哺乳动物尿和哺乳动物血的化学修饰的制作方法

专利名称：哺乳动物尿和哺乳动物血的化学修饰的制作方法
技术领域：
本发明的领域本发明涉及对哺乳动物尿和哺乳动物血进行化学修饰的方法。采用该经修饰的血或经修饰的尿对哺乳动物进行用药时产生免疫调节作用并可用于治疗免疫疾病。
本发明的技术背景已知哺乳动物血由细胞部分和非细胞部分组成。非溶血血液中的非细胞部分被称作血浆，即含有无机物以及复杂生化合成产物如蛋白质(主要来源于肝脏并以来源于免疫系统细胞的免疫球蛋白的形式存在)、碳水化合物、蛋白聚糖等的水溶液。
细胞相可以通过将血细胞组分离心或自然沉淀来分离，主要得到红细胞和血小板，以及较少部分的白细胞。这些白细胞可以区分为粒细胞和淋巴细胞。最近的研究已经特别转向通过流式细胞仪研究淋巴细胞亚群。将表面抗原进行特异染色后，已经有可能在其中鉴别出不同的细胞群。具有CD4的细胞被称作T-辅助细胞(诱导和增强免疫活性)，CD8细胞被称作T抑制细胞或细胞毒性细胞(降低和调控免疫活性)。有可能进一步鉴别T辅助细胞为Th1细胞和Th2细胞。Th1细胞优先产生促炎细胞因子如白细胞介素2、γ-干扰素和肿瘤坏死因子。Th1细胞通过它们的细胞毒性被用于攻击胞内靶抗原和肿瘤细胞。Th2细胞具有优先抗炎症作用，同时它们产生白细胞介素(IL)4、IL10和IL13。Th2细胞被用于调控胞外抗原。通过Th1细胞、Th2细胞和抗原呈递细胞的相互作用，免疫系统的效应子作用得到了调控。γ-干扰素增强促炎物质如肿瘤坏死因子、IL1、IL6、IL12、氧自由基和NO的产生。IL4对抗这些物质的促炎活性。不同种类的疾病具有典型的倾向于Th1或Th2细胞的平衡迁移。倾向于Th1细胞的迁移被认为对肿瘤患者有利(抗肿瘤活性)但是对有器官特异性自身免疫疾病的患者(如类风湿性关节炎、葡萄膜炎、甲状腺炎)有害。Th2细胞占优势对过敏性疾病(湿疹)、免疫球蛋白介导的疾病和硬皮病将是有害的。这被认为是对患有活动性过敏反应和神经性皮炎的患者不易患上癌症这一事实的一种可能的解释。患有过敏性皮肤病或肺病、风湿性疾病和其它自身免疫疾病以及多种类型癌症的患者体内部分免疫系统的病理学活性和超常导致对复杂免疫调节剂的研究，该免疫调节剂能够使得引起疾病发生的不平衡状态重新达到平衡状态以影响所致的疾病。
哺乳动物尿或经透析处理的超滤液含有一系列蛋白和蛋白聚糖以及生理性通过肾过滤的其它物质。所述物质是复杂的而且大小和生物学功能都不同。许多尿物质可能具有生物学效应，但皮下施用相同宿主哺乳动物的无菌尿没有对免疫系统细胞产生值得一提的影响。同样将无菌尿加到同一个体的白细胞培养物中，没有观察到明显的免疫调节作用。
US 4,632,980(Zee等)公开了一种对血和血制品进行病毒灭活的方法，包括采用低浓度臭氧进行处理。经病毒灭活后，所述血液成分被进一步分离并可用于特定目的。
US 4,684,521(Edelson)公开了一种在体外处理血液方法和系统。该方法包括在有光活化剂存在的条件下利用紫外辐射处理血液的步骤。
US 4,748,120(Wiesehahn)公开了一种在辐射条件下利用补骨脂内酯衍生物处理生物学组合物的方法。
Kief在EP 0265 548中公开了一种生产经杀菌处理的和/或具有免疫调节活性的物质的方法及其用途。他参考了GP 3109691中关于臭氧用于氧化的应用。他描述了在施压下将臭氧-氧混合物应用于尿或血。他公开了一种方法，在该方法中对血液进行离心后将红细胞和血浆部分分别并重复用一种氧化剂(臭氧/氧混合物)进行处理，并包括通过加入蒸馏水进行溶血，然后重复进行氧化的中间步骤。建议臭氧的含量在40-80ng/ml氧。在具体的实例中记载了添加预先经一种氧化剂处理的尿滤液。建议添加抗坏血酸、可选择的羰基载体。还记载了添加卤素。
建议进行治疗应用前以1∶10稀释最终处理物。治疗可以采用口服、吸入或局部用药。
在EP 0607 593 A2中Kief记载了一种获得机体自身细胞因子含量增高的细胞培养物的方法。他利用EP 0265 548中记载的方法的改进形式来获得患者自身细胞因子模式将全血暴露于臭氧并进行培养。通过不同的方法进行白细胞的分离并再次进行培养。可以添加所谓的溶胞产物(上述全血的血液成分，例如红细胞、淋巴细胞等)或按照EP0265 548处理过的同一患者的尿。最后诱导所培养细胞发生细胞溶解并稀释终产物用于治疗。
本发明的简要描述已经发现上述用于血或尿氧化的方法可以向两个不同的方向进行改进以产生治疗免疫系统疾病的可靠物质。一个方向(第二个技术方案)是一种在轻度和中度免疫疾病中不降低功效的总体上简化的方法，另一个(第三个技术方案)是一种通过改进的过程获得更加有效的治疗产物的新方法。本发明的一个技术方案提供了一种化学修饰哺乳动物尿的方法，包括以下步骤-收集哺乳动物的尿，-在容器中采用一种慢速氧化剂(空气)或快速氧化剂(含有至少90％至100％(v/v)的氧或还含有臭氧的气体)处理所述哺乳动物尿-除去低分子量的物质从而得到经修饰的哺乳动物尿。
本发明的另一个技术方案提供了一种化学修饰哺乳动物血的方法，包括以下步骤-在有抗凝剂如肝素存在的条件下将哺乳动物血收集到一个内部压力降低的容器中(步骤0)，-维持一种氧化气氛，如果需要，添加一种氧化剂(步骤1a)
-添加一种稀释剂，优选等渗无菌盐水(步骤2a)-将如此获得的组分进行混合(步骤4)-通过贮存所述组分而使得所述组分陈化足够长的时间(步骤5)和-接着稀释至生理学上可接受的浓度(步骤9)。
本发明的方法优选地包括以下步骤-将哺乳动物血收集到一个内部压力降低的容器中(步骤0)，-添加一种氧化剂(步骤1a)或者通过施用真空来引起溶血(步骤1b)-添加一种稀释剂，优选等渗无菌盐水(步骤2a)-任选地冷冻和再加热(步骤2b)或增强陈化过程(步骤2c)-任选地添加免疫活性物质(例如γ干扰素)(步骤3)-通过手工或在滚动装置(roller)上进行充分混合(步骤4)-在+4℃(优选地在光照作用下)贮存数周(优选2周)(步骤5)-建立活血细胞培养物(步骤6)-进行培养从而获得培养产物(步骤7)-添加溶液维持-添加防腐剂(步骤8)-稀释并稳定药物形式的终产物(步骤9)。
本发明的另一个技术方案提供了一种化学修饰哺乳动物血的方法，包括以下步骤-在有抗凝剂如肝素存在的条件下将哺乳动物血收集到一个内部压力降低的容器中(步骤0)-维持一种氧化气氛，如果需要，添加一种氧化剂(步骤1a)-添加至少一种免疫活性物质(步骤3)和/或添加按照权利要求1至12任一项的方法获得的哺乳动物尿(步骤5)-将如此获得的第一部分进行混合(步骤4)-添加活血细胞培养物(步骤6)-培养如此获得的第二部分从而获得培养产物(步骤7)-接着稀释至生理学上可接受的浓度(步骤9)。
本发明化学修饰哺乳动物血的方法优选地包括以下步骤-收集哺乳动物血，-将血液分成血浆相和细胞相，-在一个容器中利用氧化剂和含有大约90％至100％(v/v)氧的气体处理血浆相、细胞相或两者，-将血浆相与细胞相混合，-添加细胞培养基，-添加免疫活性物质(例如干扰素)，-添加按照第一个技术方案制备的经修饰的哺乳动物尿，-在约37℃下温育16至36小时，-添加防腐剂从而得到经修饰的哺乳动物血。
本发明的另一个技术方案提供了一种治疗免疫疾病的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用按照本发明方法制备的经修饰的哺乳动物尿的步骤。
本发明的另外一个技术方案提供了一种治疗免疫疾病的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用按照本发明方法制备的经修饰的哺乳动物血的步骤。
本发明的另外一个技术方案提供了能够调节免疫系统的物质。本发明的详细描述本发明的第一个技术方案记载了一种对哺乳动物尿进行化学修饰的方法。该方法包括收集哺乳动物尿的步骤。优选以一种无菌收集尿的方式进行收集。这可以通过膀胱插入无菌导管或收集中段尿来完成。为了保持尿处于无菌状态，应当使用无菌容器，例如一次性无菌塑料容器。根据尿中是否存在不溶性组分，可以将尿进行离心，然后将沉淀弃去。用于筛查细菌污染的传统试验方法是例如利用亚硝酸盐的试条试验(sticks test on nitrite)。
在含有至少约90％(v/v)氧的气体中，采用一种氧化剂处理收集到的哺乳动物尿。术语“氧”意在包括原子纯形式和分子纯形式的元素氧，特别是O2和O3的形式。O2是所述气体的主要成分。作为氧化剂，H2O2和O3是特别优选的。H2O2可以作为稀释的溶液加入到尿中。合适的量是每100ml尿中加入1至3ml 1％的H2O2溶液。臭氧(O3)可以被加到所述气体中。
如果以臭氧作为氧化剂，其浓度应当为约50至100ug/ml氧气氛。产生臭氧的装置是市售的并被记载在例如Waenwright的US5,052,382和Horste的US 5,053,140中，该两篇文献被引用作为参考。在具有至少90％(v/v)O2浓度的气体中进行氧化是相当重要的。本发明人已经揭示了弱氧化性的O2与强氧化剂的这种结合能够使哺乳动物尿得到可靠的和可重复的修饰。优选所述气体中的O2浓度应当尽可能的高，优选至少为95％以及更优选至少为99％。最优选的是O2的浓度象市售的一样高。在臭氧被用作氧化剂的情况下，唯一相关的其它气体可以是臭氧。氧应该是医用级的以避免尿的污染。容器中的氧气氛通过排掉容器中尿上方的空气或利用排空容器并加入O2来获得。O2气氛具有的压力可以从小于大气压至高于大气压约1巴。优选的是容器中的压力接近大气压，原因是这样有利于操作并避免采用密封所述容器的复杂结构。优选使得氧气氛与尿之间紧密接触。适当的方法是摇动尿液与氧气氛以使尿、氧化剂和氧气氛之间发生反应。氧化剂的浓度可以在一个宽的范围内进行变化，该浓度范围确实影响氧化剂的反应速率。氧化剂的合适浓度是每毫升尿1至5μmol。所述氧化剂不应当将有毒的物质掺入尿中，这对于本技术领域的技术人员来说是显而易见的。为了使气体与尿紧密混合，优选所述气体的体积至少为尿体积的50％，优选地是尿体积的50至200％以及更优选地是与尿的体积大约相同。
添加氧化剂后可以添加一种或多种蛋白酶。合适的蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及其混合物等。所述酶活性的范围应当是每毫升尿0.1至2微开特。1开特被定义为每秒钟切割1摩尔肽键的酶量。加入氧化剂以及任选地加入至少一种蛋白酶后，将尿在优选37℃下在暗处温育2至18小时。可以采用较低的温度，但由于反应速率取决于温度和所用试剂的浓度，所以可能需要增加氧化剂的量以及蛋白酶的量或需要延长温育时间。也可以采用稍高的温度但是实质上更高的温度可能导致尿的敏感成分发生变性并且可能降低经修饰尿的效力。
温育结束后，可以除去低分子量的物质。术语骶分子量的物质”被用来定义分子量小于大约6000道尔顿，更优选地小于大约5000道尔顿的物质。优选的去除方法是利用一种超滤装置。合适的超滤膜是例如Ultrafree-15-Biomac-5K(可以从Milipore Inc.买到)。借助于加快超滤过程的离心机可以方便地进行超滤。超滤进一步降低了尿中的含水量因而增加了高分子量成分的浓度。也可以使用其它方法来取代超滤方法。作为合适的方法例如是凝胶过滤。去除了低分子量物质以及任选地去除了水分后，优选地采用氧化剂和上述气体再次处理经修饰的尿。该重复处理过程增加了采用本发明方法进行修饰的组分的份额因而增强了治疗的效力。得到的经修饰的哺乳动物尿应当贮存于4℃以下或冷冻保藏。
作为本发明的第二个技术方案，公开了一种化学修饰哺乳动物血的方法，包括以下步骤将哺乳动物的血收集到一个内部压力降低的容器中，任选地通过静置或离心将收集的血分离成血浆相和细胞相，通过向容器中加入空气、氧或臭氧(6-70微升臭氧/毫升氧)(步骤1a)，该过程中基本避免了溶血的发生，或者通过维持容器内部的压力或进一步降低内部压力从而引起溶血(步骤1b)，来处理收集的血。
按照步骤1a或1b处理的血优选地通过以下步骤被进一步处理(步骤2a)向每100毫升的血中加入约110毫升的无菌等渗(0.9％)盐水。
在另一个优选的技术方案中按照例A和B处理的血通过以下步骤被进一步处理(步骤2b)在氧化气氛下进行冷冻-在-5℃以下的温度下冷冻具有氧化气氛的容器并且在再次加热前至少保存1小时。
在第三个优选的技术方案中，按照已公开的步骤处理的血通过以下步骤被进一步处理(步骤2c)在0-45℃通过曝露于日光、紫外线或在暗处进行陈化。
步骤3(任选以获得用于严重免疫系统疾病的产物)加入γ干扰素(例如5ml Gammaferon溶液/100ml血)和/或粒细胞细胞刺激因子(例如在德国购买的产品Neupogen，5ml g-csf/100ml血)和/或β干扰素(例如5ml betaferon/100ml血)。
步骤4在0-45℃的范围内通过手工或在滚动混合器上混合2-24小时来对所述容器进行充分的混合-步骤5a将容器在+4℃的合适冰箱中保存几天至几周。整个过程中，用日光或紫外光照射所述玻璃容器。
步骤5b(任选的)可优选加入按照第一个技术方案中描述的方法进行修饰的哺乳动物尿。
步骤6为了能够进行增殖，加入含有通常用于细胞培养的盐和氨基酸的细胞培养基。合适的培养基可以买到。一种优选的，但不是限制性的细胞培养基实例记载在实施例中。可以加入4.2％(v/v)NaHCO3溶液来调节pH。而且，可以任选地加入一种或多种适量的蛋白酶。合适的蛋白酶以及合适的量如上所述。
步骤7在约30℃下将该混合物暗培养约16至36小时。可以使用传统的滚动混合器或振荡器。高得多或低得多的温度对细胞增殖效率影响很大。因此，将温度保持在35至40℃的范围内被认为是重要的。据信在该条件下，所述细胞开始增殖或产生一种疾病特异性物质模式。认为免疫疾病患者的白细胞含有产生特异性药物(remedy)或产生药物(remedy)诱导功能的特异性信息，如果将其施用于该白细胞供体以针对所述疾病。
步骤8加入一种合适的防腐剂。已知一些用于血液保存的防腐剂。已知合适的溶液缩写为ACD(抗凝剂柠檬酸盐/右旋糖溶液)和CPD(抗凝剂柠檬酸盐磷酸盐右旋糖溶液)。这些溶液含有柠檬酸盐缓冲体系、葡萄糖以及任选一种磷酸钠盐。这些防腐剂具有pH4至6的弱酸性。一种合适的防腐剂预混合物是从德国的Fresenius购买的ACD稳定剂Fon A。
步骤9终产物可以优选地以对数级进行稀释从而避免被治疗个体发生过度的初始反应。通常采用约为10-6或10-7的稀释度开始进行治疗。
本发明的第三个技术方案公开了用于化学修饰哺乳动物血的另一种优选方法，包括采用按照第一个技术方案制备的经修饰的哺乳动物尿处理所述的血。该方法优选地用于获得一种在癌症和严重风湿性疾病的辅助治疗中治疗中度和严重免疫疾病如严重的特应性湿疹的产物。该方法包括收集哺乳动物血的步骤，以常规医学方法收集血液并转移到含有肝素防止血液凝固的容器中。6,000IU的无菌肝素钠(体积2至5ml)或相当量的低分子肝素对约200ml血来说是足够的。或者，也可以使用骨髓抽吸物或含有白细胞的匀浆组织。如上所述，在收集和进一步处理所述血液的过程中应当满足无菌条件。在进一步的加工过程中，优选地采用层流条件。对所收集的血液取样以常规方式检测HIV，乙型肝炎和丙型肝炎病毒以确保实验室人员的安全。
然后将所述血分离成血浆相和细胞相。这可以通过以约750g的条件进行离心或通过细胞室(包括红细胞、血小板和白细胞)在容器中的沉淀来完成。
将细胞相和血浆相分离到容器中后，采用一种氧化剂以及含有至少90％(v/v)氧的气体处理所述的血浆相、细胞相或两者。上述氧化步骤同样适用于血浆相和细胞相的处理。
不希望局限于一种理论，据信白细胞的增殖是由于利用氧化条件进行处理或免疫原性物质产量增加的结果。为了能够进行增殖，加入含有通常用于细胞培养的盐和氨基酸的细胞培养基。合适的培养基可以买到。一种优选的，但不是限制性的细胞培养基实例在实施例中记载。可以加入4.2％(v/v)NaHCO3溶液来调节pH。而且，可以任选地加入一种或多种适量的蛋白酶。合适的蛋白酶以及合适的量如上所述。
然后，加入按照本发明第一个技术方案制备的经修饰的哺乳动物尿，优选来源于同一哺乳动物。在约30℃下将该混合物暗培养约16至36小时。可以使用传统的滚动混合器或振荡器。高得多或低得多的温度对细胞增殖效率影响很大。因此，将温度保持在35至40℃的范围内被认为是重要的。认为在该条件下，所述细胞开始增殖或产生一种疾病特异性物质模式。认为免疫疾病患者的白细胞含有产生特异性治疗或产生治疗诱导功能的特异性信息，如果将其施用于该白细胞供体以针对所述疾病。培养结束后，加入一种合适的防腐剂。已知一些用于血液保存的防腐剂。已知合适的溶液缩写为ACD(抗凝剂柠檬酸盐/右旋糖溶液)和CPD(抗凝剂柠檬酸盐磷酸盐右旋糖溶液)。这些溶液含有柠檬酸盐缓冲体系、葡萄糖以及任选一种磷酸钠盐。这些防腐剂具有pH4至6的弱酸性。一种合适的防腐剂预混合物是从德国的Fresenius购买的ACD稳定剂Fon A。
本发明经修饰的尿以及经修饰的血一般来说可用于治疗免疫疾病。通过这种治疗能够成功地治疗或至少改善变应性疾病、风湿性疾病、自身免疫疾病和免疫缺陷。变应性疾病包括例如枯草热(过敏性鼻结膜炎)、过敏性哮喘、神经性皮炎(湿疹)等。风湿性疾病包括例如慢性多关节炎、系统性红斑狼疮等。其他自身免疫疾病包括免疫性脉管炎、免疫性肾炎等。免疫缺陷包括例如获得性免疫缺陷、慢性病毒感染。用药前，本技术领域的技术人员知道有必要检验经修饰的尿或经修饰的血是否无菌并且不含内毒素。合适的试验包括常规的医学尿培养，例如Uricult或常规的医学血培养。利用鲎变形细胞溶解物试验(BioWhittakker Inc.，Walkersville，USA)可以检验是否不含内毒素。按照本发明的方法制备的物质可以经口服给药、经皮给药、吸入给药或非肠道用药。经修饰的血或经修饰的尿优选地由将要采用经修饰的尿或经修饰的血治疗的患者的尿或血来制备。
本发明的另一个技术方案提供了具有免疫调节作用的物质。对患有例如严重变应性疾病的患者的尿进行处理后，两个峰消失而同时出现了两个新峰。这种效果未在健康个体中发现。据信这些新的分离的物质可以被分离并可成功地用作免疫调节物质。优选的方法-已知在治疗轻度和中度免疫系统疾病中有效的优选的最简单的方法如下所述收集血液并按照步骤1a，2a，4，5a，8，9进行处理。
-治疗中度至严重免疫系统疾病的优选方法如下所述步骤1a，3，4，5b，6，7，8，9或者第三个技术方案中所述的改进方式。
另一种用来产生特别针对牛皮癣的药物的优选方法如下所述将血液及抗凝剂收集到容积为200-500ml的无菌空瓶中。
在实验室中将瓶子中血液的量调节至100ml。在室温下将所述血液静置1-2小时以使红细胞沉淀，也可以通过短时间的离心来引起红细胞的沉淀。然后，向所述瓶子内充入每毫升氧中含6-13微克臭氧的医用氧气。然后将该瓶在37℃下于培养箱中进行培养。然后向100ml血液中加入20ml的前述溶液和15ml无菌的4.2％NaHCO3溶液。
再加入5ml上述经修饰的尿并且将该瓶子在37℃下于转动装置上培养3-4天。每日对瓶子气体中的pO2进行调控并且每日加入每毫升氧中含6-13微克臭氧的医用氧气。培养后，向每100ml瓶装内容物中加入20ml的6％或10％羟乙基(hydroxy-aethylic)-淀粉和20ml的血产品稳定剂(例如从Fresenius购买的FON A)。按照上述的稀释方法进行进一步操作。对于牛皮癣，从10-4的稀释度开始进行治疗，对于湿疹或其它疾病，以10-7的稀释度进行治疗。实验细节哺乳动物尿的修饰以常规的医学方式将一个哺乳动物宿主的200ml尿取样到一个无菌塑料容器中从而获得无菌的尿。一种常规的利用亚硝酸盐的试条试验被用来筛查严重的细菌污染。在20℃下将4份50ml尿样离心至2000倍重力。将沉淀上方的澄清溶液抽到无菌注射器中然后通过一个无菌细菌过滤器(0.2微米，例如购自Millipore)转移到一个容积为500ml的无菌空玻璃瓶中。利用显微镜检测余下沉淀中是否存在细菌。利用一种合适的装置制备每毫升O2中的O3含量为75微克的100％氧的气体并在用手不停地摇动下将所述气体通过尿通入到所述的空瓶中直到均衡真空。或者在加入2ml的1％H2O2溶液后以纯氧取代臭氧/氧气的混合气体通入到所述空瓶。
然后，以每20ml尿1ml的量将混合无菌酶溶液(含有3mg木瓜蛋白酶-相当于8F.I.P.E，1.5mg胰蛋白酶-相当于1.1微开特，2mg胰凝乳蛋白酶-相当于10微开特，按照木瓜蛋白酶方法总蛋白水解活性为64F.I.P.E.)加入到所述的瓶中。在37℃下将含有氧臭氧或纯氧气体的混合物以竖直的方式暗培养2-18小时。培养后，于20℃下在一个能够保留大于5000道尔顿的所有颗粒的浓缩过滤器(例如ultrafree-15-biomax-5k)中以3000倍重力对经处理尿的10ml等份样品进行离心(溶液“A”)。
该过程将液体量降低了大约50％。通过一个无菌过滤器(millipore，0.2微米)将溶液″A″过滤到另一个清洁的无菌空瓶中。再次利用合适的装置制备每毫升O2中的O3含量为75微克的100％氧的气体。或者在加入2ml的1％H2O2溶液后以纯氧取代臭氧/氧的混合气体并在不停地摇动下将所述气体通过尿通入到所述的空瓶中直到均衡真空。取2ml的所述溶液进行常规的医学尿培养(例如uricult)以证实无菌。将另一个样品进行鲎变形细胞溶解物试验(BioWhittakker Inc.，Walkersville，USA)以确保不含有内毒素。通过这些试验后，所述溶液可以用于进一步分离所含的生物活性物质或者被用作复合剂，来调节患者的免疫活性。处理产物的鉴定在进行上述过程的前后对人尿样品进行HPLC分析的结果表明，经修饰尿中保留时间为25.0和33.5分钟的两个峰消失了。在开始后的19.8和20.6分钟出现了两个新峰。两者都是双峰并且是可重现的。为了打开二硫键而采用二硫苏糖醇进行的还原处理不能改变产生这些峰的物质。对两种性别健康成人的对照尿进行HPLC分析的结果表明在33.5分钟有一个峰而在19.8，20.6和25.0分钟没有峰出现。这为定义尿的成功修饰提供了可能。
或者，可以采用如下所述的技术方案获得免疫活性尿产物的方法该方法包括以下步骤收集温血动物的尿。优选以能够进行无菌收集尿的方式进行收集。这可以通过膀胱插入无菌导管或收集中段尿来完成。为了保持尿处于无菌状态，应当使用一个无菌容器，例如一次性无菌塑料容器。根据尿中存在不溶性组分的情况，可以将尿进行离心，然后将沉淀弃去。用于筛查细菌污染物的传统试验方法是例如利用亚硝酸盐的试条试验。然后将收集到的尿暴露于或不暴露于氧化剂，例如含有至少约90％(v/v)氧的气体。术语“氧”意在包含原子纯形式和分子纯形式的元素氧，特别是O2和O3形式。O2是气体的主要成分。作为氧化剂，H2O2和O3是特别优选的。H2O2可以作为稀释溶液加入到尿中。合适的量是每100ml尿中加入1至3ml的1％的H2O2溶液。臭氧(O3)可以被加到所述气体中。如果以臭氧作为氧化剂，其浓度应当为约70至80ug/ml氧气。还可以加入或不加入一种或几种蛋白酶。得到的产物可以在0-41℃的范围内培养1-36小时或者不进行培养。临床结果以渐增的剂量反复口服或皮下施用无菌的在生理盐水中以1∶10000至1∶10稀释度稀释的产物，结果表明患有特应性湿疹(神经性皮炎)的儿童和成人的病症得到了明显的减轻。几个病例已被记录在案，多于12,000患者已用上述方法的不同变型进行治疗。修饰哺乳动物血的实施例(详细的)步骤1向总容积为250ml的无菌的预先排空的玻璃瓶(适于灌注医用溶液的普通型)中加入6000IU的无菌肝素钠(体积2-5ml)或相当量的低分子量肝素以防止以后发生血液凝集。
以常规的医学方式将200ml一个哺乳动物宿主的血液取样到所述的瓶子中从而获得无菌血。
所有下面的步骤都是在无菌条件和层流下进行的以避免污染。
步骤2以医学领域中现有的常规方式对7-9ml血进行抗HIV、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的抗体的检测。(以确保实验人员的安全)。通过移去部分血液将剩下的血液体积减到120ml。
步骤3在20℃下以750倍重力将所述瓶子离心20分钟从而将血浆(上面)和细胞室(红细胞、血小板、白细胞-下面)分离开来。
步骤4将肉眼可见的细胞室上方的血浆从原始瓶(本文中被称作“细胞瓶”)中吸到另一个容积为约250ml的无菌空玻璃瓶(本文中被称作“血浆瓶”)中。
在步骤5中，血浆瓶中的剩余真空通过注入每毫升O2中O3含量为40-60微克的100％氧的气体(如上所述利用一种合适的装置制备)来均衡，所述注入是在用手不停地摇动下将气体通过血浆注入到空瓶中直到瓶中的真空达到均衡。或者可在加入1ml的1％H2O2溶液后，在不停地摇动下通过所述液体注入纯氧而不是臭氧/氧的混合气体。
步骤6将所述血浆(血浆瓶)与剩余的血细胞沉淀(细胞瓶)合并在一起并通过轻轻摇动进行混合。
步骤7向每100ml的玻璃瓶内容物中加入所述量的下列溶液并进行混合加入30ml含有下列成分的预混合细胞培养基350ml含有氯化钙*2-H2O0.368g氯化钠 8.182g氯化钾 0.373g氯化镁*6-H2O0.305g葡萄糖 1g丙氨酸 0.48g精氨酸 0.339g天冬氨酸 0.102g谷氨酸 0.168gN2-甘氨酰-L-酪氨酸 0.1035g组氨酸 0.204g
异亮氨酸 0.168g亮氨酸 0.237g乙酸赖氨酸(lysin acetate)0.381g甲硫氨酸 0.168g苯丙氨酸 0.1755g脯氨酸 0.204g丝氨酸 0.135g苏氨酸 0.168g色氨酸 0.057g缬氨酸 0.219g维生素K10.020g棕榈酸视黄醇酯 0.00033g盐酸硫胺素 0.002g核黄素-5-磷酸0.002g烟酰胺 0.008gD-泛醇 0.005g盐酸吡哆醇 0.003g抗坏血酸 0.02gDL-α-生育酚乙酸酯 0.001g无菌水 350ml加上15ml无菌的4.2％NaHCO3溶液以及2ml混合无菌酶溶液(参见上文)。
或者，可对细胞相进行处理选择的步骤5细胞瓶中的剩余真空通过注入每毫升O2中O3含量为6-12微克的100％氧的气体(利用一种合适的装置制备的)来均衡，所述注入是在用手不停地摇动下将气体通过富集细胞的液体注入到空瓶中直到瓶中的真空达到均衡。或者可在加入1ml的0.1％H2O2溶液后，在不停地摇动下通过液体注入纯氧而不是臭氧/氧的混合气体。
选择的步骤6a将2ml的混合无菌酶溶液(参见上文)加到所述血浆瓶中。
选择的步骤6b在37℃和持续恒速振荡下将如此处理的血浆培养1-2小时，然后与细胞瓶混合并轻轻进行振荡混合(“共同”瓶)。
选择步骤7向每100ml“共同”瓶的内容物中加入20ml的预混合细胞培养基(参见上文)。
步骤8在接下来利用恒速转动装置进行培养的4个小时内，向每100毫升的瓶内容物中加入5ml实施例中经修饰的尿。
步骤9在滚动混合器或振荡器上在37℃下将完全细胞培养物暗培养16-36小时。
步骤10向每100ml培养瓶内容物中加入15ml的ACD稳定剂Fon A(含有葡萄糖*1H2O 23.9g，柠檬酸*lH2O 7.9g，柠檬酸钠*2H2O 21.8g，通过加水将体积补至1升)。取2ml的所述溶液进行常规医学血培养以证实无菌。另一个样品进行鲎变形细胞溶解物试验(BioWhittakker Inc.，Walkersville，美国)以确保不含内毒素。所述溶液必须贮存于最多4℃下或进行休克冷冻以保持效力。它可以被用来分离和研究经改变的生物物质或者在经验的基础上进行口服、经皮给药、吸入给药或非肠道给药以获得针对免疫系统疾病的免疫调节作用。临床结果以渐增的剂量反复口服或皮下施用无菌的在生理盐水中按照1∶10000至1∶10稀释度稀释的产物，结果表明患有特应性湿疹(神经性皮炎)以及其它与类似免疫疾病相关的疾病的儿童和成人中病症得到了明显而长期的缓解。多于801个病例已被长期记录，显示出统计学上显著的改善。
所述方法的终产物具有很强的免疫调节作用。
采用所述方法进行实验的结果表明对于不同的疾病(例如牛皮癣)需要进行所提及的改变。对于变应性皮炎和其它严重程度较轻的过敏性疾病来说，下述方法由于其简单易行和有效而成为优选的方法将个体患者的40-60ml血收集到一个无菌容器中。容器预先抽空有利于下列操作。
加入50ml标准等渗医用林格-乳酸盐溶液并通过振荡轻轻混合。通过充入无菌室内空气或每毫升加入氧中臭氧含量为2-30微克的氧气来解除瓶中的真空。所有三种方案都能达到理想的效果，血液物质只是以不同的速率被氧化。还没有发现快速氧化相对慢速氧化的优点。与现有技术相反，没有加入蛋白酶并且所述方法和氧化剂的浓度在它们的顺序、使用和详细描述方面有着明显的不同。
通过轻轻地转动来摇动所述血液以使其与容器内的气体接触。
在34-38℃或作为血来源的动物的正常体温范围内，利用振荡器或转动混合器将所述容器培养20-30小时。或者不进行血液的培养，而可以在冰箱中能够照射到日光的条件下在4-8℃保存几天。正在进行的研究意在显示两种方法之间可能存在的差别。临床实验结果相似，表明主要原理可能是由血液氧化/陈化而产生的物质模式。
下面步骤与上述重复提到的相同。
所获得的产品可以如上所述进行应用，也可以用来对相同的个体、相同的种或其它种进行口服给药、经皮用药或非肠道给药。它们可以不经稀释而进行用药，或可以通过用例如无菌盐水溶液、无菌水或其它适于稀释非肠道或口服药物的溶液稀释到直至10-23后进行用药。可以加入例如苯甲醇(例如0.1％)作为防腐剂。优选地应当将它们贮存在4℃以下或者可以进行冷冻保存。
权利要求
1.一种用于化学修饰哺乳动物尿的方法，包括以下步骤-收集哺乳动物尿，-在一个容器中采用一种氧化剂/一种含有约90％至100％(v/v)氧的气体处理所述的哺乳动物尿，-除去低分子量的物质从而得到经修饰的哺乳动物尿。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
3.如权利要求1和/或2所述的方法，其中所述氧化剂选自H2O2、O3及其混合物。
4.如权利要求1至3中任一项权利要求所述的方法，其中所述氧化剂以每毫升尿1至5微摩尔的浓度存在。
5.如权利要求1至4中任一项权利要求所述的方法，其中所述气体的体积至少是尿体积的50％。
6.如权利要求1至5中任一项权利要求所述的方法，其中所述气体的压力比大气压高0至1巴。
7.如权利要求1至6中任一项权利要求所述的方法，其中所述气体含有至少95％(v/v)的氧。
8.如权利要求1至7中任一项权利要求所述的方法，其中所述气体含有至少99％(v/v)的氧。
9.如权利要求1至8中任一项权利要求所述的方法，其中采用超滤来去除分子量低于5000道尔顿的物质。
10.如权利要求1至9中任一项权利要求所述的方法，其中去除分子量低于5000道尔顿的物质之后，在容器中采用一种氧化剂和一种氧含量约为90％至100％(v/v)的气体处理经修饰的哺乳动物尿。
11.如权利要求1至10中任一项权利要求所述的方法，其中用水或0.9％的无菌盐水对经修饰的哺乳动物尿进行对数级的稀释。
12.如权利要求1至11中任一项权利要求所述的方法，其中具有低分子量的物质是分子量低于约5000道尔顿的物质。
13.一种用于化学修饰哺乳动物血的方法，包括以下步骤-在有抗凝剂如肝素存在的条件下将哺乳动物血收集到一个内部压力降低的容器中(步骤0)，-维持一种氧化气氛，如果需要，添加一种氧化剂(步骤1a)，-添加一种稀释剂，优选等渗无菌盐水(步骤2a)，-将如此获得的组分进行混合(步骤4)，-通过贮存所述组分以使得所述组分陈化足够长的时间(步骤5)和-接着稀释至生理学上可接受的浓度(步骤9)。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述陈化进行至少2小时至几周，优选两周(步骤5)。
15.如权利要求13和/或14所述的方法，其中所述陈化在约4℃下进行。
16.如权利要求13至15中任一项权利要求所述的方法，其中所述陈化在光照条件下进行。
17.如权利要求13至16中任一项权利要求所述的方法，其中添加一种防腐剂(步骤8)。
18.如权利要求13至17中任一项权利要求所述的方法，其中添加一种稳定剂(步骤9)。
19.一种用于化学修饰哺乳动物血的方法，包括以下步骤-在有抗凝剂如肝素存在的条件下将哺乳动物血收集到一个内部压力降低的容器中(步骤0)，-维持一种氧化气氛，如果需要，添加一种氧化剂(步骤1a)，-添加至少一种免疫活性物质(步骤3)和/或添加按照权利要求1至12中任一项权利要求所述方法获得的哺乳动物尿(步骤5)，-将如此获得的第一部分进行混合(步骤4)，-添加活血细胞培养物(步骤6)，-对如此获得的第二部分进行培养从而得到培养产物(步骤7)，-接着稀释至生理学上可接受的浓度(步骤9)。
20.如权利要求19所述的方法，其中通过进一步降低内部压力来引起溶血。
21.如权利要求19和/或20所述的方法，其中所述免疫活性物质是γ-干扰素、β-干扰素或GCSF。
22.如权利要求19至21中任一项权利要求所述的方法，其中添加一种防腐剂(步骤8)。
23.如权利要求19至22中任一项权利要求所述的方法，其中添加一种稳定剂(步骤9)。
24.如权利要求13至23中任一项权利要求所述的方法，其中在处理收集的哺乳动物血之前，将该血分离成血浆相和细胞相，采用氧化剂处理所述的血浆相，然后将该被处理的血浆相和细胞相合并从而得到一种混合组分，再按照权利要求13或20所述方法的其余步骤对该混合组分进行进一步处理。
25.如权利要求24所述的方法，其中添加一种细胞培养基并且在有所述细胞培养基存在下以及任选地在有按照权利要求1至12中任一项权利要求所述方法处理的尿存在的条件下将所述混合物培养足够长的时间。
26.如权利要求13至25所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
27.如权利要求13至26所述的方法，其中所述氧化剂选自空气、O2、H2O2、O3及其混合物。
28.如权利要求13至27所述的方法，其中所述氧化剂以每毫升血液1至5微摩尔的浓度存在。
29.如权利要求13至28所述的方法，其中所述气体的体积至少为血液体积的75％。
30.如权利要求13至29所述的方法，其中所述所述气体的压力比大气压高0至1巴。
31.如权利要求13至30所述的方法，其中所述所述气体含有至少95％(v/v)的氧。
32.如权利要求13至31所述的方法，其中所述所述气体含有至少99％(v/v)的氧。
33.一种治疗免疫疾病的方法，包括给需要治疗的患者施用按照权利要求1至12中任一项权利要求所述方法制备的经修饰的哺乳动物尿的步骤。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述经修饰的哺乳动物尿由所述患者的尿制备而成。
35.如权利要求33或34任一项所述的方法，其中所述免疫系统的疾病选自变应性疾病、风湿性疾病、自身免疫疾病和免疫缺陷。
36.一种治疗免疫疾病的方法，包括给需要治疗的患者施用按照权利要求13至32中任一项权利要求所述方法制备的经修饰的哺乳动物血的步骤。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述经修饰的哺乳动物血由所述患者的血制备而成。
38.如权利要求36或37任一项所述的方法，其中免疫系统的疾病选自变应性疾病、风湿性疾病、自身免疫疾病和免疫缺陷。
39.可按照权利要求1至12中任一项权利要求所述方法获得的经修饰的哺乳动物尿。
40.可按照权利要求13至32中任一项权利要求所述方法获得的经修饰的哺乳动物血。
41.一种用于白细胞增殖或产生疾病特异性物质模式的方法，包括以下步骤-收集哺乳动物血，-将所述血分离成血浆相和细胞相，-在一个容器中利用一种氧化剂和含有大约90％至100％(v/v)氧的气体处理血浆相、细胞相或两者，-将血浆相和细胞相合并，-添加一种细胞培养基和至少一种蛋白酶，-添加按照权利要求1的方法制备的经修饰的哺乳动物尿，-在约37℃下培养16至36小时，-添加防腐剂从而得到经修饰的哺乳动物血。
全文摘要
本发明公开了用于化学修饰哺乳动物尿和哺乳动物血的新方法以用于疾病的治疗。
文档编号A61K38/21GK1426304SQ01808679
公开日2003年6月25日 申请日期2001年4月26日 优先权日2000年4月26日
发明者鲍里斯·布雷福格尔, 霍斯特·基弗 申请人:鲍里斯·布雷福格尔