专利名称：一种含重组人金属硫蛋白药物及制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体涉及一种含重组人金属硫蛋白药物及制备方法。
MT发现至今已有40多年，有关的分子生物学，生理学和医学基础性研究发表的论文超过5000多篇。MT的生理、生化功能非常广泛，概括起来主要有以下几点(1)参与细胞分裂增殖、分化和抑制细胞调亡；(2)参与重金属元素的代谢，维持机体锌元素等重金属元素的平衡和稳定；(3)参与调节部分机体免疫功能；(4)解除机体有害重金属元素如镉、铅、汞等的中毒；(5)强力的细胞自由基清除功能；不仅对超氧自由基有强的清除能力，而且对羟自由基、NO自由基、脂自由基等都有较强的清除能力，目前熟知的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶、谷光甘肽等是不具备同时能清除多种类型的氧自由基或其它自由基的能力。
MT自发现至今，一直是生物科学和医学科学研究的热门课题。分子生物学的研究已经使这类蛋白的基因结构，基因调空，基因序列和蛋白质结构，氨基酸序列等得到了解和阐明。MT转基因动物的研究和应用给MT医学科学的研究带来了方便和支持。MT抗氧化自由基的作用在基础医学研究中已经表明，MT可以防治许多由自由基造成的机体组织和器官的损伤以及阻止或减缓多种疾病的发生和发展，如失血或缺血以及再输血造成的组织细胞损伤。对重金属元素不平衡造成的机体疾病，MT有较好的解除重金属对肝和肾等组织的损伤。体外研究表明，MT可以阻止和降解在大脑中的β-淀粉样蛋白物质的积聚，研究发现这类物质与老年痴呆的发生发展有关。另外，清除脑组织中的自由基，对于防治老年痴呆，防止机体衰老都具有极其重要的临床治疗和保健意义。
据报道，在德国有心肌梗塞、抗风湿/类风湿关节炎；在美国有抗肝癌；在日本有抗溃疡、消炎等专利报道；我国有抗口腔溃疡药物制剂的专利报道。但所有上述专利药品已经开发成功的和市场应用的所见不多。目前市场上的产品也较多地集中在保健品、化妆品等领域。这些产品MT原料主要来自动物兔肝组织诱导提取纯化。提取成本很高，平均原料成本85万元/公斤。大约提取0.3公斤MT(大于60％含量)，需要杀死555只家兔，而且是MT-1和MT-2的混合型，纯度不高。北京大学从酵母中提取铜金属硫蛋白，虽然降低了提取成本，但仍然与人体MT还有较大的差异。所有上述产品开发的原料均为非人体MT，这可能在一定程度上限制了MT药品的产业化开发。因为非人体蛋白在人体血液中会引起免疫抗体的产生，降低蛋白质的药理生理作用或产生其他可能的副作用。目前采用重组人金属硫蛋白为主要有效成分开发的药品报道和市场应用还没有。此外，有关细胞调亡抑制作用的“卡斯帕酶(Caspases)抑制剂”的开发热潮在西方跨国制药公司与生物工程公司一浪高过一浪，竞相投入数百万美元的科研经费。目前已经有几个这类药品在进行临床阶段的研究。MT通过抑制自由基的攻击抑制卡斯帕酶的激活，从而抑制细胞调亡的作用已经有多篇研究报道得到肯定。MT作为一种类型的细胞调亡抑制剂大有临床开发前景。因此，为加速MT的开发利用，尤其是临床药品的开发，采用低成本，高纯度的重组人类MT是目前的当务之急。
本发明公开的重组人金属硫蛋白(rhMT)通过下述方法获得1.含MT基因质粒的获得RT-PCR方法，按MT目标基因mRNA的结构序列，合成5’和3’端的RT-PCR反应引物，约20-30个bp碱基。人组织细胞株体外培养，诱导(一般用锌元素等)，提取总RNA，通过30个循环的RT-PCR反应，获得MT目标基因的cDNA，同样在5’和3’端的非翻译区引入酶切位点。PCR获得的cDNA，酶切后，与相应载体上的酶切位点相连接。获得含MT目标基因cDNA的质粒。转化到相应工程菌受体细胞中，扩增质粒。
2.质粒MT序列鉴定将扩增带有MT目标基因序列的质粒，酶切，电泳分析、纯化，收集相关片段测序，以鉴别是否与目标基因序列一致。
3.MT目标基因工程菌的获得将上述扩增鉴别的质粒，酶切，与表达菌质粒酶切位点连接，获得含MT目标基因的表达菌质粒，转化到相应的工程菌(此工程菌包括大肠杆菌和酵母菌)。培养，温度变化诱导、金属锌元素诱导或化学物的诱导表达目标基因产物---重组人金属硫蛋白。培养，分析MT目标基因表达状况。
4.MT提取纯化(1)工程菌细胞发酵培养，诱导，收集菌体。对大肠杆菌，须破壁处理，离心，收集上清液；对于分泌型酵母，直接离心，收集上清液。——沉淀——离心，收集沉淀——缓冲液溶解沉淀——过Sephadex分子筛层析——收集分子量一万以下的组分——加热和有机溶剂处理，离心去沉淀——挥发有机溶剂——过DEAE离子交换柱层析——收集MT组分——再进行离子交换柱层析——收集MT组分——冷冻干燥得纯品。
(2)鉴别电泳和HPLC测纯度，同时进行抗氧化活性测定。
本发明方法中MT基因也可通过化学合成法获得，即选择MT目标基因(包括MT-1，或MT-2，或MT-3，或MT-4)的结构基因序列，按此序列合成200-300bp的碱基片段，正负链各一条，5’和3’端mRNA转录的非翻译区部分，合成时引入酶切位点。正负链退火后，PCR扩增后，酶切，与相应的载体的酶切位点相连接，得到含MT目标基因的质粒，转化到相应大肠杆菌受体细胞，培养，扩增质粒。
本发明所述的工程菌为大肠杆菌或各种酵母菌。
本发明所要解决的另一技术问题是提供用上述方法获得的重组人金属硫蛋白制成的可供临床应用的药物制剂。
本发明所述的含有重组金属硫蛋白的药物制剂，是由纯度为90％以上含量的重组人金属硫蛋白和各种相关的药用辅料以任意比例制成的各种医学上可接受的药物制剂。如注射剂(包括输液、肌肉注射剂、粉针剂等)；滴剂；固体制剂(包括胶囊剂、片剂等)；膏剂、霜剂等。
本发明的所要解决的再一技术问题是公开上述含金属硫蛋白药物制剂在临床相关疾病治疗中的应用。
本发明制剂可作为制备用于临床上需要的抗氧化，清除自由基，消炎，抑制细胞调亡，调节体内金属元素平衡的药物的应用。
本发明注射剂含1-100mg rhMT/l，胶囊剂或片剂含0.1-50mgrhMT/颗或片，可用于①心肌梗塞或脑梗塞发作时的辅助抢救药，减轻发病过程中的氧化自由基损伤引起后遗症；创伤失血后的输血抢救时使用，以防止输血造成的组织细胞氧化自由基损伤；②有益金属元素平衡失调的纠正和重金属有害元素的中毒排除和防止用药；③老年痴呆症的防治用药；④抗炎症用药；⑤防治机体自身免疫性疾病，如类风湿关节炎用药。
本发明滴剂含0.01-10mg rhMT/ml可作为防治白内障用药。
本发明膏剂或霜剂含0.1-10mg rhMT/g可用于防止烧伤病人烧伤部位氧化损伤用药。
作为保健品或化妆品中的有效添加剂原料，用于防衰老，预防氧化自由基造成的机体组织损伤及相关疾病的发生和发展，加速相关疾病的康复作用。
已有的自由基清除剂，如SOD，植物黄酮类，维生素C和维生素E等在清除自由基能力上无法与MT相比较。以MT与SOD相比较为例(1)MT清除自由基的能力是SOD的1000倍以上；(2)SOD的半衰期仅60秒，而MT的半衰期为2年；(3)SOD的稳定性差，60℃即可失活，而MT加热120℃仍保持活性；(4)SOD的分子量大，为9000-120000，不易被人体吸收，而MT的分子量仅为3000，还不及SOD的1/30，极易被人体吸收；(5)SOD在肠胃中极易被蛋白酶消化分解，而MT不易被消化；(6)MT阻抗电离辐射(紫外线)的能力远高于SOD；(7)SOD只能清除超氧阴离子等氧自由基，不能清除羟自由基等多种类型的自由基，而MT可以清除多种类型自由基。
本发明的人体抗氧化蛋白MT，具有清除多种自由基的功能，不仅能消除氧自由基，还可以清除羟自由基，脂自由基，一氧化氮自由基和其它多种自由基。除清除自由基功能外，本发明的蛋白MT还具有维持体内金属元素稳定，清除或缓解有害金属对机体造成的损伤；抑制多种因子引起的细胞调亡作用等功能。
本发明通过基因工程方法在体外大量获得所需要的目的蛋白，成本低，提取方便，产品可以高度纯化，避免了其它方法大量采伐、消耗植物资源和杀害动物等高成本现象，起到了保护环境资源的作用。
本发明采用的人体MT蛋白的另一个优点是，人MT蛋白分子量小，蛋白呈刚性，分子结构稳定，不易变性，便于提取纯化，不易产生抗体，不易对人体产生因蛋白变性引起的副作用，便于各种制剂的制备，便于保存。本发明产品适应症广泛，是一种极具应用价值的生物药物。
具体实施例方式
实施例1 rhMT的制备MT的基因克隆取人肝组织细胞株，用CDCL210(-5)M体外培养诱导8小时，抽取总MRNA，用反转录酶进行反转录。
PCR扩增引物设计上游P15’-GAATTCTAGCCGCCTCTTCAGCTCGCCATGGAT-3’下游P25’-TGTAGACCCTCGCCCCGACAGGGTCGTAGT-3’扩增反应条件引物50Pmol，dNTP100μmol/L，TAG酶2U。按照94C30s，55C30s，72C45s反应30个循环。
克隆转化将上述扩增产物，用EcoRl和Pstl酶切，质粒pUCl8用同样的酶切，目的片段回收后，用T4DNA连接酶连接构成重组质粒pUCl8-MT，转化到大肠杆菌DH5a中。对转化的目标cDNA测序与已知序列比较确认。
细菌培养；转化菌接种于含Amp的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600约为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度1mmolL/L，37℃继续培养6-8小时，收集菌体，进行SDS-PAGE分析。
其它工程菌中的转化质粒PUCl8-MT，酶切后，与温度诱导工程菌或酵母菌(如比赤酵母)的质粒酶切后重组，后者转化到相应的菌中，按该菌培养诱导条件发酵培养和MT表达诱导。
MT的提取纯化上述收集的菌体，加适量PBS缓冲液，4℃或冰浴超声破碎，离心，收集上清，沉淀加入适量PBS缓冲液，再离心，收集上清液，合并上清液。过滤，收集滤液。82℃加热，出现沉淀后，立即放入冰浴，离心4800g20min，取上清液。加入预冷的丙酮，使终浓度为40％，2小时后离心去除沉淀，取上清液。再加预冷丙酮致浓度80％，放置过夜。离心27000g25min，弃上清液，沉淀溶解在5mMTris-HCL(pH8.6)，离心，弃除沉淀。上清液过SephadexG-75柱，用5mMTris-HCL(pH8.6)洗脱，流速为17mL/h。UV吸收254nm。收集目标组分(电泳和抗氧化检测)，MT组分再过离子交换柱TSKDEAE-650柱，用20-350mMTris-HCL(pH8.6)洗脱，流速为50mL/h，254nm紫外检测，收集MT组分，用SephadexG-25柱层析脱盐。收集MT组分，冷冻干燥。得到MT纯品。
实施例2 粉针剂制备将按实施例1方法制得的含90％以上纯度的MT溶解在灭菌的0.85％NaCL液体中，加入人血白蛋白终浓度为0.5％，加入甘露醇终浓度为4％，加适量吐温-80后，混匀，0.22μm滤膜过滤灭菌，分装在无菌小瓶中，冷冻干燥，密封后，得产品。MT含量终浓度为每瓶0.5mg。
实施例3 片剂制备将实施例1方法制得的MT和甘露醇溶解在无菌水中，加入药用环糊精，混匀后，干燥，加入制片的常用辅料，混匀后，压片，得MT片剂。每片含0.5mg，甘露醇终浓度为4％。
实施例4 胶囊剂制备将实施例1方法制得的MT和甘露醇溶解在无菌水中，加入药用环糊精，混匀后，制粒，干燥，装入胶囊。每粒含MT0.5mg。
实施例5 注射液制备按常规葡萄糖生理盐水制备方法，同时加入MT，含量为25mg/l。
实施例6 滴剂制备按常规眼药水制备方法，有效成分为MT，同时加适量甘露醇，使MT含量为0.02mg/ml。
实施例7 其它制剂如口服液，乳液，霜剂等，均按常规制备方法，添加适量MT。MT含量为1--40mg/l，或MT含量在1--40mg/g。
权利要求
1.一种含重组人金属硫蛋白药物，其特征在于该药物是由含量为90％以上重组人金属硫蛋白和相关的药用辅料以任意比例制成的各种医学上可接受的药物制剂。
2.一种如权利要求1所述的含重组人金属硫蛋白药物，其特征在于其中所述的药物制剂包括注射剂、滴剂、片剂、胶囊剂、膏剂和霜剂。
3.一种如权利要求1所述的含重组人金属硫蛋白药物的制备方法，其特征在于其中所述的重组人金属硫蛋白是通过下述方法获得的(1)含MT基因质粒的获得人组织细胞株体外培养，诱导，提取总RNA，通过30个循环的RT-PCR反应，获得MT目标基因的cDNA，同样在5’和3’端的非翻译区引入酶切位点；酶切后，与相应载体上的酶切位点相连接，获得含MT目标基因cDNA的质粒，转化到相应工程菌受体细胞中，扩增质粒；(2)质粒MT序列鉴定将扩增带有MT目标基因序列的质粒，酶切，电泳分析、纯化，收集相关片段测序，以鉴别是否与目标基因序列一致；(3)MT目标基因工程菌的获得将上述扩增鉴别的质粒，酶切，与表达菌质粒酶切位点连接，获得含MT目标基因的表达菌质粒，转化到相应的工程菌，培养、筛选含MT目标基因的工程菌，并能通过培养，温度变化诱导、金属锌元素诱导或化学物的诱导表达目标基因产物---重组人金属硫蛋白；(4)MT提取纯化①工程菌细胞发酵培养，诱导，收集菌体，沉淀，离心，收集沉淀，缓冲液溶解沉淀，过Sephadex分子筛层析，收集分子量一万以下的组分，加热和有机溶剂处理，离心去沉淀，挥发有机溶剂，过DEAE离子交换柱层析，收集MT组分，再进行离子交换柱层析，收集MT组分，冷冻干燥得纯品；②鉴别电泳和HPLC测纯度，同时进行抗氧化活性测定。
4.一种如权利要求2所述的含重组人金属硫蛋白药物的制备方法，其特征在于其中所述的工程菌为大肠杆菌或各种酵母菌。
5.一种如权利要求1所述的含重组人金属硫蛋白药物在制备治疗性药物中的应用。
6.一种如权利要求5所述的含重组人金属硫蛋白药物的应用，其特征在于该药物可作为临床上所需的抗氧化，清除自由基，消炎，抑制细胞调亡，调节体内金属元素平衡的药物。
全文摘要
本发明涉及一种含重组人金属硫蛋白药物、制备方法及临床中的应用。本发明公开的重组人金属硫蛋白(rhMT)，通过大肠杆菌和酵母菌获得高效表达，成本低，提取方便，产品可以高度纯化，避免了消耗大量动植物资源。用本发明方法制得的rhMT蛋白分子结构稳定，不易变性，便于提取纯化，便于各种制剂的制备，便于保存，不易对人体产生因蛋白变性引起的副作用。本发明含rhMT的药物可作为制备用于临床上需要的抗氧化，清除自由基，消炎，抑制细胞调亡，调节体内金属元素平衡的药物的应用，是一种极具应用价值的生物药物。
文档编号A61P39/00GK1416893SQ0113204
公开日2003年5月14日 申请日期2001年10月30日 优先权日2001年10月30日
发明者杨龙春 申请人:杨龙春