神经节苷脂在制备抗癫痫药物中的应用的制作方法

专利名称：神经节苷脂在制备抗癫痫药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经节苷脂(英文名称Gangliosides)的用途，尤其涉及神经节苷脂在制药领域中的用途。
目前已有成熟的从动物组织中提取神经节苷脂的技术和进一步分离纯化的技术，其中的GM1作为药品已有市售产品，其商品名为施捷因，单唾液酸四已糖神经节苷脂钠盐注射液，进口注册证号x19990444，x19990445，生产商阿根廷TRB药厂trb pharma s.a.；专利申请号93112578报道了一种含神经节苷脂为主的脑保健品，中国专利95111569公开了一种含神经节苷脂为主的糖脂类物质的生产方法等。
神经节苷脂是一种具有广泛用途的酸性糖鞘脂。中华航空航天医学杂志2000年第1期第11卷；同济医科大学学报，2000；29(5)414-416、中风与神经系统疾病杂志1993；10(4)193.；《临床神经病学杂志》2000年第13卷第2期等许多文献报道了神经节苷脂在以下方面的临床药用价值1.由于各种原因引起的中枢神经系统结构损伤的功能恢复；2.对脑血管意外及创伤后的中枢神经系统后遗症有治疗作用；3.对缺血性和出血性的脑病变有治疗作用。而该物质在制备抗癫痫药物中的应用尚未见报道。
癫痫包括多组疾病和综合征，是由多种原因引起的一种慢性脑功能障碍性疾病。不论病因如何，均以病程中有反复发生的大脑神经元过度放电所致的暂时性中枢神经系统功能失常为特征，以肌肉抽搐和(或)意识丧失为其重要表现，另外还可表现为感觉、行为、自主神经(即植物神经)等方面的障碍。具有发作性、复发性及通常能自限的特点。其患病率在一般人口中约(5～8)‰，我国人群癫痫的终生患病率为7‰，其中儿童和青少年是癫痫的高发人群。然而，目前癫痫人群的治疗状况令人担忧，40％多的患者从未进行治疗，35％的患者接受不正规治疗，不能有效控制癫痫发作，会严重损害患者的智力，尤其对青少年。
癫痫的发生机理至今尚未完全清楚，它涉及遗传、解剖、生理生化、病理生理和免疫等范围，目前比较统一的看法是①癫痫的发生是由遗传因素、脑内癫痫性病理改变和促发因素三者相互结合所产生的，任何一个单独的因素都不可能导致癫痫发生。②脑神经元的膜电位不稳定，惊厥阈值下降，并出现异常放电是癫痫发作的实质。③每次的癫痫发作都包含起动、发作性放电的维持与扩展，以及发作性放电的抑制3个不同而连续的病理生理过程。在这个过程中，脑内钠、钾、钙、氯等离子的传导，兴奋性神经递质(如谷氨酸、天门冬氨酸)及抑制性神经递质(如γ-氨基丁酸)均起重要作用。脑内发作间放电是产生癫痫的基础，发作间放电代表某脑区神经元群异常的同步去极化，神经元去极化时Na+内流，K+持续外流，使细胞外K+急剧升高；同时神经胶质细胞的保护机制失调促进痫样放电的扩展，Na+，K+-ATP酶的正常功能是将细胞外的K+摄入细胞内，已证实在各类癫痫活动病灶中，胶质细胞、神经元内Na+，K+-ATP酶的活性对细胞外K+急剧升高的反应速度显著下降，即使在痫样放电达到高峰时也如此，说明其细胞已失去清除K+的功能。实验证明细胞外K+升高与癫痫发作有直接关系。
西方医学认为部分癫痫患者经过脑部手术与长期的抗癫痫药物的治疗能有效的控制疾病的发展。但是，在实际的治疗当中往往不能达到预期的效果，珈玛刀手术的治愈率只有3％，而且部分抗癫痫的西药长期大量应用可能导致病人性格与行为的改变严重时甚至造成呆纳或痴呆的脑功能改变，而且部分药品在癫痫大发作时无法显示出可靠的疗效。传统抗癫痫药物引起毒性作用的机制可能涉及药物代谢途径、代谢的相互影响及药物间的相互作用。如卡马西症可引起病人体内酶的自身诱导、肝药酶的合成并增加酶活性使药物代谢加快；苯妥英显示饱和代谢；丙戊酸为浓度依赖蛋白结合型药物，卡马西症、苯巴比妥及丙戊酸还为氧化代谢型药物，这成为药物间相互作用、影响代谢、增加毒性的基础；苯巴比妥与苯妥英引起肝药酶抑制，卡马西平与丙戊酸能抑制其它抗癫痫及其它药物的代谢。鉴于以上机制使毒性增加，给临床使用增加难度。克服传统抗癫痫药物的特点，为难治性癫痫病人提高疗效，研究开发具有预想特征的新一代抗癫痫药物当务之急。
Mattson等认为无论癫痫发病机制与传统AED作用机制研究上取得何等进展，新一代抗癫痫药物的选择主要取决于控制发作或减轻发作类型的疗效与药物耐受性的考虑，且有必要权衡临床疗效与毒性间的利弊，制药过程与药动学特征及其药物价格在药物选择与个人病人治疗指导上也需谨慎斟酌。
近年来对神经节苷脂的生理学功能研究表明1.经离体神经细胞培养和外科神经去势的动物模型证实，外源性神经节苷脂与细胞膜结合后能增加神经生长因子的功能，促进神经生长，加速神经支配功能的恢复。增加感觉神经、交感神经和中枢胆碱能神经元轴索生长的营养作用；2.经在体动物实验，发现神经节苷脂促进神经生长，加速受损神经恢复；3.离体和在体实验均显示，外源神经节苷脂能平稳进入细胞膜，同时激活细胞膜上的钠-钾-ATP酶的活性，该酶的活化是信息传递的基础；4.动物实验显示，神经节苷脂具有周围神经镇痛作用。这些研究一方面表明，神经节苷脂可直接作用于脑细胞的有氧呼吸、氧化磷酸化及ATP合成的作用，从而激活、营养、增强脑细胞及神经元的生长、发育及恢复，使病灶逐步被消除、代偿、脑功能得到康复；另一方面表明，神经节苷脂作为理想而安全的新一代抗癫痫药物的可能。
作为新一代抗癫痫药物应有能控制发作程度和时程的这种作用机制的基础，增加疗效谱，适合于抗癫痫药物的联合治疗，不仅可作用于多种神经递质受体或离子通道，还能在细胞与分子水平上更特异地作用于其它已知的或不同的受体与通道，以提高疗效或显示新的效果；应有较好的耐受性，有较高的治疗指数，适合癫痫症的长期治疗，无致畸作用；在药剂学与药动学特性方面应适合多种给药途径，易于投药，吸收充分，宜于多种剂量配方，代谢过程简单，不与蛋白结合或代谢，与其它抗癫痫或其它药物无相互作用。使治疗简便易行，无需广泛的监护与繁琐的剂量调整，适用于其它躯体疾病或老年人的伴随药物治疗。近年来研究发现神经节苷脂可作为抗癫痫药物，显示一定的疗效。
为了更好地理解本发明的实质，以下将用神经节苷脂的毒理、药理和临床实验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
采用《一种分离纯化制备神经节脂工艺》专利申请号85102590，公开的技术改良后进行提取纯化神经节苷脂，纯度达95％以上；用无热源去离子水将神经节苷脂溶解、消毒，配置成25mg/ml/支或50mg/2ml/支的注射剂备用；或按本领域技术人员公知的方法制备神经节苷脂胶囊，以8％淀粉浆为黏合剂，制成颗粒，然后装胶囊，制成的胶囊规格为25mg/囊。
具体实验和临床结果分述如下一、动物实验1.小鼠口服神经节苷脂急性毒理实验脏器组织学病理切片检查由上海第二医科大学病理教研组完成。
采用实施例4所配置的胶囊，选用40只22月龄雄性Wistar大鼠(军事医学科学院动物中心提供)，体重(455±30)g，平均分成4组，一次灌胃神经节苷脂，根据预实验，最高剂量定为150mg/kg体重，以25mg的比例递减，即为150、125、100、50mg/kg四个剂量组，连续喂养14天。结果服用组大鼠无死亡，另一组用蒸馏水作对照；比较各组体重情况、血液学和生化检测、脏器重量和组织学检查均正常，结果显示服用组与对照组无显著差异。
2.神经节苷脂小鼠肌肉注射急性毒理实验在上海医科大学药学院进行。采用实施例3配置的注射剂，昆明小鼠肌肉注射神经节苷脂的急性毒性进行检验，结果无死亡，各组织器官未发现病理变化。
小结上述结果表明神经节苷脂无毒性，临床使用安全。
二、神经节苷脂抗癫痫模型的药效学实验研究(一)神经节苷脂对戊四唑(PTZ)点燃模型的影响PTZ点燃模型，其惊厥行为与脑电图异常放电同步，建立后能维持较长时间，是研究癫痫最常用的模型之一。
1.大鼠PTZ点燃模型的制备1)实验动物22月龄SD大鼠70只，随机分为3组(治疗组、模型对照组和正常组)，由上海医科大学实验动物中心提供。
2)点燃模型的诱发注射34mg/kg的PTZ，记录各组动物的反应级别。
2.方法治疗组(N＝30)治疗实验采用实施例4的胶囊，连续每天一次给予神经节苷脂12.5mg/kg灌胃；对照组(N＝30)连续每天一次给予生理盐水5ml/kg；正常组(N＝10)与治疗组和对照组相同地每天一次喂食生理盐水5ml/kg；在90天后，用34mg/kg PTZ腹腔注射，测试其抗癫痫效应，观察行为变化60分钟。
3.观察项目根据点燃大鼠行为惊厥评分标准，参考文献《Functional Neuology》，1994，9(1)3-94.结果结果显示，治疗后惊厥级别与治疗前相比，模型对照组升高(P＜0.01)；治疗组反应级别下降(P＜0.05)，正常组始终无惊厥出现。结果见表1。
表1神经节苷脂对PTZ点燃模型的影响(x±s)

治疗组，治疗后反应级别与治疗前比P＜0.05。
小结神经节苷脂可阻断大鼠点燃后发作程度的进行性加重，使其发作级别降低。
(二)神经节苷脂和苯巴比妥对大鼠听源性发作的影响和不良反应P77-PMC声源发作癫痫雄性大鼠(AS)是一种先天型遗传模型，相当于临床癫痫打发作；苯巴比妥(又称鲁米那)是临床常用的抗癫痫药。
1.实验动物P77-PMC声源发作癫痫雄性大鼠(AS)54只，体重152～162g，购自上海医科大学实验动物中心，随机分成6组。
2.方法神经节苷脂组采用实施例3的注射液，按给药的不同剂量平均分成4组，每组9只(N＝9)；每组每天的给药剂量分别为100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg，用生理盐水稀释；苯巴比妥组(N＝9)每天的给药剂量为100mg/kg，用生理盐水稀释；
模型组(N＝9)连续每天一次给予生理盐水5ml/kg；先测定各组大鼠给药前对铃声的刺激反应强度，然后给各组大鼠腹腔注射30天后，测定大鼠对铃声的刺激反应强度。
3.观察项目根据AS大鼠对铃声的刺激反应强度标准评分，参考文献《Vire Res》，1974，(Supp.1)1434.结果(1)不同剂量的神经节苷脂注射液对AS发作有不同的对抗作用，其剂量反应呈正比关系，当给药剂量为50mg/kg时，抗惊厥率达100％；(2)神经节苷脂和苯巴比妥组与模型组相比均有显著的抗惊厥率(P＜0.05)，两治疗组相比无显著差异(P＞0.05)；结果见表2。
(3)不良反应，苯巴比妥组在治疗过程中出现嗜睡、和发烧现象；神经节苷脂组在治疗过程中未发现任何毒性反应。
表2药物对AS大鼠发作的影响(x±s)

平均分数与给药前比较P＜0.05；抗惊厥率与模型组比较P＜0.05。
小结神经节苷脂对AS癫痫模型有明显的拮抗作用，且无不良反应。
三、神经节苷脂治疗癫痫患者的临床实验1.病例选择结合病史及脑电图确诊的癫痫305例，其中男166例，女139例。年龄1～50岁，大多数为15～30岁。病程在1～20年以上。5年以上者61.2％。
本组305例经回顾病史，脑电图检查，脑炎后遗症者45例，脑外伤后遗症者11例。由频繁受惊造成的儿童癫痫患者36例，余为无明显诱因者193例。
2.治疗方法对305例癫痫患者均单独以实施例4的胶囊治疗，不配有其它中西药物。患者于治疗前及疗程结束后1周内复查脑电图。口服1次1粒，1日3次，疗程为6个月。
3.疗效评定标准(1)完全控制痫症未再发作，脑电图示正常，随访1年未见复发。
(2)基本控制痫症发作次数明显减少。
(3)有效痫症发作次数头减小，症状减轻，但脑电图不正常。
(4)无效痫症发作次数虽有减少或症状有的所减轻，但和治疗前无明显差别，甚至加重为无效。
4.结果305例患者中，按以上疗效标准完全控制20例，占6.56％；基本控制94例，占30.81％；有效50例，占22.62％无效122例，占40.00％，总有效率为52.77％，在治疗过程中患者未出现药物毒副作用反应。见表3。
表3癫痫患者神经节苷脂治疗疗效观察

由表3可见，癫痫患者经神经节苷脂治疗后，症状得到明显控制。
由上述公开的毒性、药理实验和临床实验可见1)神经节苷脂可阻断大鼠点燃后发作程度的进行性加重，使其发作级别降低；2)神经节苷脂对AS癫痫模型有明显的拮抗作用，且无不良反应；3)临床研究表明，神经节苷脂能有效地控制各类型癫痫患者的临床症状，总有效率达52.77％，且无不良反应；4)神经节苷脂无毒性，临床使用安全。
附神经节苷脂含量测定神经节苷脂的测定方法参照Biochim Biophys Acta 1957 Vol.24 p604的方法和国际上同行实验室的分析方法加以改良而制定，经实践证明完全适用于在科研分析和商品检验中对神经节苷脂含量的正确测定，经上海技术监督局审核批准，已列入“企业标准”。
1.材料(1)间苯二酚储液2克间苯二酚溶于100毫升蒸馏水中，冰箱放置。
(2)对照工作液(A液)80毫升盐酸、0.25毫升0.1M CuSO4溶液、19.75毫升蒸馏水。
(3)间苯二酚工作液(B液)10毫升间苯二酚储液、80毫升盐酸、0.25毫升0.1M CuSO4溶液、9.75毫升蒸馏水。此工作液至少在使用前的4小时配制，冰箱放置。
(4)正戊醇(C液)。
(5)标准品唾液酸(Sigma产品)(6)紫外分光光度计SPD-1型，日本产(Spectrophotometric Detector SPD-1，Shimadzu，Japan)2.方法电子天平精确称取5毫克标准样品溶于5毫升蒸馏水中，即为毫克/毫升标准溶液储液，由上述标准溶液储液配成10微克，20微克，30微克，40微克，50微克(系500微升中的浓度)储液，冰箱放置。
标准曲线的制作a.取具塞试管5支，分别准确加入500微升已配制的5种浓度标样，然后加入蒸馏水1.5毫升。
b.边振荡，边加入2毫升B液；空白对照加500微升上述任意一种浓度的标样，加1.5毫升水后，加2毫升A液。
c.100℃度水浴加热15分钟，然后在冷流动水中冷却10分钟。
d.边振荡，边加入4毫升C液，冰浴中冷却15分钟。
e.离心5分钟(3000转/分)，吸取上清液，在OD580测定吸收值，作出标准曲线(在OD580读数为纵轴，浓度为横轴)。
样品的测定样品(胶囊20囊)溶于5毫升蒸馏水中，稍离心后，取三支具塞试管，分别加入摇匀样品200微升混悬液。以下操作方法均按照标准曲线的制作方法进行。样品中神经节苷脂含量的计算 斜率斜率从标准曲线中求得。稀释倍数指测定是标准溶液总体积500微升与加入的被测样品体积比。5.82系校正因子。
实施例1采用含神经节苷脂的动物脏器粗提取物(由宝智生物制品有限公司提供)，浓缩后，加5倍体积的丙酮沉淀，得到白色固体，过滤后真空干燥；用2倍量的含氯化钾的68％乙醇溶解于燥固体，作为上柱液；再应用柱层析的方法提纯具体工艺如下(1)树脂的处理将经过碱乙醇和酸乙醇处理过的树脂，用水洗至中性，再以68％的乙醇溶胀后待用。树脂用量，240升。
(2)柱吸附将制备好的上柱液用4N盐酸pH 2～2.5上柱；流速为150L/h。
(3)淋洗用68％的乙醇洗去未被吸附的杂质；流速和温度与吸附条件相同。
(4)洗脱经过淋洗后的吸附柱再以1.8倍柱体积的石油醚～食用乙醇混合液(体积比1/5)洗脱。洗脱速度90L/h。
(5)最后进行浓缩和干燥，收集的洗脱液在低于60℃温度下减压浓缩。浓缩后的液体用5倍体积的丙酮沉淀，得到的白色固体用真空干燥去除有机溶剂。
用上海市食品监督检验所提供的间苯二酚法测定含神经节苷脂的原料中神经节苷脂的含量。
实施例2按本技术领域人员公知的方法，将实施例1的神经节苷脂用1000ml无热源纯净水溶解、消毒，制成注射液规格为25mg/ml/支。
实施例3按本技术领域人员公知的方法，将实施例1的神经节苷脂用1000ml无热源纯净水溶解、消毒，制成注射液规格为50mg/2ml/支。
实施例4按本技术领域人员公知的方法，将实施例1的神经节苷脂制备胶囊，以淀粉为填充剂，以8％淀粉浆为黏合剂，制成颗粒，然后装胶囊。制成胶囊的规格为神经节苷脂含量25mg/囊。
神经节苷脂原料 25克淀粉80克。
实施例5
按本技术领域人员公知的方法，将实施例1的神经节苷脂以柠檬酸和甘露糖作为添加剂制成口服液。制成口服液规格为神经节苷脂口服液25mg/10ml/支。
神经节苷脂原料 25克甘露糖 5克柠檬酸 5克纯净水 10升。
权利要求
1.神经节苷脂在制备抗癫痫药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了神经节苷脂在制备抗癫痫药物中的新用途。神经节苷脂无毒性，临床使用安全、方便；对戊四唑点燃模型，神经节苷脂可阻断大鼠点燃后发作程度的进行性加重，使其发作级别降低；神经节苷脂对AS癫痫模型有明显的拮抗作用，且无不良反应；临床研究表明，神经节苷脂能有效地控制癫痫患者的临床症状，在治疗各类型癫痫症患者的总有效率为52.77％，且无不良反应。因此神经节苷脂治疗癫痫症有效、安全可作为新一代的抗癫痫药物。
文档编号A61K31/7032GK1413587SQ01131998
公开日2003年4月30日 申请日期2001年10月25日 优先权日2001年10月25日
发明者杜士明, 潘怡 申请人:杜士明