时珍堂天然产物生理活性研究中心提供，批号分别为19970101，19970102，19970103，19970104，19970105，19970106，19970107，19970108。
实验动物NIH系小鼠，由广东省医学实验中心提供，批号1997A029二、方法与结果八种式I化合物分别按以下方法进行实验2.1灌胃给予受试物急性毒性实验选择健康NIH系小鼠，体重20±2g，20只，雌雄各半，将受试物以0.5％羧甲基纤维素钠配成20mg/ml悬浮液，对小鼠一次灌胃受试物悬浮液0.8ml/20g体重，连续观察七天，小鼠活动敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或异常反应，限于给药浓度和体积不能再增大，不能测出其LD50。故进行最大耐受量试验。选择健康小鼠20只，雌雄各半，于24小时内分3次灌服式I化合物悬浮液(20mg/ml)，每次0.5mg/20g体重，总剂量达1.5g/kg体重，观察7天，此期间让小鼠自由进食和饮水，小鼠活动敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或异常反应。
2.2腹腔注射给予受试物急性毒性实验选取健康NIH系小鼠，体重20±2g，20只，雌雄各半，受试物以0.5％羧甲基纤维素钠配成20mg/ml悬浮液，经超声波乳化器及高速搅拌器处理使颗粒细化、均匀，对小鼠一次腹腔注射受试物1.0ml/20g体重，连续观察7d，小鼠活动正常、敏捷，毛皮光滑，未引起动物死亡或异常反应，限于给受试样品浓度和体积不能再增大，故进行最大耐受量试验。
另选择健康NIH小鼠40只，体重20±2g，雌雄各半，于24h每隔4h受试物(20mg/ml)，每次0.5ml/20g体重，共6次。此后连续观察7d，此期间让小鼠自由进食和饮水。
三、结论1.小鼠每天灌胃给予式I化合物最大耐受量应不小于0.5×3×20×50＝1.5g/kg，按体表面积换算，相当于70kg成年人用量(50mg)的232.7倍(0.5×3×20×387.9÷50)。在最大耐受量试验给受试样品后观察期间，小鼠活动敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或异常反应。
2.小鼠注射给予式I化合物最大耐受量为不小于3g/kg体重(＝0.5×20×6×50mg)。在最大耐受量试验给受试样品后观察期间，小鼠活动敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或异常反应。
注射给予式I化合物对小鼠最大耐受量，相当于70kg成年人每天用量(10mg)的2327倍(0.5×6×20×387.9÷100)。
3、由此可知，式I化合物属无毒性级化合物。
实验实例2 抗心律失常作用一、实验材料丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物C)，或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物D)，或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物E)，或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物F)，乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物G)，丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物H)，丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物I)，戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物J)；均由本实验室合成提供，使用时0.5％CMC-Na配成所需浓度液体；去氢异雄甾酮(Prasterone，Pras)，胺腆酮(Amiodarin，Amio)Sanofi&Winthrop药厂出品；乌头碱(Aconitine，Aco)和哇巴因(Ouabain，Oua)是Merck药厂出品；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，广州市化学试剂玻璃仪器批发部进口分装。
NIH小鼠，广东省医学实验动物中心提供，实验动物合格证号97A018SD大鼠，广东省医学实验动物中心提供，实验动物合格证号97A017新西兰大白兔，医动字26-97043号，广东省南海市黄岐泌冲威龙养殖场提供。
MS-302多媒体生物信号记录分析系统(广东药学院)；WZ-50D型微量注射泵(浙江医科大学医学仪器厂)二、方法与结果1、对乌头碱诱发大鼠心律失常的影响SD大鼠，雄性，体重218.3±20.0g，腹腔注射乌拉坦1.2g/kg麻醉，以MS302生物信号记录分析系统连续监视并记录II导联心电图(ECG)。舌下静脉给药或0.5％CMC-Na后10min，颈外静脉插管，以2.5μg/min速度恒速静脉注射Aco，分别记录出现室性早搏(ventricular premature beat，VP)，室性心动过速(ventricular tachycardia，VT)，心室纤颤(ventricular fibrillation，VF)及心脏停搏(cardiacarrest，CA)时Aco的用量并进行t检验，表1显示式I的化合物C、化合物D、化合物E出现VP、VT、VF和CA所需Aco的用量均显著高于静脉注射0.5％CMC-Na组，在0.5mg/kg剂量下，化合物C、化合物D、化合物E效果明显较Pras及胺腆酮好。
表1 对乌头碱诱发大鼠心律失常的作用(n＝10，x±s)
与CMC-Na组相比较*P＜0.05，**P＜0.012、对Oua诱发豚鼠心律失常的影响雄性豚鼠40只，体重288.8±38.3g，分6组腹腔注射乌拉坦1.2g/kg麻醉。颈外静脉给药或静脉注射0.5％CMC-Na后10min，颈外静脉插管以3μg/min速度静脉注射Oua，记录ECG，分别测出VP，VT，VF及CA时的Oua用量并进行t检验。表2显示化合物F、化合物G、化合物H组出现VP，VT，VF及CA时所需Oua用量显著增加，表明化合物F、化合物G、化合物H组能显著提高豚鼠心脏Oua中毒的耐受剂量。
表2. 对Oua引起的心律失常的作用(n=8，x±s)
与CMC-Na组相比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.
3、对氯化钡(BaCl2)诱发心律失常的影响SD大鼠50只，雄性，体重236.7±13.7，腹腔注射10％水合氯醛0.3g/kg麻醉，记录ECG，颈外静脉插管作给药用。静脉注射BaCl24mg/kg，一般立即出现室性早搏、心动过速，并发展成稳定和典型的双向性心律失常。待出现稳定和典型的双向性心律失常后立即静脉注射药或0.5％CMC-Na，以窦性心律恢复和恢复后维持时间(60min内)为标准，比较5组作用。由表3可见化合物I、化合物J对BaCl2所致心律失常均有非常显著的治疗作用，维持时间较长，相较胺腆酮起效快。
表3 对氯化钡(BaCl2)诱发心律失常的作用(n＝10，x±s)
与CMC-Na组相比，***P＜0.001实验实例3 对心肌缺血的保护作用一、实验材料丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物C)，或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物D)，或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物E)，或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物F)，乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物G)，丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物H)，丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物I)，戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物J)；均由中山大学药学系药物化学实验室合成提供，使用时0.5％CMC-Na配成所需浓度液体；硝苯地平(Nifedipine，Nif)，大同市利群制药厂生产，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，广州市化学试剂玻璃仪器批发部进口分装。
SD大鼠，广东省医学实验动物中心提供，实验动物合格证号98A033新西兰大白兔，医动字26-98043号，广东省南海市黄岐泌冲威龙养殖场提供。
MS-302多媒体生物信号记录分析系统(广东药学院)；WZ-50D型微量注射泵(浙江医科大学医学仪器厂)二、实验方法SD大鼠，试验前测定ECG和胸导联，弃去T波、ST段位移有异常和心律失常者。选取合格大鼠，体重208.1±18.8g，雌雄兼用，按表4分组，每组8只大鼠，按表4剂量十二指肠给予受试化合物或同体积0.5％CMC-Na溶液，30min后乙醚麻醉，记录ECG后颈背部皮下注射异丙肾上腺素(Isoproterenol，ISO)2mg/kg，30min后再记录ECG1次，于第一次灌胃供试品后24h和48h，各组按上述方法重复给供试药及ISO并记录ECG。72h后眼眶取血并离心分离血清，处死大鼠，剪取心尖以4℃生理盐水制成10％的心肌组织匀浆备用。对∑ST段位移幅度的影响测量第一次给ISO前、第一、二、三次皮下注射ISO后30min各鼠ST值，计算∑ST的mv数均值作为心肌损伤程度的指标并做t检验。对血清中CK、LDH和MDA的影响用试剂盒测血清中的丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的变化。对心肌组织匀浆中CK、LDH和MDA的影响用试剂盒测血清和心肌匀浆中的丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的变化。
三、结果1.对∑ST段的影响ST段的变化幅度可基本反映心肌缺血的严重程度，而∑ST段可作为缺血程度的定量指标。皮下注射ISO诱发大鼠心肌缺血后，ST段明显抬高，显示大鼠心肌有严重的心肌缺血损伤。实验结果(见表4)表明受试化合物各组和硝苯地平均能降低皮下注射ISO引起的ST段的异常抬高程度(∑ST平均位移幅度)，式I化合物对ISO致心肌缺血大鼠的心肌具有保护作用。表4 对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤模型中∑ST的影响Group Dose ∑ST/mv/mg·kg-130min 24h 48h 72hCMC-Na 1.26±0.241.18±0.21 0.87±0.170.90±0.15化合物C0.760.64±0.21***0.52±0.11***0.50±0.14***0.52±0.12***化合物D0.760.42±0.20***0.47±0.13***0.42±0.08***0.40±0.10***化合物E0.760.53±0.11***0.50±0.10***0.57±0.04***0.51±0.07***化合物F0.760.47±0.10***0.57±0.15***0.61±0.05***0.53±0.08***化合物G0.760.51±0.13***0.50±0.14***0.67±0.19***0.42±0.07***化合物H0.760.53±0.11***0.50±0.10***0.52±0.04***0.51±0.12***化合物I0.760.49±0.12***0.54±0.12***0.50±0.06***0.54±0.08***化合物J0.760.54±0.12***0.52±0.07***0.56±0.07***0.54±0.08***Nif组 0.760.50±0.09***0.53±0.08***0.52±0.05***0.51±0.07***x±s，n＝8，与CMC-Na组相比，***P＜0.0012.对血清中CK、LDH和MDA的影响大鼠皮下注射ISO后，血清中的CK、LDH和MDA均明显上升，显示由于心肌组织的损伤而使心肌细胞中的CK和LDH漏出到血液中，血清中的脂质过氧化物(Lipid per-oxidation，LPO)大量增加。表5显示受试化合物可明显抑制CK和LDH从心肌细胞内向血清中漏出，显著抑制Iso致大鼠血清中MDA的异常升高，对心肌细胞具有保护作用。表5 对Iso致心肌损伤大鼠血清的影响Group Dose Activity of CK Activity of LDH MDA/mg·kg-1(U/L) (U/L) (nmol/ml)CMC-Na 359.23±34.25 389.23±34.4150.42±3.21化合物C 0.76 262.50±35.41***270.13±27.46***28.29±6.56***化合物D 0.76 229.27±31.32***218.55±37.35***18.15±4.52***化合物E 0.76 275.44±21.81***267.35±38.42***25.54±3.80***化合物F 0.76 252.17±18.41***250.40±31.30***24.16±4.18***化合物G 0.76 248.20±20.50***254.75±30.81***20.54±2.11***化合物H 0.76 261.24±24.27***253.24±31.55***21.17±3.36***化合物I 0.76 242.14±22.72***233.35±18.46***24.64±2.53***化合物J 0.76 239.40±16.15***257.05±31.30***26.47±3.25***Nif 0.76 255.90±31.22***224.01±51.20***27.17±3.44***与CMC-Na组相比，x±s，n＝8，***P＜0.0013.对心肌组织匀浆中CK、LDH和MDA的影响大鼠皮下注射ISO后，心肌组织中的CK、LDH含量显著降低，MDA含量明显升高。实验结果(表6)显示，与CMC组相比，硝苯地平组，说明式I化合物可明显抑制CK和LDH从胞内漏出。说明式I化合物对Iso所致的心肌组织损伤有明显的保护作用。表6 对Iso致心肌损伤大鼠心肌组织匀浆的影响(x±s，n＝8)GroupDose Activity of CKActivity of LDH MDA/mg·kg-1(U/L) (U/L)(nmol/g)CMC-Na 108.84±21.11 98.57±12.81 253.23±35.11化合物C 0.76 186.55±26.25*201.33±25.24***121.670±15.24***化合物D 0.76 270.41±34.31*292.27±29.44*78.43±7.51***化合物E 0.76 206.18±43.80***160.27±20.36***89.62±12.37***化合物F 0.76 221.58±45.58***157.39±20.69***105.02±10.84***化合物G 0.76 225.60±31.81***152.22±25.42***99.52±13.15***化合物H 0.76 230.15±53.46***167.23±27.44***105.52±14.64***化合物I 0.76 214.27±40.62***159.82±31.69***115.02±10.34***化合物J 0.76 268.28±42.59***197.45±26.88***95.67±15.67***Nif 0.76 195.67±32.63*166.68±29.64***183.15±29.67***与CMC-Na组相比，*P＜0.05，***P＜0.001实验实例4 对脑缺血模型的保护作用一、实验材料NIH系小鼠，由广东省医学实验动物中心提供合格证号98A032，99A030；达纳康(Tanakan)，由Ipsen公司生产，丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物C)，或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物D)，或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物E)，或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物F)，乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物G)，丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物H)，丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物I)，戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物J)；均由中山大学药学系药物化学实验室合成提供，使用时0.5％CMC-Na配成所需浓度液体。二、实验方法与结果NIH小鼠称体重后，以戊巴比妥钠60mg·kg-1，麻醉，进行手术。将小鼠仰卧位固定，颈部正中切开皮肤约7mm，分离两侧颈总动脉，并套以“O”号丝线，缺血时用动脉夹夹闭双侧颈总动脉2min，造成大脑缺血状态，缺血结束，松开动脉夹，恢复血液再灌注，短时间歇5min，如此反复二次。阻断颈总动脉血流后，缝合切口。加上尾端放血，放血量为总血量的10％以下。术毕从腹腔内注入适量的生理盐水以补充血容量。假手术组麻醉后分离双侧颈总动脉但不阻断血流，亦不放血。
双侧颈总动脉完全阻断后，首先出现惊厥，体温降低，呼吸减慢，最后翻正反射消失。实验动物以体温降低和翻正反射消失为缺血阳性指标，无典型缺血指征者弃之不用。在缺血过程中、或手术后均会有动物死亡。恢复血液灌注后，动物翻正反射逐渐恢复，呼吸加快，3～5h基本恢复正常活动。手术后的动物随机分为11组假手术组，化合物C，D，E，F，G，H，I，J组，达纳康组，空白组。每天给药一次，按表7剂量灌胃，连续给药10天。10天后进行记忆试验。表7 对脑缺血再灌注损伤小鼠脑记忆避暗实验的作用(x±s，n＝10)
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；从表7的结果显示，假手术组与空白组相比，进入暗箱的潜伏期明显延长，受电击次数明显减少(P＜0.001)，说明脑缺血再灌注对小鼠的学习记忆功能造成了明显损害。与空白对照组相比，受试化合物能够明显延长进入暗箱的潜伏期，同时能显著降低错误次数，对脑缺血造成记忆功能损伤具有保护作用。实验实例5 对机体免疫功能的影响一、实验材料NIH系小白鼠，实验动物合格证号97A018，由广东省医学实验动物中心提供；S.D.系大白鼠，实验动物合格证号97A017，由广东省医学实验动物中心提供；家鸡，由中山大学菜市场购得；丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物C)，或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物D)，或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物E)，或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物F)，乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物G)，丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物H)，丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物I)，戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物J)；均由中山大学药学系药物化学实验室合成提供，使用时0.5％CMC-Na配成所需浓度液体。二、实验方法对小鼠胸腺和脾脏的作用选择健康NIH系小鼠90只，18～22g，雌雄各半，每只实验时腹腔注射环磷酰胺60mg/Kg体重，随机分成9组，每组10只，雌雄各半，即空白对照组，化合物C，D，E，F，G，H，I，J组。灌胃给受试样品，给受试样品剂量见表8，连续给受试样品30d，第30d各组小鼠禁食一天，但提供饮水。第31d，处死各组小鼠，称量各组小鼠的体重，胸腺及脾脏重量，计算胸腺指数及脾脏指数，比较各组间的差异。三、实验结果表8 对小鼠胸腺和脾脏的作用(x±SD，n＝10)项目 剂量胸腺指数 脾脏指数组别(mg/kg) (mg/10g体重) (mg/10g体重)空白对照组 1％CMC11.06±3.2142.42±8.31化合物C 10 18.98±2.32***57.55±11.23**化合物D 10 25.59±3.70***103.47±13.40***化合物E 10 20.22±2.75***68.20±9.82***化合物F 10 16.24±3.31***75.24±15.48***化合物G 10 18.39±3.24***80.22±17.33***化合物H 10 19.75±3.06***72.30±11.17***化合物I 10 16.44±3.25***69.60±16.10***化合物J 10 17.24±3.34***61.29±15.34**与空白对照组相比，**P＜0.01，**P＜0.01。
从表8所示小鼠免疫器官重量实验结果可知，与空白对照组相比，化合物C，D，E，F，G，H，I，J组小鼠胸脾指数及小鼠脾脏脂数能够显著升高。实验实例6 对骨质疏松的药理作用一、实验材料1.1动物SD系大鼠，雌雄各半，体重(196±47.3)g，由广东省医学实验动物中心提供。1.2药品与试剂丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物C)，或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物D)，或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物E)，或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物F)，乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物G)，丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物H)，丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物I)，戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物J)；均由中山大学药学系药物化学实验室合成提供；维甲酸，重庆华邦制药有限公司，批准文号(95)卫药准字X-140号，批号991201。罗钙全，上海罗氏制药有限公司，批准文号(96)卫药准字J-88-3(1)号，批号B1063。以上药品试剂临用前用0.5％CMC-Na配制成混悬液。13仪器XSP-BM生物显微镜，由上海光学仪器六厂制造。Panasonic彩色闭路监控摄象机，由MatushitaElectric Industrial Co.Ltd制造。创格图象分析软件，由中青旅创格科技集团公司设计。IRIS Advantage(HR)等离子体发射光谱仪(中山大学测试中心提供)由Thermo Jarrell Ash Corporation，U.S.A.制造。二、实验方法2.1维甲酸诱导大鼠骨质疏松模型选取大鼠88只，体重(196±47.3)g，雌雄各半，随机分成11组。分为正常空白组(空白组)、维甲酸模型组(模型组)、阳性药物对照组(罗钙全组)、受试化合物C，D，E，F，G，H，I，J给药组。除正常空白组灌服0.5％CMC-Na溶液10ml.Kg-1体重外，各组大鼠每天上午灌服维甲酸70mg.Kg-1体重，下午各组大鼠相应灌服受试物。连续给药30天后，处死大鼠，取大鼠右股骨。2.2股骨骨组织计量学观察与测量取右股骨相同部位组织块，常规脱钙，石蜡包埋，HE染色。在普通光学显微镜下观察，将所有图象经摄象机模数转换后输入主机，经图象分析软件处理可得到如下参数指标相对骨体积，指骨小梁占骨髓腔的百分比，1.25×10×4倍；平均骨小梁宽度，1.25×10×10倍；单位面积骨小梁内骨细胞数，用图象分析软件采集同样面积骨小梁的图象(640×480)，计算相应区域内的骨细胞数，1.25×10×40倍；平均骨细胞陷窝长度，1.25×10×40倍；平均骨细胞陷窝宽度，1.25×10×40倍。以上5个静态指标参数，均观察10个视野，求其均值。
表9 对维甲酸诱导大鼠骨质疏松模型的股骨病变的影响，n＝8，x±s
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001从表9所示维甲酸诱导大鼠骨质疏松实验结果可知，与模型组相比，化合物C，D，E，F，G，H，I，J能够有效提高相对骨体积、单位面积骨小梁内细胞数、平均骨小梁宽度，提示受试化合物具有治疗骨质疏松作用。实验实例7 对肾功能衰竭的作用一、实验材料1.1动物NIH小鼠，18-22g，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供。
1.2试剂内毒素，Sigma ChemicaI Com.；丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物C)，或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物D)，或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物E)，或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物F)，乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物G)，丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物H)，丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物I)，戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物J)；均由中山大学药学系药物化学实验室合成提供，使用前用0.5％CMC-Na配制成所需液体。二、实验方法内毒素致动物急性肾衰模型选取小鼠100只，随机分为10组，分别正常对照组、病理模型组、受试化合物C、D、E、F、G、H、I、J组，各组分别腹腔注射给予受试物或同体积溶媒(0.5％CMC-Na)后，立即尾静脉注射内毒素0.06g/kg(正常对照组注射等量的生理盐水)。5h后，小鼠摘眼球取血，测定血清尿素氮(BUN)和肌肝(Cr)浓度。取各小鼠一只肾分别制成100ml·L-1匀浆，测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。三、实验结果从表10所示急性肾功能衰竭实验结果可知，与病理模型组相比，化合物C，D，E，F，G，H，I，J能够有效抑制因内毒素致小鼠血清BUN、Cr值升高，提高GSH-Px酶活性，对内毒素致动物急性肾衰具有保护作用。表10 受试化合物对急性肾功能衰竭的作用(x±SD，n＝10)项目剂量Cr/10mg·L-1BUN/10mg·L-1GSH-Px/nU·L-1组别 (mg/kg)正常对照组0.5％CMC12.28±2.53***182.5±26.9***45.5±18.7***病理模型组0.5％CMC59.23±13.15 485.8±34.7 19.3±8.4化合物C组10 37.99±8.74***387.0±40.2***29.8±11.6*化合物D组10 29.31±7.94***295.5±36.0***38.4±15.0**化合物E组10 32.86±8.07***315.9±40.8***32.0±14.4*化合物F组10 38.31±9.69***377.1±38.1***35.2±12.8*化合物G组10 40.42±10.94***412.2±40.5***31.8±12.3*化合物H组10 35.78±7.26***366.0±30.2***35.6±10.7*化合物I组10 34.41±9.65***344.4±40.6***37.6±15.1***化合物J组10 37.60±8.44***337.6±32.8***32.2±13.1**与病理模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.
本发明上述实验例说明式I化合物在治疗心律失常、心肌缺血、脑缺血、免疫功能低下、骨质疏松、肾衰等方面同样具有显著的治疗效果，可用于制备治疗心律失常、心肮缺血、脑缺血、骨质疏松、肾衰以及增强机体免疫力的药物。
权利要求
1.式I的二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯化合物在制备用于治疗心律失常、心肮缺血、脑缺血、骨质疏松、肾衰以及增强机体免疫力的药物中的应用。 式I中R’为 或 n＝2-5，n’＝1-全文摘要
本发明涉及式I的二酸(5－雄甾烯－17－酮－3β－羟基)二酯化合物在制备用于治疗心律失常、心肌缺血、脑缺血以及机体免疫功能低下、骨质疏松、肾衰等疾病的药物中的应用。式I中R’为或n=2～5,n’=1～4。
文档编号A61P9/06GK1348764SQ0111486
公开日2002年5月15日 申请日期2001年6月28日 优先权日2001年6月28日
发明者许东晖, 许实波 申请人:中山大学